Herstellung von konzentrierten, Lipid-basierte Sauerstoffmikroblasen-Emulsionen von High-Shear-Homogenisierung und Serien Konzentration

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine große Menge selbstassemblierender, lipidbasierter Sauerstoff-Mikrobläschen oder OMS zur intravenösen Sauerstoffgabe herzustellen. Dies wird mithilfe eines Hochscherrührwerks und eines gasdichten Tanks erreicht, um OMS herzustellen und seriell zu konzentrieren. Der zweite Schritt besteht darin, modifizierte Spritzen zu verwenden, um eine LOM-Emulsion mit 70 Volumenprozent Sauerstoff zu extrudieren.

Anschließend wird die Emulsion durch Zentrifugation konzentriert, um einen Sauerstoffschaum mit einem Volumenanteil von 90 % zu erhalten. Der letzte Schritt besteht in der Qualitätskontrolle durch Berechnung des prozentualen Volumenanteils an Sauerstoff und durch Untersuchung der Partikelgrößenverteilung mittels Lichtstreuungstechnologie. Letztendlich erzeugt die Hochscherrhomogenisierung zwei Liter OMS mit einem Sauerstoffvolumengehalt von 90 %.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Herstellungsverfahren wie Sonifikation und Amalgamierung besteht darin, dass die Homogenisierung selbstassemblierende Mikrobläschen in der Größenordnung von Litern erzeugt – ein Volumen, das für Tests an großen Tieren zur therapeutischen Sauerstoffabgabe erforderlich ist. Eine Anwendung dieser Technik liegt in der Behandlung von Patienten mit starker Hypoxämie, da mit Sauerstoffgas gefüllte Mikrobläschen innerhalb von Sekunden Sauerstoff an Desoxyhämoglobin abgeben und dreimal so viel Sauerstoff wie Blut transportieren. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, insbesondere hinsichtlich der Eintauchtiefe des Homogenisierkopfs.

Die Aufrechterhaltung einer rein oxidativen Umgebung und die Unterscheidung zwischen konzentrierter LMS und der wässrigen Phase können schwer nachvollziehbar sein. Das System zur Herstellung lipidbasierter Sauerstoffmikrobläschen oder OMS besteht aus einem Halte- und Konzentrierbehälter (HCT) mit einem einstufigen Mischer, einem in-line-Hochleistungshomogenisator, einer Rollenpumpe zur Förderung der Flüssigkeit zwischen HCT und Homogenisator sowie einem Wärmetauscher.

Um die Systemeinrichtung zu beginnen, stellen Sie einen sterilisierten, weitmundigen, viereinhalb Liter fassenden Glasbehälter mit zwei Anschlüssen am Boden und drei Seitenanschlüssen unter den Einzelstufenmischer. Verbinden Sie einen der Bodenanschlüsse, Anschluss Nummer eins des HCT, mit einem sterilen, durchsichtigen Schlauch mit einem Innendurchmesser von drei Achtel Zoll, etwa 25 cm Länge, der an der Spitze mit einem Dreifachhahn zur Sammlung der konzentrierten Emulsion ausgestattet ist. Verbinden Sie anschließend den zweiten Bodenanschluss, Anschluss Nummer zwei, mit einem sterilen Schlauch mit einem Innendurchmesser von drei Achtel Zoll, etwa 91 cm Länge. Führen Sie diesen Schlauch durch die Rollerpumpe.

Der Eingang des Hochleistungshomogenisators ist mit einem T-Stück ausgestattet, das zwei Anschlüsse umfasst. Schließen Sie einen Schlauch vom Anschluss Nummer zwei über die Rollerpumpe an den Seitenanschluss des T-Stücks an. Verbinden Sie den anderen Anschluss über ein Sauerstoffgas-Durchflussmesser mit geringem Durchfluss mit einem Sauerstofftank.

Verbinden Sie den Auslass des Hochdruckhomogenisators mit dem Einlass eines Inline-Wärmetauschers, der bei vier Grad Celsius gehalten wird. Verbinden Sie den Auslass des Wärmetauschers mit dem Rücklaufanschluss des HCT, um ein geschlossenes System zu erzeugen. Schließen Sie den Sauerstofftank über ein Durchflussmessgerät an den HCT über Anschluss Nummer vier an.

Schließen Sie abschließend einen Gaszusammensetzungsmessgerät, das der Atmosphäre ausgesetzt ist, an den oberen Anschluss des HCT an. Um dieses Verfahren zu beginnen, geben Sie 20 Gramm GMP one two DYS steer oil, SN glycerol three PHOSPHOCHOLINE bzw. DSPC und 10 Gramm Cholesterin in den Boden des HCT. Fügen Sie einen Liter Plasma light A zum HCT hinzu und rühren Sie per Hand eine Minute lang unter möglichst vollständiger Einbindung der Lipide in die wässrige Phase.

Senken Sie den einstufigen Mischer in die wässrige Phase ab, wobei sichergestellt werden muss, dass der gesamte Mischkopf von der wässrigen Phase bedeckt ist. Um zu verhindern, dass Umgebungsluft den Kopfraum kontaminiert, verwenden Sie Gummidichtungen oder Klebeband, um sicherzustellen, dass die Oberseite des HCT gasdicht ist und keine offenen Seitenanschlüsse vorhanden sind. Schalten Sie die an Anschluss Nummer vier angeschlossene Gasquelle ein und warten Sie, bis der Sauerstoffanteil im Kopfraum des HCT über 95 % beträgt. Mischen Sie mit dem einstufigen Mischer die Vorläuferemulsion fünf Minuten lang. Bei 5.000 U/min sollte die resultierende Mischung blassweiß erscheinen und keine sichtbaren Lipidklumpen enthalten.

Nach dem Mischen kann ungenutzte Lipid-Wasser-Mischung bis zu 30 Tage lang bei vier Grad Celsius vor der Verwendung aufbewahrt werden. Spülen Sie das gesamte geschlossene System mit der Vorläuferemulsion, indem Sie die Rollerpumpe mit 1,3 Litern pro Minute oder LPM einschalten. Sobald das System gespült ist, lassen Sie die Pumpe bei 1,3 LPM eingeschaltet, um die Herstellung der LOs zu beginnen.

Schalten Sie den Inline-Hochleistungshomogenisator auf 7.500 U/min ein. Unmittelbar danach schalten Sie den Sauerstofffluss an den Eingangsteil des Homogenisators mit 0,5 L/min ein. Halten Sie den Einzelschneckenmischer im HCT bei 3.500 U/min in Betrieb.

Oms bilden sich an der Grenzfläche von Rotorklingen und Emulsionsgittern innerhalb des Inline-Homogenisators. Innerhalb der ersten paar Minuten sollte die Flüssigkeit sichtbar zähflüssiger werden. Führen Sie das System 15 Minuten lang aus, und schalten Sie dann den Hochscherrhomogenisator und den Sauerstoffzulauf ab.

Dies verhindert die Phasentrennung und sorgt dafür, dass das Produkt innerhalb des HCT relativ homogen bleibt. Beachten Sie, dass das Volumen der gasgefüllten Emulsion während der seriellen Konzentrationsphase etwa um das Zweifache bis Dreifache ansteigen sollte. Die 140-Milliliter-Luer-Stopfenspritzen zur Sammlung der hergestellten OMS wurden zuvor modifiziert, indem 100 Milliliter Luft in die Spritze gezogen und anschließend das überschüssige Kolben- und Spritzenmaterial oberhalb der 140-Milliliter-Marke abgesägt wurde.

Befestigen Sie eine sterile, modifizierte Spritze am Hahn, der am Basisanschluss Nummer eins des Sammelgefäßes angebracht ist; verwenden Sie gezahnte Pinzette, um den Kolben abzusenken und 100 Milliliter Flüssigkeit aufzuziehen; verschließen Sie die Spritze fest und wiederholen Sie den Vorgang, bis die gesamte Flüssigkeit entfernt ist. Zentrifugieren Sie die Spritzen mit dem verschlossenen Ende nach unten in einer gekühlten Schwingkopfzentrifuge bei 225 × g für 10 Minuten. Nach der Zentrifugation sind drei Schichten des Materials sichtbar; drücken Sie die untere Schicht der überschüssigen trüben wässrigen Phase heraus und entsorgen Sie sie.

Die zweite Schicht ist hellweiß und enthält konzentrierte oms. Überführen Sie den konzentrierten Schaum mit Hilfe eines Dreiweghahns in eine gasdichte Glasspritze, um eine Kontamination durch Umgebungsgase zu vermeiden. Entsorgen Sie die letzte Schicht, die freies Sauerstoffgas aus aufgerissenen oms enthält.

Die Schaumqualität kann durch die Berechnung der Gas­konzentration wie folgt beurteilt werden. Ein Schaum hoher Qualität erreicht eine Gas­konzentration von mehr als oder gleich 90 Volumenprozent, wobei als zweite Qualitätskontrolle die Größe der Mikrobläschen mittels optischer Lichtstreuung überprüft wird, um festzustellen, ob die Partikelgröße im erwarteten Bereich liegt. Es sollte beachtet werden, dass eine Änderung der Homogenisierungszeit oder der Formulierung die Blasengröße verändern kann; die Glas­spritzen, die das konzentrierte oms enthalten, müssen daher fest verschlossen sein.

Bei Verwendung eines Luer-Verriegelungsanschlusses können Spritzen bei 22 Grad Celsius, vier Grad Celsius oder minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Kältere Temperaturen können eine verbesserte Lagerstabilität gewährleisten. Mit diesem Protokoll können innerhalb von 90 Minuten bis zu zwei Liter konzentriertes OMS hergestellt werden.

Die Visualisierung einer 10-Mikroliter-Probe von OMS mittels Lichtmikroskopie zeigte sphärisches OMS sowie eine relative Menge an Lipidtrümmern. Bei der Bewertung derselben OMS-Probe durch optische Streuung betrug der mittlere Partikeldurchmesser 2,624 ± 0,332 Mikrometer. Mehr als 90 % der OMS waren weniger als 10 Mikrometer im Durchmesser, und die Population war polydispers.

Die Viskosität der Emulsion hing stark vom Gasanteil und damit von der Mikroblasenkonzentration ab. Zwei-Milliliter-Aliquote der LOM-Emulsion mit 60, 70 und 90 Volumenprozent Gas wurden mittels einer stationären Fließkurve mit einer 40-Millimeter-Parallelplattenanordnung untersucht.

Die Geometrie unter variierender Belastung zeigte, dass bei Werten von 0,1 bis 1000 Pasten mit OMS, die 60 Volumenprozent Gas enthielten, ein radiologisches Profil aufwiesen, das dem menschlichen Blut ähnelte. Der Sauerstoffgehalt von OMS wurde geprüft, indem unterschiedliche Volumina von Sauerstoff, enthalten in 60 Volumenprozent OMS, Aliquots von desaturiertem menschlichem Blut mit einem bekannten Sauerstoffdefizit zugesetzt wurden. Der Zusammenhang zwischen dem zugegebenen Sauerstoffvolumen innerhalb von OMS und der volumetrischen Zunahme des Sauerstoffgehalts des Blutes betrug 1,053 ± 0,03025.

Die getesteten Sauerstoffmikroblasen enthalten nahezu 100 % Sauerstoff, weisen nur wenige eingeschlossene Gasblasen auf und können ihren gesamten Sauerstoffgehalt in vitro effektiv an das menschliche Blut abgeben. Sobald die Technik beherrscht ist, können bei sachgemäßer und effizienter Durchführung innerhalb von 90 Minuten zwei Liter Sauerstoffmikroblasen hergestellt werden. Während des Verfahrens ist es wichtig, die sich ansammelnden Sauerstoffmikroblasen stets visuell zu überwachen und eine Qualitätskontrolle an der Konzentration des Sauerstoffmikroblasenschaums durchzuführen. Nach dieser Herstellungsanleitung können Sauerstoffmikroblasen für die großtechnische intravenöse Injektion und Abgabe therapeutischer Gase verwendet werden.