Herstellung von konzentrierten, Lipid-basierte Sauerstoffmikroblasen-Emulsionen von High-Shear-Homogenisierung und Serien Konzentration

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Herstellung eines großen Volumens an selbstorganisierendem, lipidbasiertem Sauerstoff, Mikrobläschen oder OMS für die intravenöse Sauerstoffabgabe. Dies wird durch die Verwendung eines High-Shear-Homogenisators und eines gasdichten Tanks zur Herstellung und seriellen Konzentration von oms erreicht. Der zweite Schritt besteht darin, modifizierte Spritzen zu extrudieren, um eine LOM-Emulsion mit 70 Volumenprozent Sauerstoff zu extrudieren.

Anschließend wird die Emulsion durch Zentrifugation konzentriert, um einen Schaum mit 90 Volumenprozent Sauerstoff zu erhalten. Der letzte Schritt besteht darin, die Qualitätskontrolle durchzuführen, indem der Volumenprozentsatz des Sauerstoffs berechnet und die Partikelgrößenverteilung mithilfe der Lichtstreutechnologie bewertet wird. Letztendlich werden bei der High-Shear-Homogenisierung zwei Liter OMS mit 90 Vol.-% Sauerstoff erzeugt.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Herstellungsmethoden wie Ultraschall und Amalgamierung besteht darin, dass bei der Homogenisierung selbstorganisierende Mikrobläschen in der Größenordnung von Litern erzeugt werden, ein Volumen, das für Großtierversuche zur therapeutischen Sauerstoffzufuhr erforderlich ist. Eine der Anwendungen dieser Technik ist die Behandlung von Patienten mit hoher Hypoxämie, da mit Sauerstoffgas gefüllte Mikrobläschen innerhalb von Sekunden Sauerstoff an Desoxyhämoglobin übertragen und den dreifachen Sauerstoffgehalt des Blutes übertragen. Die Demonstration dieser Methode ist wichtig, da die Tiefe des Homogenisatorkopfes groß ist.

Die Aufrechterhaltung einer rein oxidierten Umgebung und die Unterscheidung zwischen konzentriertem LMS und der wässrigen Phase kann schwer zu schätzen sein. Das System für die Fertigung. Lipidbasierter Sauerstoff, Mikrobläschen oder OMS besteht aus einem Fäkalien- und Konzentrationstank oder HCT, der mit einem einstufigen Mischer, einem Inline-High-Shear-Homogenisator, einer Rollenpumpe zum Bewegen der Flüssigkeit zwischen dem HCT und dem Homogenisator und einem Wärmetauscher ausgestattet ist.

Um mit der Systemeinrichtung zu beginnen, platzieren Sie ein sterilisiertes Vier-Liter-Glassammelgefäß mit Weithalsöffnung und zwei seitlichen Anschlüssen unter dem einstufigen Mischer, um einen der Basisanschlüsse des HCT-Anschlusses Nummer eins mit einem sterilen durchsichtigen Schlauch mit einem Innendurchmesser von drei Achtel Zoll zu versehen, der etwa 10 Zoll lang ist und mit einem Drei-Wege-Absperrhahn an der Spitze zum Auffangen der konzentrierten Emulsion ausgestattet ist. Montieren Sie als Nächstes den zweiten Basisanschluss, Anschluss Nummer zwei, mit sterilen Rohren mit einem Innendurchmesser von drei Achtel Zoll und einer Länge von etwa 36 Zoll. Führen Sie diesen Schlauch durch die Rollenpumpe.

Der Einlass des High-Shear-Homogenisators ist mit einem T-Stück ausgestattet, das zwei Anschlüsse umfasst. Verbinden Sie den Schlauch von Anschluss Nummer zwei durch die Rollenpumpe und verbinden Sie ihn mit dem seitlichen Anschluss des T-Stücks. Befestigen Sie den anderen Anschluss mit einem Sauerstoffgas-Durchflussmesser mit niedrigem Durchfluss an einem Sauerstofftank.

Verbinden Sie die Auslassöffnung des High-Shear-Homogenisators mit der Einlassöffnung eines Inline-Wärmetauschers, der auf vier Grad Celsius gehalten wird. Verbinden Sie den Auslassanschluss des Wärmetauschers mit dem Rücklaufanschluss des HCT, um ein geschlossenes Kreislaufsystem zu erhalten. Befestigen Sie den Sauerstofftank über einen Durchflussmesser über Anschluss Nummer vier an den HCT.

Befestigen Sie abschließend einen zur Atmosphäre hin offenen Gaszusammensetzungsmonitor an der oberen Öffnung des HCT. Um dieses Verfahren zu beginnen, geben Sie 20 Gramm GMP, ein, zwei DYS-Ochsenöl, SN-Glycerin, drei PHOSPHOCHOLIN oder DSPC und 10 Gramm Cholesterin in die Basis des HCT. Geben Sie einen Liter Plasmalicht A in das HCT und rühren Sie eine Minute lang von Hand, wobei so viel Lipid wie möglich in die wässrige Phase integriert wird.

Senken Sie den einstufigen Mischer in die wässrige Phase ab und stellen Sie sicher, dass der gesamte Mischkopf von der wässrigen Phase bedeckt ist. Um zu verhindern, dass Umgebungsluft den Kopfraum verunreinigt, verwenden Sie Gummidichtungen oder Klebeband, um sicherzustellen, dass die Oberseite des HCT gasdicht ist und keine offenen seitlichen Anschlüsse vorhanden sind. Schalten Sie die Gasquelle ein, die an Anschluss Nummer vier angeschlossen ist, und warten Sie, bis der Sauerstoffanteil des HCT-Headspace mehr als 95 % erreicht. Mischen Sie die Vorläuferemulsion mit dem einstufigen Mischer fünf Minuten lang. Bei 5.000 U/min sollte die resultierende Mischung blassweiß erscheinen und keine sichtbaren Lipidklumpen enthalten.

Nach dem Mischen kann die unbenutzte Lipidwassermischung bis zu 30 Tage bei vier Grad Celsius gelagert werden, bevor sie einzeln verabreicht wird. Verwenden Sie die Grundierung des gesamten geschlossenen Kreislaufsystems mit der Vorläuferemulsion, indem Sie die Rollenpumpe mit 1,3 Litern pro Minute oder LPM einschalten. Sobald das System angesaugt ist, lassen Sie die Pumpe bei 1,3 l/min, um mit der Herstellung der LOs zu beginnen.

Schalten Sie den Inline-High-Shear-Homogenisator auf 7.500 U/min ein. Schalten Sie unmittelbar danach den Sauerstofffluss zum Einlassteil des Homogenisators bei 0,5 l/min ein. Lassen Sie den einstufigen Mixer im HCT bei 3.500 U/min eingeschaltet.

Oms werden an der Grenzfläche von Rotorblättern und den Emulsionssieben innerhalb des Inline-Homogenisators gebildet. Innerhalb der ersten Minuten sollte die Flüssigkeit sichtbar zähflüssiger werden. Lassen Sie das System 15 Minuten lang laufen und schalten Sie dann den High-Shear-Homogenisator und den Sauerstoffeinlass aus.

Dies mildert die Phasentrennung und hält das Produkt innerhalb des HCT relativ gleichmäßig. Es ist zu beachten, dass sich das Volumen der gasgefüllten Emulsion während der seriellen Konzentrationsphase etwa um das Zwei- bis Dreifache vergrößern sollte. Die 140-Milliliter-Lock-Spritzen zum Auffangen des hergestellten OMS wurden zuvor modifiziert, indem 100 Milliliter Luft in die Spritze zurückgezogen und dann das überschüssige Kolben- und Spritzenmaterial oberhalb der 140-Milliliter-Marke abgesägt wurde.

Befestigen Sie eine sterile, modifizierte Spritze an dem Absperrhahn, der an der Basisöffnung Nummer eins des Sammelgefäßes befestigt ist, lassen Sie den Kolben mit einer Zahnzange fallen und saugen Sie 100 Milliliter Flüssigkeit auf. Verschließen Sie die Spritze fest und wiederholen Sie den Vorgang, bis die gesamte Flüssigkeit entfernt wurde. Zentrifugenspritzen mit dem verschlossenen Ende nach unten in einer gekühlten Eimerzentrifuge bei 225 mal G für 10 Minuten. Nach dem Zentrifugieren sind drei Materialschichten sichtbar, die untere Schicht der überschüssigen trüben wässrigen Phase wird ausgestoßen und verworfen.

Die zweite Schicht ist hellweiß und enthält konzentrierte OMS. Übertragen Sie den konzentrierten Schaum mit einem Dreiwege-Absperrhahn auf eine gasundurchlässige Glasspritze, um eine Kontamination des Umgebungsgases zu verhindern. Entsorgen Sie die letzte Schicht, die freies Sauerstoffgas aus geplatzten oms enthält.

Die Schaumqualität kann durch die Berechnung der Gaskonzentration wie folgt beurteilt werden. Ein hochwertiger Schaum erreicht eine Gaskonzentration von mehr als oder gleich 90 Volumenprozent, da eine zweite Qualitätskontrolle der Mikrobläschen durch optische Lichtstreuung erfolgt, um festzustellen, ob die Partikelgröße innerhalb des erwarteten Bereichs liegt. Es sollte beachtet werden, dass eine Änderung der Homogenisierungszeit oder der Formulierung die Blasengröße verändern kann, wenn die Glasspritzen mit konzentriertem oms fest verschlossen sind.

Mit einem Lure Lock Fitting können Spritzen bei 22 Grad Celsius, vier Grad Celsius oder minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Kältere Temperaturen können zu einer verbesserten Haltbarkeit und Stabilität führen. Mit diesem Protokoll können bis zu zwei Liter konzentriertes OMS in 90 Minuten hergestellt werden.

Die Visualisierung einer 10 Mikroliter großen Probe von OMS mittels Lichtmikroskopie zeigte ein sphärisches OMS sowie eine relative Posität von Lipidtrümmern. Wenn die gleiche OMS-Probe durch optische Streuung beurteilt wurde, betrug der mittlere Partikeldurchmesser 2,624 plus oder minus 0,332 Mikrometer. Mehr als 90 % der OMS hatten einen Durchmesser von weniger als 10 Mikrometern und die Population war polydispers.

Die Viskosität der Emulsion hing stark von der Gasfraktion und damit von der Mikroblasenkonzentration ab. Zwei Milliliter Aliquots der LOM-Emulsion bei 60, 70 und 90. Die Volumenprozentzahl des Gases wurde mit einem Steady-State-Flow-Sweep unter Verwendung einer 40 Millimeter parallelen Platte untersucht.

Die Geometrie als Spannung variierte zwischen 0,1 und 1000 Gasen, die einen Gasgehalt von 60 Volumenprozent enthielten, wiesen ein radiologisches Profil auf, das dem menschlichen Blut ähnelte. Der Sauerstoffgehalt von OMS wurde getestet, indem unterschiedliche Mengen an Sauerstoff, die in 60 Volumenprozent OMS enthalten sind, zu Aliquoten von entsättigtem menschlichem Blut mit einem bekannten Sauerstoffdefizit hinzugefügt wurden. Das Verhältnis zwischen dem Volumen des im OMS zugeführten Sauerstoffs und dem volumetrischen Anstieg des Sauerstoffgehalts im Blut betrug 1,053 plus oder minus 0,03025.

Dies deutet darauf hin, dass die getesteten OMS fast 100 % Sauerstoff enthalten, nur wenige eingeschlossene Gaseinschlüsse aufweisen und ihre gesamte Sauerstofffracht effektiv in vitro auf das menschliche Blut übertragen. Einmal gemeistert, kann diese Technik zur Herstellung von zwei Litern LMS in 90 Minuten verwendet werden, wenn sie richtig und effizient durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Sichtprüfung des akkumulierenden OMS aufrechtzuerhalten und eine Qualitätskontrolle bei der Konzentration des LOM-Schaums durchzuführen. Nach diesem Herstellungsverfahren kann OMS für die großflächige intravenöse Injektion und Verabreichung von therapeutischen Gasen verwendet werden.