Name: Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-20T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Lernen Sie eine Methode zur Induktion langfristiger Veränderungen astrozytärer GPCR-Signalwege durch Manipulation neuronaler Feuerraten in akuten Hippocampus-Schnitten von Mäusen. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung astrozytärer Rezeptorplastizität.

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Die Autoren bedanken sich bei UC Riverside Center for Neuronal Gliazellen-Interaktionen für wertvolle Diskussion der Skalierung Protokolle und Daten zu bestätigen. Die Autoren möchten auch ein aufrichtiges Dankeschön an Abcam für das Sponsoring der Veröffentlichung ihrer Arbeit zu geben.

<ol><li>Araque, A., Martin, E. D., Perea, G., Arellano, J. I., Buno, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+acetylcholine+evokes+Ca2%2B+elevations+in+astrocytes+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptically released acetylcholine evokes Ca2+ elevations in astrocytes in hippocampal slices.</a> J. Neurosci. 22, 2443-2450 (2002).</li>
<li>Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+mediate+neuron-astrocyte+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids mediate neuron-astrocyte communication.</a> Neuron. 57, 883-893 (2008).</li>
<li>Bekar, L. K., He, W., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus+coeruleus+alpha-adrenergic-mediated+activation+of+cortical+astrocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb.+Cortex%22%5BJournal%5D)">Locus coeruleus alpha-adrenergic-mediated activation of cortical astrocytes in vivo.</a> Cereb. Cortex. 18, 2789-2795 (2008).</li>
<li>Hertz, L., Lovatt, D., Goldman, S. A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenoceptors+in+brain%3A+cellular+gene+expression+and+effects+on+astrocytic+metabolism+and+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem.+Int%22%5BJournal%5D)">Adrenoceptors in brain: cellular gene expression and effects on astrocytic metabolism and Ca2.</a> Neurochem. Int. 57, 411-420 (2010).</li>
<li>Porter, J. T., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+astrocytes+in+situ+respond+to+glutamate+released+from+synaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hippocampal astrocytes in situ respond to glutamate released from synaptic terminals.</a> J. Neurosci. 16, 5073-5081 (1996).</li>
<li>Bernardinelli, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+display+complex+and+localized+calcium+responses+to+single-neuron+stimulation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes display complex and localized calcium responses to single-neuron stimulation in the hippocampus.</a> J. Neurosci. 31, 8905-8919 (2011).</li>
<li>Panatier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+are+endogenous+regulators+of+basal+transmission+at+central+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses.</a> Cell. 146, 785-798 (2011).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+Ca2%2B+signaling+evoked+by+sensory+stimulation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo.</a> Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).</li>
<li>Fiacco, T. A., Agulhon, C., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+out+astrocyte+physiology+from+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pharmacol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Sorting out astrocyte physiology from pharmacology.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 49, 151-174 (2009).</li>
<li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Signaling+and+Gliotransmission+in+Normal+vs+Reactive+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Calcium Signaling and Gliotransmission in Normal vs Reactive Astrocytes.</a> Front. Pharmacol. 3, 139 (2012).</li>
<li>Nedergaard, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artifact+versus+reality--how+astrocytes+contribute+to+synaptic+events%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Artifact versus reality--how astrocytes contribute to synaptic events.</a> Glia. 60, 1013-1023 (2012).</li>
<li>Nizar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+stimulus-induced+vasodilation+occurs+without+IP3+receptor+activation+and+may+precede+astrocytic+calcium+increase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo stimulus-induced vasodilation occurs without IP3 receptor activation and may precede astrocytic calcium increase.</a> J. Neurosci. 33, 8411-8422 (2013).</li>
<li>Sutton, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniature+neurotransmission+stabilizes+synaptic+function+via+tonic+suppression+of+local+dendritic+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Miniature neurotransmission stabilizes synaptic function via tonic suppression of local dendritic protein synthesis.</a> Cell. 125, 785-799 (2006).</li>
<li>Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+synaptic+scaling+induced+by+changes+in+postsynaptic+firing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing.</a> Neuron. 57, 819-826 (2008).</li>
<li>Xie, A. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+scaling+of+astrocytic+metabotropic+glutamate+receptor+signaling+following+long-term+changes+in+neuronal+firing+rates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Bidirectional scaling of astrocytic metabotropic glutamate receptor signaling following long-term changes in neuronal firing rates.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiol. Rev. 79, 1089-1125 (1999).</li>
<li>Petravicz, J., Fiacco, T. A., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+IP3+receptor-dependent+Ca2%2B+increases+in+hippocampal+astrocytes+does+not+affect+baseline+CA1+pyramidal+neuron+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of IP3 receptor-dependent Ca2+ increases in hippocampal astrocytes does not affect baseline CA1 pyramidal neuron synaptic activity.</a> J. Neurosci. 28, 4967-4973 (2008).</li>
<li>Nett, W. J., Oloff, S. H., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+astrocytes+in+situ+exhibit+calcium+oscillations+that+occur+independent+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Hippocampal astrocytes in situ exhibit calcium oscillations that occur independent of neuronal activity.</a> J. Neurophysiol. 87, 528-537 (2002).</li>
<li>Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+bulk-loading+of+fluorescent+indicators+for+two-photon+brain+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo.</a> Nat Protoc. 1, 380-386 (2006).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforhodamine+101+as+a+specific+marker+of+astroglia+in+the+neocortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo.</a> Nat. Methods. 1, 31-37 (2004).</li>
<li>Prezeau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+carboxyl-terminal+domain+of+metabotropic+glutamate+receptor+1+by+alternative+splicing+generate+receptors+with+differing+agonist-independent+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Changes in the carboxyl-terminal domain of metabotropic glutamate receptor 1 by alternative splicing generate receptors with differing agonist-independent activity.</a> Mol. Pharmacol. 49, 422-429 (1996).</li>
<li>Shao, Y., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+relationship+between+alpha+1-adrenergic+receptor+density+and+the+receptor-mediated+calcium+response+in+individual+astroglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Quantitative relationship between alpha 1-adrenergic receptor density and the receptor-mediated calcium response in individual astroglial cells.</a> Mol. Pharmacol. 44, 247-254 (1993).</li>
<li>Wang, S. S., Thompson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+changes+in+functional+muscarinic+acetylcholine+receptor+density+in+single+neuroblastoma+cells+using+calcium+release+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Measurement of changes in functional muscarinic acetylcholine receptor density in single neuroblastoma cells using calcium release kinetics.</a> Cell Calcium. 15, 483-496 (1994).</li>
<li>Ostasov, P., Krusek, J., Durchankova, D., Svoboda, P., Novotny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+responses+to+thyrotropin-releasing+hormone+and+angiotensin+II%3A+the+role+of+plasma+membrane+integrity+and+effect+of+G11alpha+protein+overexpression+on+homologous+and+heterologous+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem.+Funct%22%5BJournal%5D)">Ca2+ responses to thyrotropin-releasing hormone and angiotensin II: the role of plasma membrane integrity and effect of G11alpha protein overexpression on homologous and heterologous desensitization.</a> Cell Biochem. Funct. 26, 264-274 (2008).</li>
<li>Shelton, M. K., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+astrocytes+exhibit+Ca2%2B-elevating+muscarinic+cholinergic+and+histaminergic+receptors+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Hippocampal astrocytes exhibit Ca2+-elevating muscarinic cholinergic and histaminergic receptors in situ.</a> J. Neurochem. 74, 555-563 (2000).</li>
<li>Hermans, E., Challiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+signalling+and+regulatory+properties+of+the+group+I+metabotropic+glutamate+receptors%3A+prototypic+family+C+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Structural signalling and regulatory properties of the group I metabotropic glutamate receptors: prototypic family C G-protein-coupled receptors.</a> Biochem. J. 359, 465-484 (2001).</li>
<li>Zur Nieden, R., Deitmer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Metabotropic+Glutamate+Receptors+for+the+Generation+of+Calcium+Oscillations+in+Rat+Hippocampal+Astrocytes+In+Situ%5BTitle%5D)+AND+%22Cortex%22%5BJournal%5D)">The Role of Metabotropic Glutamate Receptors for the Generation of Calcium Oscillations in Rat Hippocampal Astrocytes In Situ.</a> Cortex. 16 (5), 676-687 (2005).</li>
<li>de Ligt, R. A., Kourounakis, A. P., AP, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+agonism+at+G+protein-coupled+receptors%3A+%28patho%29physiological+relevance+and+implications+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inverse agonism at G protein-coupled receptors: (patho)physiological relevance and implications for drug discovery.</a> Br. J. Pharmacol. 130, 1-12 (2000).</li>
<li>Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforhodamine+101+induces+long-term+potentiation+of+intrinsic+excitability+and+synaptic+efficacy+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sulforhodamine 101 induces long-term potentiation of intrinsic excitability and synaptic efficacy in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Neuroscience. 169, 1601-1609 (2010).</li>
<li>Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+and+astrocyte+calcium+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains.</a> Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li>
<li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J. Gen. Physiol. 141, 633-647 (2013).</li>
<li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat. Neurosci. 13, 584-591 (2010).</li>
<li>Fiacco, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+stimulation+of+astrocyte+calcium+in+situ+does+not+affect+neuronal+excitatory+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Selective stimulation of astrocyte calcium in situ does not affect neuronal excitatory synaptic activity.</a> Neuron. 54, 611-626 (2007).</li>
<li>Echegoyen, J., Neu, A., Graber, K. D., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+plasticity+studied+using+in+vivo+hippocampal+activity-blockade%3A+synaptic+scaling%2C+intrinsic+plasticity+and+age-dependence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Homeostatic plasticity studied using in vivo hippocampal activity-blockade: synaptic scaling, intrinsic plasticity and age-dependence.</a> PLoS One. 2, (2007).</li>
<li>Aguado, F., Espinosa-Parrilla, J. F., Carmona, M. A., Soriano, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+correlated+network+properties+of+spontaneous+calcium+transients+in+astrocytes+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates correlated network properties of spontaneous calcium transients in astrocytes in situ.</a> J. Neurosci. 22, 9430-9444 (2002).</li>
<li>Takata, N., Hirase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+layer+1+and+layer+2%2F3+astrocytes+exhibit+distinct+calcium+dynamics+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cortical layer 1 and layer 2/3 astrocytes exhibit distinct calcium dynamics in vivo.</a> PLoS ONE. 3, e2525 (2008).</li>
<li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRET+biosensors+to+study+GPCR+biology%2C+pharmacology%2C+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">BRET biosensors to study GPCR biology, pharmacology, and signal transduction.</a> Front. Endocrinol. 3 (105), (2012).</li>
<li>Di Castro, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Ca2%2B+detection+and+modulation+of+synaptic+release+by+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes.</a> Nat. Neurosci. 14, 1276-1284 (2011).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-dependent+neuroglial+calcium+signaling+differs+between+young+and+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Glutamate-dependent neuroglial calcium signaling differs between young and adult.</a> Science. 339, 197-200 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren möchten sich offenbaren, dass die Tetrodotoxin in diesen Studien verwendet wurde aus Abcam gekauft. Abcam nicht im Bereich der Hypothesen, Design, oder eine Sammlung von Daten. Die gesamte Kommunikation über das Sponsoring der Arbeit von Abcam trat nach dem Peer-Review-Prozess abgeschlossen war.

Die beschriebenen Skalierung Modelle stellen praktische Methoden für die Erforschung von Langzeitplastizität von Astrozyten Gruppe I mGluRs. Imaging spontane und evozierte Ca 2 +-Ereignisse können empfindlicher Test für die Messung von Veränderungen in Astrozyten Gq GPCR-Aktivität, als feste Beweise wurde festgestellt, dass Astrozyten Ca 2 +-Erhöhungen treten nach der Entlassung von IP 3 R empfindlichen Läden hinter der Gq GPCR-Aktivierung 10, 12, 17, 18. Der Anteil der Astrozyten in der Bevölkerung reagiert auf Gruppe I mGluR-Agonisten und dem Muster solcher Ca 2 +-Antworten berichten Veränderungen in der Gruppe I mGluRs von Astrozyten. Die spezifische Technik zur Astrozyten mit Ca 2 +-Indikator zu laden ist eine wichtige Überlegung bei der Gestaltung von Experimenten, um Änderungen in Astrozyten Gq GPCR-Aktivität zu suchen. Bolus-loading-oder Masse-Laden mehrerer Astrozyten oder pATCH-Clamp-Belastung der einzelnen Astrozyten, um die Bild Ca 2 +-Transienten in Astrozyten verwendet werden. Jeder Ansatz bietet gewisse Vorteile und Nachteile. Direktes Füllen Astrozyten mit Ca 2 +-Indikator durch Patch-Clamp ermöglicht eine eindeutige Identifikation der Zelle als Astrozyten ohne Notwendigkeit eines sekundären Marker, wie SR-101. Patch-Clamp Lieferung der Anzeige ermöglicht auch die Aufnahme von Ca 2 +-Aktivität von Astrozyten kleine Fächer mit den buschigen feinen Prozesse, möglicherweise tiefer in der Scheibe, wo Zellen sind gesünder und mit mehr intakt Interaktionen mit Synapsen (abhängig von der Laserleistung verfügbar). Jedoch leidet Patch-Clamp-Beladung von geringem Durchsatz, da die Daten zu einem Zeitpunkt einer Zelle gesammelt. Massenlade hingegen ermöglicht eine große Anzahl von Astrozyten mit Ca 2 +-Indikator beladen und gleichzeitig abgebildet werden. Jedoch nur Astrozyten in der Nähe der Oberfläche (&lt;20 &amp;mgr; m) der Scheibe geladen sind, zugeordnet Anliegens über die Zellgesundheit und intakte Synapsen. Die hier vorgestellte Gegendruck Bolus-loading-Protokoll bietet einen Mittelweg, mit relativ hohen Durchsatz und die Fähigkeit, Ca 2 +-Aktivität zu überwachen tiefer innerhalb der Scheibe (40-75 um). Im Vergleich zu Massenbeladung Ein signifikanter Anstieg im Prozentsatz der spontan aktiven Astrozyten mit der Bolus-Beladungstechnik beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Verbindungen zwischen neuronalen Synapsen und die Astrozyten Prozesse voll 15. Mit guten Laden, kann man oft beobachten Ca 2 +-Aktivität in Hauptprozesse von Astrozyten (Daten nicht gezeigt) oder möglicherweise sogar kleinere Fächer mit 2-Photonen-Mikroskopie. Allerdings wäre Pflege brauchen, um bei der Zuordnung der kleinere Prozesse zu einem bestimmten Astrozyten ausgeübt werden, da die Grenzen in die unspezifische Hintergrundfärbung mischen. Eine weitere Sorge mit der Verwendung von Großlade-oder Bolus-Ladeverfahren ist die Notwendigkeit für eine sekundäre marker für Astrozyten Identifikation. Während es schon seit vielen Jahren bekannt, dass Astrozyten bevorzugt nehmen AM Ester Ca 2 +-Indikatoren wird die Sekundär Marker SR-101 häufig verwendet, um die geladenen Zellen als Astrozyten zu überprüfen. SR-101 kann in sich selbst verändern die innere Erregbarkeit von Neuronen 29. Verwendung von SR-101 bestätigt die Notwendigkeit, alle Astrozyten Ca 2 +-Messungen in TTX durchführen, um mögliche SR-101 Effekte auf die neuronale Erregbarkeit zu begrenzen. Unter der Annahme, dass sowohl Kontroll-und Versuchsgruppen schließen SR-101, sollte der Marker an sich nicht für die in Astrozyten-Ca 2 +-Signal beobachteten Effekte nach der Langzeitmanipulation neuronaler Aktionspotentiale zu berücksichtigen. SR-101 kann mehr ein Anliegen sein, in hohen K + Experimente aber, wie kann es den Unterschied zwischen 2,5 mM K + vs reduzieren 5,0 mM K +, wenn die basale Feuerrate ist nicht proportional geändert. Ein sehr vielversprechender Ansatz für die Ca 2 + liefern </sup&gt; Anzeige Astrozyten hat vor kurzem entstanden, die eine attraktive Alternative zu den traditionellen Ansätzen bietet mit Ca 2 +-Farbstoffe. Bedeutende Fortschritte wurden in den letzten Jahren mit genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren (GeCIS) Astrozyten 30-32 gezielt gemacht worden. GeCIS können Astrozyten durch in vivo-Mikroinjektion von Adeno-assoziierten viralen Vektoren in einer Hirnregion von Interesse, wie dem Hippocampus geliefert. Die Expression von GeCIS nach etwa zwei Wochen nach Virusinfektion 32 erreicht. Es gibt zahlreiche Vorteile durch die Verwendung von GeCIS in Astrozyten gekennzeichnet. Zuerst werden die Vektoren in Astrozyten mit einem Astrozyten-spezifischen Promotor richtet, so dass die markierten Zellen Astrozyten 32. Zweitens, das Signal-zu-Rausch scheint nun vergleichbar zu dem, was mit Patch-Clamp-Lieferung von Farbstoff erhalten werden, jedoch ohne die Invasivität, die eine Patchpipette auf die Zelle 32 hatte. Drittens können die Indikatoren sein delivered und in der Erwachsenengewebe, das mit Bulk-Loading-Versandmethoden problematisch ist, ausgedrückt. Weiterhin ist der Ausdruck Mosaik, bietet die Möglichkeit, unter mehreren Astrozyten differenzieren. So können mehrere Astrozyten potenziell gleichzeitig abgebildet werden, während die Aufnahme auch im Soma und feine Ästchen in der gleichen Zeit. Daher könnte eine einzige Technik, die in Platz drei separate Verfahren (bulk-loading, Bolus-Laden und Patch-Clamp-Belastung) verwendet werden, um die Skalierung Aktivität der Astrozyten Gq GPCRs aufzeichnen, Effizienz deutlich erhöht werden. Ein möglicher Nachteil der Verwendung von viral-vermittelte Abgabe von Ca 2 +-Indikatoren Astrozyten die möglichen Auswirkungen auf die Gesundheit Scheibe 32. Die Adeno-assoziierte virale Vektoren verwendet, um die GeCIS liefern haben bereits gezeigt worden, um reaktive Gliose der Astrozyten 33 verursachen. Herstellung von Hirnschnitten im Allgemeinen wahrscheinlich initiiert frühen Stadien der Pathologie einschließlich der Freisetzung von inflammatory 10 Moleküle. Daher kombiniert mit den langen Inkubationszeiten erforderlich, um die Skalierung der Astrozyten-Rezeptoren induzieren, die Verwendung von GeCIS Verwendung viraler Vektoren geliefert müssten zusätzliche Gegenleistung im Rahmen von Schicht Gesundheit in dieser Art von Experimenten zu erhalten. Bei der Verwendung dieses Protokoll, ist es wichtig zu beachten, dass der Antrag für die Zeit, um eine Antwort Agonisten produzieren wird als Funktion des Rezeptors Verfügbarkeit variieren. Für eine gegebene Konzentration des Agonisten wird die Anwendungszeit muss länger sein, wenn Rezeptoren unten skaliert kürzer, und wenn Rezeptoren haben, skaliert für das Medikament, eine angemessene Konzentration im Gewebe an Rezeptoren ausreichend zu aktivieren, um eine Ca 2 + zu erzeugen erreichen Antwort. Daher können Arzneimittel Anwendungszeiten und möglicherweise ihre Konzentrationen müssen in Abhängigkeit von der beabsichtigten Richtung der Skalierung eingestellt werden. Zum Beispiel muss die Agonistenkonzentration in der C abgesenktase von TTX zu vermeiden Sättigung Reaktionen und erhöhte nach Inkubation Scheiben in hohen K + noch eine Antwort finden. Insbesondere wurde die DHPG-Konzentration von 5 bis 15 uM nach TTX-Behandlung auf 30-50 uM nach 5,0 mM K + Behandlung, um die Ca 2 +-Antwort-Muster zu untersuchen, wie 5-15 uM war oft zu gering, um zuverlässige Antworten in verschobene Astrozyten nach Verkleinerung der Gruppe I mGluRs. Aufzeichnung von Astrozyten Ca 2 +-Aktivität bietet keinen direkten Beweis von Rezeptor Internalisierung Einsetzen oder zu oder von der Plasmamembran. Jedoch, bezogen auf die bemerkenswerte Ähnlichkeit der Daten mit Daten aus früheren Untersuchungen in vitro, die die direkte Beziehung zwischen Gq GPCR-Expressionsniveaus und spontane sucht und evozierte Ca 2 +-Transienten 21-24, die logische Interpretation der Änderungen der Ca 2 + Signalisierung, daß die Astrozyten-Oberflächenrezeptor-Expressionsniveaus habengeändert. Ein komplementärer Ansatz kann ein wichtiger Aspekt sein, wenn man will, um zusätzliche Erkenntnisse über den Ort der Wirkung auf die Ca 2 +-Aktivität liefern. Eine Strategie, die wir verwendet wurde, um die Wirkung von TTX Inkubation auf Hippocampus von Astrozyten MrgA1R Mäusen zu untersuchen. Diese transgenen Mäuse exprimieren einen Fremd Gq GPCR (die MrgA1R) nur in Astrozyten. Da dieser Rezeptor nicht heimisch an das Gehirn, gibt es keinen endogenen Neurotransmitter vorhanden, seine Aktivität zu ändern. Frühere Arbeiten vorgeschlagen, dass dieser Rezeptor die gleiche intrazelluläre Signalmoleküle als endogene Gruppe I mGluRs in den gleichen Astrozyten 34 greift. Nach Langzeit-Inkubation von Scheiben von MrgA1R Mäuse in TTX, keine Unterschiede in der Agonisten-evozierte MrgA1R Antworten im Vergleich zu Kontrolle inkubiert Wurfscheiben wäre nachzuweisen, dass die Wirkung auf Astrozyten aufgrund von Änderungen an der Oberfläche lokalisierten Rezeptor Ca 2 +-Aktivität, vor allem wenn Gruppe I mGluR Antworten sind immer noch significantly in den gleichen Astrozyten verbessert. Eine alternative, wenn auch komplizierter Strategie wäre, Astrozyten aus den Scheiben für die Western-Blot-Analyse zu isolieren, solange einer Membranfraktion kann für Änderungen der Oberflächenrezeptorexpressionsniveaus analysiert. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) oder Durchflusszytometrie kann hier hilfreich sein. Die möglichen Anwendungen dieser Technik auf die Untersuchung von Neuronen, Astrozyten und Astrozyten-neuronalen Interaktionen viele. In unseren Experimenten nur DHPG-evozierte Gruppe I mGluR Astrozyten Ca 2 +-Antworten untersucht wurden, in isolierten akuten Hippocampus von jungen Mäusen. Diese Vorbereitung hat nicht nur die intakten Afferenzen (Schaffer-Kollateralen), aber auch die Nervenzellen, die Anlass zu ihnen (CA3 Pyramidenzellen), so dass es möglich ist, die Feuerraten dieser glutamatergen Neuronen auf die postsynaptischen Zellen (CA1-Pyramidenzellen) zu manipulieren und die Astrozyten in Stratum radiatum deren Prozesse verbundee mit diesen Synapsen. Die akute Hippocampus-Scheibe ist vielleicht nicht die beste Vorbereitung für die Manipulation von Feuerraten von anderen Arten von Neuronen zu sein, aber, wie viele Afferenzen aus den Neuronen, die Anlass zu ihnen abgebrochen. Dennoch kann es in bestimmten Schnittpräparate sein, Plastizität der anderen Astrozyten Gq GPCR-Subtypen zu beobachten. Zum Beispiel könnte Scheiben mit cholinergen Neuronen des basalen Vorderhirns und ihre Projektionen hergestellt intakt Hippocampus. Inkubation dieser Scheiben in TTX oder erhöhter K + würde basalen Feuerraten von cholinergen Neuronen beeinflussen, was zu Skalierung mAChRs in Astrozyten des Stratum oriens, die einen wesentlichen Anteil des cholinergen Eingang 1 empfangen. Ein alternativer Ansatz für die noch nicht erprobt Astrozyten-Rezeptor-Skalierung in einem bestimmten Bereich des Gehirns, mit allen Verbindungen intakt studieren, während die Skalierung auftritt, könnte es sein, ein in vivo-Modell, bei dem eine anhaltende Freisetzung von TTX durch Implantation eines plast erreicht verwendenic Polymer Elvax 40W oberhalb der interessierenden Region 35. Dieser Ansatz wurde bereits in einer Studie von neuronalen Skalierung verwendet worden, aber sollte auch auf Astrozyten Skalierung sein. Schließlich, mit der richtigen Anzeige, zukünftige Studien könnten andere GPCR Familien, einschließlich der Änderungen in G s oder G i GPCRs zu untersuchen. Man könnte Astrozyten GABA B G vorherzusagen i GPCRs zu folgenden Hemmung der Brenn lokal vorstehende GABA Inter innerhalb einer Schnittpräparat betroffen sein. Entwicklung neuer Indikatoren, die gegen andere Signalmoleküle, wie eine Echtzeit-Anzeige der zweiten Botenstoffes cAMP, die Öffnung für ein völlig neues Gebiet der Forschung auf Neuron-zu-Astrozyten-Rezeptor-Kommunikation. Bidirektionale Skalierung der Astrozyten mGluRs durch Manipulation der basalen Neuronenfeuerraten liefert ein Maß für die Empfindlichkeit der Astrozyten auf AP-vermittelte Freisetzung von Neurotransmitter. Astrozyten kann offenbar spüren spontanen APs und glutamate Freisetzung bei Schaffer Sicherheiten-CA1-Pyramidenzellen Synapsen auch bei extrazellulären K + ist in einem physiologischen Bereich. Während akute Anwendung der TTX ist die Häufigkeit der spontanen Astrozyten Ca 2 +-Aktivität 18, 36, 37, die Ca 2 +-Aktivität unter den Astrozyten in der Bevölkerung wird entkorreliert 36, den Nachweis, dass Astrozyten Rezeptoren sind AP-Detektoren nicht zu reduzieren. Dies deutet darauf hin, dass Astrozyten spüren spontanen neuronalen APs mit auf ihre Gesamt Ca 2 +-Aktivität nicht beeinflussen. Es wird allgemein akzeptiert, dass die intrazelluläre Konzentration von IP 3 benötigen, um einen Schwellenwert zu IP 3 Rs stimulieren ausreichend, um eine nachweisbare Ca 2 +-Erhöhung führen zu erreichen. Könnte spontanen neuronalen APs aktivieren Astrozyten GPCRs, ohne messbare Ca 2 +-Erhöhungen? Zukünftige Studien könnten Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) oder eine ähnliche techn nutzen<html> ique (wie BRET), um die Beziehung zwischen G-Protein-Kopplung an den Rezeptor (ein Maß für die Rezeptoraktivierung) und Ca 2 +-Freisetzung aus internen Speichern zu prüfen. BRET wurde ausführlich in vitro verwendet werden, um G-Protein-zu-GPCR-Kupplung 38 zu erkennen, auch wenn es einige Zeit dauern, bis diese Technologie wird für die Verwendung in intakten Gewebepräparate zur Verfügung. Es ist möglich, dass Astrozyten Gq GPCRs ist viel häufiger als mit der aktuell verfügbaren Ca 2 +-Imaging Werkzeuge aufgezeichnet werden aktiviert. Neben der Erfassung von Aktionspotentialen, können Astrozyten Gq GPCRs auch in der Lage, Miniatur-Quanten Freisetzung von Neurotransmitter zu erfassen, wie in einer aktuellen Studie 39 gemeldet werden. Die hier beschriebene bidirektionale Skalierungsverfahren kann in zukünftigen Studien genutzt werden, um ein Maß für den Umfang, in dem Astrozyten Gq GPCRs erkennen Quanten vesikulären Freisetzung von Neurotransmitter, indem Bafilomycin A1 im Inkubationsprotokoll bieten. ntent &quot;&gt; So weit die Skalierungs Protokolle nur im Hippocampus von jungen Mäusen (p12-p18) verwendet worden. Daher ist es zur Zeit nicht bekannt, ob Astrozyten-Rezeptor-Skalierung könnte auch von erwachsenen Mäusen Gewebe induziert werden. Eine überzeugende neue Studie legt nahe, dass Gruppe I mGluR Expression in Astrozyten verringert erheblich nach der ersten Woche und weiter bis ins Erwachsenenalter zurückgehen, mit einem sehr niedrigen Niveau von Rezeptor-Expression in adulten Astrozyten 40. Es wäre daher interessant sein, festzustellen, ob Astrozyten mGluRs skalieren nach Lang tige Hemmung der neuronalen Erregung bei erwachsenen Hippocampus der Maus auf Werte, die denen in Astrozyten von jungen Mäusen gesehen. Dieser Befund legt nahe, dass Astrozyten-Rezeptor-Expression ist nicht statisch in einem bestimmten Alter, sondern kann schnell je nach Höhe des neuronalen Aktivität zu verändern. Im Gegensatz zu verminderte Expression von Gruppe I mGluRs in erwachsenen Mäusen, die Beweise ab, dass adrenergen Rezeptoren, einschließlich &amp; #945; 1A, 2A α und β 1-Subtypen, werden überwiegend durch Astrozyten im Gehirn von Erwachsenen 3, 4 ausgedrückt. Die α 1A-adrenergen Gq GPCR kann ein attraktives Ziel für zukünftige Studien der Neuron-zu-Astrozyten-Kommunikation, einschließlich, ob diese Rezeptoren empfindlich auf Veränderungen der adrenergen Neuronenfeuerraten sein.

Astrozyten reagieren innerhalb von Sekunden bis Stimulation von Neuronen oder neuronalen Axonen mit einem Anstieg der cytoplasmatischen Ca 2 + resultierenden fast ausschließlich aus der Aktivierung von Astrozyten Gq GPCRs. Zum Beispiel muskarinischen Acetylcholin-Rezeptoren 1, 2 Cannabinoid-Rezeptoren, α 1A adrenergen Rezeptoren 3, 4, und ich mGluRs Gruppe (siehe unten) sind alle Astrozyten Gq GPCR-Subtypen, die akut die neuronale Aktivität zu reagieren. Aktivierung von Astrozyten Gruppe I-mGluRs wurde sehr ausgiebig demonstriert, nach Stimulation des glutamatergen Nerven Afferenzen in situ (z. B. akute Hippocampus) 5-7 sowie in adulten Maus Kortex in vivo nach sensorischer Stimulation 8. Das Ergebnis der Aktivierung von Astrozyten Gq GPCR-Signal über die Biologie und Physiologie der Astrozyten, Neuronen oder Astrozyten-Neuron-Interaktionen ist eine Angelegenheit der Debatte 12.09. Es wird s seinome Zeit vor der Funktion von Neuronen zu Astrozyten-Rezeptor-Signal ist voll gewürdigt. Zwar ist klar, dass Neuronen Astrozyten Rezeptoren mit Versuchsprotokolle zu aktivieren, gibt es Aspekte der Neuron-zu-Astrozyten-Rezeptor-Kommunikation, die kaum verstanden zu bleiben. Zuerst wird die tatsächliche Menge der neuronalen Aktivität erforderlich Astrozyten Gq GPCRs aktivieren ist nicht gut definiert, und die zweite ist die Fähigkeit der Astrozyten Rezeptoren nutzungsabhängige Plastizität aufweisen wenig Aufmerksamkeit geschenkt. Um zu beginnen, um diese Fragen zu beantworten, haben wir vor kurzem ein Protokoll zur bidirektionalen Skalierung der Astrozyten Gruppe I mGluRs in akuten Jugend Hippocampus in Reaktion auf langfristige Veränderungen in der neuronalen Aktionspotential (AP)-abhängige synaptische Aktivität zu induzieren. Ähnlich wie für bidirektionale homöostatische Plastizität neuronaler ionotropen Glutamat-Rezeptoren 13, 14, Astrozyten Gruppe I mGluRs Scale-up fo entdecktllowing Blockade neuronaler Aktionspotentiale und verkleinern, wenn neuronale Aktionspotentialfrequenz erhöht 15. Diese kompensatorischen Veränderungen in Astrozyten Rezeptoren können durch spontane Aufnahme gemessen werden und evozierte Astrozyten Ca 2 +-Transienten-und den Vergleich der Eigenschaften von diesen Ereignissen um die aus Astrozyten in Kontrollbedingungen. In diesem Manuskript, beschreiben wir die vollständige Methodik für den Einsatz dieses Protokolls, einschließlich der Vorbereitung der akuten Hippocampus, Inkubationsbedingungen zu Astrozyten-Rezeptor-Skalierung zu induzieren, Astrozyten Ca 2 +-Indikator-Farbstoff Laden, Ca 2 +-Imaging-Techniken mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie und erwarteten Auswirkungen auf Astrozyten Gq GPCR-Aktivität. Vorhersehbare Auswirkungen auf Astrozyten Ca 2 + Signaleigenschaften - was die zuvor in kultivierten Zellen mit unterschiedlichen Expressionsniveaus von Gq GPCRs transfiziert aufgezeichnet wurde - eine &quot;Roadmap&quot;, die in zukünftigen Studien genutzt werden kann, um Änderungen in wie Assaytrocytic GPCR Ausdruck. Die Auswirkungen und Anwendungsmöglichkeiten für den Einsatz dieser Technik wird zu unserem Verständnis der Astrozyten-neuronalen Interaktionen im gesunden und erkrankten Gehirn beitragen.

<table><tbody><tr><td>Chamber SuppliesBrinkmann</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Pipettenaufbewahrungsbehälter</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-491</td><td>Verwenden Sie den Schubladenteil als Inkubationskammer</td></tr><tr><td>Elektrischer Bohrer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flexibler Schlauch</td><td>Tygon</td><td>R-3603</td><td></td></tr><tr><td>Silikonnahtdichtstoff</td><td></td><td></td><td>Auch Aquariennahtversiegelung genannt</td></tr><tr><td>Gastank</td><td></td><td></td><td>95% Sauerstoff, 5% Kohlendioxid</td></tr><tr><td>Natürliche abgeschrägte Pipettenspitze</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1000</td><td>Cut-to-fit zum Anschließen von sauerstoffhaltigen Leitungen</td></tr> Ein- <tr><td>bis sechs Leitungen Verteiler</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0210 (MP-6)</td><td>Für das Mikrolader-Verteilergerät</td></tr><tr><td>Mikrolader</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td>Für die Mikrolader-Verteiler-Apparatur, passgenaues</td></tr><tr><td>Floating Bubble Rack</td><td>Bel Art Scienceware</td><td>F18875-0400</td><td>Für Scheibenhalter</td></tr><tr><td>600 & micro; m Sefar Nitex Nylon Mesh</td><td>ELKO Filtering Co.</td><td>06-600/51</td><td>Für Scheibenhalter</td></tr><tr><td>Krazy Glue</td><td></td><td></td><td>Für Scheibenhalter</td></tr><tr><td><stark>Reagenzien</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P333-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Fisher</td><td>Fisher (</td><td></td></tr><tr><td>&plusmn;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure (Trolox)</td><td>Acros Organics</td><td>53188-07-1</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Acros Organics</td><td>401471000</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoxincitrat (TTX)</td><td>Abcam</td><td>ab120055</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamin 101 (SR-101)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>284912</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Pluronsäure F-127</td><td>Invitrogen, Molekulare Sonden</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (Spezialverpackung)</td><td>Invitrogen, Molekulare Sonden</td><td>O6807</td><td></td></tr><tr><td>(RS)-3,5-DHPG</td><td>Abcam</td><td>ab120020</td><td></td></tr><tr><td>Histamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7125</td><td></td></tr><tr><td>Carbamoylcholin Chlorid (Carbachol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4382</td><td></td></tr><tr><td>Adenosin 5'-ATP Dinatrium (Na-ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td><stark>Dissektionswerkzeuge</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einschneidige Rasierklinge&nbsp;</td><td>GEM</td><td>62-0161</td><td>Für Halbierung&nbsp;</td></tr><tr><td>Doppelschneidige Rasierklinge</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>121-6</td><td>Zum Schneiden von Scheiben</td></tr><tr><td>Mayo-Schere, supercut</td><td>WPI</td><td>14010-15</td><td>Zum Enthaupten</td></tr><tr><td>Feine Irisschere, gerade</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td>Zum Schneiden des Schädels</td></tr><tr><td>Iriszange, gebogen</td><td>WPI</td><td>15915</td><td>Zum Entfernen von Haut und Schädel</td></tr><tr><td>Kleiner Spatel</td><td></td><td></td><td>Zum Entfernen/Übertragen des Gehirns</td></tr><tr><td>Dumostar Dumont #5 Biologie Tip Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td>Für die Hippocampus-Dissektion</td></tr><tr><td>Glaspasteur-Pipette</td><td>Fisher</td><td>13-678-20B</td><td>Für die Übertragung von Hirnschnitten</td></tr><tr><td>Pasteur-Pipette Gummibirne</td><td>Fisher</td><td>03-448-22</td><td>Für die Übertragung von Hirnschnitten</td></tr><tr><td>Polystyrol 100 mm Gewebekulturschalen</td><td>Corning</td><td>25020</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT 1200S</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Fisher</td><td>ISOTEMP 210</td><td>Für die Warminkubation</td></tr><tr><td>Mikropipettenzieher</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>Für Bolusladepipetten</td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>Olympus Fluoview 1000</td><td></td></tr><tr><td>Offenes Diamantbad mit niedrigem Profil Bildgebungskammer mit PM-1-Plattform</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26GLP</td><td>Diamantbad mit niedrigem Profil</td></tr><tr><td>Pipette aus Borosilikatglas</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>Für Bolusladepipetten</td></tr><tr><td>Mikromanipulator&nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>ROE-200</td><td>Für Bolusladepipetten</td></tr><tr><td>Spin-X Zentrifugenröhrchenfilter mit 0,22 &; Mikro; M Celluloseacetat&nbsp;</td><td>Costar</td><td>8161</td><td></td></tr></tbody></table>

induktion von plastizität astrozytäre rezeptoren durch manipulation der neuronalen feuerraten

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Nähe von zwei Dekaden der Forschung hat festgestellt, dass Astrozyten in situ und in vivo exprimieren viele G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), die von neuronal-Freigabe Sende angeregt werden können. Jedoch wurde die Fähigkeit von Astrozyten Rezeptoren Plastizität in Reaktion auf Veränderungen in der neuronalen Aktivität aufweisen, wenig Aufmerksamkeit geschenkt. Hier beschreiben wir ein Modellsystem, die global nach oben oder unten skalieren Astrozyten Gruppe I metabotropen Glutamat-Rezeptoren (mGluRs) in akuten Hirnschnitten verwendet werden kann. Enthalten sind Methoden, wie man parasagittale Hippocampus vorbereiten, bauen Kammern geeignet für langfristige Scheibe Inkubation bidirektional manipulieren neuronalen Aktionspotential, Belastung Astrozyten und Astrozyten Prozesse mit fluoreszierenden Ca 2 +-Indikator, und messen Veränderungen in Astrozyten Gq GPCR-Aktivität durch die Aufnahme spontane und evozierte Astrozyten Ca 2 +-Ereignisse mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Im wesentlichen ein &quot;Calcium roadmap &quot;ist, wie man Plastizität der Astrozyten Gq GPCRs zu messen. Anwendungen der Technik zur Untersuchung von Astrozyten diskutiert. Nachdem ein Verständnis dafür, wie Astrozyten-Rezeptor-Signal wird durch Veränderungen der neuronalen Aktivität beeinflusst hat wichtige Implikationen sowohl für die normale synaptische Funktion sowie Prozesse zugrunde liegenden neurologischen Störungen und neurodegenerative Erkrankungen.

Repräsentative Ergebnisse in Abbildung 3 zeigen die Wirkung der Inkubation von akuten Maus Hippocampus in TTX für 4-6 h auf sr Astrozyten Ca 2 +-Aktivität. Die Daten umfassen sowohl spontane Ca 2 +-Transienten und DHPG-evozierte Gruppe I mGluR Ca 2 +-Antworten, von den Scheiben in Steuer ACSF vs ACSF zzgl. TTX inkubiert. Anders als Grund charakteristischen morphologischen Merkmale, sternförmigen Prozess der Montage und kleine Soma Größe (~ 10 um), sind Astrozyten im sr durch Überlagerung der Ca 2 +-Indikator-OGB 1.00 mit der selektiven Astrozyten-Marker SR-101 19, 20 (identifiziert Figur 3A). Die nummerierten Boxen über Astrozyten Zellkörper entsprechen den nummerierten Fluoreszenz über in 3B gezeigt Zeitspuren. Die Gruppe 1 mGluR Agonisten (RS)-3.5-DHPG wird angewandt, um die spezifischen Auswirkungen auf die Skalierung der Gruppe 1 mGluRs in Astrozyten zu bestimmen. Um zwischen phys. diskriminiereniology in der Spezifität von dem Skalierungseffekt Gruppe 1 mGluRs im Vergleich zu anderen GPCRs Gq wird ein Cocktail von Agonisten am Ende jedes Experiments angewandt. Hier haben wir jede der 10 uM Gq GPCR-Agonisten Histamin, Carbamylcholin Chlorid (Carbachol) und Adenosin-5&#39;-ATP-Dinatrium (Na-ATP). Der Agonist Cocktail dient auch als eine positive Kontrolle, um lebensfähige, reaktions Astrozyten in Fällen, in denen Zellen nicht auf DHPG reagieren identifizieren, vermutlich, weil diese insbesondere Astrozyten exprimieren keine ausreichenden Mengen des Rezeptors, eine Antwort zu entlocken DHPG. Wir verwendeten verschiedenen Konzentrationen von DHPG einschließlich 5 um und 15 um (Fig. 3B) sowie 30 und 50 &amp;mgr; m (4A) in offenbaren Veränderungen Astrozyten Gruppe I-mGluRs unterstützen. Die Beziehung zwischen zelluläres Ca 2 +-Antworten und Gq GPCR-Expressionsniveaus zuvor in vitro 21-24 untersucht worden. Erstens, dieSchwelle zu einer bestimmten Konzentration des Agonisten zu reagieren, hängt von der Dichte der Rezeptoren, die durch jede Zelle exprimiert. In einer Population von Zellen, mehr Zellen reagieren mit einem Ca 2 +-Erhebung in einer bestimmten Konzentration an Agonist, wenn die Zellen mit höherer Dichte von Rezeptoren transfiziert. Nach Inkubation Scheiben in TTX der Prozentsatz von Astrozyten in der Population reagieren, um eine feste Konzentration des Agonisten erhöht (Fig. 3B und 3C). Wir haben festgestellt, dass 5 um und 15 um DHPG zeigen deutliche Unterschiede im Anteil der reaktions Astrozyten zwischen der Steuerung und TTX behandelten Zellen, während 30 und 50 uM DHPG sind erforderlich, um der Gruppe I mGluR Antworten in 5,0 mM K + behandelt vs Kontrolle zu vergleichen Zellen (Fig. 4A). Die Beziehung zwischen Astrozyten Ca 2 +-Antwort-Muster und Agonistenkonzentration wurde auch in situ untersucht. Die Erhöhung der AgonistenKonzentration verschiebt sich das Muster der Ca 2 +-Antwort in Astrozyten aus einzelnen Peak Ca 2 +-Anstiege auf Multipeak und Plateau-Ca 2 +-Erhebungen 25-27. Auf der Grundlage dieser früheren Befunden, sagten wir voraus, dass die Antwort-Muster auf einer einzigen Konzentration des Agonisten wird zu verschieben, wenn es Veränderungen in der Höhe der Rezeptorexpression. Somit kann in Abhängigkeit davon, welche der beiden Skalierungsverfahren wird verwendet (Hemmung neuronale Aktivität oder Erhöhung it) wird die Konzentration des Agonisten erforderlich, um eine bestimmte Antwort-Muster erzeugen zu erhöhen oder zu verringern. Zum Beispiel, Astrozyten in TTX inkubiert verlagern ihre DHPG-evozierte Ca 2 +-Antwort-Muster, mehr Plateau-Typ-Ca 2 +-Erhöhungen und reagieren auf Agonist-Konzentrationen im Vergleich zu Astrozyten (3C) steuern senken. Unter Berücksichtigung der früheren Studien legen diese Beobachtungen nahe, dass die Gruppe I mGluR Rezeptor-Expressionsniveaus in Astrozyten erhöht. Anstiegszeit und dem Beginn (Latenz) der Ca 2 +-Erhöhungen haben auch gezeigt, direkt auf Änderungen Gq GPCR-Expressionsniveaus in kultivierten Zellen 22-24 korrelieren. Höhere Rezeptorexpressionsniveaus führen zu kürzeren Latenzzeiten und schnellere Anstiegszeiten während die Reduktion der Rezeptordichte erzeugt den gegenteiligen Effekt. Für Astrozyten in TTX, Ca 2 +-Transienten inkubiert durch Anwendung von DHPG evozierte deutlich schnellere Anstiegszeiten im Vergleich zu Astrozyten in Steuer ACSF (3D) inkubiert. Wie zuvor erwähnt, Amplituden-Agonisten hervorgerufene Ca 2 +-Antworten bleiben unverändert, unabhängig von der Konzentration des Agonisten oder des Skalierungsmodell 15 (Fig. 3D). Neben den direkt aktivierende Gruppe beobachteten Veränderungen mGluRs ich mit DHPG, spontan Astrozyten Ca 2 +-Aktivität wird auch wesentlich durch diese Manipulation betroffen. Wir beobachtenda 2,26-fachen Anstieg des Anteils der spontan aktiven Astrozyten in TTX versus Kontrolle inkubiert. Dies ist ein Anstieg von nur 12,9% der Kontroll Astrozyten zeigen spontane Aktivität im Soma auf 42,1% in der TTX inkubiert Astrozyten (3E). Da es bekannt ist, dass GPCRs weisen &quot;intrinsische&quot; oder konstitutive Aktivität in Abwesenheit von Agonist 21, 26, 28, und dass das Niveau dieser intrinsischen Aktivität mit zunehmender Rezeptorexpressionsniveaus, legen diese Daten nahe, dass die Dichte der Astrozyten Gq GPCRs Erhöhungen folgende langfristige Reduktion der neuronalen Aktionspotential Brand. Ähnlich Agonisten hervorgerufenen Reaktionen werden die Anstiegszeiten der spontanen Ca 2 + Erhebungen erhöht (Fig. 3E). Repräsentative Daten unter Verwendung des zweiten Protokolls, die Inkubation in erhöhten extrazellulären Kalium (5,0 mM) wird in Fi dargestelltengure 4. Eine Erhöhung der extrazellulären K + 2,5-5,0 mM zu einer signifikanten Zunahme der basalen CA3-Neuronen Aktionspotentialfrequenz 15. Höhere Konzentrationen von DHPG (30 um und 50 um) sind, um der Gruppe I mGluR Ca 2 +-Antworten von den Astrozyten in hohen Kalium (4A und 4B) inkubiert evozieren erforderlich. Dies ist konsistent mit einem reduzierten Niveau der Gruppe I mGluR Reaktionsfähigkeit in Astrozyten nach einer langfristigen Steigerung der neuronalen Aktionspotentiale. Darüber hinaus ist die evozierte Antwortmuster auf einen festen Konzentration von DHPG verschiebt plateauartigen Reaktionen auf schwächere Einzelpeak-Reaktion (Fig. 4B). Prüfung der Prozentsatz spontan aktiven Astrozyten in den beiden Kalium Bedingungen zeigt, dass weniger Astrozyten in hohem K + inkubiert Vergleich zu der Kontrollgruppe (Fig. 4C) werden spontan aktiv. Dieser Effekt ist in der opposite Richtung des TTX Zustand, in dem der Prozentsatz von Astrozyten zeigen spontane Ca 2 + Erhebungen erhöht wird. Last, hervorgerufen sowohl spontane und Ca 2 +-Erhebungen langsamer Anstiegszeiten in Astrozyten in hoher K + gegenüber der Kontrollbedingung (4C und 4D) inkubiert. Insgesamt legen diese Daten nahe, dass Astrozyten Gq GPCR-Expressionsniveaus skala bidirektional abhängig von der Höhe der neuronalen Aktionspotenzial Aktivität über einen längeren Zeitraum. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" width="500" /> Fig. 1 ist. Scheibe Inkubationsraum Herstellung und eingerichtet. (A) Die Schublade Teil einer Pipette Lagerbehälter Brinkmann zusammen mit seiner luftdichten Deckel wird die Scheibe Brutraum zu konstruieren. (B) DRillen ein Loch in der Seite des Behälters etwa 1 ¼ von oben und ¼ von der Seite. Fit in einem Schlauchstück. (C) Verbinden der Microloader-Verteilervorrichtung an das eine Ende des flexiblen Schlauchs. Hinweis cut-to-fit Natur 200 ul Pipettenspitze (weißer Pfeil). (D) Sechs 20 ul Eppendorf Microloader geschnitten-to-fit zu einer Eins-zu-sechs Line-Verteiler, um eine Microloader-Verteilergeräte erstellen. (E) Bohren zwei kleine Löcher auf dem Deckel. (F) Ein Floating-Rack-Blase für die Herstellung der Scheibe Halter. (G) Die unteren &quot;Beine&quot; des Schwimmblase Zahnstange entfernt, so dass ein Stück Nylonmaschenmaterial kann mit dem Boden verklebt werden. (H) Füllen Sie den Brutraum mit einer ausreichenden Menge von ACSF, so dass die Scheibe Halter schwimmt. Stellen Sie die Schlauchlänge, so dass die Spitzen der Microloader kann an einer Ecke der Kammer Boden ruhen. Wenn Sie das Brutraum indas Wasserbad, sollte der Wasserstand in der Badewanne auf dem gleichen Niveau wie der ACSF in der Kammer sein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" width="500" /> 2. Die Einschätzung der Scheibe Gesundheit. (A) Eine gesunde aussehende Hippocampus-Scheibe mit Differentialinterferenzkontrast (DIC)-Optik. Gesunde Scheiben haben eine glatte, samtig Aussehen und einen hohen Anteil an gesunden CA1 Pyramidenzellen. Beachten Sie die apikalen Dendriten in Stratum radiatum vorsteht. Patch-Clamp von Neuronen, die wie die hier gezeigt aussehen zeigen einen niedrigen Ruhemembranpotential (-61 bis -62 mV) in Standard 2,5 mM K + ACSF mit wenigen spontanen Aktionspotentiale. Membranpotentials und Feuerraten als Funktion von Ex variierenzellulären K + (Xie et al. 15). Pfeile zeigen auf vermeintliche Astrozyten. Abkürzungen: sr, stratum radiatum; s.py., Stratum pyramidale. Maßstabsbalken, 10 um. (B) Ungesunde Scheiben haben einen hohen Prozentsatz an Toten CA1 Pyramidenzellen, die das Aussehen von gebratenen Eiern (weiße Pfeile zeigen auf Kerne von toten Neuronen - das &quot;Eigelb&quot; der Spiegelei) haben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Fig. 3" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" width="500" /> 3. Aufnahme verstärkt Gq GPCR-Aktivität und evozierte Gruppe I mGluR Ca 2 +-Antworten nach Langzeit Hemmung der neuronalen APs durch Inkubation in TTX. (A) Repräsentative Bilder der Zellen in der Aufzeichnungsfeld in C inkubiertontrol Bedingungen (obere Felder) oder im TTX (untere Felder), die bis Oregon Green BAPTA-01.00 Ca 2 +-Indikator-Farbstoff (linke Felder) und SR-101 (Mitte Panels) genommen haben. Maßstabsbalken 10 um. Overlay der beiden Signale (&quot;Merge&quot;) zeigt, dass Astrozyten Last mit Ca 2 +-Indikator. Die Boxen sind über die einzelnen Astrozyten soma gezogen, um Fluoreszenzintensität über die Zeit in den grünen Kanal aufzeichnen, um Ca 2 +-Aktivität in Astrozyten zu überwachen. (B) Probe Spuren von den Registrierkassen in A) von Ca 2 +-Aktivität in den Astrozyten. Astrozyten in TTX-Show inkubiert erhöhte spontane Aktivität und robuster evozierte Gruppe I mGluR Ca 2 +-Antworten, wie durch Änderungen in der Reaktionsmuster belegt. Beispiele einzelner Peak (Kreis), Multipeak (Rechteck) und Plateau (gestrichelte Rechteck) Ca 2 +-Transienten werden angezeigt. (C) Änderungen im Reaktionsmuster sind besonders deutlich mit verschiedenen concentRationen der Gruppe I mGluR Agonisten DHPG. Mehr Multipeak und Plateau-Antworten sind nach Inkubation in TTX im Vergleich zur Kontrolle zu einem bestimmten Agonisten-Konzentration deutlich. (D) Anstiegszeiten von DHPG-evozierte Ca 2 +-Antworten werden schneller in Astrozyten in TTX inkubiert Vergleich zur Kontrolle (oben), während die Amplituden ändern sich nicht (unten), was der &quot;Alles-oder-nichts&quot;-Antwort-Amplituden einmal die Schwelle zu reagieren erreicht wurde. (E) Anstiegszeiten der spontanen Astrozyten Ca 2 +-Transienten sind auch schneller in TTX vs Kontrolle inkubiert Astrozyten (oben), während der Anteil der Astrozyten in der Bevölkerung zeigen spontane Gq GPCR Ca 2 +-Aktivität steigt (unteres Bild). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Fig. 4" fo:content-width = &quot;6in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; 4. Aufnahme vermindert Astrozyten Gq GPCR-Aktivität und evozierte Gruppe I mGluR Ca 2 +-Antworten folgende langfristige Steigerung der neuronalen APs durch Inkubation in erhöhten extrazellulären Kalium. (A) Repräsentative Spuren von Astrozyten Ca 2 +-Aufnahmen von den Scheiben in 5,0 mM K + ACSF inkubiert Neuronen zu depolarisieren und erhöhen ihre basalen Feuerrate im Vergleich zu ACSF (2,5 mM K + ACSF) zu steuern. Astrozyten mit 5,0 mM K + ACSF weisen weniger spontane somatische Ca 2 +-Transienten und schwächer DHPG inkubiert hervorgerufenen Reaktionen im Vergleich zu Astrozyten in Steuer ACSF inkubiert. (B) Ein Vergleich von Mustern hervorgerufenen Reaktionen auf mehrere Konzentrationen von DHPG zeigt schwächere Antworttypen nach langfristiger Anstieg der neuronalen APs. (C) Eine Verringerung des Anteils der Astrozyten im povölkerung spontane Ca 2 +-Aktivität zeigt nach langfristigen Inkubation in erhöhter K + beobachtet, verglichen mit ACSF (oben) steuern, während Anstiegszeiten der spontanen Aktivität langsamer werden (unten). (D) Anstiegszeiten der evozierten Astrozyten Ca 2 +-Reaktionen auf verschiedene Konzentrationen von DHPG langsamer folgenden 5,0 mM K + Behandlung im Vergleich zu Astrozyten in Steuer ACSF inkubiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a>

Hier beschreiben wir eine Anpassung der Protokolle verwendet, um homöostatische Plastizität in Neuronen für die Untersuchung der Plastizität von Astrozyten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zu induzieren. Kürzlich verwendet werden, um Veränderungen in Astrozyten Gruppe I mGluRs mit jungen Mäusen zu untersuchen, kann das Verfahren auf die Skalierung der verschiedenen Astrozyten GPCRs zu messen, in Gewebe von erwachsenen Mäusen in situ und in vivo, und ein besseres Verständnis für die Empfindlichkeit der Rezeptoren Astrozyten gewinnen angewendet werden Veränderungen in der neuronalen Aktivität.

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine langfristige Erhöhung oder Verringerung der Astrozyten-GqG-Protein-gekoppelten Rezeptorsignalübertragung als Reaktion auf Veränderungen der neuronalen synaptischen Übertragung zu induzieren. Dies wird erreicht, indem zunächst akute Hippocampus-Schnitte von Wildtyp-Mäusen präpariert werden. Der zweite Schritt besteht darin, Sulur Rumine 1 0 1 auf die Schnitte aufzutragen, um Astrozyten zu markieren.Anschließend werden die akuten Hippocampus-Schnitte vier bis sechs Stunden lang entweder mit Tetrodotoxin inkubiert, um neuronale Aktionspotentiale zu blockieren, oder in regulärer künstlicher zerebrospinaler Flüssigkeit. Im letzten Schritt werden die Astrozyten in der Stratum-radiatum-Schicht des Schnitts mithilfe eines Back-pressure-Ladeverfahrens mit einem Kalziumindikator beladen. Abschließend wird mittels konfokaler Mikroskopie die Veränderung der Astrozyten-Gq-GPCR-Signalaktivität durch Aufzeichnung von spontanen und ausgelösten kalziumabhängigen Transienten in den Astrozyten dargestellt.Diese Methode liefert Einblicke in die Rezeptorplastizität von Astrozyten und die damit verbundenen Veränderungen in der TQG-PCR-Signalübertragung. Sie kann außerdem verwendet werden, um die homöostatische Plastizität metabotroper Rezeptoren in Neuronen zu messen. Um dieses Verfahren zu beginnen, schalten Sie den Vibratome ein und stellen Sie sicher, dass der Abfluss geschlossen ist.Danach befestigen Sie die Schneidkammer im Vibratom und packen Sie Eis um die Schneidkammer herum. Entfernen Sie anschließend die Fabrikschmierung von der Doppelschliff-Rasierklinge, indem Sie sie fünf Minuten lang in 70 %igem Ethanol einweichen und danach mit doppelt destilliertem Wasser abspülen. Schneiden Sie die Klinge vorsichtig in zwei Hälften und befestigen Sie eine Hälfte auf dem Schneidblock zur Herstellung von Gehirnschnitten.Nachdem ein Maushirn mit dem gekühlten Rasiermesser in einer Petrischale in zwei Hälften geteilt wurde, um eine größere Oberfläche für die Kühlung und Sauerstoffversorgung zu ermöglichen, werden die halbierten Hemisphären zwei bis drei Minuten lang in kaltem Schneidepuffer belassen, damit sie vollständig abkühlen und fester werden. Danach wird eine dünne Schicht Sekundenkleber auf die Plattform des Vibratoms aufgetragen und beide Hemisphären auf die Plattform geklebt.Legen Sie das Gewebe mit den Schnittflächen nach unten und den seitlichen Seiten nach oben, wobei die Riechrinde nach vorne weist, und befestigen Sie die Plattform in der Schneidekammer. Füllen Sie die Schneidekammer mit eiskaltem, gut oxygeniertem Schneidepuffer. Setzen Sie die Sauerstoffversorgung der Schneidekammer fort, während Sie mithilfe des Vibroschneiders 300 µm dicke parasagittale Schnitte anfertigen. Entfernen Sie nach dem Schneiden den Hippocampus und den angrenzenden entorhinalen Kortex aus jedem parasagittalen Schnitt im eiskalten, gut oxygenierten Schneidepuffer.Um eine Transferpipette herzustellen, brechen Sie die lange Spitze einer Glas-Pasteurpipette ab und setzen einen Pipettierball auf das abgebrochene Ende. Überführen Sie die Hippocampus-Schnitte einzeln in die Inkubationskammer im 35 °C-Wasserbad. Bitte beachten Sie, dass diese Schritte aus Gründen der besseren Sichtbarkeit außerhalb des 35 °C-Wasserbads gezeigt werden.Die hippocampalen Schnitte 20 Minuten lang in einem Mikromolar SR 1 0 1, das in kalziumarmem ACSF verdünnt ist, im 35-Grad-Wasserbad inkubieren. Danach in kalziumarmes ACSF ohne SR 1 0 1 überführen und weitere 10 Minuten inkubieren. Warme Rekoveration.Überführen Sie die Schnitte anschließend in die Kontroll- oder experimentelle ACSF für die verbleibenden 15 Minuten der warmen Inkubation. Nach der 45-minütigen Erholungsphase bringen Sie die Inkubationskammern vorsichtig aus dem 35 Grad Celsius warmen Wasserbad auf die Laboroberfläche und lassen die Schnitte insgesamt drei Stunden bei Raumtemperatur weiterinkubieren, bevor Sie mit dem Bolus-Ladeprotokoll beginnen. Bereiten Sie in diesem Verfahren eine Pipette aus einer Borosilikatglas-Kapillare vor, die auf einen Widerstand von etwa 1,3 Megaohm gezogen wurde, wenn sie mit Farbstofflösung gefüllt ist.Als Nächstes wird ein hippocampaler Schnitt in eine Ableitungskammer gegeben und kontinuierlich mit oxygeniertem ACSF mit einer Geschwindigkeit von 1,5 Millilitern pro Minute perfundiert. Verwenden Sie nur hippocampale Schnitte mit einem hohen Anteil gesunder CA1-Parasagittale Zellen und einer glatt erscheinenden Oberfläche; verwerfen Sie Schnitte, wenn sie ungesund aussehen. Mithilfe der differentiellen Interferenzkontrast-Optik wird ein geeignetes Areal von Astrozyten im Stratum radiatum 40 bis 70 Mikrometer unterhalb der Schnittoberfläche lokalisiert. Anschließend wird die Glaspipette, die vorab mit D-Lösung beladen wurde, in einen standardmäßigen Patch-Clamp-Mikroelektrodenhalter eingesetzt.Senken Sie sie mit der Pipette auf die Oberfläche des Schnitts über dem Feld ab, wobei die Pipette die Schnittfläche berührt. Üben Sie positiven Druck auf die Pipette aus, um die Einfärbung zu beginnen. Senken Sie die Pipette langsam mit einem Mikromanipulator auf etwa 40 Mikrometer unter die Schnittoberfläche ab und lassen Sie die Färbung etwa 45 bis 60 Sekunden lang austreten.Danach senken Sie die Pipette weitere 35 Mikrometer ab und spritzen Farbstoff für etwa 45 bis 60 Sekunden aus. Anschließend ziehen Sie die Pipettenspitze langsam aus dem Schnitt, um sicherzustellen, dass eine große Anzahl von Astrozyten den Farbstoff aufnimmt. In der Regel ist es hilfreich, eine zweite Farbstoffbolus kurz entfernt zu injizieren.Um dies zu erreichen, heben Sie die Pipette wieder an die Oberfläche des Schnitts zurück und vergewissern Sie sich, dass die Pipette nicht verstopft ist. Bewegen Sie dann die Pipette etwa 80 bis 100 Mikrometer vom ersten Injektionsort entlang der Stratum radiatum weg, wiederholen Sie die Bolusinjektion an dieser Stelle und warten Sie 30 bis 45 Minuten, bevor Sie die Astrozyten abbilden, um das Konfokalmikroskop für die Bildaufnahme einzurichten. Die Begrenzung der Belichtung des Schnitts gegenüber Laserlicht ist äußerst wichtig, da eine starke Belichtung zum Ausbleichen des Farbstoffs und/oder zu Phototoxizität führen kann.Stellen Sie die Standardwerte für jeden Laser auf eine hohe Photomultipliereinstellung, eine Verstärkung von 1 x und eine Laserleistung von 0,5 % pro Stunde ein. Wenden Sie anschließend einen 1,5-fachen Zoom an, um die Astrozytenfortsätze besser visualisieren zu können. Stellen Sie dann die Feldauflösung auf 512 Pixel mal 512 Pixel ein.Danach die Abtastgeschwindigkeit auf das schnellstmögliche Maß einstellen, was etwa 1,2 Sekunden pro Scan beträgt. Mit dem Einweg-Scan-Modus Emissionsspektren sammeln, wobei Bandpassfilter von 503 bis 548 Nanometer für den 488-Nanometer-Laser und von 624 bis 724 Nanometer für den 559-Nanometer-Laser verwendet werden. Anschließend die Identität der mit Kalziumfarbstoff beladenen Zellen als Astrozyten bestätigen, indem die SR 1 0 1-Ko-Labeling visualisiert wird.Aufzeichnung der Kalziumaktivität von Astrozyten mithilfe des 559-Nanometer-Lasers. Zunächst werden mit der Bildakquisitionssoftware Boxen über die interessierenden Bereiche innerhalb der Zelle, in diesem Fall über die Astrozytenzellkörper, gezeichnet. Anschließend wird eine Box über den Hintergrund als Referenz gelegt.Erhalten Sie 10 Minuten Basalaufzeichnung der spontanen Kalziumaktivität aus den ROIs. Danach wenden Sie einen Agonisten der Wahl in schrittweise steigenden Konzentrationen an und lassen Sie mindestens fünf Minuten zwischen den Applikationen, um eine mögliche Rezeptordesensibilisierung zu verringern. Am Ende der Aufzeichnung geben Sie ein Cocktail aus Agonisten für andere astrozytäre GQ, GPCR als positiven Kontrolltest für die Inpact-astrozytären GQ-GPCR-Signalwege.Nach Abschluss der Kalziumaufzeichnung stille Bilder mit den 488 Nanometer- und 559 Nanometer-Lasern aufnehmen, um später die Identität der Astrozyten und die Platzierung der ROI zu bestätigen. Hier sind repräsentative Bilder von Zellen im Aufzeichnungsfeld, die unter Kontrollbedingungen oder in Gegenwart von TTX inkubiert wurden und den Kalziumindikatorfarbstoff Oregon Green BAPTA-1 sowie SR 101 aufgenommen haben. Die Überlagerung beider Signale zeigt die Astrozyten, die mit dem Kalziumindikator beladen sind. Rechtecke werden über die Somen einzelner Astrozyten gezeichnet, um die Fluoreszenzintensität im grünen Kanal über die Zeit zu erfassen und so die Kalziumaktivität in Astrozyten zu überwachen.Hier sind die Beispielkurven aus den Aufnahmekammern der Kalziumaktivität in den Astrozyten. Astrozyten, die in TTX inkubiert wurden, zeigen eine erhöhte spontane Aktivität und stärkere evozierte kalziumabhängige Antworten der Gruppe I MGLR, wie durch die Veränderungen im Antwortmuster belegt. Beispiele für einzelne Spitzen, mehrfache Spitzen und plateauartige Kalziumtransienten werden gezeigt, sowie repräsentative Spuren der Kalziumaufzeichnungen aus Astrozyten in Schnitten, die in 5,0 Millimolar Kalium-ACSF zur Depolarisation der Neurone und Erhöhung ihrer basalen Feuerrate im Vergleich zu 2,5 Millimolar Kalium-Kontroll-ACSF inkubiert wurden. Astrozyten, die mit 5,0 Millimolar Kalium-ACSF inkubiert wurden, weisen weniger spontane somatische Kalziumtransienten und schwächere DHPG-evozierte Antworten auf als Astrozyten in Kontroll-ACSF. Die Kalziumbildgebung in Astrozyten liefert einen guten funktionellen Überblick über Veränderungen in der Signalübertragung über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren.Allerdings kann damit nicht genau bestimmt werden, an welcher Stelle der Signaltransduktionskaskade diese Veränderungen stattfinden. Daher wäre ein ergänzender Ansatz, die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder Durchflusszytometrie an Astrozyten durchzuführen, die grün fluoreszierendes Protein exprimieren, dann einen Antikörper gegen den G-Protein-gekoppelten Rezeptor der Wahl aufzubringen und anschließend Western Blots durchzuführen, um nach Veränderungen in der Rezeptor-Expressionsstärke zu suchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Skalierung der Astrozyten-tqt-PCR-Aktivität misst, die auf Veränderungen der neuronalen synaptischen Transmission folgt, indem man spontane und Agnes-induzierte Kalziumereignisse in Astrozyten aufzeichnet.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Die Herstellung von akuten Hirnschnitten aus isolierten hippocampi, sowie die gleichzeitige elektrophysiologischen Ableitungen von Astrozyten und Neuronen...

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Die Eigenschaften und Funktionen der intrazellulären Ca2+-Signale der Astrozyten im Striatum sind noch unvollständig erforscht. Wir beschreiben Methoden zur Expression genetisch kodierter Calciumindikatoren in striatalen Astrozyten unter Verwendung von Adeno-assoziierten Viren des Serotyps 2/5 (AAV2/5) sowie Verfahren zur zuverlässigen Abbildung von Ca2+-Signalen in striatalen Astrozyten in situ.

Abbildungsintrazellulären Ca 2+ Signale in Striatal Astrozyten von erwachsenen Mäusen mit gentechnisch-kodierte Kalzium Indikatoren

Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung einer Stichverletzung im Vorderhirn bei erwachsenen Mäusen. Die Stichverletzung führt zu einer schweren reaktiven Gliose und Glianarbenbildung, die anschließend mit immunhistochemischen Standardmethoden untersucht werden können.

Auslösen Reactive Gliose<em&gt; In Vivo</em&gt; Durch eine Vorderhirn Stab Injury

Vagusnervstimulation (VNS) hat sich als Instrument zur zielgerichteten synaptischen Plastizität im Vorderhirn zu veranlassen, eine Reihe von Verhaltensweisen ändern entstanden. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Umsetzung VNS, um die Konsolidierung der Angst Aussterben Speicher zu erleichtern.

Vagusnervstimulation als Instrument zur Plastizität in Pathways Relevant für Extinction Learning herbei

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Vorbereitung der akuten Gehirnscheiben mit einem optimierten N-Methyl-D-Glucamine-schützende Recovery-Methode

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Aufnahme synaptische Plastizität in akuten Hippocampal Scheiben gepflegt in einem kleinvolumigen Recycling - Perfusions- und untertauchen-Typ-Kammer-System

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Analyse der Größe, Form und Direktionalität von Netzwerken von gekoppelten Astrozyten

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Implantation eines kranialen Fensters für wiederholte In-vivo-Bildgebung bei wachen Mäusen

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Ex vivo Optogenetische Befragung der synaptischen Übertragung und Plastizität über große Entfernungen vom medialen präfrontalen Kortex zum lateralen entohinalen Kortex

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Induktion der Langzeitplastizität der intrinsischen neuronalen Erregbarkeit in Neuronen des dorsalen lateralen Genikulatkerns

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Eine zweifarbige Faserphotometriemethode zur Aufzeichnung der Aktivität von Astrozytenneuronen über mehrere Gehirnregionen während des Lern- und Gedächtnisverhaltens

Lernen Sie eine Methode zur Induktion langfristiger Veränderungen astrozytärer GPCR-Signalwege durch Manipulation neuronaler Feuerraten in akuten Hippocampus-Schnitten von Mäusen. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung astrozytärer Rezeptorplastizität.

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

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