Name: Ein Low-Cost-Methode für die Analyse von Beschlagnahme-ähnliche Aktivität und Bewegung in Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-19T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Erfahren Sie eine kostengünstige Methode zur Analyse von Lokomotion und Anfallsaktivität bei Drosophila melanogaster mittels Webcam und spezialisierter Software. Diese Technik ermöglicht die Quantifizierung von Bewegungsmustern.

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Die Autoren möchten auch dank Kris Burner, Stephen McKinney, Laura Tobin, Jenny Gilbreath, Ashley Olley, Megan Hoffer, und Megan Hyde für ihre Arbeit bei der Feinabstimmung dieser Test auszudrücken.

1. Erstellung von individuellen Fliegen für Locomotion Assay <ol><li> Über fliegt durch leichtes Klopfen in einzelne leere Fläschchen und Kappe die Fläschchen mit einem Wattebausch. Lassen Fliegen ungestört 20-30 min vor Beobachtung zu sitzen. Es ist wichtig, um die Fliegen in den Stunden vor der Verhaltensbeobachtung nicht betäuben wie frühere Studien haben gezeigt, Anästhesie Exposition Verhalten zu ändern im Vergleich zu 14 narkotisierten Fliegen. </li><li> Klopfen Sie leicht die Fliege aus dem Fläschchen und legen einzelne Fliegen unter einem Durchmesser von 5 cm Petrischale Deckel (5 mm hoch) mit kleinen Schlitzen auf Luftdurchgang zu ermöglichen. Illuminate von unten und beobachten Sie die Fliegen mit einer Webcam über der Petrischale montiert. </li></ol> 2. Erstellung von individuellen Fliegen für Beschlagnahme Assay <ol><li> Feed-zwei Tage alten Beschlagnahme empfindlich Fliegen entweder Standard-Hefe / Maismehl / Agar-Medien-oder Standard-Medien direkt mit Drogen gemischt. Für die hier vorgestellten Daten wurden Fliegen entweder ein unterwegs zugeführtf Standardmedien oder 1 g Standardmedien mit 25 mg Metformin gemischt. </li><li> Nachdem die Fliegen haben für zwei Tage auf die Medien oder Medien sowie Drogen zugeführt wird, übertragen Sie sie durch leichtes Klopfen in einzelne leere Flaschen und Fläschchen, die Kappe mit einem Wattebausch. Lassen Sie fliegt nach 20 Minuten ruhig stehen, bevor Beobachtung. Es ist wichtig, um die Fliegen in den Stunden vor der Verhaltensbeobachtung nicht betäuben wie frühere Studien haben gezeigt, Anästhesie Exposition Verhalten zu ändern im Vergleich zu 14 narkotisierten Fliegen. </li><li> Vortex einzelnen Ampullen mit einer Fliege auf einem Vortexer Labor mit der höchsten Einstellung für 10 Sekunden. Legen Sie die immobilisiert Fliege auf einem leeren weißen Blatt Papier direkt unter einer Webcam über der Papier montiert. </li></ol> 3. Video Recording <ol><li> Nehmen Sie die Bewegung oder die SLA mit dem Software-Programm HandyAvi <a href="http://www.azcendant.com/download.htm">http://www.azcendant.com/download.htm</a> . Dieses Programm verwendet die Webcam andie Aufnahmen auf der Basis der Benutzereinstellungen. </li><li> Wählen Sie die Option Bilder Zeitraffer der Registerkarte Capture Wenn das Fenster öffnet, wählen Sie die Webcam als Aufnahmegerät. Bei den meisten Versuchen wurde die Videobildgröße von 640 x 480 ist ausreichend. </li><li> Wählen Sie Intel IYUV Codec für die Komprimierung und wählen 0,1 sec / Rahmen für die Beschlagnahme-Assay oder wählen 0,1-0,5 sec / Rahmen für die Bewegung Assay. Auf der Registerkarte Erweitert, wählen Sie schaffen ein. BMP-Bild-Datei für jede Erfassung und wählen Sie einen Ordner für das Programm, um die Bilder, die es braucht (die Bildstapel) zu speichern. </li><li> Legen Sie eine tote Fliege auf dem Blatt Papier. Klicken Sie auf das Video Feld Einstellungen und passen Sie die Einstellungen auf der Registerkarte Geräteeinstellungen so, dass es einen hellen weißen Hintergrund und eine klare Kontrast zu den dunkleren Fliege. </li><li> Klicken Sie auf die Start-Taste, um die Aufnahme zu starten. Sobald die Aufnahmedauer beendet ist, klicken Sie auf die Stopp-Taste. Die Bildstapel sollte nun in der ausgewählten Ordner. Hinweis: Vor der Aufnahme sicher, dass die folder für die Bildstapel ausgewählt ist leer. </li></ol> 4. Datenanalyse mit ImageJ <ol><li> Offene NIH kostenlosen Bildbearbeitungssoftware ImageJ, die heruntergeladen werden kann <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a> . Hinweis: Neben dem Herunterladen des Programms, muss der Multitracker-Plug-in heruntergeladen und installiert, wie bei angegeben werden <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html</a> . </li><li> Importieren Sie die Bildstapel in ImageJ, indem Sie auf der Registerkarte Datei und wählen Sie dann Import → Bildsequenz. <ol><li> Wählen Sie den Ordner, der die Bildstapel enthält, markieren Sie eines der Bilder und wählen Sie geöffnet. Eine Sequenz Optionen Dialogfeld wird geöffnet. Klicken Sie auf die Namen numerisch sortieren und wählen Sie OK und die Bildstapel werden in ImageJ geladen werden. </li></ol></li><li> Schwellen alle Bilder, so dass jedes aus einem weißen Hintergrund mit der Flug wobeiumgewandelt, um einen schwarzen Punkt. Um diesen Prozess zu beginnen, konvertieren Sie das Bild in ein 8-Bit-Format, indem Sie → 8-Bit-Typ unter der Registerkarte Bild. <ol><li> Klicken Sie auf der Registerkarte Bild und wählen Sie erneut einstellen → Threshold. Dies eröffnet den Threshold Dialogbox, in der die Schwelle abgeschnitten Punkt kann eingestellt werden. </li><li> Scannen Sie durch die Bilder zu sehen, ob es zusätzliche schwarze Punkte oder wenn ein Stück fehlt ein schwarzer Punkt. Wenn dies der Fall ist, der Schwellenwert eingestellt werden, um das Problem zu lindern. Regel die Schwelle muss nicht als Standardprogramm auf einen angemessenen Wert eingestellt werden. Hinweis: Jede Folie in der Stapel sollte nur ein schwarzer Punkt, der die Position der Fliege haben. </li><li> Wählen Sie gelten in der Schwelle Dialog und eine Umwandlung in Dialog-Maske wird geöffnet. Klicken Sie nicht auf eine der Optionen, sondern einfach auf OK, um Schwellen klicken Sie auf die Bildstapel. </li></ol></li><li> Nach den Schwellenbildstapel, wählen Sie den Multitracker-Plug-in auf der Registerkarte Plugins, ummessen die Bewegung der Fliege in Pixel. Der Objekt-Tracker Dialogfeld erscheinen. <ol><li> Klicken Sie auf alle vier Optionen im Dialogfeld gegeben, und wählen Sie OK. Der Multitracker Plug-in wird dann bringen Koordinaten an dem schwarzen Punkt in jeder Scheibe und listen diese im Fenster Ergebnisse sowie die gesamte Weglänge in Pixel. Das Fenster Pfade gibt eine grafische Anzeige des Weges die Fliege nahm. </li><li> Kopieren Sie die x-und y-Koordinatenliste aus dem Fenster Ergebnisse und fügen Sie die Daten in eine Excel-Tabelle. Wenn eine Folie in der Stapel nicht über einen schwarzen Punkt in ihr, wird die Multitracker-Programm an dieser Folie zu stoppen. Wenn dies geschieht, ist es notwendig, zurück auf 4,2 und Re-Schwelle den Stapel Schritt, um sicherzustellen, dass die Fliege Register als schwarzer Punkt in der Folie in Frage. </li></ol></li><li> Um wandeln die Weglängen von Pixel cm, einen separaten Bild von zwei Punkten, die einen cm auseinander auf ein weißes Blatt Papier angeordnet sind. <ol><li> Folgen Sie der obenSchritte (3.1-4.4.2), um die x bestimmen, y-Koordinaten für die beiden Pixel-Punkten und verwenden diese Informationen, um die Anzahl der Pixel, die einen cm zu bestimmen. Dieser Umrechnungsfaktor wird in Schritt fünf verwendet, um Bewegungsdaten in cm zu erzeugen. Hinweis: Sobald dies erledigt ist, ist es wichtig, die für alle zukünftigen Aufnahmen feste Kamera halten. Jedes Mal, wenn die Kamera bewegt wird oder eingestellt werden, muss man diesen Schritt wiederholen, um die Pixel cm konvertieren. </li><li> Die Pfadlänge, die von der Multitracker-Plug-in erzeugt wird überschätzt Bewegung, weil geringe Schwankungen der Körperposition und der Lichtintensität / Reflexion wird die Größe und die Mitte der schwarzen Punkt, der erzeugt wird, wenn Schwellen die Bilder beeinflussen. Dieses Geräusch muss, um eine genaue Schätzung der Fliege Bewegung bekommen entfernt werden. </li></ol></li></ol> 5. Datenanalyse mit Excel <ol><li> Entfernen Sie das Rauschen aus den aufgezeichneten Daten durch den Import der Serie von x, y-Koordinaten durch die Multitracker pr erzeugtOgram in Fly-Analyse, einer Excel Visual Basic-Programm von den Autoren. (Das Programm ist durch Kontaktieren der Autoren verfügbar.) </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche Klicken Sie mich an und wählen Sie einen Schwellenwert Abschaltung. Einen Schwellenwert von 0,5 cm / sec Wählen Sie für SLA-Analyse oder wählen Sie einen Wert zwischen 0,1 bis 0,3 cm / sec für Bewegungsanalyse. Klicken Sie auf OK und das Programm wird die Geschwindigkeit, Zeit und Strecke der Bewegung zu berechnen. Hinweis: Das Programm verwendet eine Schiebefenster-Analyse, um die Daten in aufeinanderfolgenden Bins 0,5-1,0 sec bewerten und berechnet die Geschwindigkeit während dieses Fensters. Alles, was über den benutzerdefinierten Abschaltung wie Flugbewegung behandelt. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Bei der Prüfung des Bewegungs oder Bewegungsmuster in Drosophila, ist es nützlich, in der Lage, Informationen über die zurückgelegte Wegstrecke, die Geschwindigkeit der Bewegung und die Bewegungsmuster zu extrahieren. Um diese Informationen zu extrahieren, hat teure Ausrüstung traditionell verwendet worden, die oft unerschwinglich für kleinere Labore oder Labors, die solche Tests sparsam verwenden möchten 4,8,9 ist. Die hier beschriebenen Assays können zur Bestimmung der ...

Aufgrund ihrer kurzen Lebensdauer und die robusten genetische Werkzeuge zur Verfügung, ist Drosophila melanogaster eine ausgezeichnete Modellsystem für die Untersuchung der Ursachen verschiedener Erkrankungen und die zugrunde liegende Physiologie der verschiedenen biologischen Prozessen. In vielen Fällen ist es vorteilhaft, um die Auswirkungen, dass Verhaltens, genetische oder pharmakologische Manipulationen haben auf die Fortbewegung in diesen Modellorganismen 1,2 messen. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die üblicherweise zur Messung der Flugbewegung in zwei Dimensionen 3-7 verwendet werden. Diese Systeme können die Tracking von mehreren Fliegen gleichzeitig unterstützt und kann Geschwindigkeit, Plattenpfadlängen messen und aufzeichnen den Prozentsatz der Zeit eine Fliege verbrachte bewegt. Sie wurden benutzt, um die Bewegung in einer Vielzahl von Zusammenhängen einschließlich der Auswirkungen von Drogen auf die Fortbewegung und die sexuelle Natur der Fliege dimorphic Bewegung 6-9 studieren. Der wesentliche Nachteil dieser Systeme sind die Kosten der Spur system oder die entsprechende Software und Kamera. In einigen Fällen kann dies in die Tausende von Dollar. Die Kosten sind ein besonderes Anliegen für ein Labor, die nur noch eingeschränkte Nutzung würde ein solches System, zum Beispiel, Quantifizierung Lokomotive Muster eines neu isolierten Mutante. Eine einfachere, aber weniger robuste Methode ist es, Systeme, die Rekord-Bewegung auf, wie oft eine Fliege kreuzt einen Infrarotlichtstrahl Pfad, der in der Mitte des geschlossenen Rohr 10,11 platziert wird, verwenden. Während solche Systeme können wertvolle Informationen über die Bewegung und Schlaf-Wach-Zyklen geben, können sie über oder unter Schätzung Bewegung, weil sie nicht den tatsächlichen Pfad der Fliege zu erfassen. So wird beispielsweise Fliegen, die erhebliche Bewegung zeigen an den Enden der Röhre so niedrig Bewegung registrieren fliegt obwohl zusätzliche hochauflösende Methoden verwendet wurden, um zu versuchen, diese Einschränkungen zu umgehen 12. Einfacher und noch billiger sind Klettergeräte, die geotaxi messens, die Aufwärtsbewegung entfernt, durch ein einzelnes Rohr oder eine Reihe von Rohren 2,13. Während solche Systeme sind billig und leicht erkennen können Geotaxis Mängel, scheitern sie an viele andere Aspekte der Bewegung, die von Interesse für die Ermittler wäre zu erfassen. Für viele Labors, eine kostengünstige robuste Analysesystem, das einfach zu gründen und zu betreiben wäre eine vorteilhafte Werkzeug zur Charakterisierung von Verhaltensunterschiede in D. melanogaster Stämme sein. Hier beschreiben wir einen Assay, der Set-up kann die weniger als zweihundert Dollar und ist in der Lage, Informationen über den Weg, Geschwindigkeit und Dauer der Bewegung der Fliege geben. Um die Wirksamkeit des Tests nachweisen, Daten, die zeigen, dass es verwendet werden kann, um zu identifizieren, präsentieren wir: 1) eine Bewegungs Defekt in einem Bang-und Kleinschreibung (BS)-Mutante, die anfällig für Anfälle und 2) die Fähigkeit des Medikaments Metformin, ist die wird häufig verwendet, um Typ-II-Diabetes zu behandeln, um die Intensität der Beschlagnahme-ähnliche Aktivität (SLA) i reduzierenn zwei BS Mutanten.

<table><tbody><tr><td>WebCam</td><td>Logitech</td><td>Pro900</td><td>Jede hochwertige Webcam reicht aus.</td></tr><tr><td>HandiAVI Zeitraffer-Software</td><td>Azcendant Software</td><td></td><td>Die neueste Version finden Sie unter http://www.azcendant.com/</td></tr> <tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Die neueste Version finden Sie unter http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Multiracker Plug-In</td><td>NIH</td><td></td><td>Die neueste Version finden Sie unter http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>VWR</td><td>Vortex Genie 2</td><td>Die meisten Vortexer in Standardgröße, wie z. B. der Vortex Genie 2, reichen aus.</td></tr><tr><td>5 cm Petrischalenabdeckung</td><td>LabM Limited</td><td>D011</td><td>Kleinere oder größere Petrischalenabdeckungen können für einen Arena in Bewegungsassay verwendet werden.</td></tr><tr><td>Leuchtkasten</td><td>nach Maß</td><td></td><td>Gebaut aus Schrott. Die Beleuchtung wird für den Lokomotionsassay verwendet. Abhängig von der Raumbeleuchtung ist es möglich, den Assay ohne den Leuchtkasten durchzuführen.</td></tr></tbody></table>

ein low-cost-methode für die analyse von beschlagnahme-ähnliche aktivität und bewegung in<em&gt; drosophila</em

A Low-cost Method for Analyzing Seizure-like Activity and Movement in Drosophila

Video-Tracking-Systeme sind weit verbreitet, um Drosophila melanogaster Bewegung erkennen und analysieren verschiedene Anomalien im Verhalten Lokomotive. Während diese Systeme kann eine Fülle von Verhaltens Informationen zu liefern, können die Kosten und die Komplexität dieser Systeme unerschwinglich für viele Labore. Wir haben eine Low-Cost-Assay zur Messung Lokomotive Verhalten und Beschlagnahme Bewegung in D. melanogaster entwickelt. Das System verwendet eine Web-Cam Bilder, die mit einer Kombination aus preiswerten und freie Software auf die Spur der Abstand bewegt verarbeitet werden können, zu erfassen, die mittlere Geschwindigkeit der Bewegung und die Dauer der Bewegung während einer bestimmten Zeitspanne. Um den Nutzen dieses Systems zu demonstrieren, untersuchten wir eine Gruppe von D. melanogaster-Mutanten, die Bang-und Kleinschreibung (BS) Gelähmte, die 3-10 mal anfälliger für Beschlagnahme-ähnliche Aktivität (SLA) als Wildtyp-Fliegen sind. Unter Verwendung dieses neuartigen Systems, waren wir in der Lage, zu erkennen, dass die BS Mutant Knall sinnlos (BSS) weist geringere Sondierungsfortbewegung in einer neuen Umgebung als Wildtyp-Fliegen. Außerdem wurde das System verwendet, um zu identifizieren, dass das Medikament Metformin, die üblicherweise verwendet wird, um Typ-II-Diabetes, reduziert die Intensität des SLA in den BS-Mutanten.

Die hier beschriebene Technik bereits verwendet wurde, um Unterschiede in der SLA in den Drosophila-Mutanten BS 1 zu analysieren. Die hier dargestellten Ergebnisse beziehen die BS-Stämme leicht schockiert (EAS), Knall sinnlos (BSS) und technischen KO (TKO). Das EAS-Locus kodiert für ein Ethanolamin-Kinase in Phosphatidylethanolamin 15 Synthese beteiligt und die tko Locus kodiert für eine mitochondriale riboprotein 16. Die BSS-Mutation...

Mit einer Webcam und einer Kombination aus kostenlosen und kostengünstigen Software-Programme können Lokomotive Muster in Drosophila melanogaster analysiert werden, um Unterschiede in der Geschwindigkeit, Distanz, Zeit und der verschiedenen motorischen Aktivitäten zu erkennen.

Ein Low-Cost-Methode für die Analyse von Beschlagnahme-ähnliche Aktivität und Bewegung in<em&gt; Drosophila</em

Video tracking systems have been used widely to analyze Drosophila melanogaster movement and detect various abnormalities in locomotive behavior. While ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Veränderungen im Lokomotionsverhalten oder in Anfallserscheinungen bei Drosophila zu identifizieren. Dazu werden die Fliegen zunächst unter Verwendung einer Anästhesie in einzelne Gefäße getrennt. Anschließend wird mithilfe einer einfachen Webcam die Bewegung der Fliegen aufgezeichnet.Anschließend werden die Daten in Image J importiert, um die Analyse zu starten. Schließlich kommt eine eigens entwickelte Software zur Fluganalyse zum Einsatz, um die während der Aufzeichnungszeit zurückgelegte Distanz, die Geschwindigkeit und die Dauer der Bewegung zu bestimmen. Letztendlich kann dieser Test Veränderungen im Lokomotions- oder Anfallsverhalten aufzeigen, die mit genetischen und pharmakologischen Eingriffen assoziiert sind.Nun, diese kostengünstige Aufnahmetechnik, die wir beschreiben werden, kann sowohl zur Analyse von Anfallsverhalten als auch von Bewegungsabläufen bei Fruchtfliegen eingesetzt werden. Insbesondere haben wir sie verwendet, um genetische und pharmakologische Eingriffe zu identifizieren, die das Anfallsverhalten dieser Fliegen verändern. Heute wird jedoch Chris Burner, ein studentischer Hilfswissenschaftler in meinem Labor, diese Technik demonstrieren. Beginnen Sie damit, die Webcam einzurichten, die die Fliegen während der Bewegungs- und Anfallsversuche aufzeichnen soll.Nachdem die Kamera angebracht ist, öffnen Sie das Hilfsprogramm a VI. Um die Aufnahmeeinstellungen anzupassen, wählen Sie im Reiter „Capture“ die Option „Time-lapse images“ und anschließend im neu geöffneten Fenster die Webcam als Aufnahmegerät aus. Für die meisten Experimente ist eine Videobildgröße von 640 mal 480 ausreichend. Wählen Sie unter der Kompressionsoption den Intel IUV-Codec aus und stellen Sie die Sekunden pro Einzelbild gemäß dem Assay ein.Erstellen Sie unter der Registerkarte „Erweitert“ eine Bitmap-Bilddatei für jede Aufnahme und wählen Sie einen Ordner aus, in dem das Programm den Bildstapel nach der Aufnahme speichern soll. Legen Sie anschließend eine tote Fliege auf ein Blatt Papier. Klicken Sie auf das Feld „Videoeinstellungen“ und passen Sie unter der Registerkarte „Geräteeinstellungen“ die Einstellungen so lange an, bis der helle weiße Hintergrund deutlich vom dunkleren Fliegenkörper abgehoben ist.Klicken Sie auf die Schaltfläche „Start“, um die Aufnahme zu beginnen. Sobald der Aufnahmezeitraum abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Schaltfläche „Stop“. Der Bildstapel sollte sich nun im Ordner befinden, der zu Beginn des Lokomotoraktivitätstests ausgewählt wurde.Überführen Sie die Fliegen in einzelne Röhrchen, die mit einem Wattepfropfen verschlossen sind. Lassen Sie die Fliegen 20 bis 30 Minuten lang ungestört, bevor Sie fortfahren. Danach klopfen Sie die zu testende Fliege vorsichtig aus dem Röhrchen und unter eine Petrischalenabdeckung. Die Abdeckung sollte kleine Schlitze aufweisen, um Luftzirkulation zu ermöglichen. Positionieren Sie die Fliege unter der zuvor eingerichteten Webcam. Wenn Sie bereit sind, drücken Sie auf „Start“, um die Aufzeichnung der motorischen Aktivität zu beginnen. Der erste Schritt des Anfallsassays besteht darin, zwei Tage alte anfallsanfällige Fliegen entweder mit Standardmedium oder mit einem Medium zu füttern, das den zu testenden Wirkstoff enthält.Nach zwei Tagen Fütterung werden die Fliegen durch vorsichtiges Klopfen in einzelne leere Gefäße überführt und die Gefäße mit einem Wattepfropfen verschlossen. Die Fliegen vor der Beobachtung 20 Minuten ungestört stehen lassen. Zum Durchführen wird ein Gefäß auf einem Labor-Vortex-Mischer oder mit den höchsten Einstellungen 10 Sekunden lang vortexiert.Stellen Sie die fixierte Fliege unverzüglich auf ein weißes Blatt Papier direkt unter die Webcam. Sobald sie positioniert ist, beginnen Sie mit der Aufnahme. Diese Aufnahme dient der Erfassung der Fliegenaktivität.Die Fliege wird schnelle, unkoordinierte Bewegungen durchführen, die von Phasen der Lähmung unterbrochen werden. Die Aufnahme wird beendet, sobald sich die Fliege wieder aufgerichtet hat. Um mit der Datenanalyse zu beginnen, öffnen Sie die kostenlose Bildverarbeitungssoftware ImageJ, sobald diese geöffnet ist.Importieren Sie den gewünschten Bildstapel, indem Sie zunächst auf den Datei-Tab und dann auf Importieren klicken. Abschließend wählen Sie Bildsequenz aus. Wählen Sie den Ordner aus, der den Bildstapel enthält, und öffnen Sie ein Bild. Wenn das Dialogfeld „Sequenzauswahl“ geöffnet wird, wählen Sie „Namen numerisch sortieren“ und klicken dann auf „Okay“. Der Bildstapel wird nun in Image J geladen. Wählen Sie anschließend den Bildreiter aus und stellen Sie den Wertetyp auf „8 Bit“. Klicken Sie erneut auf den Bildreiter und wählen Sie unter der Option „Anpassen“ den Schwellenwert aus.Dadurch wird der Schwellenwert in allen Bildern so festgelegt, dass jeweils ein weißer Hintergrund entsteht, auf dem die Fliege in einen schwarzen Punkt umgewandelt wird. Außerdem wird das Dialogfenster für die Schwellenwertanpassung geöffnet, in dem die Grenzwerte angepasst werden können. Blättern Sie durch die Bilder, um zu überprüfen, ob zusätzliche schwarze Punkte vorhanden sind oder ob der Punkt fehlt.Passe gegebenenfalls die Schwelle an, um mögliche Probleme zu beheben. Nachdem die Anpassungen vorgenommen wurden, wählen Sie „Anwenden“ im Dialogfeld „Schwelle“. Wenn das Dialogfeld „In Maske umwandeln“ geöffnet wird, klicken Sie auf „OK“, um den Bildstapel zu schwellen.Um die Bewegung der Fliege in Pixeln zu messen, wählen Sie unter der Registerkarte „Plugins“ das Multi-Tracker-Plugin aus. Wenn das Objekt-Tracker-Dialogfeld erscheint, aktivieren Sie alle vier angegebenen Optionen und klicken Sie auf „Okay“. Das Multi-Tracker-Plugin weist dann Koordinaten an das Schwarze an. in jeder Schnittansicht und listen Sie diese im Ergebnisfenster sowie die Gesamtlänge in Pixeln auf. Das Pfadfenster zeigt die grafische Darstellung des Weges an, den die Fliege genommen hat. Kopieren Sie die Liste der X- und Y-Koordinaten aus dem Ergebnisfenster und fügen Sie die Daten in eine Excel-Tabelle ein.Wenn eine der Folien im Stapel kein Schwarz enthält, wird das Multitracker-Programm bei dieser Folie anhalten. Tritt dies auf, schwellen Sie den Stapel erneut, um sicherzustellen, dass die Fliege als Schwarz registriert wird.in der betreffenden Folie. Um die Weglängen von Pixeln in Zentimeter umzuwandeln, machen Sie ein Bild von zwei Punkten, die einen bekannten Abstand voneinander auf einem leeren weißen Blatt Papier haben. Bestimmen Sie die XY-Pixelkoordinaten der beiden Punkte und verwenden Sie diese Informationen, um die Anzahl der Pixel zu ermitteln, die einem Zentimeter entsprechen, um genauere Ergebnisse zu erhalten.Entfernen Sie das Rauschen aus den Bildern, indem Sie die XY-Koordinaten in ein benutzerdefiniertes Fluganalyse-Programm importieren. Öffnen Sie anschließend die Daten jeder Genotyp- oder Behandlungsgruppe in getrennten Tabellenblättern. Wählen Sie danach die Registerkarte „Zusammenfassung“ aus und klicken Sie auf die Schaltfläche „Klicken Sie hier“.Wählen Sie einen Schwellenwert entsprechend der Art der Analyse aus, klicken Sie auf „OK“, und das Programm berechnet die Geschwindigkeit, Zeit und Distanz der Bewegung. Diese repräsentativen Bahnen zeigen anfallsähnliche Aktivität in mutierten Fliegen mit und ohne Metformin-Behandlung. Die Anfallsaktivität war bei den beiden getesteten Mutanten nach Behandlung verringert.Metformin reduzierte signifikant sowohl die während des Anfallsassays zurückgelegte Distanz als auch die Gesamtdauer der anfallsähnlichen Aktivität. Im Gegensatz dazu zeigte sich keine Änderung der durchschnittlichen Geschwindigkeit in diesen individuellen Bewegungsbahnen. Die Bahn der Wildtyp-CS-Fliege zeigt eine Konzentration am Rand der kreisförmigen Versuchsarena.Während der Pfad einer mutierten BSS-Fliege die gleiche Konzentration aufweist, ist die Gesamtbewegung jedoch geringer. Beim Test der Lokomotion in einer neuen Umgebung zeigten die BSS-Mutanten eine signifikante Verringerung der Pfadlänge im Vergleich zu CS-Fliegen. Der Test detektierte außerdem Veränderungen in der Bewegungsgeschwindigkeit, während die CS-Fliege während des Lokomotionstests erkundete.Die BSS-Fliege blieb während des gesamten Versuchs relativ inaktiv, mit Ausnahme einiger kurzer Aktivitätsschübe. Eines der wichtigsten Dinge, die man beachten sollte, wenn man einen dieser Verhaltensassays mit dieser Technik durchführt, ist sicherzustellen, dass man die Fliegen vor der Aufnahme nicht anästhesiert. Es zeigt sich, dass die Anästhesierung sowohl das Anfallsverhalten als auch das motorische Verhalten beeinflusst und die Ergebnisse erheblich verändern kann.

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Research

Forschung

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