Zebrabärblingszucht und die Handhabung der Embryonen

Zebrafish Breeding and Embryo Handling

JoVE Science Education
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

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JoVE Science Education Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

Zebrafish Breeding and Embryo Handling

4.1: Mouse Genotyping

4.3: Zebrafish Maintenance and Husbandry

57,150 Views

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07:48 min

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April 30, 2023

Overview

Zebrabärblinge (Danio rerio) sind ein wichtiger Modellorganismus, der besonders wertvoll für die entwicklungsbiologische Forschung ist. Zebrabärblinge sind extrem fruchtbar und können hunderte Nachkommen pro Woche produzieren, was es einfach macht eine große Anzahl von Embryonen für hohe Probenzahlen zu sammeln. Außerdem durchlaufen Zebrabärblinge eine schnelle Entwicklung und die Embryonen sind durchsichtig, weshalb es einfach ist entwicklungsbiologische Prozesse zu visualisieren.

Dieses Video behandelt die Schritte, welche erforderlich sind, um frisch befruchtete Zebrabärblingsembryonen zu gewinnen. Außerdem stellen wir einen kurzen Überblick über das Zebrabärblingspaarungverhalten bereit und geben eine Anleitung, um genetische Kreuze in speziellen Laboraquarien anzusetzen, in welchen die kontrollierte Paarung stattfinden kann. Wir zeigen außerdem die Bedingungen, durch welche die Absonderung der Eier – auch Laichen genannt – am Morgen nachdem die Aquarien angesetzt werden, eingeleitet wird. Danach präsentieren wir wichtige Verfahren, um mit Embryonen zu arbeiten, einschließlich der Hemmung der Pigmententwicklung mit der Chemikalie PTU und der Dechorinierung, also einer Prozedur, in welcher die schale-ähnliche Membran, die den Embryo umgibt (das Chorion), entfernt wird. Zum Schluss stellt das Video einige praktische Anwendungen dieser Verfahren in der entwicklungsbiologischen Forschung vor.

Procedure

Zebrabärblinge sind zwar klein, aber ein leistungsfähiges Modellsystem. Diese fruchtbaren Fische können hunderte von Nachkommen pro Woche und viele Tausende während ihrer Lebensspanne produzieren. Durch ihre schnelle äußerliche Entwicklung und ihren durchsichtigen Körper sind die Embryos ideal für viele Anwendungen. Dieses Video behandelt die Grundlagen der Embryogewinnung und Handhabung. Danach werden aktuelle Forschungsmethoden beschrieben, welche die Vorteile des Zebrabärblingembryos ausnutzen.

Um zu verstehen wie man Embryos gewinnt, hilft es ein bisschen etwas über das Paarungsverhalten des Zebrabärblings zu verstehen. Zebrabärblinge durchlaufen die sexuelle Reproduktion, das heißt dass man für Kreuzungen sowohl männliche als auch weibliche Fische benötigt. Männchen haben schlankere Körper mit einem leicht roten Farbton, während Weibchen dickere, silberne Bäuche voller Eier haben.

Die regelmäßige Paarung hält die Eier gesund. Aber alle diese Eier zu produzieren ist sehr anstrengend, und einzelne Weibchen sollten nur einmal pro Woche für die Paarung verwendet werden.

Letztendlich wird, wie das bei vielen anderen Tieren auch der Fall ist, das Paarungsverhalten in dem Fisch durch die Sinne geleitet. Geruchsimpulse von dem Männchen helfen ihrer Freundin beim Laichen, und ein bisschen Beleuchtung hilft beiden in Fahrt zu kommen.

Nun dass wir wissen wie man ein Weibchen von einem Männchen unterscheidet, ist es an der Zeit eine Kreuzung anzusetzen. Für Zebrabärblingskreuzungen benutzen Forscher Aquarien, die speziell für die Paarung gestaltet worden sind. Zuchtaquarien haben typischerweise einen entfernbaren Einsatz mit Löchern, durch welche die Eier durchfallen können. Dieser Einsatz verhindert dass hungrige erwachsene Fische die Eier aufessen.

Um anzufangen, setzt man die erwachsenen Fische am Nachmittag oder am Abend in das Zuchtaquarium. Um Embryos im frühen Stadium am nächsten Morgen zu erhalten, trennt man die Männchen und Weibchen mit einer Trennwand, welche verhindert dass die Paarung anfängt bevor man alles für das Experiment vorbereitet hat. Um zu verhindern dass die Fische rausspringen, sollte man sicherstellen dass das Zuchtaquarium mit einer Abdeckung verschlossen ist. Dann lässt man die Fische sich über Nacht aneinander gewöhnen.

Nachdem sie die Nacht miteinander im Zuchtaquarium verbracht haben, paaren sich die Fische am nächsten Morgen. Der erste Schritt für das Laichen ist die Trennwand zu entfernen, welche die Weibchen von den Männchen trennt. Wenn keine Trennwand benutzt wird, findet das Laichen kurz nach dem ersten Lichteinfall statt.

Wenn die Männchen die Weibchen durch das Aquarium jagen, stimulieren sie das Laichen, wobei sie Sperma in das Wasser für die Befruchtung ausscheiden. Nachdem man die Trennwand entfernt hat sollte man ca. 15-30 Minuten warten, um den Fischen genug Zeit für die Paarung zu lassen. Danach entfernt man die erwachsenen Fische mit einem Netz aus dem Aquarium. Alternativ kann man den Aquariumeinsatz hochheben und die Fische in ein anderes Aquarium setzen.

Danach gießt man das Wasser und die Embryos durch ein Sieb, um sie aufzusammeln. Nun benutzt man das ‘Eiwasser’ um die Embryos aus dem Sieb in eine Petrischale zu waschen. Es kann möglich sein, dass man die Embryos zwischen den verschiedenen Schalen transferieren muss, damit man die optimale Dichte von 50-100 pro Schale erreicht. Damit die Entwicklung mit der normalen Geschwindigkeit voranschreitet, stellt man die Schalen in einen 28.5°C warmen Inkubator.

Nun dass ihr eure Embryos habt, müsst ihr sie vorsichtig behandeln. Sie sind wichtig für eure Experimente! Schauen wir uns einige Hinweise an.

Um die Embryos gesund zu halten, sollte man sicher stellen dass das Wasser in den Petrischalen sauber und ohne Ablagerungen ist. Tote Embryonen sind lichtundurchlässig und sollten täglich entfernt werden. Zusätzlich kann Methylenblau zu dem Wasser hinzugefügt werden, um dem Pilzwachstum vorzubeugen.

Jedes Mal wenn man die Embryos von einer Schale in eine andere transferieren muss, sollte eine Transferpipette benutzt werden. Durch Schwenken der Schale kann man die Embryos in der Mitte der Schale konzentrieren und dadurch das Pipettieren vereinfachen.

Einige Protokolle erfordern einige weitere Schritte für die Haltung der Embryonen. Für die ersten drei Tage ihres Lebens entwickeln sich die Zebrabärlingsembryonen in einem Chorion, was die Handhabung des Embryos erschweren kann. Der Chorion kann dann durch die Behandlung mit dem proteolytischen Enzym Pronase, oder manuell durch die Benutzung einer Pinzette entfernt werden. Zusätzlich dazu fangen Zebrabärblinge nach 24 Stunden an eine Pigmentierung zu zeigen, wie hier bei der Zebrabärblingslarve zu sehen ist. Um durch dieses Problem hindurchzusehen, können Wissenschaftler PTU zu dem Embryowasser hinzugeben, welches die Produktion des Pigments Melanin hemmt.

Nun dass ihr wisst wie man Zebrabärblingsembryonen erhält, schauen wir uns einige Wege an, wie man sie für die wissenschaftliche Entdeckung verwenden kann.

Die äußerliche Entwicklung des Embryos ermöglicht die genetische Manipulation durch die Mikroinjektion von DNA, RNA oder von Genabschaltungsreagenzien. Diese Methode führt zu der gleichförmigen Verteilung des injizierten Materials durch den Embryo, wodurch sichtbare Phänotypen durch die Überexprimierung oder den Verlust eines Proteins produziert werden können. Die selben Verfahren können benutzt werden, um transgene Fische herzustellen, in welchen spezifische Strukturen durch die Exprimierung von fluoreszenten Proteinen markiert werden.

Zusätzlich macht die kleine Größe des Zebrabärblingsembryos und der Larve sie zu einem idealen System für einen phänotypischen, chemischen Screen. Hier werden Embryos in eine 96-Well Platte gesetzt, und dann mit Bibliotheken von kleinen Molekülen durch die Zugabe von Chemikalien ins Wasser behandelt. Später werden die Platten mit Fischen auf morphologische Defekte überprüft, wie zum Beispiel die hier gezeigte anormale Entwicklung.

Letztlich ist die Transparenz der Zebrabärblingsembryos ideal für die Mikroskopie. Lebende Embryos, die ein fluoreszentes Protein in spezifischen Zelltypen exprimieren, können auf den Objektträger gelegt werden, damit Forscher dann die Zellbewegungen von sich entwickelnden Geweben mit der Zeit mit dem Konfokalmikroskop untersuchen können.

Das war das Video über die Zebrabärblingszucht und die Handhabung von Embryonen von JoVE. In diesem Video haben wir uns die Grundlagen der Kreuzung, wie man die Zuchtaquarien ansetzt, und wie man die Embryonen handhabt, behandelt. Wir haben außerdem einige Methoden gezeigt, wie man die Vorteile dieses leistungsstarken, kleinen Embryos nutzen kann. Danke für eure Aufmerksamkeit!

Transcript

Zebrafish are a small but powerful model system. These prolific fish can generate hundreds of offspring per week and many thousands over their lifetimes. Rapid external development and transparent bodies make the embryos ideal for diverse applications. This video will cover the basics of embryo collection and handling before describing current research methods that take advantage of zebrafish embryos.

In order to generate embryos, it helps to know a little bit about zebrafish mating behavior.

Zebrafish undergo sexual reproduction, so breeding requires both male and female fish. Males have slimmer bodies with a slightly red hue, while females have bigger, silver bellies full of eggs.

Periodic mating keeps eggs healthy, but making all those eggs takes a lot of work, so individual females should only be mated once per week.

Finally, like many other animals, sensory processes guide mating behavior in fish.

Olfactory cues from the male help to get his lady friend ready to spawn, while a little bit of mood lighting sets them both in action.

Having learned how to identify male and female fish, it’s time to set up a cross.

For zebrafish breeding, researchers use tanks specifically designed for mating. Breeding tanks typically feature a removable insert with holes that allow eggs to fall through. This feature protects the eggs from being eaten by hungry adult fish.

To begin, combine adult fish in breeding tanks during the afternoon or evening. To collect early stage embryos the following morning, separate male and female fish with a divider, which stops them from breeding before you’re ready to begin an experiment. To prevent the fish from jumping out, be sure to cover the breeding tank with a lid. Then, leave the fish to acclimate to each other overnight.

After spending the night together in a breeding tank, the fish will mate the following morning.

The first step in the morning is to remove the divider from between the male and female fish to initiate spawning. If a divider is not used, the fish will lay eggs shortly after light onset.

As the males chase the females around the tank, they stimulate spawning of eggs while releasing sperm into the water for fertilization. Wait approximately 15 – 30 minutes after pulling a divider to give the fish time to mate. Then, remove the adults from the tank by using a net or by lifting the tank insert and placing the fish into another tank.

Next, pour the water and the embryos through a mesh tea strainer for collection. Then, using “egg water,” wash the embryos off the strainer into a petri dish. It may be necessary to transfer embryos between dishes to achieve an optimal density of 50 – 100 per dish. To ensure development proceeds at a normal pace, place the dishes in an incubator at 28.5 °C.

Once you’ve got your embryos, handle them with care. They are important for your experiments! Let’s go over some pointers.

To keep embryos healthy, make sure to keep the water in the petri dishes clean and free of debris. Dead embryos will be opaque and should be removed daily. Additionally, methylene blue can be added to the water to prevent fungal growth.

Any time you need to move embryos from one dish to another, use a transfer pipet. By swirling the dish, you can concentrate the embryos in the center of the plate, making the pipetting easier.

Some protocols require a few additional steps for embryo maintenance. For the first three days of life, zebrafish embryos develop inside of a chorion, which can impede manipulation of the embryo. The chorion can be removed by treatment with the proteolytic enzyme, pronase, or by using forceps to remove it manually. Additionally, zebrafish begin to develop pigment by 24 hours, as shown here in this zebrafish larva, which can interfere with microscopy. To see through this problem, scientists supplement the embryo water with PTU, which inhibits production of the pigment melanin.

Now that you know how to obtain and care for zebrafish embryos, let’s explore some of the ways researchers use them for scientific discovery.

The external development of zebrafish embryos allows for genetic manipulation by microinjection of DNA, RNA, or gene knockdown reagents. This method leads to uniform distribution of injected material throughout the embryo and can produce visible phenotypes resulting from the overexpression or loss of a protein. The same technique can also be used to make transgenic fish in which specific structures are marked by the expression of fluorescent proteins.

Additionally, the small size of zebrafish embryos and larvae make them ideal for phenotypic chemical screening. Here, embryos are loaded into 96-well plates and then treated with libraries of small molecules by adding the chemicals into the water. Later, these plates of fish are screened for morphological defects, such as the abnormal development shown here.

Finally, the transparency of the zebrafish embryos makes them well suited for microscopy. Live embryos expressing fluorescent proteins in specific cell types can be mounted and visualized with confocal microscopy, allowing researchers to examine cell movements in developing tissues over time.

You’ve just watched JoVE’s video on zebrafish breeding and embryo handling. In this video, we’ve discussed the basics of mating, setting up breeding tanks, and embryo handling. We also discussed some research methods that take advantage of this powerful little embryo. Thanks for watching!

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