Einem Restriktionsenzym basierte Klonen Methode, um das Beurteilen In-vitro- Replikation Kapazität von HIV-1 Subtyp C-Gag MJ4 chimären Viren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Gag-Gene, die von mit dem Subtyp CHIV infizierten Personen abgeleitet sind, in ein replikationskompetentes HIV-Plasmid einzubauen. Um die Wirkung von Gag-Sequenz-Polymorphismen auf die Replikationskapazität von HIV one in vitro zu beurteilen, wird dies zunächst durch Amplifikation des Gag-Gens aus dem Plasma des Patienten erreicht. Der zweite Schritt besteht darin, die vom Patienten abgeleitete Gag-Sequenz in den replikationskompetenten infektiösen molekularen Klon MJ vier zu klonen.

Als nächstes wird das Gag-Plasmid MJ mit vier Chimären transfiziert, um infektiöse Virusstämme zu erzeugen, und titerisiert, um die Infektiosität auf einer Indikatorzelllinie zu beurteilen. Der letzte Schritt besteht darin, die In-vitro-Replikationskapazität in der G XR 25 T-Zelllinie zu messen. Letztendlich wird ein radiomarkierter reverser Transkriptase-Assay verwendet, um die Virionenproduktion im Laufe der Zeit zu quantifizieren und die Kinetik der viralen Replikation sichtbar zu machen.

Die Methode, die wir heute beschreiben werden, kann helfen, Schlüsselfragen im HIV-Bereich zu beantworten. Dazu gehören die Definition der Determinanten der replikativen Fitness von HIV und das Verständnis, wie sich die HIV-Fitness auf die langfristige Pathogenese auswirkt. Die Methoden werden heute von Jessica Prince und Dan Klaban, zwei meiner Doktoranden, beschrieben.

Um dieses Verfahren zu beginnen, wird CDNA aus RNA reverse transkribiert und die DNA-Produkte der ersten Runde mit Hilfe von reverser Transkriptase und einer thermostabilen DNA-Polymerase in einer einstufigen RT-PCR amplifiziert. Führen Sie dann unter Verwendung eines Mikroliters der PCR-Amplifikation der ersten Runde als DNA-Template eine verschachtelte PCR-Amplifikation der zweiten Runde durch. Als nächstes fügen Sie drei Mikroliter mit fünf x Ladefarbstoff zu fünf Mikrolitern des Reaktionsvolumens der zweiten Runde hinzu.

Lassen Sie es bei 120 Volt an einem 1%arosa TAE-Gel laufen, das einen UV-fluoreszierenden DNA-Farbstoff enthält, bis sich die Banden aufgelöst haben. Visualisieren Sie dann die 1,6 KB großen Bänder auf einem Blaulichtbeleuchtungsgerät. Danach lassen Sie das verbleibende Reaktionsvolumen von 45 Mikrolitern auf einem 1%aros, TAE-Gel laufen, das den DNA-Farbstoff enthält.

Schneiden Sie die entsprechenden Bänder mit einer sauberen Rasierklinge aus und kombinieren Sie drei positive Reaktionen pro Person. Extrahieren Sie anschließend DNA aus der Gelscheibe mit einem Gelaufreinigungskit und verwenden Sie sie in nukleasefreiem Wasser. Frieren Sie das Produkt bei minus 20 Grad Celsius ein, um es später in diesem Verfahren zu verwenden.

Nach der Amplifikation der langen terminalen Wiederholung fünf Primzahlen UTR-Region des MJ vier Plasmids. Visualisieren Sie die 1,3 KB PCR-Produkte auf dem Illuminator, entfernen Sie die positiven Amplikone, reinigen und frieren Sie sie dann wie zuvor beschrieben ein. Erstellen Sie als Nächstes die fusionierten MJ-Amplikons mit vier LTR-Gags mittels Spleißüberlappungsverlängerungs-PCR.

Visualisieren, exzentrieren, reinigen und frieren Sie das 3,2 kb lange Amplikon ein. Verdauen Sie nun 1,5 Mikrogramm MJ, vier Plasmid und 1,5 Mikrogramm gereinigtes LTR-Gag-PCR-Produkt mit BCL-Ein-Restriktionsendonuklease für 1,5 Stunden bei 50 Grad Celsius. Anschließend wird ein Mikroliter NGOM vier zur Verdauungsreaktion hinzugefügt und eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubiert.

Fügen Sie danach fünf x Ladefarbstoff zu den Restriktionsverdauungsreaktionen hinzu. Langsam elektrophoresisieren Sie das Gesamtvolumen auf einem 1%aros, TAE-Gel, das einen DNA-Farbstoff enthält, für ein bis zwei Stunden bei 100 Volt. Visualisieren, exzitieren und reinigen Sie die angezeigten Banden für das Klonen, wie zuvor beschrieben.

Bereiten Sie anschließend die Ligationsreaktionen mit einem gereinigten LTR-Knebel vor. Insertion einer MJ-DNA mit vier Vektoren in einem Verhältnis von drei zu eins von Insertion zu Vektor. Inkubieren Sie die Ligationsreaktionen über Nacht bei vier Grad Celsius.

Transformieren Sie dann JM 1 0 9 chemisch kompetente Bakterien mit Ligationsprodukten, die auf LB-Schneckenplatten mit 100 Mikrogramm pro Milliliter verteilt sind. Ampicillin züchtet transformierte Bakterien mindestens 22 Stunden lang bei 30 Grad Celsius. Um die Klontreue zu bestätigen, schneiden Sie die Mini-Prep-DNA mit den Restriktionsenzymen NGO M vier und HPA 1 in einem doppelten Verdau bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden.

Analysieren Sie es anschließend mit einem 1%aros. TAE-Gel. Berechnen Sie das Virusvolumen, das aus jedem Stamm benötigt wird, basierend auf der IE pro Mikroliter Titer aus einem TZM BL-Zellassay, um fünfmal 10 bis zum fünften G XR zwei fünf Zellen bei einer Infektionsmultiplizität von 0,05 zu infizieren.

Achten Sie darauf, dass Sie für die Arbeit mit replikationsfähigem HIV eine geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen, die am Tag der Infektion einen vollständigen Kittel, eine Gesichtsmaske und doppelte Handschuhe umfasst. Virenbestände aus dem minus 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank nehmen und auftauen. Verdünnen Sie anschließend das Virus in C-R-P-M-I-Medien auf ein Volumen von 100 Mikrolitern.

Um einen MOI von 0,05 zu erreichen, geben Sie es in die mit VBO behandelte 96-Well-Platte, einschließlich einer Positiv- und einer Negativkontrolle in jedem Satz von Replikationsexperimenten, und richten Sie die Platte so ein, dass jede zweite Säule leer ist, um eine Kreuzkontamination zwischen den Wells zu begrenzen. Zählen Sie anschließend die GXR mit einem automatisierten Zellzähler zwei und fünf Zellen und berechnen Sie die Anzahl der Zellen, die insgesamt für alle Infektionen benötigt werden. Aliquotieren Sie das erforderliche Volumen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie, um die Zellen zu pelletieren.

Dann das Medium vorsichtig aspirieren und in C-R-P-M-I in einer Konzentration von fünfmal 10 bis zur fünften Zellzahl pro 100 Mikroliter resuspendieren, die Zellen in einen sterilen Trog pipettieren und gründlich mischen. Anschließend werden mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter Zellen in jede Vertiefung der 96-Well-Platte mit dem verdünnten Virus gegeben und gründlich gemischt. Geben Sie danach zwei Mikroliter von fünf Milligramm pro Milliliter Polyhirnlösung in jede Vertiefung und mischen Sie die Zellen gründlich.

Anschließend bei 37 Grad Celsius in einem Gewebekultur-Inkubator mit 5%CO2 für drei Stunden inkubieren, um die infizierten Zellen zentrifugierend zu waschen. Die 96-Well-V-Bodenplatte zum Pelletieren der Zellen. Entfernen Sie dann vorsichtig 150 Mikroliter des Mediums und ersetzen Sie es durch frische 150 Mikroliter C-R-P-M-I, ohne das Zellpellet zu stören.

Wiederholen Sie den Vorgang noch zwei weitere Male, um die Zellen ausreichend zu waschen, nach der letzten Zentrifugation und der Zugabe von 150 Mikrolitern C-R-P-M-I resuspendieren Sie das Zellpellet mit einer Mehrkanalpipette. Geben Sie die Mischung aus jeder Vertiefung zu 800 Mikrolitern C-R-P-M-I in eine Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Stellen Sie die Platte dann alle zwei Tage in einen 5%CO2-Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius.

Übertragen Sie 100 Mikroliter Überstand von der Oberfläche der Kulturvertiefung in eine Vertiefung mit einer Bodenplatte mit 96 Vertiefungen und frieren Sie sie für die anschließende Analyse mit dem RT-Assay ein, resuspendieren Sie die Zellen dann gründlich und entfernen Sie die Hälfte des verbleibenden Volumens, um ein Überwachsen der Zellen zu verhindern. Danach stellen Sie das ursprüngliche Volumen wieder her, indem Sie in diesem Verfahren 550 Mikroliter frisches C-R-P-M-I in jede Vertiefung geben, fügen Sie ein bis zwei Mikroliter 10 Millicurie pro Milliliter DTTP und vier Mikroliter eines molaren DIO drei Etols zu jedem Milliliter aliquot unseres Mastermixes hinzu. Jedes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen RT-Mastermix DTT und DTTP vorsichtig mit einer 1000-Mikroliter-Pipette mischen und in einen sterilen Trog umfüllen.

Geben Sie anschließend 25 Mikroliter markiertes RT ab. In jede Vertiefung einer dünnwandigen PCR-Platte mit 96 Vertiefungen mischen. Geben Sie fünf Mikroliter jedes Überstands in die PCR-Platte, die den RT-Mastermix enthält. Dann die PCR-Platte mit einer selbstklebenden Folienabdeckung verschließen und nach der Inkubation zwei Stunden bei 37 Grad Celsius in einem Thermocycler inkubieren, mit einer 200-Mikroliter-Mehrkanalpipette kleine Löcher in die Folienabdeckung bohren.

Mischen Sie die Proben fünfmal. Von jeder Probe werden fünf Mikroliter auf DE 81-Papier umgefüllt und alle Proben 10 Minuten an der Luft trocknen gelassen. Legen Sie die Kleckse in separate Waschbehälter.

Anschließend die Blots fünfmal mit einem XSSC waschen. Dann zweimal mit 90% Ethanol für fünf Minuten pro Waschgang, bevor sie an der Luft trocknen lassen. Nach dem Trocknen wickeln Sie den Klecks vorsichtig in Saran-Folie ein und setzen Sie ihn über Nacht bei Raumtemperatur in einer fest verschlossenen Kassette dem Phosphorsieb aus.

Sobald Sie fertig sind, analysieren Sie die Phospho-Screenings mit einem Phospho-Imager und quantifizieren Sie die radioaktiven Transkripte. Gezeigt. Hier sind die repräsentativen Gelbilder, die die elektrophoretische Trennung der verschiedenen PCR-Amplikons darstellen, die zur Erzeugung eines vom Patienten abgeleiteten Gag-Amplikons erforderlich sind, das in das MJ-Vier-Plasmid-Rückgrat kloniert werden kann. Dieses repräsentative Gelbild zeigt die elektrophoretische Trennung von Restriktionsverdauen für die Klonierung von Gag-Genen von Patienten in MJ vier.

Und dieses repräsentative Gelbild zeigt die elektrophoretische Trennung von Restriktionsverdauungen eines gereinigten Knebels MJ mit vier Chimären, Plasmid-DNA. Diese Grafik zeigt die Reproduzierbarkeit des Replikationsassays über die Zeit in der G XR Zwei-Fünf-Zell-Linie. Derselbe Gag MJ: Vier chimäre Viren wurden verwendet, um G XR, zwei Fünf-Zellen, in zwei unabhängigen Experimenten zu infizieren, die im Abstand von etwa einem Jahr durchgeführt wurden.

Replikationsbewertungen wurden generiert, indem die Steigung der logarithmisch transformierten DLU-Werte berechnet und diese Steigung auf den Wildtyp MJ vier normalisiert wurde. Die beiden unabhängigen Messungen sind stark korreliert und unterstreichen die Reproduzierbarkeit von Assays, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten und mit Zellen in unterschiedlichen Passagen durchgeführt wurden. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der HIV-Aids den Weg, um die viralen Determinanten der Pathogenese zu erforschen.

Bei der akuten Subtyp-C-Infektion, dem weltweit am weitesten verbreiteten Subtyp. Die Arbeit mit replikationskompetentem HIV kann äußerst gefährlich sein. Alle Schritte, die mit lebenden Viren zu tun haben, sollten in einer BSL two plus-Einrichtung durchgeführt werden.

Alle Oberflächen sollten regelmäßig dekontaminiert werden und es sollten immer doppelte Handschuhe getragen werden.