Name: Eine modifizierte In-vitro- Invasion Assay, um die mögliche Rolle von Hormonen, Cytokinen und / oder Wachstumsfaktoren bei der Vermittlung der Invasion von Krebszellen fest, (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Erfahren Sie, wie ein modifizierter In-vitro-Invasions-Assay die Rolle von Hormonen, Zytokinen und Wachstumsfaktoren bei der Krebszellinvasion untersucht. Diese Methode ermöglicht präzise Einblicke in Metastasemechanismen.

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Die Autoren geben an, dass sie von der D'Youville College School of Pharmacy, Buffalo, NY, finanziert werden.

1. Bereiten Sie die verschiedenen Medien und Zusatzkomponenten <ol><li> Vor experimentieren, bereiten Medien aus DMEM oder andere spezifizierte Medien mit der Zugabe von entweder normalen FBS, Aktivkohle gereinigt FBS oder Aktivkohle gereinigt FBS sowie die Komponente zu testen. Man beachte, dass mehrere Komponenten können in jedem Experiment getestet werden. </li><li> Abzuwiegen und verdünnt die Hormone, Wachstumsfaktoren oder Cytokine in geeigneter Weise in der Aktivkohle gereinigt Serum bei der physiologischen Konzentration gelöst werden. </li></ol> 2. Bereiten Sie die Kollagenmatrix on Ice <ol><li> Planen 2 ml Kollagen I Matrix bei 2,2 mg / ml durch Zugabe der folgenden sterilfiltriert Komponenten auf Eis: 200 ul 10x PBS (pH 7,4), 5,4 ul 1 N NaOH, 600 ul bidestilliertes H 2 O und 1,2 ml Kollagen I (bei 3,63 mg / ml). </li><li> Halten Kollagen I-Lösung auf Eis, bis bereit, zu plattieren. </li></ol> 3. Bereiten Sie die Migration / Invasion Platten für Assay &lt;/ P&gt; <ol><li> Für jede zu testende Zelllinie, verwenden Sie eine 24-Well-Kammerplatte, in der 12-Mulden enthalten Einsätze. Mit den zusätzlichen 12 Brunnen, die Einsätze nicht enthalten, zum Addieren der chemoattractant Medien und die Übertragung der Einsätze für den Versuchsaufbau. HINWEIS: Ein Kollagenmatrix auf Platten mit einem Polyethylenterephthalat (PET) Membran und 8 &amp; mgr; m Porengröße ist optimal für die Zelllinien verwenden hier. Jedoch kann eine Matrigel-Matrix in vorbeschichteten Platten auch mit der Porengrße verringert entsprechend die Zelllinie untersucht, ausgewechselt werden. </li><li> Eindeutig zu kennzeichnen die Platte, mit 3 Vertiefungen pro Zustand analysiert (FBS Migration, CS-FBS Migration, FBS Invasion und CS-FBS Invasion sowie FBS-Migration für eine Kontrolle, nicht-invasive Zelllinie). Assay Migration durch Bewegung durch Poren in einem PET-Membran und Assay Invasion durch Bewegung durch eine Collagen oder Matrigel-Matrix und dann durch die Poren in der Membran. Verwenden Sie unterschiedliche Farbmarkierungen für jede Zelle Zustand einID im Beschichtungsprozess. </li></ol> 4. Pipettieren Sie die Invasion Matrix <ol><li> Beim Pipettieren der 75 ul der Kollagenmatrixlösung in die Einsätze für Invasionsassays verwendet werden. Seien Sie vorsichtig, um Luftblasen zu vermeiden. Disperse Blasen durch Anlegen eines invertierten Pipettenspitze auf die Oberfläche. </li><li> Übertragen die Platte mit den Kollagen-beschichteten Einsätze zu einem 37 ° C und 5% CO 2 Inkubator für 30 min, um das Gel zu ermöglichen, sich zu verfestigen. </li></ol> 5. Platte die Zellen auf der Membran oder Matrix-Invasion <ol><li> Inzwischen trypsinieren Zellen und fügen Sie Medien mit 10% FBS. Spin-Zellen bei 200 xg für 5 min auf einer Tischzentrifuge und spülen 3x in serumfreiem Medium. </li><li> Resuspendieren in serumfreiem Medium. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder automatisierte Diaschau-Zähler. Hinzufügen serumfreiem Medium auf eine Endkonzentration von 5 x 10 4 Zellen / ml. </li><li> Wenn die Kollagenmatrix (nach 30 min) verfestigt wird, fügen 700 ul Medium mit entweder2% definiert FBS oder Holzkohle-beraubt FBS in jede Vertiefung. Von den 12 Einsätzen pro Platte: <ul><li> 3 Einsätze Kollagen und Vertiefungen mit Medium + 2% FBS </li><li> 3 Einsätze Kollagen und Vertiefungen mit Medium + 2% FBS CS- </li><li> 3 Einsätze haben keine Kollagen und Vertiefungen, die mit Medien + 2% FBS </li><li> 3 Einsätze haben keine Kollagen und Vertiefungen, die mit Medien + 2% FBS CS- </li></ul><ol><li> Verwendung zusätzlicher Platten in Abhängigkeit von der Zahl der Faktoren, die getestet und mit einem nicht Kollagen Steuerung entsprechend jedem Zustand. </li></ol></li><li> In Zellsuspension auf die Einsätze bei 5 × 10 4 Zellen / ml, Überzug 500 ul Zellen pro Einsatz in allen Migration und Invasion Einsätze. </li><li> Die Zellen für 22 Stunden bei 37 ° C. </li></ol> 6. Quantifizierung der Anzahl der Migration und eindringenden Zellen <ol><li> Richten Färbung von Brunnen mit Methanol Fixiermittel, Eosin und Hämotoxylin, in getrennten Vertiefungen. </li><li> Verwenden Sie Wattestäbchen, um Zellen und Matrix aus jeder Vertiefung entfernen.Rrepeat mit zweiten Tupfer Anwendung für jede Vertiefung. </li><li> Mit einer Pinzette, tauchen jedes Einsatzes 5 Mal für 1 Sekunde in jeder der 3-Lösungen in Folge. </li><li> Lassen Einsätze trocknen O / N. </li><li> Entweder i) Filter entfernen mit einem Skalpell, Schneiden sorgfältig an den Rändern und montieren auf einem Objektträger mit Deckglas und Immersionsöl, oder ii) erlauben die Einsätze trocknen O / N invertiert und verwenden Sie die Einsätze direkt für die Mikroskopie. </li><li> Am nächsten Tag sehen können Dias oder Einsätze unter dem Mikroskop mit einem 20x-Objektiv und nehmen Sie sich 5 Bildern aus verschiedenen Regionen des Filters. Um die Konsistenz zu verbessern, nehmen 4 äußeren Feldern und einem Zentrum. </li><li> Zählen von Zellen für alle Bedingungen mit der ImageJ Software und beziehen sich auf die nachstehenden Formeln. </li><li> Bestimmen Sie die Prozent-Invasion, wie folgt: Die mittlere Anzahl der Zellen eindringende durch Kollagen I einfügen = a Die mittlere Anzahl der Zellen, die Migration durch Steuerung Einsatz = b % Invasion = (a / b) · 100 </li><li> Bestimmen Sie die Invasion Index in 2% FBS, wie folgt: % Invasion von Zellen (in 2% FBS) getestet = c % Invasion Steuernichtinvasiven Zellen (2% FBS) = d Invasion Index (FBS) = (c / d) </li><li> Bestimmen Sie die Invasion Index in 2% CS-FBS wie folgt: % Invasion von Zellen (in 2% CS-FBS) = e getestet % Invasion Steuernichtinvasiven Zellen (2% CS-FBS) = f Invasion Index (CS-FBS) = (e / f) </li></ol> 7. Wiederholen Sie die Versuchsprotokoll Vergleichen von Holzkohle-beraubt FBS auf Holzkohle-beraubt FBS + X n mit mehreren Faktoren zusammen <ol><li> Wiederholen Sie diese Prozedur mehrmals bei Bedarf mit verschiedenen Komponenten für &quot;X&quot; oder einer Kombination von Komponenten. </li><li> Übernehmen Sie die Berechnungen, um den Beitrag der einzelnen Faktoren &quot;X&quot;, um die Migration und Invasion Auswirkungen zu bestimmen. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Tumormetastasen ist ein mehrstufiger Prozess. Die Zellen müssen über die Basalmembran zu brechen, intravasate entweder in das Lymphsystem oder Blutmikrogefäße, in denen sie an entfernten Stellen transportiert werden. Die Tumorzellen dann extravasieren und zu kolonisieren in eine macrometastasis 12. Progression durch die Epithelzellen zu mesenchymale Transition (EMT), Tumorinvasion und Metastasierung wurde von Steroidhormonen 13,14 erweitert, Wachstumsfaktoren von 15 bis 18, 19 bis 21 und...

Eine neuartige Invasionstest wurde mit dem Ziel der Identifizierung der Einbeziehung spezifischer Hormone, Cytokine und / oder Wachstumsfaktoren als Chemoattraktantien in Invasion von Krebszellen entwickelt. Die Fähigkeit der Tumorzellen durch die extrazelluläre Matrix (ECM) einzudringen ist ein Markenzeichen der metastatischen Phänotyp 1-3. Invasionskammern wurden intensiv als in vitro-Werkzeuge zur Invasion von Krebszellen und die Migration zu untersuchen und möglicherweise Kenntnis über die Mechanismen der in vivo Tumorinvasion und Metastasenbildung bereitzustellen. Die Kammern bestehen aus zylindrischen Zellkultureinsätze in die Vertiefungen von Zellkulturplatten verschachtelt sind. Die Unterseiten der Einsätze semipermeablen Polycarbonat- oder Polystyrolmembranen definierte Porengrößen. In der Standard-Invasion Assay werden die Zellen auf den Einsatz Membran mit serumfreiem Medium ausgesät und in Zellkulturschalen, die mit Serum oder Serumähnlichen Lockstoffe gefüllt werden aufgestellt, um set up a chemoattractive Kraft. Diese Kraftantriebe Zellen durch die halbdurchlässige Membran (Migration) bewegen, oder alternativ, durch eine Beschichtung aus extrazellulären Matrix (Invasion), die dann unter Verwendung herkömmlicher Farbstoffe zum Nachweis und zur Quantifizierung der Anzahl von Zellen angefärbt werden können. Die Zellzahl wird dann entsprechend dem Ausmaß der Migration und Invasion in einer nichtinvasiven Zelllinie normalisiert. Dieses Verfahren ermöglicht ein Ermittler die invasive Potential von verschiedenen Zelltypen unter einer Vielzahl von Bedingungen, einschließlich genetische Manipulationen zu bewerten. Hormone, Zytokine und Wachstumsfaktoren sind kritische Komponenten von Serum und werden zunehmend gezeigt, dass mit einem Antrieb des invasiven Phänotyps 4 zugeordnet werden. Allerdings ist die Art, Aufgaben und Spezifität dieser chemoattractive Serum-Moleküle bei der Vermittlung Invasion nach wie vor schwer. Die Herausforderung bleibt, zu bestimmen, welche spezifischen Faktoren in Serum oder Serumähnlichen Lockstoffe für den Antrieb zuständig sindInvasion von Krebszellen als auch, was Moleküle können die Invasion Prozess hemmen. In diesem Bericht beschreiben wir eine Methode, um die mögliche Beteiligung von Hormonen, Cytokinen und / oder Wachstumsfaktoren im Serum zu bewerten, wie Moleküle Antrieb der Chemoattraktion und Invasion von Krebszellen. Bei diesem vorgeschlagenen modifizierten Protokoll wird verwendet, um Holzkohle Strippen Hormone, Zytokine und Wachstumsfaktoren von 2% fötalem Rinderserum (FBS) zu entfernen, um 2% Aktivkohle gereinigt FBS (CS-FBS) zu erzeugen. Sowohl 2% FBS und 2% CS-FBS als Mittel verwendet zum Einrichten der chemoattractive Kraft Invasion von Krebszellen zu fahren. Verwendung von 2% CS-FBS als chemoattractive Mittel im Vergleich zu normalen 2% FBS bietet mehrere Vorteile, einschließlich erster und am deutlichsten, die Möglichkeit, das Krebsinvasion Phänotyp in dem reduzierten / relative Abwesenheit von Hormonen, Zytokinen und Wachstumsfaktoren zu untersuchen. Er ermöglicht auch die Prüfer, ob gemeinsamen Entfernung von Hormonen, Wachstumsfaktoren zu beurteilen und cytokines bewirkt eine Zunahme oder Abnahme der invasive Index. Der Assay wird dann entwickelt, um zu bestimmen, ob die Zugabe einer einzelnen Komponente, die als &quot;X&quot; bezeichnet hemmen, Senkung, Erhöhung oder Wiederherstellung der invasive Index auf den ursprünglichen Wert (siehe 2 und 3). Obwohl diese Methode ist spezifisch für das Erreichen der physiologischen Konzentrationen der Komponente, die aus dem Serum während Kohledestillation entfernt wird, sollte auch beachtet werden, dass Kohle Abstreifen kann auch Auswirkungen auf Signaltransduktionswege werden. Zum Beispiel wurde berichtet, dass Kohle Strippen kann die alkalische Phosphatase-Aktivität der Knochenvorläuferzellen zu verringern und induzieren Adipogenese durch Reduktion von MAPK Aktiva 5. Aktivkohle gereinigt Medien sind im Handel erhältlich und auf dem Protokoll basiert umrissen, damit kombiniert Kohle mit Dextran und mit fötalem Rinderserum O / N 6 inkubiert. Dieser Test wurde in respo entwickeltnse zu einem Ergebnis von Zucker et al. 7 berichteten die Autoren gezeigt, dass eine mutierte Phänotyp beeinflussen gap junction Kommunikations zeigten eine Zunahme bei der Invasion Index bei der Migration in Richtung Medien normales 2% FBS. Dieser Anstieg wurde mit dem Ersatz von Holzkohle-gestrippt Serum eliminiert. Aus diesem Ergebnis schlossen die Autoren, dass diese Mutante betroffen Migration in Richtung eines lipophilen Moleküls (genauer gesagt, ein Hormon, Wachstumsfaktor oder Zytokin) 7. Es ist bekannt, daß Hormone, Wachstumsfaktoren und Zytokine vermitteln Signalwege in Tumorpromotion und Invasion 4 beteiligt. Daher ist es wichtig, für wissenschaftliche Forscher, um festzustellen, was Faktor (en) treiben die Tumorinvasion ihrer besonderen Krebszellen oder Mutanten untersucht. Der Test wurde entwickelt, um die Rolle der einzelnen Komponenten auf den physiologischen Konzentration ansprechen als entsprechend der Differenz zwischen der Konzentration der Komponente bestimmt und# 8220; X &quot;in normalen FBS und der CS-FBS. Durch die Entwicklung dieses Assays können Forscher mehr Einblick in die spezifische invasiven Weg zur Regelung ihrer System zu erlangen. Hormone, Wachstumsfaktoren und Zytokine sind oft als Tumorpromotoren 8 klassifiziert. Einige dieser Faktoren wie EGF als direkte Quellen für chemische Lockstoffe in Invasionskammern 9 verwendet. So scheint es wahrscheinlich, dass diese stellen die Hauptkomponenten des Serums, dass direkte Tumorinvasion. Dieses Protokoll schlägt eine einfache, aber bedeutenden, Modifikation der herkömmlichen in vitro-Invasionstest, der ein Ermittler die Beteiligung von Hormonen, Wachstumsfaktoren und Cytokine bei der Vermittlung der invasive Potential von Tumorzellen zu bewerten gestattet. Jedoch wird der Assay entwickelt, um dem Prüfer eine Antwort auf die Frage, ob das Verfahren wird in einem frühen Schritt in der Analyse wirksam für ihre Studie liefern, um nicht wertvolle Zeit und r verwendenESSOURCEN wenn nicht notwendig erachtet. Bei dieser Methode wird CS-FBS und stützt sich auf die Ermittler Ermessen, die als Lead-Kandidaten, die möglicherweise vermitteln Invasion von Krebszellen zu verfolgen Moleküle. Die Ergebnisse aus diesen Analysen erweisen sollte, bei der Identifizierung, welche Serumkomponenten dienen als Chemoattraktantien oder Inhibitoren für die bestimmte Zelllinie oder Mutante untersucht werden. Darüber hinaus kann dieser Ansatz hilft der Forscher identifizieren Schlüsselsignalwege entweder fördern oder zu hemmen Invasion von Krebszellen; damit die Leitung zukünftige Entwicklung von Arzneimitteln.

<table><tbody><tr><td>BioCoat Control Inserts mit 8.0 & micro; m PET-Membran</td><td>Corning</td><td>354578</td><td>12 in jeweils zwei 24-Well-Platten. PET = Polyethylenteraphthalat</td></tr><tr><td>Kollagen I, Rattenschwanz</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Quelle = Rattenschwanzsehne, Reinheit = 90%</td></tr><tr><td>Fixiermittel; Diff-Quick</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9844047</td><td>Fixiermittel auf Methanolbasis, Hämatoxylin/Eosin</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Life Technologies</td><td>16000</td><td>Bezeichnung als FBS</td></tr><tr><td>Holzkohlegestreiftes fötales Rinderserum</td><td>Life Technologies</td><td>12676</td><td>Bezeichnung als CS-FBS</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30070</td><td>bezeichnet als FBS</td></tr><tr><td>Aktivkohle gestreiftes fötales Rinderserum</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30068</td><td>bezeichnet als CS-FBS</td></tr></tbody></table>

eine modifizierte<em&gt; in-vitro-</em&gt; invasion assay, um die mögliche rolle von hormonen, cytokinen und / oder wachstumsfaktoren bei der vermittlung der invasion von krebszellen fest,

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Blutserum dient als chemoattraktive, auf das Krebszellen wandern und dringen, die Erleichterung ihrer Intravasation in Mikrogefäßen. Jedoch sind die tatsächlichen Moleküle zu dem die Zellen wandern bleiben ungeklärt. Diese modifizierte Invasion Assay wurde entwickelt, um Ziele, die Zellmigration und Invasion fahren zu identifizieren. Dieses Verfahren vergleicht die Invasion Index unter drei Bedingungen, um zu bestimmen, ob ein bestimmtes Hormon, Wachstumsfaktor oder Zytokin spielt eine Rolle bei der Vermittlung des invasiven Potentials einer Krebszelle. Zu diesen Bedingungen gehören i) normale fetale Rinderserum (FBS), ii) Holzkohle-beraubt FBS (CS-FBS), die Hormone, Wachstumsfaktoren und Zytokine und iii) CS-FBS + Molekül entfernt (bezeichnet &quot;X&quot;). Eine wesentliche Änderung der Zellinvasion mit CS-FBS im Vergleich zu FBS, zeigt die Beteiligung von Hormonen, Cytokinen oder Wachstumsfaktoren bei der Vermittlung der Veränderung. Einzelne Moleküle können dann zurück zu CS-FBS zugegeben, um ihre Fähigkeit zur Wieder AssayVers oder retten die Invasion Phänotyp. Ferner können zwei oder mehr Faktoren kombiniert werden, um die additive oder synergistische Effekte mehrerer Moleküle in Fahrt oder Hemmen Invasion bewerten. Insgesamt ermöglicht dieses Verfahren den Prüfer, um festzustellen, ob Hormone, Cytokine und / oder Wachstumsfaktoren spielen eine Rolle bei der Zellinvasion durch als Chemoattraktantien oder Inhibitoren Invasion für einen bestimmten Typ von Krebszelle oder einer bestimmten Mutante dient. Durch die Identifizierung von spezifischen Lockstoffe und Inhibitoren, kann dies geändert Invasionstest helfen, aufzuklären Signalwege, die Invasion von Krebszellen zu lenken.

Die Invasion Index wird für jede Bedingung nach Normalisierung auf eine nicht-invasive Zelllinie berechnet. Für unsere Experimente verwenden wir den 1205Lu Melanomzelllinie und etablierte Variante stabile Zelllinien wie unsere invasive Leitungen sowie die Vorstufen noninvasive Variante WM793, aus dem die Zellen stammen 1205Lu 10, die als eine logische Steuerung dient. Wir verwenden auch Kollagen I nach der Invasion Matrix, denn das ist die primäre Komponente der Dermis. Dies ist in Übereinstimmung mit einer v...

Dieser Videoartikel beschreibt eine modifizierte in vitro Methode, um die Rolle von Hormonen, Zytokinen und/oder Wachstumsfaktoren bei der Invasion von Krebszellen zu untersuchen.

Eine modifizierte<em&gt; In-vitro-</em&gt; Invasion Assay, um die mögliche Rolle von Hormonen, Cytokinen und / oder Wachstumsfaktoren bei der Vermittlung der Invasion von Krebszellen fest,

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, einen In-vitro-Assay zu etablieren, mit dem die Rolle von Hormonen, Zytokinen und/oder Wachstumsfaktoren bei der Tumorzellinvasion untersucht werden kann. Dies wird erreicht, indem als zweiter Schritt bestimmt wird, ob ein Unterschied zwischen dem Invasionsindex verschiedener Zellvarianten oder Mutanten besteht. Der Invasionsassay wird mit kohleabsorbiertem Medium wiederholt, wodurch jegliche Hormone, Wachstumsfaktoren oder Zytokine aus dem Serum entfernt werden.Der Invasionstest wird anschließend wiederholt, wobei ein spezifischer, bekannter Faktor dem kohlefiltrierten Medium hinzugefügt wird, um festzustellen, ob die Migration in Richtung dieses Faktors die Invasion verstärkt oder hemmt. Die Ergebnisse zeigen die Veränderungen des Invasionindex für bestimmte Zellpopulationen während der Migration in Richtung bekannter experimenteller Faktoren, basierend auf der Normalisierung der Ergebnisse gegenüber dem Invasionindex nicht-invasiver Zellpopulationen. Die Idee zu dieser Methode kam mir erstmals, als ich einen traditionellen Invasionstest durchführte und bemerkte, dass ein signifikanter Unterschied zwischen den Invasionindizes verschiedener Zellmutanten bestand.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem traditionellen Invasionsassay besteht darin, dass mit ihr gezielt die Rolle von Hormonen, spezifischen Wachstumsfaktoren und Zytokinen bei der Förderung oder Hemmung der Zellinvasion untersucht werden kann. Diese Methode könnte bei der Beantwortung zentraler Fragen auf dem Gebiet der Krebsforschung hilfreich sein, beispielsweise welche Faktoren zur Metastasenbildung beim Krebs führen. Die Ergebnisse dieser Technik könnten einen therapeutischen Ansatz für die zukünftige Arzneimittelentwicklung liefern. Verwenden Sie für jede zu testende Zelllinie eine 24-Loch-Platte mit 12 Inserten.Dann beschriften Sie die Platten gemäß den zu analysierenden Bedingungen. Anschließend geben Sie vorsichtig je 75 µL einer frisch zubereiteten Kollagen-Matrix-Lösung in jeden Insert, der für einen Invasionstest verwendet wird, und achten Sie darauf, keine Blasen zu erzeugen. Inkubieren Sie danach die Platten mit den mit Kollagen beschichteten Inserts bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid für 30 Minuten, um die Gelierung zu ermöglichen.Nachdem die experimentellen Zellen mit Trypsin abgelöst wurden, Medium mit 10 % FBS zugeben, um das Enzym zu inaktivieren, und die Zellen dreimal mit PBS waschen. Anschließend den Zellpellet in serumfreiem Medium resuspendieren und die Zellen zählen. Wenn die Kollagenmatrix erstarrt ist, serumfreies Medium so zugeben, dass eine Endkonzentration von 50.000 Zellen pro Milliliter erreicht wird.Nach 30 Minuten 700 Mikroliter Medium mit entweder 2 % definiertem FBS, 2 % kohlefiltratfreiem FBS oder 2 % kohlefiltratfreiem FBS plus der zusätzlichen Komponente in jedes Gefäß geben. 500 Mikroliter Zellsuspension in serumfreiem Medium in das obere Kompartiment jedes Migrations- oder Invasions-Inserts geben und die Ansätze 22 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren.Danach Methanol, Fixans, Eosin und Hämation in drei der leeren Vertiefungen der Kammerplatte geben. Anschließend die Zellen und die Matrix von der Oberseite jedes Inserts durch zweimaliges Abwischen mit Wattebäuschen entfernen. Dann mit einer Pinzette.Tauchen Sie jeden Insert fünfmal nacheinander jeweils für eine Sekunde in jede der drei Färbelösungen ein und lassen Sie die Inserts über Nacht verkehrt herum trocknen. Am nächsten Tag verwenden Sie ein 20x-Objektiv, um Bilder der Zellen auf den Inserts zu erfassen, indem Sie die gefärbten Inserts direkt betrachten.Für jede Probe werden fünf Bilder aufgenommen, darunter vier aus den äußeren Bereichen der Membran und eines aus dem Zentrum. Abschließend werden mithilfe der Image-J-Software die Zellen für jedes Bild gezählt und der Invasionsindex relativ zu einer nicht-invasiven Zelllinie normalisiert. Dieses Modell zeigt die möglichen Ergebnisse, die bei einem Invasionsassay auftreten können, sowie die entsprechende Dateninterpretation.Jeder Kreis veranschaulicht ein repräsentatives Ergebnis für einen angefärbten Filter aus einer der drei getesteten Bedingungen, und jeder Punkt repräsentiert eine Zelle, die durch die Invasionsmatrix hindurchgegangen ist und auf der Unterseite der Membran angefärbt wurde. Der Invasionsindex wird dann für jede Bedingung basierend auf der Normalisierung auf eine nicht-invasive Zelllinie berechnet. Beispielsweise wurden in diesem repräsentativen Experiment drei Hormone getestet, um einen möglichen Faktor x zu identifizieren.Zwei der Hormone hatten keinen Einfluss auf den Invasionindex, aber eines zeigte hemmende Eigenschaften, sobald die Methode beherrscht war. Diese Technik kann am ersten Tag in etwa vier Stunden und am zweiten Tag in einer Stunde durchgeführt werden, sofern alle Schritte ordnungsgemäß ausgeführt werden. Bei Verwendung dieser Technik ist es wichtig, jeden einzelnen Zellinsert sorgfältig korrekt zu beschriften.Wir verwendeten ein farblich codiertes System und verschiedene Punkte, um jeden Zellinsert sorgfältig zu kennzeichnen. Danach könnten andere Methoden wie in-vivo-Mausmodelle für Metastasen verwendet werden, um die in-vitro-Ergebnisse zu validieren. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die physiologische Relevanz von Faktoren wie Hormonen, Wachstumsfaktoren und Zytokinen als Enhancer oder Inhibitoren der Zellinvasion in einem in-vitro-Modell untersucht werden kann.Vielen Dank für Ihr Interesse an unserem Video und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

JoVE Journal

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Medizin

Ein Test zur quantitativen Messung Transforming Growth Factor (TGF)-β-induzierte Invasion im 3-dimensionalen Kollagen-Gelen beschrieben. Dieser Assay nutzt die MCF10A Reihe von Zelllinien, die verschiedenen Stadien der Entwicklung von Brustkrebs darstellen. Diese Methode kann angenommen, um mit anderen Zelllinien verwendet werden und könnte verwendet werden, um andere potenzielle Aktivatoren oder Inhibitoren der Invasion zu untersuchen sein.

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Models of Tumorzellinvasion in dreidimensionale extrazelluläre Matrix besser...

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Zellinvasion

Dieses Video beschreibt die Technik, eine native Matrix zu verwenden, um die Invasion von Tumorzellen zu untersuchen. Die in diesem Assay verwendete Technik bietet die Möglichkeit, epithelial-mesenchymale Zellinteraktionen in einer 3D-Umgebung zu bewerten, ohne dass eine synthetische oder fremde Matrix erforderlich ist.

Tumorzellinvasions-Assay: Eine native 3D-Matrix-basierte 3D-In-vitro-Methode zur Beurteilung von Epithel-mesenchymalen Zellinteraktionen

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Die Invasion des umgebenden normalen Gewebes ist ein definierendes Merkmal von bösartigen Tumoren. Wir stellen hier einen einfachen, halbautomatischen Mikroplatten-Assay der Invasion in eine natürliche 3D-Biomatrix zur Verfügung, der mit einer Reihe von Modellen fortgeschrittener menschlicher Krebsarten veranschaulicht wurde.

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Eine Krebszelle Spheroid Assay zur Invasion in einem 3D-Rahmen Beurteilen

Dieses Protokoll beschreibt einen umgekehrte vertikale Invasion-Assay, der verwendet werden könnten, um die Migration und Invasion Funktionen von Zellen in einer dreidimensionalen Umgebung unter Beibehaltung der Zelle Mikroumgebung zu quantifizieren. Dieser Test eignet sich für seltene und/oder empfindliche Zellen.

Nach oben bewegen: Eine einfache und Flexible In-vitro- dreidimensionale Invasion Assay Protokoll

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Alternative Strategie zur Analyse der in vitro Zellinvasion von 3D-Kulturen

Erfahren Sie, wie ein modifizierter In-vitro-Invasions-Assay die Rolle von Hormonen, Zytokinen und Wachstumsfaktoren bei der Krebszellinvasion untersucht. Diese Methode ermöglicht präzise Einblicke in Metastasemechanismen.

Eine modifizierte In-vitro- Invasion Assay, um die mögliche Rolle von Hormonen, Cytokinen und / oder Wachstumsfaktoren bei der Vermittlung der Invasion von Krebszellen fest, (Video) | JoVE Journal

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