Name: Polysomprofile Fraktionierung und Analyse von Säuger Translatomes auf einer Genom-weite Skala (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Erfahren Sie die Polysomfraktionierung zur Analyse von mRNA-Translation in Säugetierzellen. Diese Methode nutzt Cycloheximid und Saccharose-Dichtegradienten, um Ribosomen zu isolieren und Genexpressionsänderungen genomweit zu untersuchen.

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Diese Forschung wurde von der kanadischen Institutes of Health Research Grant (CIHR MOP-115195) und FRQ-S IT, der auch ein Empfänger von CIHR Young Investigator Award unterstützt; und die schwedische Forschungsrat und die schwedische Krebsgesellschaft zu OL

1. Sucrose Gradient Vorbereitung <ol><li> Es werden 100 ml 60% (w / v) Saccharoselösung in ddH 2 O. Lösung sollte durch eine 0,22 &amp;mgr; m-Filter gefiltert werden, um ein Verstopfen der Rohrleitung während der Fraktionierung (Schritt 3,5) zu verhindern. </li><li> Vorbereitung 5 ml 10x Saccharosegradienten Puffer: 200 mM HEPES (pH 7,6), 1 M KCl, 50 mM MgCl 2, 100 &amp;mgr; g / ml Cycloheximid, 1x Protease-Inhibitor-Cocktail (EDTA-frei), 100 Einheiten / ml RNase-Inhibitor. </li><li> Verwendung der 60% igen Lösung, hergestellt wie in Schritt 1.1 beschrieben, stellen 40 ml 5% und 50% Sucroselösungen in 1x Saccharose-Gradienten-Puffer. </li><li> Verwenden Sie das mit dem Gradienten-Hersteller zur Verfügung gestellt, um die Markierung Block halb voll Punkt auf jeder Polyallomer Ultrazentrifugation Rohr für die Schichtung (6 Ultrazentrifugation Rohre insgesamt) markieren. Mit der Schichtung Gerät mit dem Farbverlauf-Hersteller zur Verfügung gestellt, plus 5% Saccharose-Lösung, bis sie den halb vollen Punkt erreicht. Dann fügen Sie 50% Saccharose-Lösung vom Boden bis zur interfAss zwischen den beiden Lösungen erreicht die Halb vollen Punkt. Besondere Sorgfalt sollte während dieser Stufe entnommen werden, so daß Steigungen sind so ähnlich wie möglich, wie dies zur Erzielung einer hohen Reproduzierbarkeit (siehe unten). </li><li> Seal Röhrchen mit Rate zonale Kappen mit dem Gradienten-Hersteller zur Verfügung gestellt und übergeben die verschlossenen Röhrchen mit dem Rohrhalter auf der Steigung ausgestattet. </li><li> Führen Sie den Gradienten-Hersteller, um eine lineare 5% bis 50% Steigung zu erhalten. 6 lineare Farbverläufe werden in wenigen Minuten durch die Rotation bei hohen Neigungswinkel gebildet werden. Hinweis: Saccharosegradienten kann sofort für 6 Monate verwendet oder bei -80 ° C gelagert werden. </li></ol> 2. Isolierung und Sedimentation von Polysomen <ol><li> Je nach Zelltyp, Samenzellen in 1-5 15 cm Petrischalen (etwa 15 x 10 6 Zellen) mindestens einen Tag vor der Lyse. Am Tag der Experimente sollten die Zellen ~ 80% konfluent sein. <!-- Hinweis: Optimale Konfluenz ist kritisch, weil Übersetzung und Proliferationsraten sind direktproportional 8, und deshalb sollte Polysomen in aktiv proliferierenden Zellen analysiert werden (dh Übersetzung Preise werden deutlich sinken in über konfluenten Zellen während niedrige Konfluenz von Zellen nicht genügend Material für die weitere Analyse). Ausnahmen von dieser Regel können gemacht werden, wenn zum Beispiel der Experimentator interessiert sich für die Untersuchung der Wirkung von Kontakthemmung auf Übersetzung. Zellen jedoch nicht unter Über konfluenten Bedingungen zu lange gehalten werden, da dies Auswirkungen auf die unbeabsichtigte translatome haben. Wenn Transfektion erforderlich ist, die meisten der im Handel erhältlichen Kits nicht beeinträchtigen Polysomen Ebenen. Denn am Tag der Transfektion Zellen müssen 80-90% konfluent sein, ist es empfehlenswert, Zellen breiten sich 24 Stunden nach der Transfektion und isolieren Polysomen 48 Stunden nach der Transfektion von Zellen, ~ 80% konfluent. </li><li> Inkubieren Zellen mit Cycloheximid in einer Endkonzentration von 100 ug / ml in Wachstumsmedium für 5 min bei 37 ° C und 5% CO 2; und waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 ml eiskaltem 1x PBS mit 100 ug / ml Cycloheximid. Cycloheximid ist eine Übersetzung Dehnung Inhibitor, &quot;friert&quot; Ribosomen auf der mRNA, wodurch verhindert wird, Ribosom weglaufen 20. </li><li> Kratzen Zellen vorsichtig in 5 ml eiskaltem 1x PBS mit 100 ug / ml Cycloheximid und sammeln sie in einem 50-ml-Tube. Es ist wichtig, dass dieser Schritt recht schnell als Abgangs Zellen auf Eis für eine längere Zeitdauer wird die Qualität der Polysomen-Herstellung drastisch verringern geführt. </li><li> Sammle die Zellen durch Zentrifugation bei 200 × g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendieren Zellen in 425 ul hypotonischen Puffer [(5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2,5 mM MgCl 2, 1,5 mM KCl und 1x Protease-Inhibitor-Cocktail (EDTA-frei)], mit 5 &amp;mgr; l 10 mg / CHX ml, 1 &amp;mgr; l 1 M DTT, 100 Einheiten RNase-Inhibitor und Rührers 5 Sekunden, gefolgt von der Zugabe von 25 ul 10% Triton X-100 (Endkonzentration 0,5%) und 25 ul 10% Natriumdeoxycholat (Endkonzentration 0,5%) und 5 Sekunden vortexen. Durch Zellschwellung, wird der hypotonischen Puffer die Plasmamembran stören, während die Bedingungen milden Reinigungsmittel werden verwendet, um cytosolischen und endoplasmatischen Retikulum-assoziierten Ribosomen, ohne dass der Kernhülle zu lösen. </li><li> Zentrifuge Lysate bei 16.000 × g für 7 min bei 4 ° C und Transferüberstand (~ 500 &amp;mgr; l) in eine neue vorgekühlte 1,5 ml Röhrchen. Messung der OD bei 260 nm für jede Probe unter Verwendung eines Spektrophotometers und halten 10% des Lysats als Eingabe verwendet, um die cytosolische stationären mRNA-Spiegel zu bestimmen wird. Verdünnen Sie den Eingang auf 750 ul in RNAse freiem H 2 O, fügen Sie 750 ul Trizol-und Flash-Freeze in flüssigem Stickstoff. </li><li> Übertragen Ultrazentrifuge Röhrchen mit Saccharose-Gradienten in vorgekühlte Rotorschaufeln. Entfernen 500 ul von der Spitze des Saccharose-Gradienten. Lysate so einzustellen, dass sie den gleichen Außendurchmesser (10-2 enthalten0 OD bei 260 nm) in 500 ul Lysepuffer (in Schritt 2.5 beschrieben) und laden Sie sie auf jedem Saccharose-Gradienten. Hinweis: Es ist wichtig, sofort zu laden Lysate auf den Steigungen, da dies entscheidend die Qualität der Polysom ​​Vorbereitungen zu verbessern. </li><li> Wiegen und die Waage Steigung vor der Ultrazentrifugation. </li><li> Zentrifuge bei 222.228 xg (36.000 rpm) für 2 h bei 4 ° C unter Verwendung SW41Ti Rotors. Hinweis: Um nicht zu Saccharose-Gradienten zu stören, sollten &quot;low&quot; Bremsoption ausgewählt werden. </li></ol> 3. Polysomprofile Fraktionierung und RNA-Extraktion <ol><li> Bereiten Sie den Fraktionssammler durch Reinigung mit warmem RNAse freies Wasser enthält RNase ZAP (ein paar Spritzer). Wiederholen Sie diesen Schritt nur mit warmen RNAse freies Wasser. Schalten UV-Lampe und warten, bis das grüne Licht zu erscheinen. </li><li> Röhren vorsichtig aus dem Rotor zu entfernen und sie auf Eis. Computer einschalten, Pumpe, UV-Detektor und Fraktionssammler. Pumpenaggregat mit 3 ml / min und fill der Schlauch mit der Verfolger Lösung [60% (w / v) Saccharose, das 0,02% (w / v) Bromphenolblau], bis die Nadel erreicht. Achten Sie darauf, um zu sehen, zumindest ein Tropfen aus der Nadel kommt, und festzustellen, dass keine Blasen in der Spritze oder Pumpe Schlauch eingeführt. </li><li> Platz 2 ml-Röhrchen in einem Fraktionssammler. Starten Analyseprogramm und stellen Sie die Empfindlichkeit zu + / - 10 MeV. Stellen Sie &quot;Zeitbasis&quot;, um 100 Sekunden. </li><li> Positionieren Sie jedes Ultrazentrifugation Rohr in den UV-Detektor gleichzeitig dafür, dass das Rohr in der orthogonalen Position. Durchbohren die Röhre mit der Nadel durch Drehen des Knopfes unter dem Rohrhalter. </li><li> Stellen Sie die Pumpe bei 1,5 ml / min und sammeln die Fraktionen Einstellen der Zeit bis 30 Sekunden auf der Fraktionssammler (dies wird in ~ 750 ul in jeder Fraktion führen). Stellen Sie die Pumpe in der &quot;Remote-Position&quot;, starten Sie die Pumpe und Fraktionssammler, und zur gleichen Zeit starten Sie die Aufnahme mit dem DAQ-Tracer. Dies wird eine Aufwärtsverschiebung der Saccharose gra startendient und eine gleichzeitige Detektion UV-Absorption bei 254 nm auf. Stoppen Sie sammeln, sobald der erste Tropfen jagen Lösung in einem 2 ml Sammelrohr fällt. </li><li> Speichern Sie die Ablaufverfolgung im csv-Format und (einmal Schritt 3.7 abgeschlossen ist) in einem Tabellenkalkulationsprogramm, gehen Sie wie folgt, um die Positionierung der einzelnen Fraktionen im UV-Absorptionsprofil identifizieren.: <ol><li> Wählen Sie die Spalte, die Werte entsprechend bei 254 nm Extinktion (Kanal 0). </li><li> Erstellen Sie eine glatte Linie Streudiagramm der Absorptionen. </li><li> Stellen Sie die Haupteinheit der X-Achse 300, indem das Volumen von 5% -50% Saccharose-Gradienten (~ 12 ml) durch die Erfassungszeit jeder Fraktion (30 sec) erhaltene (Wert. </li></ol></li><li> In 750 ul Trizol in jeder Fraktion und Flash Einfrieren der Fraktionen in flüssigem Stickstoff. </li><li> Isolieren Polysomen-assoziierten und cytosolische (2,6)-RNA unter Verwendung von Trizol-Protokoll gemäß den Anweisungen des Herstellers. Um RNA-Ausbeute zu erhöhen, gehen Sie mit RNA Präzisionschlags bei -80 ° C für 30 min und 20 ° C über Nacht. Hinweis: Da die Menge von RNA aus polysomaler Fraktionen gefällt nicht deutlich sichtbar sein, wird empfohlen, Träger hinzuzufügen. 1 &amp;mgr; l des Trägers an dem Rohr vor der RNA-Fällungsschritt während des Trizol-Protokoll. </li><li> Bestimmen Sie, welche Fraktionen entsprechen mRNA mit&gt; 3 Ribosomen assoziiert (mit Ansatz beschrieben 3.6) und bündeln diese Fraktionen. Verwenden Sie die RNA Cleanup Kit zur Reinigung von gepoolten Polysom-assoziierten und zytosolischen RNA (ab 2.6) durchzuführen. Proben Senden an eine Anlage zur genomweiten mRNA-Spiegel bestimmen mit Microarrays oder tief Sequenzierung. Wenn die Übersetzung von spezifischen mRNAs müssen durch RT-qPCR überwacht werden, ist es empfehlenswert, 500 ng RNA (aus gepoolten Fraktionen, die&gt; 3 Ribosomen oder Gesamt-RNA), um cDNA zu synthetisieren. Hinweis: mRNAs mit&gt; 3 Ribosomen assoziiert ist willkürlich festgelegt, um effizient übersetzt mRNAs darstellen und enthalten mehr als 80% der neu synthetisiertenGröße Polypeptide 28,29. Inklusive Fraktionen, die Licht (1-2), mittel-(2-3) und schweren Polysomen (&gt; 3) wäre es von Vorteil, aber diese werden Anzahl der Proben, die durch 2-fach (4 vs 2 pro Bedingung) zu erhöhen und damit die Kosten des Experiments. Ungeachtet dessen, dass es wird erwartet, dass der Rückgang der Kosten für die Tief Sequenzierung und Microarray-Analyse in Zukunft sollte den zweiten Ansatz bevorzugen, ist es ratsam, dass bei der Validierung, die Verteilung der einzelnen mRNAs ist in jeder Fraktion überwacht. </li></ol> 4. Genom-weite Analyse der mRNA-Translation <ol><li> Installieren Sie R, Bioconductor und die anota Paket: <ol><li> Installieren Sie R (Download von r-project.org) und starten Sie eine R-Sitzung. Hinweis: R ist für alle Betriebssysteme verfügbar und anota wird auf alle von ihnen laufen. </li><li> Installieren Bioconductor (bioconductor.org). Die von do gestartet wird - R-Code wird durch den R-Anschluss (z. B. die R-Konsole in Windows interpretiertuble Sie auf die R-Verknüpfung). Bioconductor wird durch Eingabe von (in der R-Terminal) installiert: Quelle (&quot;http://bioconductor.org/biocLite.R&quot;) biocLite () </li><li> Installieren Sie das Paket anota Bioconductor (und die qvalue Paket, das anota erfordert), indem Sie (in der R-Anschluss): Quelle (&quot;http://bioconductor.org/biocLite.R&quot;) biocLite (c (&quot;anota&quot;, &quot;qvalue&quot;)) </li><li> Testen Sie, ob das Paket erfolgreich installiert und öffnen Sie die anota Handbuch, indem Sie (in der R-Anschluss): Bibliothek (&quot;anota&quot;) Vignette (&quot;anota&quot;) </li><li> Hinweis: Zusätzliche Hilfe für alle Funktionen, die im anota Paket verwendet werden, können entweder an der anota Web-Seite (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/anota.html) oder über gefunden werden Die Hilfe-Funktion in R. Zum Beispiel, um Hilfe zum anotaPerformQc Funktion erhalten Sie auf der R-terminal und Art (beachten Sie, dass dies nur funktioniert, wenn die anota Paket geladen wurde): Bibliothek (&quot;anota&quot;) # lädt das Paket anota ? AnotaPerformQc # öffnet Hilfe für diese Funktion </li></ol></li><li> Importiert Daten in R: <ol><li> Bereiten Expressionsdaten für die Analyse. Daten sollten vorverarbeitet werden (zB normalisiert und Qualitätskontrolle) in Bezug auf die Technik, die verwendet wurde, um die mRNA-Spiegel zu messen. Eingabewerte müssen sich transformiert werden, am häufigsten ist log2. Kompilieren einer Tabelle mit Daten für alle Polysomen-assoziierten RNA-Proben und eine für alle zytosolischen RNA-Proben. Die erste Spalte ist die Gen-Identifikatoren, gefolgt von einer Datenspalte pro Probe enthalten; die erste Zeile sollten Namen für die Proben enthalten. Es ist entscheidend, dass die Tabellen identische Probe bestellen und identischen Gen Ordnung. Speichern Sie die Dateien als durch Tabulatoren getrennte Textdateien namens &quot;myPolysomeData.txt&quot; und &quot;myCytosolicData.txt&quot;. </li><li> In diesem Beispiel werden zwei Beispielklassen verwendet werden (Steuer oder kranken) mit 3 Wiederholungen pro Klasse, wodurch 6 Proben mit dieser Reihenfolge: C1, C2, C3, D1, D2, D3 in den beiden myCytosolicData.txt und myPolysomeData.txt-Dateien. Anota benötigt mindestens drei Wiederholungen pro Bedingung, wenn es zwei Beispielklassen. Diese sollten unabhängige biologische Wiederholungen sein. </li><li> Erstellen Sie ein Verzeichnis, das die Daten-Eingabedateien (myPolysomeData.txt und myCytosolicData.txt) enthält. Offene R aus diesem Verzeichnis. In Windows / Mac kann dies durch Kopieren eines R-Verknüpfung in dieses Verzeichnis und starten mit R diese Abkürzung durchgeführt werden (die direkte Arbeit kann auch über die Dropdown-Menüs geändert werden). </li><li> Erstellen Sie eine Datei namens myCode.R in das neu erstellte Verzeichnis und öffnen Sie sie mit einem Textbearbeitungssoftware. Schreiben Sie den Code in dieser Datei. </li><li> Um die Daten in R zu laden schreiben Sie den folgenden Code in die Datei myCode.R (denken Sie daran, erneut speichern Sie diese Datei nach jeder Zugabe von Code). Unten finden Sie eine Schritt-für-step Erklärung der Code, sondern den gesamten Code könnte auch zunächst und die Quellenfunktion geschrieben werden (das führt den Code, siehe unten) nur einmal verwendet: # # Dies lädt die Bibliothek anota Bibliothek (anota) # # Dies lädt Eingangsdaten in R dataCyto &lt;- as.matrix (read.table (&quot;myCytosolicData.txt&quot;, header = TRUE, row.names = 1, September = &quot; t&quot;)) dataPoly &lt;- as.matrix (read.table (&quot;myPolysomeData.txt&quot;, header = TRUE, row.names = 1, September = &quot; t&quot;)) </li><li> Führen Sie den Code in R, indem Sie direkt in die R-Terminal: Quelle (&quot;myCode.R&quot;) </li><li> Prüfen, ob die Daten erfolgreich, indem Sie (in den R-Anschluss) geladen: Kopf (dataCyto) # wird oben in der Tabelle zeigen dataCyto Kopf (dataPoly) </li></ol></li><li> Identifizierung der Gene unterschiedlich übersetzt: <ol><li> Erzeugen Sie einen Vektor, der beschreibt,die Proben Kategorien (ein Vektor ist eine Art von Objekt in R). Dieser Vektor sollte die Probe, um in der myPolysomeData.txt myCytosolicData.txt und zu reflektieren, so dass alle drei Objekte eine identische Reihenfolge der Proben. Der Vektor wird bei der Beauftragung anota, über die Proben zum Vergleich verwendet werden. Fügen Sie den folgenden auf die myCode.R Datei: # # Beachten Sie, dass die Wiederholungsproben identische Beispielklasse # # Beschreibungen (dh &quot;C&quot; oder &quot;D&quot;) in diesem Vektor. myPhenotypes &lt;- c (&quot;C&quot;, &quot;C&quot;, &quot;C&quot;, &quot;D&quot;, &quot;E&quot;, &quot;D&quot;) </li><li> Eine Qualitätskontrolle des Datensatzes. Es gibt eine Reihe von Qualitätsmaßen, die bewertet werden, bevor anota kann für die Analyse verwendet werden müssen. Diese sind im Detail in der anota Handbuch besprochen. Fügen Sie diesen Code myCode.R Datei und speichern: anotaQcOut &lt;- anotaPerformQc (DATAT = dataCyto, DataP = dataPoly,phenoVec = myPhenotypes) anotaResidOut &lt;- anotaResidOutlierTest (anotaQcObj = anotaQcOut) </li><li> Führen Sie den Code, indem Sie in die R-Terminal: Quelle (&quot;myCode.R&quot;) Dies wird eine Reihe von Ausgabedateien, die untersucht wie in der Anleitung beschrieben werden anota generieren. </li><li> Identifizieren unterschiedlich übersetzt Gene. Die Proben werden auf der Grundlage der alphabetischen Reihenfolge der auf den Parameter &quot;phenoVec&quot; (dh die &quot;myPhenotypes&quot; Vektor) geliefert, sofern sie nicht durch den Benutzer (mit dem Parameter &quot;Kontraste&quot;) angegeben sind Namen verglichen werden. Fügen Sie den folgenden Code, um Datei-und Abgang mit dem &quot;Quelle&quot;-Befehl innerhalb myCode.R die R-Terminal, wie oben beschrieben: anotaSigOut &lt;- anotaGetSigGenes (DATAT = dataCyto, DataP = dataPoly, phenoVec = myPhenotypes, anotaQcObj = anotaQcOut) </li><li> Verwenden Sie die Hilfe für anotaGetSigGenes zu verstehen, wie die output formatiert und sehen, wie man Probe Kategorien wählen, indem Sie (in der R-Anschluss) zu vergleichen: ? AnotaGetSigGenes </li><li> Filter und Grundstück Gene, die übersetzt werden. Es gibt mehrere Schwellenwerte, die innerhalb der anotaPlotSigGenes Funktion angewendet werden kann, und mit Hilfe eine benutzerdefinierte Kombination solcher Schwellenwerte zu vereinfachen. Um zuverlässig analysierten Gene wählen, gelten die minSlope (-0,5), maxSlope (1.5) und slopeP (0,01)-Einstellungen. Hinweis: Zusätzlich, Einstellungen der Anwendung zu RVM 23,26,30 False Discovery Rate (FDR) (0,15) und falten Änderungen (log2 [1.5]) kann zB verwendet werden, um Gene zu identifizieren unterschiedlich übersetzt werden. Andere Filter wie &quot;selDeltaPT&quot; kann für eine strengere Filterung (zB Einstellung selDeltaPT log2 [1.5]) sein. Es ist auch notwendig, um festzulegen, die den Vergleich sollte (mit dem Argument selCont) gefiltert werden. Übernehmen Sie die beschriebenen Einstellungen, indem Sie folgende Zeile in die myCode.RDatei: anotaSigFiltered &lt;- anotaPlotSigGenes (anotaSigObj = anotaSigOut, selContr = 1, minSlope = (-0,5), maxSlope = 1,5, slopeP = 0,01, maxRvmPAdj = 0,15, minEff = log2 (1.5) = selDeltaPT log2 (1.5)) </li><li> Führen die Analyse unter Verwendung der Quellenfunktion von der R-Klemme, wie oben beschrieben. Dies wird auch eine grafische Ausgabe erzeugen. Untersuchen Sie diese Ausgabe ist ein guter Ausgangspunkt, um die Leistung der Analyse zu bewerten und die notwendigen Änderungen an den Einstellungen zu identifizieren. </li><li> Generieren einer Ausgabetabelle. Fügen Sie den folgenden Code in die Datei myCode.R: write.table (anotaSigFiltered $ selectedRvmData, file = &quot;MySignificantGenes.txt&quot;, September = &quot; t&quot;) </li><li> Führen Sie den Code mit der Quellenfunktion in der R-Terminal. Die Spalten in der Ergebnistabelle sind in der Hilfe zum anotaPlotSigGenes Funktion erläutert. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Dieser Artikel beschreibt eine gut etablierte Polysom ​​Fraktionierung Protokoll gefolgt von einer in-house entwickelten Analyseverfahren für die Erfassung von qualitativen und quantitativen Veränderungen in der translationalen Aktivität auf einem genomweiten Maßstab in Säugerzellen. Für sollten erfolgreichen Abschluss dieses Protokoll besonders auf 1) Handy Konfluenz bezahlt werden (wie die Proliferationsraten und Nährstoffverfügbarkeit korrelieren mit mRNA-Translation-Aktivität und kann die Zusammensetzung der translatome beeinflussen, Zellkonfluenz sollte konsistent über Wiederholungen und experimentellen Bedingungen), 2) Schnelle Zelllyse (trotz der Gegenwart von Cycloheximid und RNAse-Inhibitoren in Puffer sollte Lyse schnell und Zellextrakten sollte Saccharose-Gradienten unmittelbar nach der Lyse zu RNA-Abbau und Dissoziation von Polysomen verhindern lagert werden), 3) verlaufend Herstellung (um sicherzustellen, hohe Daten Reproduzierbarkeit sollte Saccharose-Gradienten unter Verwendung des Gradienten-Hersteller und spe vorbereitet werdensoziale Sorgfalt sollte beim Umgang mit ihnen) entnommen werden. Neben der Untersuchung die Veränderungen in der translationalen Aktivität können dieses Protokoll verwendet, um Ribosomen-assoziierten Protein-Komplexe zu isolieren und ihre physiologischen Funktionen einzurichten. Zu diesem Zweck können Ebenen und Phosphorylierung verschiedener Ribosomen-assoziierten Proteinen, die durch TCA-Fällung bestimmt werden, gefolgt von Western-Blot, während Ribosomen-assoziierten Proteinkomplexen aus Gradientenfraktionen immunpräzipitiert und mittels Western-Blotting oder Massenspektrometrie analysiert werden. Ein Nachteil dieser Technik ist, dass die langsame Gradientenfraktion Methode könnte in Dissoziation von selbst fest gebundenen Proteine, deren Bindungs ​​Kinetik in schneller Verband / Dissoziation führen. Faktoren, die neu synthetisierten Polypeptiden assoziiert sind typische Beispiele. Neu synthetisierte Polypeptide Schwellen bilden die Ribosomen können Proteinkomplexe mit Ribosomen unter Verwendung chemischer Vernetzungsmittel, wie 3 zugeordnet immobilisiert, 3&#39;-Dithiobis [sulfosuccinimidylpropionat] (DTSSP) 31. Dieser Ansatz zeigte, dass der Rezeptor für aktivierte C Kinase 1 (RACK1) / c-Jun N-terminale Kinase (JNK) / Übersetzung eukaryotischen Elongationsfaktor 1A2 (eEF1A2)-Komplex reguliert Abbau von neu synthetisierten Polypeptide in Reaktion auf Stress 27. Darüber hinaus wurde eine ähnliche Methodik wie in Studien, die zeigen, dass die Proteinkinase C bII (PKCbII) an Ribosomen durch RACK1 32 und daß die Aktivierung des mTOR-Komplex 2 (mTORC2) rekrutiert tritt an den Ribosomen, wo es phosphoryliert neu synthetisierte Polypeptide AKT reguliert und verwendet ihre Stabilität 33,34. Haupteinschränkungen der Polysomen-Fraktionierungsverfahren gefolgt von anota Analyse sind: 1) Erfordernis einer relativ hohen Anzahl von Zellen (~ 15 × 10 6 Zellen), 2) das Fehlen von Positionsinformationen über die Lokalisierung des Ribosoms auf einer gegebenen mRNA-Moleküls, und 3 ) Fragen, die zellulären und molekularen Zusammenhang Heterogenität von Normal-und Tumorgewebe. Probleme, auf die erforderliche Zellzahl bezogen kann durch Ausrichten Absorptionsspektren Peaks, die monosomes (80S) von Zellen, deren Beträge werden mit denen von Hochfluss-Zellen erhalten (zB HeLa-Zellen) 35 Begrenzung gelöst werden. Ribosomen-Profiling-Technik (siehe unten) kann die genaue Position des Ribosoms auf einer gegebenen mRNA-Moleküls zu bestimmen, während Probleme Störfaktoren Wirkungen einer Gewebe Heterogenität über die Auslegung von Veränderungen in der Genexpression von komplexen Systemen wie menschlichen Geweben gewonnen Zusammenhang diskutiert im Detail in einer Veröffentlichung von Lauch und Storey 36. Kürzlich wurde eine neue Ribosomen Profitechnik entwickelt, bei der Ribosomen-geschützten Fragmente (RPF) von RNase I-Behandlung erzeugt und durch Tief Sequenzierung 22 analysiert. Dieses Verfahren ermöglicht die Bestimmung der Position des Ribosoms an einer einzelnen Nukleotid-Auflösung, wodurch bisher UNPRecedented Einblicke in Ribosomen Biologie. Zum Beispiel kann Ribosomen Profilierung zur Bestimmung der Ribosomendichte auf einer gegebenen mRNA-Moleküls oder die Identifizierung von Elementen verwendet werden, die Einfluss Translationsinitiationsraten wie die alternativen Initiierungsstellen, Initiierung bei nicht-Aug-Codons und regulatorischen Elementen wie uORFs. Es gibt jedoch einige methodische Einschränkungen, die die Fähigkeit des Ribosoms Profiling genau zu schätzen mRNA Translationseffizienz zu beschränken. Dazu gehören unabhängige Verzerrungen durch zufällige Fragmentierung und RNase-Verdau eingeführt, Vorurteile durch Übersetzung Inhibitoren (zB Dehnung Inhibitoren wie Emetin und Cycloheximid wahrscheinlich Ribosom Ansammlung an Translationsinitiationsstellen induzieren) eingeführt, eine große Anzahl von falsch-positiven und falsch-negativen Ergebnissen verbunden mit TE-Scores sowie deren Ungenauigkeit bei der Vorhersage der liest, dass von Protein-kodierenden mRNAs 37 stammen. Vielleicht am wichtigsten ist, währendRibosomen Profilierung ermöglicht eine direkte Identifizierung der Ribosomen Position auf einer gegebenen mRNA-Moleküls, ist die Anzahl der Ribosomen, die mit einer gegebenen mRNA assoziiert wird indirekt durch Normalisieren Frequenzen liest RPF (Ribosomen-assoziierten mRNA) über die in zufällig fragmentiert mRNAs beobachtet (geschätzte Gesamt mRNA). Zum Beispiel wird in einer einfachen, in dem vier &quot;B&quot;-mRNA-Moleküle (Ba, Bb, Bc und Bd) werden durch vier Ribosomen an den Positionen 1, 2, 3 und 4 ist ein inhärenter Nachteil des Ribosoms Profiling-Technik ermöglicht nicht besetzt eine Unterscheidung zwischen einem Szenario, bei dem alle 4 Ribosomen assoziieren nur mit einem Ba-mRNA in den Positionen 1, 2, 3 und 4 und einem Szenario, Ba, Bb, Bc und Bd mRNA sind jeweils durch eine einzige Ribosomen an der Position 1, 2 besetzt , 3 und 4. Im Gegensatz dazu während der Polysomen-Fraktionierung wird Polysomen Integrität bewahrt, wodurch eine Isolierung des Pools von mRNAs mit einer definierten Anzahl von Ribosomen (Fig. 1) verbunden. Dieser Important Unterscheidung zwischen Polysom ​​Fraktionierung und Ribosom Profilierung schlägt vor, dass, während die erste Methode verwendet werden, um direkt vergleichen mRNAs in mRNP werden, leichte und schwere Polysom ​​Fraktionen, die letztere Methode wird wahrscheinlich nicht zu Veränderungen in der translatome, die von mRNAs, die verursacht werden, zu erfassen Übergang von Leichte bis schwere Polysomen, während Überschätzung der Beitrag von denen, die von der Fraktion auf mRNP schweren Polysomen verschieben. Die biologische Bedeutung dieser Abweichungen zwischen den vorgenannten Verfahren ist von einer großen Menge an Daten, die zeigen, dass Translations Aktivierung einer Untergruppe von mRNAs, wie jene, die eIF4E-empfindlich sind unterstrichen, Übergang von leicht bis schwer Polysomen, während andere, wie die Beherbergung 5&#39;TOP Elemente, um schwere Polysomen direkt aus Pools von Ribosomen-mRNA frei 6 rekrutiert. Interessanterweise ist die mTOR wurde gezeigt, gleichzeitig modulieren Übersetzung von &quot;eIF4E empfindlich&quot; und 5&#39;TOP mRNAs 11. Daher kann methodischen Unterschieden, die oben diskutiert sind die scheinbare Unstimmigkeit des Abschlusses zwischen Studien mit Ribosomen-Profilierung 38,39 und 24 Polysomen-Fraktionierung, um die Auswirkungen von mTOR Inhibition am translatome beurteilen zu erklären. Abschließend Polysomen-Fraktionierung und Ribosom Profilierung komplementär sind Methoden, die in erster Linie Informationen über die Anzahl der Ribosomen-mRNA und die Position des Ribosoms an mRNA zugeordnet sind. Wichtig ist, dass trotz der Mängel und Vorteile dieser Verfahren ist es wesentlich, daß die genomweite Daten von beiden Verfahren erhalten werden, ausreichend analysiert und funktionell und biochemisch bestätigt.

Die regulatorischen Netzwerke, die die Genexpression steuern, sind ausführlich in den letzten zwei Jahrzehnten untersucht. Die überwiegende Mehrheit dieser Forschung auf Transkriptionsregulation, wobei Änderungen in der Steady-State-mRNA-Spiegel auf einem genomweiten Maßstab wurden verwendet, um so genannte &quot;Gen-Expression&quot;-Profile bestimmen, konzentriert. Neuere Studien zeigen, dass stationäre mRNA-Spiegel nur lose mit der Zusammensetzung des Proteoms 1,2 entsprechen, wodurch angezeigt wird, dass die post-transkriptionale Mechanismen, einschließlich mRNA-Translation, spielen eine wichtige Rolle in der Regulation der Genexpression 3,4. Tatsächlich wird geschätzt, dass ~ 50% der Protein-Ebene auf der Ebene der mRNA-Translation in immortalisierten Mausfibroblasten 5 bestimmt. mRNA-Translation ist ein hoch regulierter Prozess, bei dem mRNAs werden über orchestrierte Aktion von Ribosomen, Transfer-RNAs (tRNAs) und Hilfsfaktoren Zusammenarbeit in Proteine ​​übersetztmmonly als Übersetzungsfaktoren (TFs) 6 bezeichnet. Die Proteinsynthese ist die energieverbrauchenden Prozess in Säugetierzellen 7 und damit globale mRNA Umrechnungskurse werden eingestellt, um die Verfügbarkeit von Nährstoffen und Zellproliferationsraten 8 zubringen. Neben den Veränderungen in der globalen mRNA Umrechnungskurse, verschiedene extrazelluläre Stimuli (z. B. Hormone und Wachstumsfaktoren), intrazelluläre Signale (zB Aminosäurespiegel) und verschiedene Arten von Stress (z. B. ER-Stress) induzieren selektive Veränderungen in den Pools von mRNAs, die sind übersetzt (translatome) 6. Abhängig von der Art des Reizes, Translationsaktivität von einigen, aber nicht alle mRNAs dramatisch beeinflusst, was zu Veränderungen im Proteom, die erforderlich sind, um eine schnelle zelluläre Reaktion 6 zu montieren. Diese qualitative und quantitative Veränderungen in der translatome gedacht werden, um durch das Zusammenspiel zwischen trans-wirkende Faktoren (vermittelt werden, z. B. </em&gt; Komponenten der Translationsmaschinerie, Hilfsfaktoren oder miRNAs) und cis-Elemente (RNA Elemente oder Merkmale) in ausgewählten Teilmengen von 6,9 mRNAs vorhanden. Zum Beispiel Veränderungen in der Höhe und / oder Aktivität von geschwindigkeitsbegrenzenden Translationsinitiationsfaktoren eIF4E und eIF2 selektiv modulieren Übersetzung von Transkripten auf die spezifischen Merkmale 5&#39;UTR 6. eIF4E und eIF2 sind für die Rekrutierung von mRNA und Initiator-tRNA zum Ribosom erforderlich, bzw. 6. Eine Zunahme der Aktivität selektiv eIF4E Wangen Translation von mRNAs beherbergen lang und stark strukturierten 5&#39;UTRs einschließlich der Codierung Proliferation und Überleben stimulierende Proteine, einschließlich Cycline, c-myc-und Bcl-xL-10. Im Gegenzug Inaktivierung von eIF2 führt zu einer globalen Proteinsynthese Abschaltung, während selektiv Regel Übersetzung von mRNAs, die kurze hemmende aufwärts offenen Leserahmen (uORFs) in ihrer 5&#39;UTRs, wie solche Codierung Master transcriptional Regulatoren des ungefalteten Protein-Reaktion (z. B. ATF4). Als Reaktion auf verschiedene Reize wie Nährstoffe, Wachstumsfaktoren und Hormone, die mechanistische / mammalian target of Rapamycin (mTOR)-Weg stimuliert eIF4E-Aktivität durch Inaktivierung des 4E-Bindungsprotein (4E-BP)-Familie von Übersetzungsunterdrücker, während die MAPK-Weg direkt phosphoryliert EIF4E 6,11. Im Gegenzug eIF2a Kinasen (dh Perk, PKR, HRI und GCN2) hemmen eIF2 durch Phosphorylierung seiner eIF2a regulatorischen Untereinheit in Reaktion auf einen Nährstoffmangel, ER-Stress-und Virus-Infektion 6,12. Veränderungen in der Aktivität und / oder Expression von Transkriptionsfaktoren, haben andere Komponenten der Translationsmaschinerie und regulatorische Faktoren miRNAs in verschiedenen Krankheitszuständen, einschließlich Krebs, Stoffwechselsyndrome, neurologischer und psychiatrischer Erkrankungen und Nierenerkrankungen und Herz-Kreislauf 13-19 beobachtet. Insgesamt zeigen diese Daten, dass mir translationalenismen spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Zell-Homöostase und dass ihre Aufhebung spielt eine zentrale Rolle in der Ätiologie der verschiedenen menschlichen Krankheiten. Hierin wird ein Protokoll für die Fraktionierung von Polysomen durch Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation in Säugerzellen, die verwendet wird, um von Polysomen monosomes, ribosomalen Untereinheiten und Messenger Ribonukleoproteinpartikel (mRNPs) getrennt beschrieben. Dies ermöglicht die Unterscheidung zwischen effizient übersetzt (mit schweren Polysomen assoziiert) von schlecht übersetzt (mit Licht Polysomen assoziiert) mRNAs. In diesem Assay werden Ribosomen auf der mRNA mit immobilisierten Translationselongation Inhibitoren wie Cycloheximid 20 und cytosolische Extrakte werden auf 5-50% linearen Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation getrennt durch. Anschließende Fraktionierung Saccharosegradienten erlaubt die Isolierung von mRNA nach der Zahl von Ribosomen sie zu binden. RNA aus jeder Fraktion extrahiert können dann verwendet werden, um zu bestimmen,Veränderungen in der Verteilung der mRNAs für die Gradienten zwischen unterschiedlichen Bedingungen, wobei die Translationseffizienz nimmt von der Oberseite zur Unterseite des Gradienten. Northern Blotting oder quantitative reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) verwendet werden, um Niveaus von mRNA in jeder Fraktion zu bestimmen. Alternativ Fraktionen mit schweren Polysomen (in der Regel mehr als 3 Ribosomen) werden gesammelt und Genom-weiten Polysomen-assoziierter mRNA-Spiegel werden mittels Microarray-oder Tief Sequenzierung bestimmt. Es ist von größter Wichtigkeit zu betonen, dass das Niveau der Polysom ​​assoziierte mRNAs sind, zusätzlich zur Übersetzung von Transkriptions-und post-transkriptionale Mechanismen, die cytosolische mRNAs 21 Ebenen beeinflussen betroffen. Deshalb, um Unterschiede in der Übersetzung mit genomweiten Daten von Polysomen-assoziierten mRNA zu bestimmen, ist es notwendig, die Auswirkungen der Schritte der Genexpression Weg, der stromaufwärts des Translations sind korrigierention 21. Um eine solche Korrektur zu ermöglichen, wird zytosolischen RNA parallel Polysom-assoziierten RNA von jeder Probe und der Genom-weiten Steady-State-mRNA-Mengen hergestellt werden, bestimmt 21. Derzeit sogenannten &quot;Übersetzung Effizienz&quot; (TE) Bewertung (dh die Log-Verhältnis von Polysomen-assoziierten mRNA-Daten und cytosolische mRNA-Daten) werden oft verwendet, um die Effekte von Änderungen der cytosolischen mRNA-Mengen auf die Translationseffizienz eines korrekten 22 mRNA gegeben. Allerdings mit TE-Scores zu identifizieren Differential Übersetzung ist mit einer beträchtlichen Zahl von falsch positiven und falsch negativen Befunde durch eine mathematische Eigenschaft der TE-Partituren allgemein als Scheinkorrelation 27 Absatz verbunden. In der Tat eine Erhebung von Datensätzen aus verschiedenen Labors gezeigt, dass solche Scheinkorrelationen scheint unvermeidlich zu sein, wenn die Analyse von Veränderungen in den translatomes 23. Dies veranlasste Entwicklung der &quot;Analyse der Differenz tr<html> anslation &quot;(anota)-Algorithmus, der nicht von den vorgenannten Unzulänglichkeiten 23 leidet. Während anota-Analyse ein Regressionsmodell wird verwendet, um Maßnahmen der translationalen Aktivität unabhängig von zytosolischen RNA-Werte abzuleiten. Solche Maßnahmen werden dann zwischen den Bedingungen und eine Statistik berechnet wird, verglichen. Der Benutzer hat die Möglichkeit der Anwendung einer Schrumpfung Varianz-Methode, die statistische Aussagekraft verbessert und reduziert das Auftreten von falsch-positive Ergebnisse aus Studien mit wenigen Wiederholungen 24. Bezeichnenderweise wurde kürzlich gezeigt, dass Störungen in der translatome durch anota erfasst, aber nicht TE Partituren, korrelieren mit Veränderungen im Proteom 25. Es wird daher dringend empfohlen, anota Analyse zur Identifizierung von Änderungen in der Übersetzung auf einem genomweiten Maßstab gelten. Während die theoretischen Grundlagen der anota Algorithmus wurden zuvor im Detail diskutiert 21,23,26, Schwerpunkt liegt hier auf, wie es in der Praxis anzuwenden. ve_content &quot;&gt; Zusätzlich zu der Untersuchung von Veränderungen in der mRNA-Übersetzung Aktivität in der Zelle, kann diese Ribosomen Fraktionierung Protokoll zur Isolierung und funktionell und biochemisch zu charakterisieren Ribosomen und Polysomen-assoziierten Protein-Komplexe werden. Dieser Ansatz hat sich in der Vergangenheit erfolgreich zu identifizieren, im Einsatz Komplexe, die die Stabilität von neu synthetisierten Polypeptiden, 27 und / oder der Phosphorylierung von Komponenten des Translationsmaschinerie beteiligt regulieren. Diese Anwendung der Polysomen-Fraktionierungsverfahren wird auch kurz beschrieben werden.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Biobasic</td><td>HB0264</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>CABDH4532</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Biobasic</td><td>DB0058</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Biobasic</td><td>TB0196</td><td></td></tr><tr><td>Glycoblue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td>RNA-Fällungsträger</td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximid</td><td>Sigma</td><td>C1988</td><td></td></tr><tr><td>Proteasehemmer Cocktail</td><td>Roche</td><td>04693132001</td><td>Tabletten (EDTA-frei)</td></tr><tr><td>RNase-Hemmer&nbsp;</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>0,45 & Mikro m Filtersystem 150 ml</td><td>Corning</td><td>431155</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Cleanup Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>RNA-Aufreinigungskit</td></tr><tr><td>Dünnwandige Polyallomer-Ultrazentrifugenröhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>SW41Ti Rotorpaket mit Zubehör</td><td>Beckman Coulter</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>Optima L100 XP ultra Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>DS-9340A</td><td></td></tr><tr><td>ISCO Fraktionssammler&nbsp;</td><td>Brandel</td><td>FC-176-R1</td><td></td></tr><tr><td>Typ II Detektor mit Diagrammschreiber</td><td>Brandel</td><td>UA-6 UV-Detektor</td><td></td></tr><tr><td>Tube Piercer mit Durchflusszelle und Spritzenpumpe</td><td>Brandel</td><td>BR-A86-5</td><td></td></tr><tr><td>UA-6 Detektorkabel</td><td>Brandel</td><td>60-1020-211</td><td></td></tr><tr><td>FC-176 Kommunikationskabel</td><td>Brandel</td><td>FCC-176</td><td></td></tr><tr><td>Gradient Master Base Unit</td><td>Biocomp</td><td>108-1</td><td>Gradient Maker</td></tr><tr><td>Gradient Forming Anbaugeräte</td><td>Biocomp</td><td>105-914A-1R</td><td>Gradient Maker Anbaugerät</td></tr><tr><td>Measurement Computing 8-Kanal 50 kHz Datenerfassungsgerät</td><td>MicroDAQ</td><td>USB-1208FS</td><td>Analysesoftware Anbaugerät</td></tr><tr><td>Measurement Computing Datenerfassungssoftware</td><td>MicroDAQ</td><td>TracerDAQ Pro</td><td>Analysesoftware (nur Download)</td></tr><tr><td>10x Puffer für Saccharosegradienten:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>200 mM HEPES (pH7,6)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM MgCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 & Mikro; g/ml Cycloheximid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x Proteaseinhibitor-Cocktail (EDTA-frei)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 Einheiten/ml RNase-Inhibitor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lysepuffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mM Tris-HCl (pH7,5)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,5 mM MgCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mM KCl&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x Proteaseinhibitor-Cocktail (EDTA-frei)]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dann Cycloheximid (CHX), DTT, RNAse-Inhibitor, Triton und Natriumdesoxycholat hinzufügen, wie im Haupttext</td><td></td><td></td><td></td> angegeben</tr></tbody></table>

polysomprofile fraktionierung und analyse von säuger translatomes auf einer genom-weite skala

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA-Translation spielt eine zentrale Rolle bei der Regulation der Genexpression und repräsentiert die Energie verbrauchenden Verfahren in Säugerzellen. Dementsprechend ist eine Fehlregulation der mRNA-Übersetzung als eine wichtige Rolle in einer Vielzahl von pathologischen Zuständen wie Krebs spielen. Ribosomen hosten auch Chaperone, die Faltung des entstehenden Polypeptide zu erleichtern, damit Funktion und Stabilität von neu synthetisierten Polypeptide modulieren. Zusätzlich Schwellen Daten zeigen, dass Ribosomen dienen als Plattform für ein Repertoire von Signalmolekülen, die in einer Vielzahl von post-translationalen Modifikationen von neu synthetisierten Polypeptiden beteiligt sind, wie sie aus dem Ribosom hervorgehen, und / oder Komponenten der Translationsmaschinerie. Hierin ist ein gut etabliertes Verfahren zur Ribosomen Fraktionierung unter Verwendung von Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation beschrieben. In Verbindung mit der in-house entwickelten &quot;anota&quot;-Algorithmus diese Methode erlaubt die direkte Bestimmung der verschierenz Übersetzung der einzelnen mRNAs auf einem genomweiten Maßstab. Darüber hinaus kann diese vielseitige Protokoll für eine Vielzahl von biochemischen Untersuchungen mit dem Ziel, die Funktion der Ribosomen-assoziierten Proteinkomplexen, einschließlich derjenigen, die in Falz-und Abbau von neu synthetisierten Polypeptiden eine zentrale Rolle spielen, zu sezieren verwendet werden.

mTOR ist ein wichtiger Knotenpunkt des globalen Mobilfunknetz, die Proteinsyntheserate mit Nährstoffverfügbarkeit 19 koordiniert. mRNA-Translation wird vor allem an der geschwindigkeitsbestimmende Schritt Einleitung 6 geregelt. Der Anteil der Ribosomen in Polysomen engagiert positiv korreliert mit Translationsinitiationsraten 28. Ein Beispiel der Anwendung der Polysomen-Fraktionierungsverfahren, die Rolle des mTOR-Signalweg in die Vermittlung der Wirkung von Insulin auf die mRNA-Translation zu untersuchen dargestellt. Zu diesem Zweck wurden MCF7-Brustkrebszellen in niedrigen Serum gehalten und dann mit Insulin allein oder in Kombination mit dem aktiven Zentrum mTOR Inhibitor Torin1 stimuliert. Nicht-stimulierten Zellen, die kontinuierlich in niedrigen Serum gehalten wurden, dienten als Kontrolle. mRNPs, monosome (80S) und Polysomen-Fraktionen wurden unter Verwendung der Polysomen-Fraktionierungsverfahren getrennt. Relativ zu den Kontrollzellen induzierte Insulin eine Zunahme der Absorption in Gradientenfraktionen entsprechendePolysomen an, begleitet von einer gleichzeitigen Abnahme der Extinktion im monosome Fraktion (Abbildung 1). Diese Ergebnisse zeigen, dass der Anteil der Ribosomen in Polysomen Eingriff ist in der Insulin im Vergleich zu Kontrollzellen behandelt, erhöht daher darauf hinweist, dass, wie erwartet, stimuliert die Insulin globalen Translationsinitiationsraten. Torin1 umgekehrt die Wirkung von Insulin auf die Absorptionsprofile (Fig. 1), wodurch die übereinstimmende Ergebnisse, dass mTOR Signalisierung spielt eine wichtige Rolle bei der Vermittlung der Wirkungen von Insulin auf den Translationsmechanismus 19. Basierend auf einem Grundsatz, dass die Unstimmigkeiten in Gradienten Vorbereitung nicht vermieden werden kann, sind Fragen wurden in Bezug auf die Reproduzierbarkeit der mit der Polysom ​​Fraktionierungsmethode 22 erhaltenen Daten erhöht. Um dieses Problem möglicherweise schädlichen, cytosolische und schwere Polysom-assoziierten RNA (mRNA mit 4 und mehr Ribosomen assoziiert) empirisch zu testen, wurden isoliert<html> von MCF7-Zellen mit Insulin allein oder in Kombination mit Insulin Torin1 aus 4 unabhängigen biologischen Wiederholungen (Fig. 2) behandelt. Die Wirkung von Insulin und Torin1 über die Zusammensetzung der cytosolischen und schwere Polysom-assoziierten mRNA in jeder Wiederholung wurde auf einem genomweiten Maßstab unter Verwendung eines Mikroarray-Ansatz bestimmt. Um die Reproduzierbarkeit der Polysomen-Fraktionierungsverfahren die Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurde angewendet bestimmen. Eine derartige Analyse zeigte, daß die Proben auf die jeweilige Gegebengehör wurden eng in die beiden ersten Komponenten angeordnet, während die anderen Bedingungen waren gut getrennt (Fig. 2). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Fraktionierung Polysom ​​Verfahren wie hier beschrieben wird, ist in hohem Maße reproduzierbar und daher angebracht, quantitative und qualitative Veränderungen in der Übersetzung auf einer Genom-weiten Ebene zu studieren. ad/51455/51455fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51455/51455fig1.jpg &quot;/&gt; Fig. 1 ist. Polysomen-Profile, welche die Effekte von Serumentzug, Insulin und mTOR Signalisierung auf globale Translation in MCF7-Zellen. MCF7-Zellen wurden von Nährstoffen (in 0,1% FBS) für 16 Stunden entzogen und mit 5 nM Insulin (Ins) allein oder behandelt in Kombination mit 250 nM Torin1 (Ins + Torin1) für 4 Stunden. Unbehandelte Zellen, die kontinuierlich von Nährstoffen (0,1% FBS) entzogen wurden, wurden als Kontrolle verwendet. Die entsprechenden cytosolischen Extrakte wurden durch Zentrifugation auf 5-50% Saccharose-Gradienten sedimentiert. Kostenlose ribosomalen Untereinheiten (40S und 60S), monosomes (80S) und Anzahl der Ribosomen in den Polysom ​​Fraktionen sind angegeben. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2.jpg" /> Abbildung 2. Verwendung von p erhalten Genom-weite Datenolysome Profilierung ist in hohem Maße reproduzierbar. MCF7-Zellen wurden, wie in 1. cytosolische und Polysomen-assoziierten RNA (&gt; 3 Ribosomen) wurde aus 4 unabhängigen biologischen Replikaten und deren Genom-weiten-mRNA-Spiegel wurden unter Verwendung von extrahierten GeneTitan Arrays (Affymetrix) bestimmt behandelt. PCA wurde verwendet, um die Reproduzierbarkeit der erhaltenen Daten zu bewerten. Gezeigt werden die ersten beiden PCA-Komponenten für alle Behandlungen (T1 = Torin 1; ctrl = Kontrolle; Ins = Insulin), Ursprung der RNA (C = cytosolische, p = Polysom-assoziiert) und repliziert. Die Proben aus den gleichen Bedingungen und RNA Herkunft sind eng positioniert was eine hohe Reproduzierbarkeit.

Ribosomen spielen eine zentrale Rolle bei der Proteinsynthese. Polyribosom (Polysomen) Fraktionierung durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation ermöglicht die direkte Bestimmung der Übersetzung Effizienz einzelner mRNAs auf einem genomweiten Maßstab. Darüber hinaus kann dieses Verfahren für die biochemische Analyse von Ribosomen und Polysomen-assoziierten Faktoren wie Chaperone und Signalmolekülen verwendet werden.

Polysomprofile Fraktionierung und Analyse von Säuger Translatomes auf einer Genom-weite Skala

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, translatierende Ribosomen (Polysomen) zu isolieren, um Veränderungen in der mRNA-Translationsaktivität in der Zelle untersuchen zu können. Dies wird erreicht, indem Cycloheximid dem Wachstumsmedium zugesetzt wird, um die Ribosomen am mRNA-Molekül festzuhalten und so ein Abwandern der Ribosomen zu verhindern. Im zweiten Schritt werden Ribosomen aus den Zellen gewonnen und gemäß ihrer Dichte durch Zentrifugation in einer Saccharosedichtegradienten getrennt, um freie ribosomale Untereinheiten (40 S und 60 S), Monosomen sowie translatierende Ribosomen (Polysomen) zu quantifizieren und zu isolieren.Anschließend können RNAs oder Proteine aus den Saccharose-Fraktionen isoliert werden, um die Menge der mRNA und der Proteine in den Prä- und Polysomen-Fraktionen zu analysieren. Die Ergebnisse zeigen quantitative und qualitative Veränderungen in der mRNA-Translation, die mithilfe von Microarrays oder der Next-Generation-RNA-Sequenzierung auf genomweiter Ebene untersucht und mit einem NoDa-Algorithmus ausgewertet werden können. Die Poison-Profiling-Methode kann verwendet werden, um wichtige Fragen zur Regulation der Genexpression auf posttranskriptioneller Ebene zu beantworten, wie beispielsweise die Überwachung von Veränderungen in der mRNA-Translation auf genomweiter Ebene sowie die Assoziation von Proteinen mit Ribosomen und Polysomen.Valentina Gand, wissenschaftliche Mitarbeiterin in unserem Labor, wird diese Technik demonstrieren. Beginnen Sie damit, 100 Milliliter einer 60 %iger (Gewicht pro Volumen) Saccharoselösung in deionisiertem destilliertem Wasser herzustellen und filtrieren Sie die Lösung anschließend durch einen 0,22-Mikrometer-Filter. Verdünnen Sie danach die 60 %ige Saccharoselösung in einem 1× Saccharose-Gradientenpuffer, um jeweils 40 Milliliter einer 5 %igen und einer 50 %igen Saccharoselösung herzustellen. Verwenden Sie den mit der Gradienteneinheit mitgelieferten Markierungsblock, um die Halbvollmarkierung auf sechs Polyamid-Ultrazentrifugenröhrchen anzubringen.Verwenden Sie dann das Schichtungsgerät, um eine 5%ige Saccharoslösung bis zur halbvollen Markierung hinzuzufügen. Fügen Sie anschließend die 50%ige Saccharoslösung bis zum Boden des Röhrchens hinzu, bis die Grenzfläche der beiden Lösungen die halbvolle Markierung erreicht. Verschließen Sie die Röhrchen mit Rate-Zonal-Kappen und stellen Sie sie in den Röhrchenhalter des Gradientenherstellers. Betreiben Sie den Gradientenhersteller, um einen linearen Gradienten von 5% bis 50% zu erhalten. Der Gradientenhersteller rotiert die Röhrchen unter einem hohen Neigungswinkel, wodurch innerhalb weniger Minuten sechs lineare Gradienten gebildet werden.Am Tag des Experiments sollten die Zellen etwa 80 % konfluent sein. Behandeln Sie die Zellen mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Cycloheximid in Wachstumsmedium und inkubieren Sie fünf Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Waschen Sie die Zellen zweimal mit je 10 Milliliter eiskaltem PBS, das 100 Mikrogramm pro Milliliter Cycloheximid enthält. Geben Sie anschließend weitere fünf Milliliter der eiskalten PBS-Lösung hinzu.Die Zellen abkratzen und die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Gefäß überführen, um die Zellen bei 200 × g fünf Minuten bei vier Grad Celsius zu zentrifugieren. Danach den Überstand verwerfen und die Zellen in 425 Mikroliter hypotonischem Lysepuffer resuspendieren. Anschließend fünf Mikroliter einer 10 Milligramm pro Milliliter Cycloheximid-Lösung, ein Mikroliter einer einmolarigen DTT-Lösung und 100 Einheiten eines RNase-Inhibitors zur Zellsuspension hinzufügen.Versetzen Sie die Lösung anschließend fünf Sekunden lang im Vortex. Ergänzen Sie die Zellsuspension mit 25 µL 10 % Triton X und 125 µL 10 % Natriumdesoxycholat und versetzen Sie erneut fünf Sekunden lang im Vortex. Anschließend zentrifugieren Sie die Lysate sieben Minuten lang bei 16.000 ×g und 4 °C.Überführen Sie das Überstand in ein neues vorab gekühltes 1,5-Milliliter-Röhrchen und heben Sie 10 % des Lysats als Kontrolle zur Messung der steady-state-mRNA-Spiegel auf. Messen Sie den OD bei 260 Nanometern für jede Lysatprobe und stellen Sie anschließend den OD in hypotonischem Lysispuffer auf denselben Wert ein, wobei ein Endvolumen von 500 Mikrolitern eingehalten wird. Entnehmen Sie 500 Mikroliter von der Oberseite der Saccharosegradienten und pipettieren Sie die angepassten Lysatproben jeweils auf die Oberseite der Gradienten. Als Nächstes jede Gradientenröhre wiegen und ausbalancieren. Die Röhrchen in einen SW 41 TI-Rotor geben und die Ultrazentrifuge auf niedrige Bremsstufe stellen. Anschließend die Proben bei 222.228 ×g für zwei Stunden bei vier Grad Celsius zentrifugieren.Wenn die Ultrazentrifugation abgeschlossen ist, die Gradientenröhrchen vorsichtig aus dem Rotor nehmen und auf Eis stellen. Zunächst den Fraktionensammler mit zwei Milliliter sammelnden Röhrchen füllen. Anschließend die Computerpumpe, den UV-Detektor und den Fraktionensammler eine halbe Stunde vor dem Sammeln der Fraktionen einschalten.Stellen Sie die Pumpe auf drei Milliliter pro Minute ein und füllen Sie die Leitung mit einer Nachspüllösung, um die Luft im System zu entfernen. Leiten Sie die Nachspüllösung durch die Leitung, bis ein Tropfen aus der Nadel austritt. Öffnen Sie die Analyse-Software.Stellen Sie dann die Empfindlichkeit auf plus oder minus 10 Millielektronenvolt und die Zeitbasis auf 100 Sekunden ein. Platzieren Sie das Ultrazentrifugenröhrchen in den UV-Detektor und stellen Sie sicher, dass sich das Röhrchen in der orthogonalen Position befindet. Drehen Sie anschließend den Knopf unter dem Röhrchenhalter, um das Röhrchen mit der Nadel zu durchstechen.Stellen Sie die Pumpenflussrate auf 1,5 Milliliter pro Minute ein und konfigurieren Sie den Fraktionssammler so, dass alle 30 Sekunden Fraktionen gesammelt werden, was jeweils 750 Mikroliter pro Fraktion entspricht. Bringen Sie die Pumpe in die Fernbedienungsposition. Starten Sie dann die Pumpe und den Fraktionssammler und beginnen Sie gleichzeitig mit der Aufzeichnung mithilfe des DAQ-Tracers.Wenn die erste Tropfen der Nachwaschlösung in ein Sammelröhrchen tropft, stoppen Sie die Pumpe und den DAQ-Tracer. Geben Sie gleichzeitig 750 Mikroliter Triol zu jedem gesammelten Fraktion und flashen Sie. Gefrieren Sie die Fraktionen in flüssigem Stickstoff ein.Befolgen Sie anschließend die Anweisungen des Herstellers, um die mit Polysomen assoziierte und zytosolische RNA aus den Proben zu isolieren. Die Polysomfraktionierung wurde verwendet, um die translatorische Aktivität von C sieben Brustkrebszellen, die mit Insulin behandelt wurden, zu bewerten. Der Anteil an Polysomen stieg bei Insulinbehandlung im Vergleich zu Kontrollzellen sowie zu Zellen, die mit dem mTOR-Inhibitor Torin eins behandelt wurden.Dieses Ergebnis zeigt, dass Insulin die globale Initiierung der Translation in mc-sieben-Zellen stimuliert. Die Ergebnisse aus vier unabhängigen Versuchen des Insulinexperiments wurden verwendet, um die Reproduzierbarkeit dieser Polysom-Fraktionierungsmethode zu bewerten. Die Proben aus denselben Behandlungsbedingungen und mit derselben RNA-Herkunft liegen auf diesem Graphen eng beieinander, was auf eine hohe Reproduzierbarkeit hinweist.Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen lysiert, Saccharose präpariert, Gradienten herstellt und schließlich fraktionierte Ribosomen sammelt. Dieses Protokoll ermöglicht es Ihnen, die Genexpression auf posttranskriptioneller Ebene zu analysieren.

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Biologie

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Extraktion des Übersetzens Ribosomen aus eukaryotischen Zellen. Sobald extrahiert, Ribosomen in monosomes und Polyribosomen durch Saccharose-Gradienten Fraktionierung getrennt, um verschiedene ribosomale Populationen analysiert werden. Als solche ist diese Methode der Goldstandard für die Untersuchung der Regulation der Translation.

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Polysomenprofilierung ohne Gradientenerzeuger oder Fraktionierungssysteme

Das hier vorgestellte Protokoll beinhaltet polysomales Profiling zur Isolierung von Translatomen, mRNAs, die mit Ribosomen assoziiert sind, in nicht-polysomale und polysomale RNAs aus Arabidopsis durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation. Diese Methode demonstriert die Translationseffizienz von hitzegestresstem Arabidopsis.

Translationseffizienztest mit Polysomenprofilen unter Hitzebelastung

Erfahren Sie die Polysomfraktionierung zur Analyse von mRNA-Translation in Säugetierzellen. Diese Methode nutzt Cycloheximid und Saccharose-Dichtegradienten, um Ribosomen zu isolieren und Genexpressionsänderungen genomweit zu untersuchen.

Polysomprofile Fraktionierung und Analyse von Säuger Translatomes auf einer Genom-weite Skala

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