Ein Low-Cost-Methode für die Analyse von Beschlagnahme-ähnliche Aktivität und Bewegung in Drosophila

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Veränderungen des Bewegungsapparates oder des Anfallsverhaltens bei Drosophila zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem die Fliegen zunächst unter Verwendung von Anästhesie in einzelne Fläschchen getrennt werden. Als nächstes wird eine einfache Webcam verwendet, um die Bewegung der Fliegen aufzuzeichnen.

Die Daten werden dann in Image J importiert, um die Analyse zu starten. Schließlich wird eine speziell entwickelte Fliegenanalysesoftware verwendet, um die Entfernung, Geschwindigkeit und Dauer der Bewegung während des Aufzeichnungszeitraums zu bestimmen. Letztendlich kann dieser Assay Veränderungen des Bewegungs- oder Anfallsverhaltens zeigen, die mit genetischen und pharmakologischen Manipulationen verbunden sind.

Diese kostengünstige Aufzeichnungstechnik, die wir beschreiben werden, kann sowohl zur Analyse des Anfallsverhaltens als auch der Fortbewegung bei Fruchtfliegen verwendet werden. Insbesondere haben wir es verwendet, um genetische und pharmakologische Manipulationen zu identifizieren, die das Anfallsverhalten bei diesen Fliegen verändern. Aber heute wird Chris Burner, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter in meinem Labor, diese Technik demonstrieren: Um mit der Einrichtung der Webcam zu beginnen, die die Fliegen während der Bewegungs- und Anfallstests aufzeichnet.

Sobald die Kamera an Ort und Stelle ist, öffnen Sie das praktische VI-Softwareprogramm. Um die Aufnahmeeinstellungen anzupassen, wählen Sie die Option Zeitrafferbilder auf der Registerkarte "Aufnahme" aus, und wenn sich das neue Fenster öffnet, wählen Sie die Webcam als Aufnahmegerät aus. Für die meisten Experimente ist eine Videobildgröße von sechs 40 x vier 80 ausreichend. Wählen Sie unter der Komprimierungsoption den Intel IUV-Codec aus und stellen Sie die Sekunden pro Frame entsprechend dem Assay ein.

Erstellen Sie auf der Registerkarte "Erweitert" eine Bitmap-Bilddatei für jede Aufnahme und wählen Sie einen Ordner aus, in dem das Programm den Bildstapel nach der Aufnahme speichern soll. Lege als nächstes eine tote Fliege auf ein Blatt Papier. Klicken Sie auf das Feld für die Videoeinstellungen und passen Sie die Einstellungen auf der Registerkarte Geräteeinstellungen an, bis der helle weiße Hintergrund in klarem Kontrast zum dunkleren Flügel steht.

Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um die Aufnahme zu starten. Sobald der Aufnahmezeitraum abgelaufen ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Stopp. Der Bildstapel sollte sich nun in dem Ordner befinden, der ausgewählt wurde, um den Assay der lokomotorischen Aktivität zu starten.

Übertragen Sie die Fliegen in einzelne Fläschchen, die mit einem Wattestärkel verschlossen sind. Lassen Sie die Fliegen 20 bis 30 Minuten ungestört sitzen, bevor Sie fortfahren. Nach dieser Zeit klopfen Sie die zu testende Fliege vorsichtig aus dem Fläschchen und unter einen Deckel der Petrischale.

Die Abdeckung sollte kleine Schlitze enthalten, damit der Luftstrom den Flyer unter der zuvor eingerichteten Webcam positionieren kann. Wenn Sie fertig sind, drücken Sie Start, um mit der Aufzeichnung der Bewegungsaktivität zu beginnen. Der erste Schritt des Anfallstests besteht darin, zwei Tage alte, anfallsempfindliche Fliegen entweder mit Standardmedien oder mit dem zu testenden Medikament gemischten Medien zu füttern.

Nach zwei Tagen der Fütterung übertragen Sie die Fliegen durch vorsichtiges Klopfen in einzelne leere Fläschchen und verschließen die Fläschchen mit einem Wattestopfen. Lassen Sie die Fliegen 20 Minuten lang ungestört sitzen, bevor Sie sie beobachten. Wenn Sie fertig sind, wirbeln Sie ein Fläschchen auf einem Laborwirbel oder verwenden Sie die höchsten Einstellungen für 10 Sekunden.

Platzieren Sie die immobilisierte Fliege sofort auf einem weißen Blatt Papier direkt unter der Webcam. Sobald Sie an Ort und Stelle sind, beginnen Sie mit der Aufnahme. Das ist die Aktivität.

Die Fliege durchläuft schnelle, unkoordinierte Bewegungen, die von Lähmungsphasen unterbrochen werden. Die Aufnahme ist beendet, sobald sich die Fliege aufgerichtet hat. Um mit der Analyse der Daten zu beginnen, öffnen Sie die kostenlose Bildbearbeitungssoftware image J nach dem Öffnen.

Importieren Sie den gewünschten Bildstapel, indem Sie zuerst auf die Registerkarte Datei klicken und dann Importieren auswählen. Und schließlich die Bildsequenz. Wählen Sie den Ordner aus, der den Image-Stack enthält, und öffnen Sie ein Image.

Wenn das Dialogfeld "Sequenzoptionen" geöffnet wird, wählen Sie "Namen numerisch sortieren" und dann "Auswählen". Okay. Der Bildstapel wird nun in Image J geladen.Wählen Sie als Nächstes die Registerkarte Bild aus und legen Sie den Werttyp auf acht Bit fest. Klicken Sie erneut auf die Registerkarte "Bild" und wählen Sie unter der Option "Anpassen" die Option "Schwellenwert" aus.

Dadurch wird der Schwellenwert in allen Bildern so festgelegt, dass jedes Bild aus einem weißen Hintergrund besteht, wobei die Fliege in einen schwarzen Punkt umgewandelt wird. Dadurch wird auch das Dialogfeld "Schwellenwert" geöffnet, in dem die Grenzwerte angepasst werden können. Scannen Sie die Bilder, um zu sehen, ob sie zusätzliche schwarze Punkte enthalten oder ob der Fleck fehlt.

Passen Sie bei Bedarf den Schwellenwert an, um Probleme zu beheben. Nachdem Sie die Anpassungen vorgenommen haben, wählen Sie im Dialogfeld "Schwellenwert" die Option "Anwenden" aus. Wenn das Dialogfeld "In Maske konvertieren" geöffnet wird, klicken Sie auf "OK", um den Schwellenwert für den Bildstapel festzulegen.

Um die Bewegung der Fliege in Pixeln zu messen, wählen Sie das Multi-Tracker-Plugin unter dem Plugins-Tab aus. Wenn das Dialogfeld für die Objektverfolgung angezeigt wird, klicken Sie auf alle vier angegebenen Optionen und wählen Sie sie aus. Okay. Das Multi-Tracker-Plugin hängt dann Koordinaten an das Schwarz an.

in jedem Slice und listen Sie diese im Ergebnisfenster auf, ebenso wie die Gesamtlänge in Pixel. Das Pfadfenster zeigt die grafische Darstellung des Pfades an, den die Fliege genommen hat. Kopieren Sie die X- und Y-Koordinatenliste aus dem Ergebnisfenster, und fügen Sie die Daten in eine Excel-Tabelle ein.

Wenn eine Folie im Stapel kein schwarzes Zeichen enthält, bleibt das Multi-Tracker-Programm bei dieser Folie stehen. In diesem Fall legen Sie den Schwellenwert für den Stack neu fest, um sicherzustellen, dass die Fliege als Schwarz registriert wird.

auf der betreffenden Folie. Um die Pfadlängen von Pixeln in Zentimeter umzuwandeln, nehmen Sie ein Bild von zwei Punkten auf, die in einem bekannten Abstand voneinander auf einem leeren weißen Blatt Papier angeordnet sind. Bestimmen Sie die XY-Pixelkoordinaten für die beiden Punkte, und verwenden Sie diese Informationen, um die Anzahl der Pixel zu bestimmen, die einem Zentimeter entspricht, um genauere Ergebnisse zu erzielen.

Entfernen Sie Rauschen aus den Bildern, indem Sie die XY-Koordinaten in ein speziell erstelltes Fliegenanalyseprogramm importieren. Importieren Sie nach dem Öffnen Daten von jedem Genotyp oder jeder Behandlung in separate Tabellenkalkulationen. Wählen Sie als Nächstes die Registerkarte Zusammenfassungsblatt aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Klick auf mich.

Wählen Sie einen Schwellenwert entsprechend der Art der Analyse aus, klicken Sie auf OK, und das Programm berechnet die Geschwindigkeit, die Zeit und die Entfernung der Bewegung. Diese repräsentativen Pfade zeigen eine anfallsähnliche Aktivität bei mutierten Fliegen mit und ohne Metformin-Behandlung. Die Anfallsaktivität war bei den beiden getesteten Mutanten mit der Behandlung verringert.

Metformin reduzierte sowohl die während des Anfallstests zurückgelegte Strecke als auch die Gesamtdauer der anfallsähnlichen Aktivität signifikant. Im Gegensatz dazu gab es bei diesen einzelnen Fortbewegungsbahnen keine Veränderung der mittleren Geschwindigkeit. Der Weg der Wildtyp-CS-Fliege zeigt eine Konzentration am Rand der kreisförmigen Arena.

Während der Weg der A-mutierten BSS-Fliege die gleiche Konzentration aufweist, jedoch mit insgesamt weniger Bewegung. Beim Testen der Fortbewegung in einer neuartigen Umgebung zeigten die BSS-Mutanten eine signifikante Verringerung der Weglänge im Vergleich zu CS-Fliegen. Der Assay erkannte auch Veränderungen in der Bewegungsgeschwindigkeit während der Erkundung der CS-Fliege während des Lokomotor-Assays.

Die BSS-Fliege blieb während des gesamten Versuchs relativ inaktiv, abgesehen von einigen Aktivitätsschüben. Eines der wichtigsten Dinge, die Sie bei der Durchführung eines dieser Verhaltenstests mit dieser Technik beachten sollten, ist sicherzustellen, dass Sie die Fliegen vor den Aufnahmen nicht betäuben. Es stellt sich heraus, dass eine Anästhesie sowohl das Anfallsverhalten als auch das Bewegungsverhalten beeinflusst und Ihre Ergebnisse erheblich verändern kann.