Name: Herstellung von konzentrierten, Lipid-basierte Sauerstoffmikroblasen-Emulsionen von High-Shear-Homogenisierung und Serien Konzentration (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von lipidbasierten Sauerstoffmikroblasen durch Hochgeschwindigkeits-Homogenisierung und serielle Konzentration. Diese skalierbare Methode erzeugt zwei Liter stabiler Mikroblasen mit 90% Sauerstoffgehalt für intravenöse Sauerstofftherapie.

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Finanzierung: US Army Medical Research &amp; Materiel Command (USAMRMC) und von der Telemedizin &amp; Advanced Technology Research Center verwaltet. Shunxi Ji trug die Änderung der Spritzen, wie hier beschrieben.

1. System Set-up Das System besteht aus einer Halte-und Konzentrationstank (HCT) mit einem Einzelstufen-Mischer, einem In-line-Homogenisator mit hoher Scherkraft, einer Walzenpumpe, um Fluid zwischen der HCT und dem Homogenisator zu bewegen, und einen Wärmetauscher (1) angebracht ist. <ol><li> Legen Sie ein sterilisiert, Weithals 4 l Glassammlung mit 2 Basisanschlüsse und 3 Seitenöffnungen unterhalb der einstufigen Mischgefäß montiert. Senken Sie den Mischkopf bis zur Mündung des Schiffes und sorgen für eine gasdichte Montage mit Gummidichtungen oder Band (um Umgebungsluft verunreinigen den Kopfraum zu verhindern). </li><li> Setzen Sie einen der Basisanschlüsse (Abbildung 1, Port 1) der HCT mit steriler 3/8 &quot;(ID) klare Schlauch, ca. 10&quot; lang, mit einem 3-Wege-Hahn an der Spitze für die Sammlung der konzentrierten Emulsion versehen . </li><li> Setzen Sie den zweiten Basishafen (Abbildung 1, Port # 2) mit steriler 3/8 &quot;(ID) Schläuche, approximately 36 &quot;in der Länge. Ziehen Sie diese Schläuche durch eine Rollenpumpe. Setzen Sie den Eingang der Hochscher Homogenisator mit einem T-Stück mit zwei Ports und wie folgt anschließen: Verbinden Schlauch von Port # 2, durch die Rollenpumpe und eine Verbindung zu der Seite Port der T-Stück. Befestigen Sie den anderen Anschluss an ein Sauerstofftank mit einem Low-Flow-Sauerstoff-Gasdurchflussmesser. </li><li> Verbinden der Auslassöffnung des Homogenisators mit hoher Scherkraft mit der Einlassöffnung einer in-line-Wärmetauscher bei 4 ° C gehalten, Verbinden den Auslaß des Wärmetauschers zu dem Rücklaufanschluß des HCT (Fig. 1, Port Nr. 3), wodurch ein geschlossenes Schleifensystem. </li><li> Befestigen eines Sauerstofftank (über einen Durchflussmesser) an den HCT (Fig. 1, Port # 4). Bringen Sie einen Monitor, der Gaszusammensetzung der Atmosphäre offen in die obere Öffnung des HCT (Abbildung 1, Port # 5) ist. </li><li> Wenn Sterilität gewünscht wird, sterilisieren die Glas-und Metallkomponenten vor jeder Verwendung von Autoklaven. Sterilisieren Sie die Rohrkomponenten und Kunststoff Connectors von Ethylenoxid vor jeder Verwendung. Dies ist besonders wichtig, wenn das Produkt in vivo getestet werden. </li></ol> 2. LOM Herstellung <ol><li> Platzieren von 20 g GMP 1,2-Distearyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DSPC) und 10 g Cholesterin in der Basis des HCT. 1 l Plasma-Lyte A zu der HCT und Hand Rühren für 1 min, zu integrieren, so viel wie möglich in die Lipid wässrigen Phase. </li><li> Senken Sie den einstufigen Mischer in die wässrige Phase, so dass die gesamte Mischkopf wird von der wässrigen Phase bedeckt. Stellen Sie sicher, dass die Spitze des HCT ist gasdicht (siehe Schritt 1.1) und dass es keine offenen Seite Ports. Schalten Sie die Gasquelle an Port # 4 befestigt und warten, bis der Sauerstoffanteil der HCT Headspace erreicht&gt; 95%. Bei 10 L / min (LPM), sollte diese nehmen ~ 10 min. </li><li> Mit dem einstufigen Mixer, mischen Sie die Ausgangsemulsion für 5 min bei 5.000 Umdrehungen pro Minute. Die resultierende Mischung sollte blass weiß erscheinen und enthalten keine sichtbaren lipid Klumpen. Einmal gemischt, kann ungenutzt Lipid-Wasser-Mischung bei 4 º C für bis zu 30 Tage vor einmaligen Gebrauch gespeichert werden. </li><li> Prime das gesamte System mit geschlossener Schleife mit der Vorstufen-Emulsion, indem der Rollenpumpe bei 1,3 LPM. Sobald das System grundiert, halten Sie die Pumpe auf 1,3 LPM. </li><li> Zur Herstellung der LOMs beginnen, schalten Sie die In-Line-Homogenisator mit hoher Scher zu 7.500 Umdrehungen pro Minute. Unmittelbar danach schalten Sauerstofffluss zu dem Einlassabschnitt der Homogenisator bei 0,5 LPM. Halten Sie die stufigen Mixer-Single (in der HCT) auf 3.500 Umdrehungen pro Minute. LOMs sind an der Schnittstelle der Rotorschaufeln und den Emulsor Abschirmung innerhalb des in-line-Homogenisator (Fig. 2) ausgebildet. Innerhalb weniger Minuten sollte Flüssigkeit sichtbar mehr viskos werden. Ein strengerer Ansatz ist, um die Viskosität als Funktion der Zeit, die durch Entfernen von Aliquoten aus Port 1 während der Herstellung und Analyse mit einem Viskosimeter durchgeführt werden können, zu bestimmen. Hinweis: Bei sichtbaren Luftblasen im Schlauch Verlassen des Mischers, Sauerstoff vorhanden sindfließen, um die in-line-Homogenisator ist zu hoch. Titriert Gasstrom nach unten, bis die Flüssigkeit ist undurchsichtig und enthält keine sichtbaren Gasblasen. </li><li> Führen Sie das System für 15 Minuten, und schalten Sie dann den hohen Scher Homogenisator und der Sauerstoffeingang zu. Fahren Sie mit dem einstufigen Mischer in der HCT laufen, bis die Emulsion entfernt wird; Dies mildert Phasentrennung und hält das Produkt im HCT relativ einheitlich. Hinweis: Das Volumen des gasgefüllten Emulsion sollte ca. 2-3x in der Serienphase Konzentration zu erhöhen. Wenn es nicht, zu überprüfen, um sicherzustellen, daß Sauerstoff in den Homogenisator mit hoher Scher fließt und dass Lipid-Konzentrationen in der Ausgangsemulsion korrekt sind. Effizienz der Produktion nimmt mit Lipid-Konzentration abnimmt. </li></ol> 3. Sammlung, Konzentration, Bewertung, Lagerung von LOMs <ol><li> Bringen Sie eine sterile, modifizierte 140 ml Luer-Lock-Spritze, um den Hahn zu Basis-Port # 1 auf dem Sammelgefäß angebracht. Zeichnen bis 100 ml Flüssigkeit. Verschließe Spritze und Wiederholen, bis alle Flüssigkeit entfernt wurde. <ol><li> Ändern Spritzen durch Entnahme von 100 ml Luft in die Spritze und dann sägen Sie das überschüssige Kolben und Spritzenmaterial über der 140-ml-Marke. Füllen und leere Spritzen mit Zahnzangen für die Erstellung des Kolbens. Diese Modifikation ermöglicht eine einfachere Zentrifugieren. </li></ol></li><li> Centrifuge Spritzen mit der bedeckten Ende nach unten in einem gekühlten (4 º C) Becherzentrifuge bei 225 g für 10 min ausgerichtet. </li><li> Drei Schichten von Material nach dem Zentrifugieren erscheinen. Vertreibt die untere Schicht der Über bewölkt wässrige Phase und entsorgen. Die zweite Schicht ist hell weiß und enthält konzentrierte LOMs. Übertragen konzentrierter Schaum zu einer gasundurchlässigen Spritze mit einem Drei-Wege-Hahn auf Umgebungsgaskontamination zu vermeiden. Entsorgen Sie die letzte Schicht, die freie Sauerstoffgas aus geplatzten LOMs enthält. </li><li> Schaumqualität kann durch das Erreichen ≥ 90% Gas konzentrierter Schaum beurteilt werden. Calculaß Gaskonzentration, wie folgt: Volume% Gas = [(Foam Gewicht / Volumen-Schaum) - 1] x 100 <ol><li> Als zweite Qualitätskontrolle, der Größe von Mikrobläschen Lichttrübung festzustellen, ob Partikelgröße innerhalb des erwarteten Bereichs. Es sei darauf hingewiesen, dass eine Änderung in der Zeit der Homogenisierung oder Formulierung kann die Blasengröße zu verändern. </li></ol></li><li> Verschließe das Glasspritze mit Luer-Lock-Montage. Konzentrierte LOMs mit Plasma-Lyte A zum Zeitpunkt der Verwendung verdünnt werden. Spritzen bei 22, 4 gespeichert werden, oder -20 º C; kälteren Temperaturen kann eine verbesserte Lagerstabilität 7. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die wichtigsten Schritte zur Schaffung konzentrierte, hoch sauerstoffhaltigen LOMs gehören: 1) sicherzustellen, dass der Kopfraum in der HCT bleibt voll mit Sauerstoff angereichert; 2) sicherstellen, dass die Reinheit der Lipidträger optimal ist (einschließlich Lagerbedingungen und Verwendung von GMP-Produkte); 3) die Gewährleistung, dass die pulverförmigen Lipiden mischen vollständig mit der wässrigen Phase vor, um die System Grundierung; und 4) aufmerksam auf die Erhöhung der Gasfraktion im HCT zu gewährleisten, dass ...

Mikrobläschen von Protein-, Polymer-und Lipidschalen zusammengesetzt sind als Vektoren für die Arzneimittelabgabe, Gentherapie, und Ultraschall-Kontrastmitteln 1-5 entwickelt. Da diese therapeutische Anwendungen erfordern intravaskulären Mikroblasen-Persistenz, werden solche Mikroblasen häufig mit inerten, molekulare Gase hoch wie perfluorierte Kohlenwasserstoffe 6, die geringe Löslichkeit im Blut haben und Stabilisierung der Blase 3,4 gefüllt. Kürzlich, Lipid-basierten Sauerstoff-Mikrobläschen (LOMs) wurden entwickelt, um therapeutische Dosen von Sauerstoff, der Endorgane Sauerstoffversorgung zu erhalten und hämodynamische Instabilität in Zeiten der Obstruktion der Atemwege oder Hypoxämie 7 verhindern können, zu liefern. Emulsionen zur intravenösen Gaszufuhr ausgelegt erfordern unterschiedliche Design-Merkmale als die für Ultraschallkontrastmittel oder gezielten Verabreichung von Medikamenten verwendet. Erstens, weil der Körper verbraucht große Mengen an Sauerstoffgas (~ 200 ml / min), ist LOMs erzeugt werden undim großen Maßstab injiziert. Dies erfordert, dass der Herstellungsprozess effizient. Zweitens sollte das Herstellungsverfahren mit geschlossener Schleife, um Stickstoffverunreinigung durch die Belichtung LOMs (die mit 100% Sauerstoff gefüllt werden soll) zu vermeiden, um die Umgebungsluft sein. Drittens, da der Zweck LOMs intravenös Gaszufuhr sollte der Gasanteil LOMs maximiert werden, wobei die Einschränkungen, die durch Emulsionsviskosität 7 auferlegt. Schließlich, wie bei jedem intravenös injizierbare ist eine genaue Kontrolle über die Partikelgrößenverteilung wesentlich zur Vermeidung mikrovaskuläre Obstruktion 8. Es gibt mehrere etablierte Methoden für die Herstellung von Mikrobläschen. Beschallung hoher Intensität verwendet, um die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche einer Emulsion, die ein Tensid, wie ein amphipathisches Phospholipid in Gegenwart eines Gasraum auf 7,9 Mikrobläschen erzeugen beinhaltet aufgebracht niederfrequenten Ultraschall. Dieses Verfahren ist durch Variieren UltraSchallfrequenz, Leistung und Impulsdauer, und die resultierende Größenverteilung hergestellt werden, um Mikrobläschen aus einem bestimmten Größenverteilung zu erzeugen, wenn der Beschallung nur selten bei der Herstellung von klinisch verwendeten Mikrobläschen verwendet werden. Verschmelzung ist die intensive mechanische Bewegung eines Tensids und Gas in einem geschlossenen System, das auch schwierig zu skalieren, um große Mengen 2 aufzunehmen. Tröpfchenbasierte Mikrofluidik ermöglicht die präzise Steuerung der Mikroblasengrößenverteilung 10-13. Obwohl traditionell schwierig zu skalieren, Multi-Channel-, High-Speed-Mikrofluidik beschrieben worden, die Effizienz in der Produktion von Mikrobläschen 13 zu erhöhen. Mikrobläschen mit einer dieser Methoden hergestellt wurden, können nach der Herstellung Zerkleinerungsprozesse, wie Zentrifugalfraktionierung 14,15 und Mikroblasen-Flotation 16,17 erforderlich. Eine weitere etablierte Methode für die Herstellung von hochstabilen Mikrobläschen Scher homogenization 6, die in einem Stabilisierungs Phospholipid hexagonalen Muster auf der Mikroblasenoberfläche 18 führen kann. Aufbauend auf diesem Konzept beschreiben wir den Einbau eines In-Line-Homogenisator mit hoher Scher zu selbstorganisierenden LOMs 19 erstellen. In diesem Prozess nutzt der Homogenisator schnell rotierenden Klingen in unmittelbarer Nähe zu Dual feinmaschigen Emulsor Bildschirme, wodurch hohe mechanische und hydraulische Schere für die Schaffung von Mikrobläschen. Serien Konzentration der Lipidemulsion durch dieses System liefert eine zunehmend konzentrierte Gasfraktion, die noch weiter durch Zentrifugation konzentriert werden kann.

<table><tbody><tr><td>1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DSPC)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>770365</td><td>Alternativprodukt: non-GMP from NOF America (Coatsome MC-8080)</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C75209</td><td></td></tr><tr><td>Plasma-Lyte A</td><td>VWR</td><td>80089-818</td><td>Alternativ kann das NaCl-Glassammelgefäß</td></tr><tr><td></td><td>Specialty Glass, Inc.</td> verwendet werden.<td></td><td>Kundenspezifischer Kontakt: Pam Zurbrick - 281-595-2210</td></tr><tr><td>Monitor für die Gaszusammensetzung (Sauerstoff)</td><td>Precision Medical</td><td>PM5900L</td><td></td></tr><tr><td>Sarns 8000 Rollenpumpe</td><td>Calicut Medical</td><td>16407</td><td>Teil eines modularen Perfusionssystems</td></tr><tr><td>BIOtherm Wärmetauscher</td><td>Medtronic</td><td>ECMOtherm-II</td><td></td></tr><tr><td>Verso Labor-Inline-Mischer</td><td>Silverson Machines, Inc</td><td>TH-IL-102-VERSO</td><td>Verwenden Sie mehrstufige Werkstückköpfe und Front-End-Verlängerung mit T-Stück</td></tr><tr><td>T-Stück für den Silverson Verso Einlassanschluss</td><td>Prozessinnovationen</td><td>Kundenspezifischer</td><td>Kontakt: Brian Leavitt - 508-423-2266</td></tr><tr><td>L5M-A Labormischer</td><td>Silverson Machines, Inc</td><td>NC0136483</td><td>Verwenden Sie ein Mesh-Emulsorsieb (fein)</td></tr><tr><td>Rochester-Ochsner Zahnzange</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-18</td><td></td></tr><tr><td>140 ml Spritze</td><td>Kendall Healthcare Monoject</td><td>8881114030</td><td>Stellen Sie sicher, dass ein Luer-Lock vorhanden ist.</td></tr><tr><td>IX71 Inverses Lichtmikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Retiga-2000R Mikroskopkamera</td><td>QImaging</td><td>RET-2000R-F-M-12</td><td></td></tr><tr><td>Accusizer 780A Autodilution</td><td>PSS-NICOMP Partikelgrößenmesssysteme</td><td>Nicht mehr produziert</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von konzentrierten, lipid-basierte sauerstoffmikroblasen-emulsionen von high-shear-homogenisierung und serien konzentration

Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration

Gasgefüllte Mikrobläschen haben als Ultraschallkontrast und Drug-Delivery-Agenten entwickelt. Mikrobläschen können durch Verarbeiten Tenside mit Beschallung, mechanischer Agitation, mikrofluidischen Vorrichtungen oder Homogenisierung hergestellt werden. Kürzlich, Lipid-basierten Sauerstoff-Mikrobläschen (LOMs) wurden entwickelt, um Sauerstoff während der medizinischen Notfällen intravenös zu liefern, Rückfahrlebensbedrohlichen Hypoxämie und verhindert spätere Organschäden, Herzstillstand und Tod. Wir stellen Methoden für die vergrösserte Produktion von stark mit Sauerstoff-Mikrobläschen mit einem Closed-Loop-High-Shear Homogenisator. Das Verfahren kann 2 l konzentrierter LOMs (90 Vol.%) in 90 min zu erzeugen. Resultierende Blasen einen durchschnittlichen Durchmesser von ~ 2 um, und eine rheologische Profil in Übereinstimmung mit der von Blut, wenn sie 60 Vol.% verdünnt. Diese Technik erzeugt LOMs in hoher Kapazität und hoher Sauerstoffreinheit, was darauf hindeutet, dass diese Technik kann für die translationale Forschungslabors sein.

Hohe Scher Homogenisierung ermöglicht die effiziente (dh innerhalb eines Nachmittags) die Produktion von ausreichend LOMs für eine Tierstudie und nicht technisches Know-how erfordern. Sobald beherrschen, bis 2 l konzentrierter LOMs in 90 min hergestellt werden. Mikroblasen-Größe und Morphologie wurde durch Lichtmikroskopie und durch Lichttrübung bewertet. Wenn ein 10 &amp;mgr; l-Probe von LOMs visualisiert wurde, wurden kugelförmige LOMs erwähnt, sowie eine relativ geringe Menge an ...

Wir beschreiben Methoden zur Herstellung großer Mengen von Lipid-basierten Sauerstoffmikrobläschen (LOMs) zur intravenösen Sauerstoffzufuhr ausgebildet mit hoher Scherung homogenisiert und serielle Konzentration.

Herstellung von konzentrierten, Lipid-basierte Sauerstoffmikroblasen-Emulsionen von High-Shear-Homogenisierung und Serien Konzentration

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine große Menge selbstassemblierender, lipidbasierter Sauerstoff-Mikrobläschen oder OMS zur intravenösen Sauerstoffgabe herzustellen. Dies wird mithilfe eines Hochscherrührwerks und eines gasdichten Tanks erreicht, um OMS herzustellen und seriell zu konzentrieren. Der zweite Schritt besteht darin, modifizierte Spritzen zu verwenden, um eine LOM-Emulsion mit 70 Volumenprozent Sauerstoff zu extrudieren.Anschließend wird die Emulsion durch Zentrifugation konzentriert, um einen Sauerstoffschaum mit einem Volumenanteil von 90 % zu erhalten. Der letzte Schritt besteht in der Qualitätskontrolle durch Berechnung des prozentualen Volumenanteils an Sauerstoff und durch Untersuchung der Partikelgrößenverteilung mittels Lichtstreuungstechnologie. Letztendlich erzeugt die Hochscherrhomogenisierung zwei Liter OMS mit einem Sauerstoffvolumengehalt von 90 %.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Herstellungsverfahren wie Sonifikation und Amalgamierung besteht darin, dass die Homogenisierung selbstassemblierende Mikrobläschen in der Größenordnung von Litern erzeugt – ein Volumen, das für Tests an großen Tieren zur therapeutischen Sauerstoffabgabe erforderlich ist. Eine Anwendung dieser Technik liegt in der Behandlung von Patienten mit starker Hypoxämie, da mit Sauerstoffgas gefüllte Mikrobläschen innerhalb von Sekunden Sauerstoff an Desoxyhämoglobin abgeben und dreimal so viel Sauerstoff wie Blut transportieren. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, insbesondere hinsichtlich der Eintauchtiefe des Homogenisierkopfs.Die Aufrechterhaltung einer rein oxidativen Umgebung und die Unterscheidung zwischen konzentrierter LMS und der wässrigen Phase können schwer nachvollziehbar sein. Das System zur Herstellung lipidbasierter Sauerstoffmikrobläschen oder OMS besteht aus einem Halte- und Konzentrierbehälter (HCT) mit einem einstufigen Mischer, einem in-line-Hochleistungshomogenisator, einer Rollenpumpe zur Förderung der Flüssigkeit zwischen HCT und Homogenisator sowie einem Wärmetauscher.Um die Systemeinrichtung zu beginnen, stellen Sie einen sterilisierten, weitmundigen, viereinhalb Liter fassenden Glasbehälter mit zwei Anschlüssen am Boden und drei Seitenanschlüssen unter den Einzelstufenmischer. Verbinden Sie einen der Bodenanschlüsse, Anschluss Nummer eins des HCT, mit einem sterilen, durchsichtigen Schlauch mit einem Innendurchmesser von drei Achtel Zoll, etwa 25 cm Länge, der an der Spitze mit einem Dreifachhahn zur Sammlung der konzentrierten Emulsion ausgestattet ist. Verbinden Sie anschließend den zweiten Bodenanschluss, Anschluss Nummer zwei, mit einem sterilen Schlauch mit einem Innendurchmesser von drei Achtel Zoll, etwa 91 cm Länge. Führen Sie diesen Schlauch durch die Rollerpumpe.Der Eingang des Hochleistungshomogenisators ist mit einem T-Stück ausgestattet, das zwei Anschlüsse umfasst. Schließen Sie einen Schlauch vom Anschluss Nummer zwei über die Rollerpumpe an den Seitenanschluss des T-Stücks an. Verbinden Sie den anderen Anschluss über ein Sauerstoffgas-Durchflussmesser mit geringem Durchfluss mit einem Sauerstofftank.Verbinden Sie den Auslass des Hochdruckhomogenisators mit dem Einlass eines Inline-Wärmetauschers, der bei vier Grad Celsius gehalten wird. Verbinden Sie den Auslass des Wärmetauschers mit dem Rücklaufanschluss des HCT, um ein geschlossenes System zu erzeugen. Schließen Sie den Sauerstofftank über ein Durchflussmessgerät an den HCT über Anschluss Nummer vier an.Schließen Sie abschließend einen Gaszusammensetzungsmessgerät, das der Atmosphäre ausgesetzt ist, an den oberen Anschluss des HCT an. Um dieses Verfahren zu beginnen, geben Sie 20 Gramm GMP one two DYS steer oil, SN glycerol three PHOSPHOCHOLINE bzw. DSPC und 10 Gramm Cholesterin in den Boden des HCT. Fügen Sie einen Liter Plasma light A zum HCT hinzu und rühren Sie per Hand eine Minute lang unter möglichst vollständiger Einbindung der Lipide in die wässrige Phase.Senken Sie den einstufigen Mischer in die wässrige Phase ab, wobei sichergestellt werden muss, dass der gesamte Mischkopf von der wässrigen Phase bedeckt ist. Um zu verhindern, dass Umgebungsluft den Kopfraum kontaminiert, verwenden Sie Gummidichtungen oder Klebeband, um sicherzustellen, dass die Oberseite des HCT gasdicht ist und keine offenen Seitenanschlüsse vorhanden sind. Schalten Sie die an Anschluss Nummer vier angeschlossene Gasquelle ein und warten Sie, bis der Sauerstoffanteil im Kopfraum des HCT über 95 % beträgt. Mischen Sie mit dem einstufigen Mischer die Vorläuferemulsion fünf Minuten lang. Bei 5.000 U/min sollte die resultierende Mischung blassweiß erscheinen und keine sichtbaren Lipidklumpen enthalten.Nach dem Mischen kann ungenutzte Lipid-Wasser-Mischung bis zu 30 Tage lang bei vier Grad Celsius vor der Verwendung aufbewahrt werden. Spülen Sie das gesamte geschlossene System mit der Vorläuferemulsion, indem Sie die Rollerpumpe mit 1,3 Litern pro Minute oder LPM einschalten. Sobald das System gespült ist, lassen Sie die Pumpe bei 1,3 LPM eingeschaltet, um die Herstellung der LOs zu beginnen.Schalten Sie den Inline-Hochleistungshomogenisator auf 7.500 U/min ein. Unmittelbar danach schalten Sie den Sauerstofffluss an den Eingangsteil des Homogenisators mit 0,5 L/min ein. Halten Sie den Einzelschneckenmischer im HCT bei 3.500 U/min in Betrieb.Oms bilden sich an der Grenzfläche von Rotorklingen und Emulsionsgittern innerhalb des Inline-Homogenisators. Innerhalb der ersten paar Minuten sollte die Flüssigkeit sichtbar zähflüssiger werden. Führen Sie das System 15 Minuten lang aus, und schalten Sie dann den Hochscherrhomogenisator und den Sauerstoffzulauf ab.Dies verhindert die Phasentrennung und sorgt dafür, dass das Produkt innerhalb des HCT relativ homogen bleibt. Beachten Sie, dass das Volumen der gasgefüllten Emulsion während der seriellen Konzentrationsphase etwa um das Zweifache bis Dreifache ansteigen sollte. Die 140-Milliliter-Luer-Stopfenspritzen zur Sammlung der hergestellten OMS wurden zuvor modifiziert, indem 100 Milliliter Luft in die Spritze gezogen und anschließend das überschüssige Kolben- und Spritzenmaterial oberhalb der 140-Milliliter-Marke abgesägt wurde.Befestigen Sie eine sterile, modifizierte Spritze am Hahn, der am Basisanschluss Nummer eins des Sammelgefäßes angebracht ist; verwenden Sie gezahnte Pinzette, um den Kolben abzusenken und 100 Milliliter Flüssigkeit aufzuziehen; verschließen Sie die Spritze fest und wiederholen Sie den Vorgang, bis die gesamte Flüssigkeit entfernt ist. Zentrifugieren Sie die Spritzen mit dem verschlossenen Ende nach unten in einer gekühlten Schwingkopfzentrifuge bei 225 × g für 10 Minuten. Nach der Zentrifugation sind drei Schichten des Materials sichtbar; drücken Sie die untere Schicht der überschüssigen trüben wässrigen Phase heraus und entsorgen Sie sie.Die zweite Schicht ist hellweiß und enthält konzentrierte oms. Überführen Sie den konzentrierten Schaum mit Hilfe eines Dreiweghahns in eine gasdichte Glasspritze, um eine Kontamination durch Umgebungsgase zu vermeiden. Entsorgen Sie die letzte Schicht, die freies Sauerstoffgas aus aufgerissenen oms enthält.Die Schaumqualität kann durch die Berechnung der Gas­konzentration wie folgt beurteilt werden. Ein Schaum hoher Qualität erreicht eine Gas­konzentration von mehr als oder gleich 90 Volumenprozent, wobei als zweite Qualitätskontrolle die Größe der Mikrobläschen mittels optischer Lichtstreuung überprüft wird, um festzustellen, ob die Partikelgröße im erwarteten Bereich liegt. Es sollte beachtet werden, dass eine Änderung der Homogenisierungszeit oder der Formulierung die Blasengröße verändern kann; die Glas­spritzen, die das konzentrierte oms enthalten, müssen daher fest verschlossen sein.Bei Verwendung eines Luer-Verriegelungsanschlusses können Spritzen bei 22 Grad Celsius, vier Grad Celsius oder minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Kältere Temperaturen können eine verbesserte Lagerstabilität gewährleisten. Mit diesem Protokoll können innerhalb von 90 Minuten bis zu zwei Liter konzentriertes OMS hergestellt werden.Die Visualisierung einer 10-Mikroliter-Probe von OMS mittels Lichtmikroskopie zeigte sphärisches OMS sowie eine relative Menge an Lipidtrümmern. Bei der Bewertung derselben OMS-Probe durch optische Streuung betrug der mittlere Partikeldurchmesser 2,624 ± 0,332 Mikrometer. Mehr als 90 % der OMS waren weniger als 10 Mikrometer im Durchmesser, und die Population war polydispers. Die Viskosität der Emulsion hing stark vom Gasanteil und damit von der Mikroblasenkonzentration ab. Zwei-Milliliter-Aliquote der LOM-Emulsion mit 60, 70 und 90 Volumenprozent Gas wurden mittels einer stationären Fließkurve mit einer 40-Millimeter-Parallelplattenanordnung untersucht.Die Geometrie unter variierender Belastung zeigte, dass bei Werten von 0,1 bis 1000 Pasten mit OMS, die 60 Volumenprozent Gas enthielten, ein radiologisches Profil aufwiesen, das dem menschlichen Blut ähnelte. Der Sauerstoffgehalt von OMS wurde geprüft, indem unterschiedliche Volumina von Sauerstoff, enthalten in 60 Volumenprozent OMS, Aliquots von desaturiertem menschlichem Blut mit einem bekannten Sauerstoffdefizit zugesetzt wurden. Der Zusammenhang zwischen dem zugegebenen Sauerstoffvolumen innerhalb von OMS und der volumetrischen Zunahme des Sauerstoffgehalts des Blutes betrug 1,053 ± 0,03025.Die getesteten Sauerstoffmikroblasen enthalten nahezu 100 % Sauerstoff, weisen nur wenige eingeschlossene Gasblasen auf und können ihren gesamten Sauerstoffgehalt in vitro effektiv an das menschliche Blut abgeben. Sobald die Technik beherrscht ist, können bei sachgemäßer und effizienter Durchführung innerhalb von 90 Minuten zwei Liter Sauerstoffmikroblasen hergestellt werden. Während des Verfahrens ist es wichtig, die sich ansammelnden Sauerstoffmikroblasen stets visuell zu überwachen und eine Qualitätskontrolle an der Konzentration des Sauerstoffmikroblasenschaums durchzuführen. Nach dieser Herstellungsanleitung können Sauerstoffmikroblasen für die großtechnische intravenöse Injektion und Abgabe therapeutischer Gase verwendet werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Das Kombinieren der monodispersen Tropfenerzeugung mit Beschleunigungssensoren Anordnung von Zellen und Partikeln, beschreiben wir ein Verfahren, um eine gewünschte Anzahl von Zellen oder Teilchen in einem einzelnen Tropfen mit kHz Preise zu kapseln. Wir demonstrieren die Effizienz zweimal höher sind als die von ungeordneten Kapselung für Single-und Double-Teilchen-Tropfen.

High-Throughput-Einzel-Zell-und Multiple-Zelle Mikroverkapselung

Dieses Protokoll beschreibt ein Extrusionsverfahren zur Herstellung Lipidvesikel von Submikrometer-Abmessungen mit einem hohen Grad an Homogenität. Dieses Verfahren verwendet eine Druck-Steuerung mit gesteuerten Stickstoff Flussraten für Liposomenpräparation. Die...

Constant Pressure-gesteuerte Extrusionsverfahren zur Herstellung von Nano-Größe Lipidvesikeln

Mikrofluidik-Strahl gegen eine Tröpfchen Schnittstelle Lipid-Doppelschicht bietet eine zuverlässige Möglichkeit, die Kontrolle über Vesikel mit Membran-Asymmetrie, die Aufnahme von Transmembranproteinen und Kapselung von Material zu erzeugen. Diese Technik kann angewandt werden, um eine Vielzahl von biologischen Systemen, in denen unterteilte Biomolekülen gewünscht studieren.

Lipiddoppelschicht Vesicle Erzeugung anhand Mikrofluidik Jetting

Die Erzeugung von Mikrofluidik-Doppelemulsionen umfasst typischerweise Geräte mit strukturierter Benetzbarkeit oder speziell angefertigte Glaskomponenten. Hier beschreiben wir die Herstellung und Prüfung eines Doppelemulsionsgenerators aus Polydimethylsiloxan (PDMS), der keine Oberflächenbehandlung oder komplizierte Herstellungsprozesse erfordert und in der Lage ist, Doppelemulsionen bis zu 14 μm herzustellen.

Doppelemulsion Erstellung Mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS) Co-Axial Flow Fokus Geräte-

Dieses Protokoll beschreibt die Methode, Materialien, Ausrüstung und Schritte zur Bottom-up-Vorbereitung von RNA und Protein produzierenden synthetischen Zellen. Das innere wässrige Fach der synthetischen Zellen enthielt das in einer Lipid-Bilayer (d. h. stabile Liposomen) eingekapselte S30-Bakterienlysat, das mit einem Wasser-in-Öl-Emulsionstransferverfahren verkapselt war.

Herstellung von Proteinproduktion synthetischer Zellen mit zellfreien bakteriellen Extrakten, Liposomen und Emulsionstransfer

Das Protokoll stellt die optimierten Parameter für die Herstellung thermoempfindlicher Liposomen mit dem gestaffelten Fischgrät-Mikrofluidikgerät vor. Dies ermöglicht auch die Kokapselung von Doxorubicin und Indocyaningrün in die Liposomen und die photothermal ausgelöste Freisetzung von Doxorubicin zur kontrollierten/ausgelösten Wirkstofffreisetzung.

Mikrofluidische Produktion von Lysolipid-haltigen temperaturempfindlichen Liposomen

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung großer Mengen lipidverkapselter Decafluorbutan-Mikrobläschen mittels Sondenspitzen-Beschallung und anschließender Kondensation zu phasenverschobenen Nanotröpfchen mittels Hochdruckextrusion und mechanischer Filtration.

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Das vorliegende Protokoll beschreibt die Oktanol-unterstützte Liposomenassemblierung (OLA), eine mikrofluidische Technik zur Erzeugung biokompatibler Liposomen. OLA produziert monodisperse, mikrometergroße Liposomen mit effizienter Verkapselung, die sofortige On-Chip-Experimente ermöglichen. Dieses Protokoll soll sich besonders für die synthetische Biologie und die synthetische Zellforschung eignen.

On-Chip-Oktanol-gestützte Liposomen-Assemblierung für die Biotechnologie

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Lipid-Mikrobläschen und eine kompatible Ein-Topf-Mikroblasen-Radiomarkierungsmethode mit einer aufreinigungsfreien Markierungseffizienz von &gt;95 %, die die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Mikroblase bewahrt. Diese Methode ist bei verschiedenen Lipid-Mikrobläschen-Formulierungen wirksam und kann auf die Erzeugung radioaktiver und/oder fluoreszierender Mikrobläschen zugeschnitten werden.

Herstellung und Markierung von Mikrobläschen mit fluoreszierenden und radioaktiven Tracern

Ultraschall gezielte Mikroblasen Destruction (UTMD) können verwendet werden, um ortsspezifische Abgabe von bioaktiven Molekülen, einschließlich therapeutischer Gene zu richten, um Organe zugänglich Ultraschall, wie Herz und Leber Ziel...

Einführung in die Ultraschall-gezielte Mikroblasen Zerstörung Technik

Erfahren Sie die Herstellung von lipidbasierten Sauerstoffmikroblasen durch Hochgeschwindigkeits-Homogenisierung und serielle Konzentration. Diese skalierbare Methode erzeugt zwei Liter stabiler Mikroblasen mit 90% Sauerstoffgehalt für intravenöse Sauerstofftherapie.

Herstellung von konzentrierten, Lipid-basierte Sauerstoffmikroblasen-Emulsionen von High-Shear-Homogenisierung und Serien Konzentration (Video) | JoVE Journal

Herstellung von konzentrierten, Lipid-basierte Sauerstoffmikroblasen-Emulsionen von High-Shear-Homogenisierung und Serien Konzentration

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