Name: Isolierung von Kleine-kodierenden RNAs von Human Serum (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Lernen Sie die optimierte Isolierung hochwertiger kleiner RNAs aus menschlichem Serum. Diese Methode minimiert Proteinverunreinigungen durch Phasen-Lock-Röhrchen und Flash-Zentrifugation für zuverlässige downstream-Anwendungen.

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Samantha Khoury und Pamela Ajuyah werden von der australischen Postgraduate-Award unterstützt. Wir würden auch gerne die Translationale Krebsforschung Network, Lowy Krebsforschungszentrum der Universität von New South Wales und der Nord Translationale Krebsforschungsstelle für ihre zusätzliche Unterstützung von Samantha Khoury bestätigen.

Hinweis: Humanes Serumproben von gesunden Patienten oder Patienten mit Krebs wurden mit Einwilligung im Rahmen genehmigter menschlichen ethischen Protokolle aus der Royal Prince Alfred Hospital in Sydney (Protokollnummer X10-0016 und HREC/10/RPAH/24) und der University of Technology erhalten, Sydney. Serumproben wurden von Patienten vor der Operation aus verschiedenen Krankenhäusern Sydney gesammelt und bei -80 ° C platziert 1. Kleine RNA-Isolierung aus Serum Gesamt-RNA wurde aus menschlichem Serum unter Verwendung einer modifizierten Version des Tri-Reagent RT LS Protokoll hergestellt. <ol><li> Tauen Sie gefrorene Serum-Probe auf Eis und dann übertragen 400 ul der frisch aufgetauten Serum in einem markierten Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Verdünnt das Serum mit 100 &amp;mgr; l RNase-freiem H 2 O und fügen Proteinase K in einer Konzentration von 1 mg / ml. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C für 20 min, um die Proteinverdauung durch Proteinase K. ermöglichen </li><li> To vollständige Auflösung zu gewährleisten, fügen Sie das 1,5-fache seines Volumens an Tri-Reagenz RT LS und 100 ul 4-Bromanisol. </li><li> Kurz invertieren die Homogenat, sich wiederholende Pipettieren für 5 Sekunden und Transfer in einem markierten 2 ml schwere Phase Lock Röhre. </li><li> Drehe das Homogenat bei 12.000 × g für 20 min bei 4 ° C. </li><li> Mindestens 1 ml der resultierenden wässrigen Lösung vorsichtig dekantieren in eine frische DNA LoBind Röhre. Die organische und die Zwischenphase sollte unterhalb der weißen Gel der Phase Lock Rohr eingeklemmt werden. </li><li> Add 5,0 ul Glycogen (5 mg / ml) und 500 &amp;mgr; l 100% igem Isopropanol zu der wässrigen Lösung, Mischen durch Umdrehen und inkubiert O / N bei 20 ° C. </li><li> Folgenden O / N Inkubation Zentrifuge die Probe für 20 min bei 12.000 × g bei 4 ° C zentrifugiert. </li><li> Entsorgen Sie die klare Überstand und führen Sie einen &quot;Flash&quot;-Spin für 2 min bei 16.000 × g in einem 4 ° C zentrifugiert. </li><li> Die klare Sol vorsichtig entfernenution rund um das Pellet mit einer Pipette. </li><li> Waschen Sie das Pellet mit 1 ml 70% Ethanol und Zentrifugation bei 10.000 × g für 10 min. Dekantiert man die Waschlösung und wiederholen Waschschritt. </li></ol> 2. RNA Resuspension in Lösung <ol><li> Das Pellet in 10 ul RNase freiem H 2 O, wodurch das Pellet vollständig gelöst ist. Um sicherzustellen, dass die RNA vollständig solubilisiert die Probe auf 55 ° C für 5 min erhitzt werden. Während dieser Zeit mischen die Probe mit wiederholten Pipettieren. Für eine höhere Gesamt-RNA-Ausbeute, bündeln zwei RNA-Präparationen des gleichen Patienten. </li><li> Quantifizieren der resuspendiert RNA mit Hilfe eines UV-Vis-Spektrophotometer und Beurteilung der RNA-Qualität mit einem Bioanalyzer 2100. Speichern die gepoolte RNA-Proben bei -80 ° C zur Verwendung in nachfolgenden Anwendungen. </li></ol>

<ol><li>Babu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+extraction+efficiency+of+small+RNAs+with+the+Agilent+2100+Bioanalyzer+and+the+Small+RNA+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22Agilent+Application+Note%22%5BJournal%5D)">Monitoring extraction efficiency of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer and the Small RNA Kit.</a> Agilent Application Note. , (2010).</li>
<li>Tran, N., Hutvagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+the+regulation+of+the+maturation+of+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+Biochem%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and the regulation of the maturation of miRNAs.</a> Essays Biochem. 54, 17-28 (2013).</li>
<li>Chim, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+characterization+of+placental+microRNAs+in+maternal+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma.</a> Clin. Chem. 54, 482-490 (2008).</li>
<li>Lodes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+cancer+with+serum+miRNAs+on+an+oligonucleotide+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Detection of cancer with serum miRNAs on an oligonucleotide microarray.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
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<li>Kirschner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemolysis+during+sample+preparation+alters+microRNA+content+of+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Murphy, N. R., Hellwig, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+nucleic+acid+organic+extraction+through+use+of+a+unique+gel+barrier+material%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Improved nucleic acid organic extraction through use of a unique gel barrier material.</a> Biotechniques. 21, 934-936 (1996).</li>
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<li>Ichikawa, M., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Combination+of+Extraction+Reagent+and+DNA+Microarray+That+Allows+for+the+Detection+of+Global+MiRNA+Profiles+from+Serum%2FPlasma%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Combination of Extraction Reagent and DNA Microarray That Allows for the Detection of Global MiRNA Profiles from Serum/Plasma.</a> Methods Mol. Biol. 1024, 247-253 (2013).</li>
<li>Fromm, B., Harris, P. D., Bachmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+preparations+from+individual+monogenean+Gyrodactylus+salaris-a+comparison+of+six+commercially+available+totalRNA+extraction+kits%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">MicroRNA preparations from individual monogenean Gyrodactylus salaris-a comparison of six commercially available totalRNA extraction kits.</a> BMC Res. Notes. 4, 217 (2011).</li>
<li>Li, Y., Kowdley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+microRNA+isolation+from+clinical+serum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Method for microRNA isolation from clinical serum samples.</a> Anal. Biochem. 431, 69-75 (2012).</li>
<li>McAlexander, M. A., Phillips, M. J., Witwer, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Methods+for+miRNA+Extraction+from+Plasma+and+Quantitative+Recovery+of+RNA+from+Cerebrospinal+Fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparison of Methods for miRNA Extraction from Plasma and Quantitative Recovery of RNA from Cerebrospinal Fluid.</a> Frontiers in Genetics. 4, 83 (2013).</li>
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</ol>

Es gibt nichts zu offenbaren.

Die Bevölkerung von microRNAs macht ungefähr 0,4 bis 0,5% der Gesamt-RNA im Serum gefunden. Ferner gibt es auch einen hohen Proteingehalt im menschlichen Serum gefunden. Um RNA zu verbessern und sowohl die Protein-und Phenol verseucht reduzieren wir den traditionellen Ansatz Chomczynski 9 mit dem Zusatz von mehreren Schritten modifiziert. Gesamt-RNA wurde aus dem Serum unter Verwendung des Standard-Tri-Reagent RT-LS (Molecular Research Center) isoliert jedoch, wenn sie in unserem ...

In den letzten Jahren hat es eine wachsende Druck neuartige Biomarker für die Früherkennung von menschlichen Krankheiten zu entdecken. Viel Aufmerksamkeit wurde zur Verwendung von kleinen RNAs, wie microRNAs 2 (miRNAs oder miRs) als potenzielle Marker konzentriert. Diese kleinen RNAs werden in Körperflüssigkeiten wie Serum und Studien gefunden haben gezeigt, sie sind robust, um den Abbau und sind über einen Bereich von 3 unterschiedlichen Umweltbedingungen stabil. Angesichts dieser Eigenschaften, Serum oder zirkulierenden miRNAs sind die ideale Biomarker 4, 5. Derzeit gibt es zwei Hauptansätze zur Isolierung von kleinen RNA aus biologischen Flüssigkeiten. Der erste Ansatz verwendet spaltenbasierte Technologie zu binden und zu eluieren die kleinen RNAs 6, während der zweite Ansatz nutzt die langjährige Protokoll mit Phenol und Guanidiniumthiocyanat Reagenzien 7. Wir haben eine einfache, effektive, stützenfreie Protokoll an kleinen RNAs aus menschlichem Serum isolieren entwickelt. Die isolierte RNA wird sofortLICH verwendbar in nachgelagerten Anwendungen, einschließlich DNA-Oligonukleotid-Arrays und RNA-Sequenzierung. Dieses Protokoll wurde entwickelt, weil wir mit einigen Problemen bei der Verwendung von Phenol-basierte Methoden zur RNA aus Serum isolieren konfrontiert. Die traditionelle Chomczynski Ansatz wird häufig in den meisten Labors mit einer Reihe von Reagenzien von den meisten kommerziellen Anbietern verwendet. Jedoch unter Berücksichtigung ihrer Verbreitung haben strenge Richtlinien nicht entwickelt worden, um konsequent qualitativ hochwertige RNA aus Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut oder Serum. Häufige Probleme mit Isolierung von RNA aus Serum assoziiert sind geringe RNA-Ausbeuten und Kontamination mit Reagenzien während der Trennung, insbesondere Phenol. Unser Ansatz eliminiert diese Schadstoffe Phenol, qualitativ hochwertige RNA für Downstream-Analyse wie die quantitative PCR (qPCR) und RNA-Sequenzierung bieten. Wir haben weiter diesen RNA getestet auf miRNA-Arrays.

<table><tbody><tr><td>Tri-Reagenz RT LS</td><td>Molecular Research Center, USA</td><td>TR 118</td><td></td></tr><tr><td>RNase frei H2O</td><td>GIBCO Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Finnzymes, Finnland</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Phase Lock Röhrchen</td><td>5PRIME</td><td>2302830</td><td>2 ml</td></tr><tr><td>Fassungsvermögen DNA Lobind Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.078</td><td>1,5 ml Kapazität</td></tr><tr><td>Glykogen</td><td>Invitrogen, USA</td><td>10814-010</td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>Isopropanol in RNA-Qualität</td><td>Sigma Aldrich, USA</td><td>I9516</td><td>100%</td></tr><tr><td>gekühlte Zentrifuge</td><td>John Morris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop UV-Vis-Spektralphotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol in RNA-Qualität</td><td>Sigma Aldrich, USA</td><td>E7023</td><td>70%</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalysator</td><td>Agilent, Vereinigte Staaten von Amerika</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von kleine-kodierenden rnas von human serum

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Die Analyse von RNA und deren Ausdruck ist ein gemeinsames Merkmal in vielen Labors. Von Bedeutung ist die Entstehung von kleinen RNAs wie microRNAs, die in Säugetierzellen zu finden sind. Diese kleinen RNAs sind potente Genregulatoren Steuerung Vitalwege wie Wachstum, Entwicklung und Tod und hat viel Interesse an ihren Ausdruck in Körperflüssigkeiten gerichtet. Dies ist aufgrund der Fehlregulation im menschlichen Krankheiten wie Krebs und ihre potentielle Anwendung als Serum Biomarker. Jedoch kann die Analyse der miRNA-Expression in serum problematisch sein. In den meisten Fällen die Menge an Serum und Serum Begrenzungs geringe Mengen an Gesamt-RNA, von denen kleine RNAs bilden nur 0,4-0,5% 1. So ist die Trennung von ausreichenden Mengen an Qualität RNA aus Serum ist eine große Herausforderung für Forscher heute. In diesem Fachbeitrag zeigen wir, ein Verfahren, das nur 400 ul Humanserum verwendet, um eine ausreichende RNA entweder für DNA-Arrays oder qPCR-Analyse zu erhalten. Die einorteile dieser Methode sind seine Einfachheit und Fähigkeit, qualitativ hochwertige RNA ergeben. Es erfordert keine speziellen Spalten für die Reinigung von kleinen RNAs und nutzt allgemeine Reagenzien und Hardware gemeinsam Laboratorien gefunden. Unsere Methode nutzt eine Phase Lock Gel zu Phenol Verunreinigung zu beseitigen, während zur gleichen Zeit ergibt hohe Qualität RNA. Außerdem stellen wir einen weiteren Schritt, um alle Verunreinigungen während der Isolierung Schritt weiter zu entfernen. Dieses Protokoll ist sehr effektiv bei der Isolierung von Gesamt-RNA-Ausbeuten von bis zu 100 ng / &amp;mgr; l aus Serum, sondern kann auch für andere biologische Gewebe angepasst werden.

Figur 1 stellt eine typische UV / Vis-Spektrum von RNA aus dem Serum isoliert. Aus diesem Profil haben wir festgestellt Protein-Kontamination bei 280 nm mit Phenol und organischen Verunreinigungen sowohl bei 270 nm und 230 nm auf. Rückstand Guanidiniumthiocyanat wurde bei 260 nm festgestellt. Um Verunreinigungen zu reduzieren, wurden eine Reihe von Optimierungsschritten zur Standard Tri-Reagent RT-LS-Verfahren hergestellt. Wir haben 5 mg / ml Glykogen, sowohl die Gesamt-RNA-Ausbeute zu erhöhen und die V...

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Extraktion von kleinen RNAs aus menschlichem Serum. Wir haben diese Methode verwendet, um microRNAs von Krebsserum für den Einsatz in DNA-Arrays isolieren und auch Singleplex quantitative PCR. Das Protokoll nutzt Phenol und Guanidiniumthiocyanat Reagenzien mit Modifikationen, um qualitativ hochwertige RNA ergeben.

Isolierung von Kleine-kodierenden RNAs von Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, hochwertige RNA aus Serumproben zu isolieren. Mithilfe unserer optimierten Version des gängigen MRC-try-Reagenz-RTLS-Protokolls wird dies erreicht, indem das Serum zunächst im Verhältnis 1:5 mit nukleasefreiem Wasser verdünnt wird, um eine Proteinkontamination zu verringern.Der zweite Schritt besteht darin, zwei Milliliter Phase-Lock-Röhrchen für den ersten Zentrifugationsschritt einzuführen. Dadurch werden die meisten Kontaminanten, wie Phenol und Proteine, in der organischen Phase festgehalten. Als nächster und letzter Optimierungsschritt folgt ein Kurzzentrifugationsschritt bei 12.000 ×g, bei dem jegliche Restkontamination aus dem RNA-Pellet vor den Ethanolaufreinigungen entfernt wird.Der letzte Schritt besteht darin, zwei modifizierte RNA-Präparationen desselben Patienten zu vereinen, wenn eine höhere Gesamt-RNA-Ausbeute erforderlich ist. Letztendlich zeigen wir durch die Anwendung dieser modifizierten Methode, bei der Serum in nukleasefreiem Wasser solubilisiert wird, eine Phasentrennröhre verwendet wird, um die Hauptkontaminanten einzufangen, und eine kurze Zentrifugation eingeführt wird, dass es möglich ist, die Rückgew

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Papier zeigt Methoden zur Isolierung, Aufreinigung und Detektion von Exosomen, sowie Techniken für die Analyse ihrer molekularen Inhalten. Diese Methoden sind anpassungsfähig für Exosom Isolation von beiden Zellkulturmedien und biologischen Flüssigkeiten, und kann darüber hinaus Analyse molekularer Inhalte auch in funktionellen Studien nützlich sein.

Isolierung und Charakterisierung von RNA-haltigen Exosomen

Viele mRNAs mitochondriale Proteine ​​kodieren, sind mit der äußeren Mitochondrien-Membran verbunden. Wir beschreiben eine subzellulärer Fraktionierung Verfahren auf Isolierung von Hefe-Mitochondrien mit den zugehörigen mRNAs und Ribosomen ab. Dieses Protokoll kann auf Zellen unter verschiedenen Bedingungen gezüchtet, um die Mechanismen der mRNA-Lokalisierung und Übersetzung lokalisiert in der Nähe der Mitochondrien zeigen angewendet werden.

Isolierung von mRNAs Verbunden mit Hefe-Mitochondrien Study Mechanismen der lokalisierten Übersetzung

Dieses Manuskript beschreibt einen Ansatz zur Isolierung ausgewählter verwandter RNPs, die in eukaryotischen Zellen gebildet werden, durch eine spezifische Oligonukleotid-gerichtete Anreicherung. Wir demonstrieren die Anwendbarkeit dieses Ansatzes, indem wir ein verwandtes RNP isolieren, das an die retrovirale 5'-untranslatierte Region gebunden ist, die aus DHX9/RNA-Helikase A besteht.

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RNA-Protein-Wechselwirkungen sind das Herzstück vieler zellulärer Prozesse. Hier beschreiben wir eine in vivo Methode, um spezifische RNA zu isolieren und neue Proteine zu identifizieren, die mit ihr assoziiert sind. Dies könnte ein neues Licht darauf werfen, wie RNAs in der Zelle reguliert werden.

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Ein Tandem RNA Isolierung (Reise) für die Verwertung von endogen gebildeten mRNA-Protein-komplexe Vorgehensweise wird. Speziell, RNA-Protein-komplexe sind vernetzt in VivoPolyadenylated RNAs sind isoliert aus Extrakten mit oligo(dT) Perlen und besonderen mRNAs werden mit modifizierten RNA antisense Oligonukleotide erfasst. Proteine gebunden, mRNAs werden vom Immunoblot Analyse erkannt.

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Circular RNAs (circRNAs) sind nicht-kodierende RNAs, die eine Rolle bei der Transkriptionsregulation und der Vermittlung von Wechselwirkungen zwischen Proteinen spielen können. Nach Der Bewertung verschiedener Parameter für den Aufbau von CircRNA-Sequenzierungsbibliotheken wurde ein Protokoll unter Verwendung der gestrandeten Gesamt-RNA-Bibliotheksvorbereitung mit RNase R-Vorbehandlung erstellt und hier vorgestellt.

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Isolierung von microRNAs aus Zecken-Ex-vivo-Speicheldrüsenkulturen und extrazellulären Vesikeln

Lernen Sie die optimierte Isolierung hochwertiger kleiner RNAs aus menschlichem Serum. Diese Methode minimiert Proteinverunreinigungen durch Phasen-Lock-Röhrchen und Flash-Zentrifugation für zuverlässige downstream-Anwendungen.

Isolierung von Kleine-kodierenden RNAs von Human Serum

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