Beurteilung der Gefäßfunktion bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Gefäßfunktion Bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung wird dies erreicht, indem zunächst vaskuläre Endothelzellen von Patienten gesammelt werden. Die Pulswellengeschwindigkeit der Aorta wird dann gemessen, um die Steifigkeit der großen elastischen Arterien zu messen. Als nächstes wird die durch den Fluss der Arteria brachialis vermittelte Dilatation gemessen, um die Funktion des vaskulären Endothels zu beurteilen.

Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die vaskuläre Endothelfunktion charakterisieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im vaskulären Bereich zu beantworten, z. B. was auf zellulärer Ebene mit der Expression verschiedener Proteine passiert. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da umfangreiche Übung und Schulung erforderlich sind, um die Ultraschallbildgebung zu beherrschen.

Das Verfahren wird von Lonnie Perino, einem Forschungsassistenten aus meinem Labor, vorgeführt. Bereiten Sie zunächst die Stelle mit einem topischen Antiseptikum vor. Platzieren Sie anschließend sterile Fensterabdeckungen über der Stelle.

Eine ausgebildete Krankenschwester oder ein Arzt sollte eine Infusion legen und einen Hepatitis-Lock-Adapter anbringen. Legen Sie zwei J-Drähte auf die Vorhänge, um die J-Form abzuwickeln. Ziehen Sie den Lichtbogen des J an beiden Drähten.

Nach dem Abwickeln lösen Sie den Halteverschluss und führen Sie den JWI etwa acht Zentimeter in die Vene ein. Schieben Sie den Draht vor dem Entfernen mehrmals hin und her, um zu vermeiden, dass sich zu viel Blut auf dem Draht ansammelt. Schneiden Sie anschließend die Drähte mit einem Drahtschneider so ab, dass sie in ein konisches 50-Milliliter-Rohr passen, das etwa 30 Milliliter Dissoziationspuffer enthält.

Wiederholen Sie diese Schritte für den zweiten Draht, wenn die Probenentnahme abgeschlossen ist. Rückkehr ins Nasslabor. Fassen Sie die Drähte mit einer Pinzette an und halten Sie sie 10 Minuten lang in das Röhrchen, aber über die Lösung.

Verwenden Sie eine motorisierte Pipette, um die Drähte mit Dissoziationspuffer aus dem Röhrchen zu spülen. Lassen Sie den Puffer so los, dass er über die gesamte Länge der Drähte verläuft, und schütteln Sie überschüssige Flüssigkeit in den Schlauch ab. Entfernen Sie die Drähte und zentrifugieren Sie die Probe zu Pellets.

Entnehmen Sie die Proben und resuspendieren Sie das Pellet in PBS, bevor Sie es zentrifugieren. Verwenden Sie danach weitere fünf Minuten lang eine Pipettenspitze am Ende eines Saugschlauchs, um etwa zwei Milliliter im Röhrchen zu belassen. Saugen Sie den Rest ab, ohne das Pellet zu stören.

Resuspendieren Sie das Pellet und pipettieren Sie die Probe gleichmäßig in die ovalen Bereiche von acht zuvor beschrifteten Objektträgern. Legen Sie die Objektträger fünf Stunden lang bei 37 Grad Celsius in den Inkubator, bevor Sie sie bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis die Analyse beginnen kann. Das Subjekt sollte in Einwegshorts schlüpfen und in Rückenlage in einem ruhigen, dunklen, klimatisierten Raum liegen.

Wenn Sie bereit sind, zu beginnen, positionieren Sie die Elektroden für den Ultraschall und unser Gerät zur arteriellen Steifigkeit. Legen Sie als Nächstes die Blutdruckmanschette auf das Subjekt. Beginnen Sie nach 20 Minuten mit der Blutdruckmessung und wiederholen Sie die Messungen, bis die Messungen innerhalb von fünf Millimetern von Quecksilbersäule liegen.

Ruhen Sie sich zwischen jedem Lesen zwei Minuten aus und führen Sie mindestens drei Minuten aus. Als nächstes tasten Sie auf den Puls der Arteria brachialis und platzieren Sie das Sonometer, um die Formen der brachialen Wellen aufzuzeichnen. Wiederholen Sie dies für die Arteria radialis, die Arteria femoralis und die Halsschlagader.

Messen Sie den Abstand zu jeder dieser Stellen von der Supersternumkerbe mit einem Maßband für die Arteria brachialis, radial und carotis und einem benutzerdefinierten Lineal für den Oberschenkelknochen. Berechnen Sie als Nächstes die Pulswellengeschwindigkeit der Halsschlagader, der brachialen Halsschlagader und der femoralen Halsschlagader mit einer speziellen Software. Platzieren Sie die Unterarm-Blutdruckmanschette nur distal des Reon-Prozesses.

Stellen Sie die Gefäßsoftware auf den Auslösemodus ein und zeichnen Sie mindestens 10 Herzzyklen der Arteria brachialis zu Studienbeginn, Ultraschallbilder und Messungen der Blutflussgeschwindigkeit auf. Auf Wunsch kann ein mechanischer Arm verwendet werden, um die Ultraschallsonde zu stabilisieren. Als nächstes blasen Sie die Unterarm-Blutdruckmanschette auf 250 Millimeter Quecksilbersäule auf.

Und starten Sie einen Timer. Weisen Sie den Teilnehmer an, sehr still zu bleiben. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung von Geschwindigkeiten, wenn der Timer den Auslöser von vier Minuten und 45 Sekunden anzeigt.

Lassen Sie die Manschette nach fünf Minuten los und wechseln Sie den Ultraschall, um Bilder im B-Modus aufzunehmen. Wenn die Uhr fünf Minuten und 10 Sekunden anzeigt. Fahren Sie mit der Aufnahme fort, bis die Uhr sieben Minuten anzeigt.

Als nächstes messen Sie den Blutdruck des Probanden. Wenn der systolische Blutdruck größer oder gleich 100 Millimeter Quecksilbersäule ist, geben Sie 0,4 Milligramm sublinguales Nitroglycerin unter die Zunge des Probanden und starten Sie den Timer. Starten Sie die Aufnahme im B-Modus, wenn die Uhr drei Minuten anzeigt, und beenden Sie die Aufnahme.

Wenn die Uhr acht Minuten anzeigt. Um die gefärbten Endothelzellen zu analysieren, sollte ein einzelner verblindeter Experimentator die Objektträger scannen. Systematisch werden Endothelzellen durch positive Färbung für VE-Cadherin identifiziert und die nukleäre Integrität durch positive Färbung für Dapi bestätigt. Darüber hinaus sollten die Zellen für das interessierende Protein gefärbt werden.

Insgesamt sollten 30 Zellen pro Objektträger für die spätere Analyse abgebildet werden. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Objektträger in der gefärbten Charge, einschließlich des VE-Kontrollobjektträgers. Qualitative Software wird verwendet, um die Intensität der Färbung für den primären Antikörper von Interesse zu analysieren.

Dieses Bild zeigt den Ausgangsdurchmesser der Arteria brachialis, der bei der Beurteilung eines Patienten mit chronischer Nierenerkrankung nach dem Lösen der Manschette für zwei Minuten erhalten wurde. Diese Aufnahme zeigt eine R-Wellen-Gated-Änderung des Durchmessers. Diese Wellenformen wurden an jeder der Halsschlagadern und der Oberschenkelarterie erhalten.

Die Differenz in Zeit und Entfernung wurde verwendet, um einen Bericht über die Pulswellengeschwindigkeit der Aorta zu berechnen. Hier wurden Kontroll- und Patientenzellen auf nukleäre Integrität mit DPI-Endothelzellexpression mit VE-Cadherin und auf das oxidative Enzym N-A-D-P-H-Oxidase analysiert. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, Ultraschallbilder, Wellenformen und Endothelzellbilder von höchster Qualität zu erhalten, die für eine genaue und quantitative Beurteilung möglich sind.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Proben äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung getroffen werden sollten.