Name: Einem Restriktionsenzym basierte Klonen Methode, um das Beurteilen In-vitro- Replikation Kapazität von HIV-1 Subtyp C-Gag MJ4 chimären Viren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Erfahren Sie eine Restriktionsenzym-basierte Klonierungsmethode zur Bewertung der In-vitro-Replikationskapazität von HIV-1 Subtyp C-Gag-MJ4-Chimären. Diese Technik ermöglicht die Quantifizierung der Virionenproduktion und die Visualisierung viraler Replikationskinetiken.

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Die Forscher danken allen Freiwilligen in Sambia, die an dieser Studie teilgenommen haben, und allen Mitarbeitern des Zambia Emory HIV Research Project in Lusaka, die diese Studie möglich gemacht haben. Die Ermittler danken Jon Allen, Smita Chavan und Mackenzie Hurlston für die technische Unterstützung und das Probenmanagement. Wir möchten uns auch bei Dr. Mark Brockman für seine Gespräche und die großzügige Spende der GXR25-Zellen bedanken.
Diese Studie wurde von R01 AI64060 und R37 AI51231 (EH) und der International AIDS Vaccine Initiative finanziert. Diese Arbeit wurde zum Teil durch die großzügige Unterstützung der amerikanischen Bevölkerung durch die United States Agency for International Development (USAID) ermöglicht. Der Inhalt liegt in der Verantwortung der Studienautoren und spiegelt nicht unbedingt die Ansichten von USAID oder der Regierung der Vereinigten Staaten wider. Diese Arbeit wurde auch teilweise durch den Virology Core am Emory Center for AIDS Research unterstützt (Grant P30 AI050409). DC und JP wurden zum Teil von Action Cycling Fellowships unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise durch das Yerkes National Primate Research Center Base Grant (2P51RR000165-51) unterstützt. Dieses Projekt wurde ebenfalls teilweise vom National Center for Research Resources P51RR165 finanziert und wird derzeit vom Office of Research Infrastructure Programs/OD P51OD11132 unterstützt.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Aufgrund der Länge und die Art der diesem Protokoll gibt es mehrere Schritte, die für die sowohl die erfolgreiche Konstruktion von chimären Gag-MJ4 Plasmide als auch für die Quantifizierung der viralen Replikationskapazität sind. Obwohl das Restriktionsenzym basierte Klonen Strategie für die Einführung von Fremdgenen in MJ4 Gag in diesem Protokoll beschriebenen hat zahlreiche Vorteile gegenüber bisher verwendeten Rekombination basierte Methoden, kann das Protokoll technisch eine Herausforderung sein, wenn kriti...

Bestimmung sowohl der Host und viralen Eigenschaften, die Einfluss auf HIV-1-Pathogenese und Progression der Erkrankung ist von größter Bedeutung für eine rationelle Impfstoff-Design. Die zelluläre Immunantwort ist eine Schlüsselkomponente der menschlichen Immunantwort auf HIV-1-Infektion. Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) sind für die erste Kontrolle der akuten Virämie notwendig und erlauben dem Host, einen stabilen Zustand (Sollwert) die Viruslast 1,2 etablieren. Experimentelle Erschöpfung dieser Effektor-Zellen führt zu einem Verlust der viralen Steuer 3,4. Trotzdem entkommen Mutationen entstehen innerhalb des viralen Genoms, die CTL-Erkennung von virusinfizierten Zellen 5-9 zu untergraben. Bestimmte HLA-Allele wurden mit niedriger Viruslast und langsamer Fortschreiten der Krankheit, einschließlich B * 57, B * 27 und B * 81 10-15 in Verbindung gebracht. Teil der Schutzwirkung von HLA Klasse I-Allele können, daß sie funktional eingeschränkten Regionen des Genoms, wie Gag Ziel zurückzuführenund wählen Flucht Mutationen, die die Fähigkeit des Virus zur Replikation in vitro 16-21 abnehmen. Obwohl Flucht aus dem zellulären Immunsystems ist vorteilhaft gegenüber dem Virus in Zusammenhang mit dem Auswahl HLA-Klasse-I-Allel kann die Wirkung dieser Mutationen Differenzfolgen für den Host bei der Übertragung zu einem HLA-übereinstimmende Einzel 22,23 aufweisen. Daher, das Verständnis der Auswirkungen von übertragenen HLA-assoziierten Mutationen Flucht auf die virale Replikation Kapazität wird wichtig sein, um unser Verständnis der frühen HIV-1-Pathogenese zu fördern. Während viele Fortschritte gemacht worden, Identifizierung und Charakterisierung der Fitness der einzelnen Defekte mit bestimmten HLA-Klasse-I-Allele 24-29 verbunden Mutationen, natürlich vorkommende HIV-1-Isolate einzigartige und komplexe Spuren der HLA-assoziierten Polymorphismen, wahrscheinlich aus der HLA vermittelte Immun Druck von verschiedenen immungeneHinter 30. In aprevious Analyse, Goepfert et al. zeigten, dass eine Ansammlung von HLA-assoziierte Mutationen in den übertragenen Gag-Sequenzen von 88 akut infizierten Zambians abgeleitet wurde, mit einer Verringerung der Sollviruslast 31 verbunden. Dies legte nahe, dass die Übertragung von schädlichen Mutationen, insbesondere in Gag, an HLA-übereinstimmende Empfänger einen klinischen Nutzen und können durch virale Replikation gedämpft werden. Moving forward, ist es zwingend notwendig, zu untersuchen, wie komplexe Kombinationen von Gag-Polymorphismen in natürlich vorkommenden Isolate im Konzert arbeiten, um Eigenschaften des Virus übertragen wie Replikation Kapazität und wie früh Replikation kann wiederum HIV-1-klinischen Parametern und Spätstadium beeinflussen definieren Pathogenese. Brockman et al. Eine Verbindung zwischen den Replikationskapazität von gag-pro-Sequenzen während der chronischen Phase der Infektion und Viruslast in beiden Subtyp C und B-Infektionen isoliert erstmals gezeigt32-35. Der experimentelle Ansatz in diesen Studien vorgestellt, obwohl geeignete für die Prüfung der in vitro Replikation Kapazität von Sequenzen aus chronisch infizierten Personen stammen, hat mehrere technische Vorbehalte und Einschränkungen, die das Studium machen HIV-1-Replikationskapazität in Subtyp C akut infizierten Personen schwierig. Dieses Verfahren beruht auf der Rekombination von Bevölkerungs basierten PCR-amplifizierten Sequenzen in den Subtyp B NL4-3 Provirus, die teilweise von LAV, abgeleitet wurde, angepasst, ein Laborvirusvorrat 36. Viruserzeugung wurde durch Co-Transfektion einer CEM-basierte T-Zelllinie mit 37 PCR-Produkte durchgeführt und aufgeschlossen Delta-gag-pro NL4-3 DNA. Dieses Verfahren erfordert das Auswachsen von Virus über einen Zeitraum von Wochen bis Monate, möglicherweise Neigen der Art des gewonnenen Virus Lager in Bezug auf die virale Quasi-Spezies in vivo und somit zur Änderung der Messung der Replikationsfähigkeit in vitro. Diese Methode, die ichist mehr für die Untersuchung chronisch infizierten Individuen, wenn sie tatsächlich selektiert Virus mit der höchsten Replikationsfähigkeit, und wo die Klonierung zahlreichen verschiedenen Virusvarianten aus einer großen Anzahl von chronisch infizierten Personen angemessen ist sehr arbeitsintensiv und daher nicht durchführbar ist. Jedoch in einer akut infizierten Individuum gibt es im allgemeinen ein zwei Varianten vor, und wodurch das Risiko einer Schrägstellung der Art des gewonnenen Virus-Stock, durch in vitro Selektionsdruck erlaubt eine bessere Beurteilung der in vitro-Replikationskapazität. Zweitens erfordert dieses Verfahren Rekombination Subtyp C-Gag-pro-Sequenzen in einem Subtyp B abgeleitet Rückgrat und könnte Rückgrat Inkompatibilität Vorurteile in die Analyse einzuführen. Aufgrund dieser Einschränkungen ist eine große Anzahl von Sequenzen, um mögliche Verzerrungen eingeführt überwinden analysiert werden. Hier beschreiben wir eine alternative Versuchs approach für das Studium Sequenzen aus Subtyp C akut infizierten Individuen abgeleitet angemessen. Wir verwenden eine Restriktionsenzym-basierte Klonen Strategie, um die gag-Gen von einer akuten Infektion Zeitpunkte der HIV-1 Subtyp C infizierten Personen in den Subtyp C proviraler Rückgrat, MJ4 abgeleitet einzuführen. Die Verwendung von MJ4 als gemeinsames Grundgerüst, in dem gag-Gene zu klonieren ist für die Analyse von Subtyp C abgeleitete Sequenzen. MJ4 ist aus einem primären Isolat 38 abgeleitet, und somit wäre weniger wahrscheinlich, Verzerrung durch Subtyp Inkompatibilität zwischen dem Backbone und gag-Gen einzuführen. Darüber hinaus ist die Ansatz der Verwendung von Enzym-basierte Klonen Einschränkung erlaubt die proviralen Konstrukte direkt in 293T-Zellen transfiziert werden, und für die Wiederherstellung eines klonalen Virus-Stamm identisch mit dem geklonten gag-Sequenz. Die nachstehenden Verfahren ein Hochdurchsatzverfahren zur Bewertung der Replikationsfähigkeit des Subtyps C abgeleitet Gag-MJ4chimären Viren. Transfektion in 293T-Zellen ist einfach und Virusgewinnung erfolgt nur drei Tage. In vitro Replikationskapazität auf demselben CEM-CCR5 basierend T-Zell-Linie, die durch Brockman et al untersucht. 37, aber unter Verwendung von für die erfolgreiche Replikation notwendig wichtiges Protokoll Modifikationen des Subtyps C MJ4 chimären Viren. Die Verwendung einer geeigneten T-Zell-Linie anstatt PBMCs ermöglicht eine große Anzahl von Subtyp C MJ4-chimären Viren mit hoher Reproduzierbarkeit Assay getestet werden. Schließlich, unter Verwendung einer radioaktiv markierten Reverse-Transkriptase-Assay zur Quantifizierung von Virus im Überstand ist kostengünstiger als die Verwendung von kommerziell erhältlichen p24-ELISA-Kits. Es gibt auch einen höheren Dynamikumfang, die wichtig zur Erkennung beide schlecht und sehr replizierende Viren innerhalb der gleichen Assay zum Nachweis und feine Unterschiede in der Replikation zwischen Isolaten war. Im Ergebnis hat das hier vorgestellte Verfahren zur gestattetDie eingehende Untersuchung der Replikationskapazität von gag-Sequenzen von HIV-1 Subtyp C abgeleitet akut infizierten Personen aus Sambia und wie geschrieben, könnte auch erweitert werden, um andere Subtyp C infiziert Populationen zu untersuchen. Ein hohes Maß an Variation in der Replikation zwischen verschiedenen Kapazitäten Gag Isolate beobachtet. Darüber hinaus waren wir in der Lage, eine statistische Assoziation zwischen der Kapazität der Replikation übertragen Gag und Sollwert der Viruslast als auch mit CD4 + Rückgang über einen Zeitraum von drei Jahren 39 zeigen. Solche Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Untersuchung, wie tragene Viruseigenschaften, wie Replikationskapazität, die Interaktion mit dem Immunsystem des Wirts zu Pathogenese während der frühen Infektion beeinflussen und Integral für die Entwicklung wirksamer Impfstoff Interventionen als auch die Behandlung sein.

<table><tbody><tr><td colspan="4">PCR Reagenzien</td></tr><tr><td>GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, Standard Entsalzung</td></tr><tr><td>VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, Standard Entsalzung</td></tr><tr><td>GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'</td> <td>IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, Standard Entsalzung</td></tr><tr><td>BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, Standard Entsalzung</td></tr><tr><td>MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'</td> <td>IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, Standard Entsalzung</td></tr><tr><td>MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCTCCTTCTAGC 3'</td> <td>IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, Standard Entsalzung</td></tr><tr><td>BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3'</td><td>IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, Standard Entsalzung</td></tr><tr><td>GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, Standard Entsalzung</td></tr><tr><td>For3: 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'</td> <td>IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, Standard Entsalzung</td></tr><tr><td>GagR6: 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, Standard Entsalzung</td></tr><tr><td>Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, Standard Entsalzung</td></tr><tr><td>Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA 3'</td> <td>IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, Standard Entsalzung</td></tr><tr><td>CoolRack PCR 96 XT</td><td>Biocision</td><td>BCS-529</td><td></td></tr><tr><td>CoolRack M15</td><td>Biocision</td><td>BCS-125</td><td></td></tr><tr><td>Nuklease freies Wasser</td><td>Fisher</td><td>SH30538FS</td><td>Hergestellt von Hyclone</td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>Simport PCR 8 Strip Tubes, Blau (Schieberverschluss)</td><td>Daigger</td><td>EF3647BX</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III einstufiges RT-PCR-System</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>12574035</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot-start II DNA-Polymerase</td><td>Fisher</td><td>F-549L</td><td></td></tr><tr><td>PCR Nukleotid Mix</td><td>Roche</td><td>4638956001</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, hohe Gelstärke</td><td>Fisher</td><td>50-213-128</td><td></td></tr><tr><td>TAE 10X</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>AM9869</td><td></td></tr><tr><td>Promega 1 kb DNA-Leiter</td><td>Fisher</td><td>PRG5711</td><td>Hergestellt von Promega</td></tr><tr><td>Sybr Safe DNA Gel Stain, 10.000x</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel und PCR-Reinigungssystem</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklingen, einschneidig</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td>Hergestellt von Surgical Design</td></tr><tr><td>Thermocycler, PTC-200</td><td>MJ Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Mikrobiologie & Klonierungsreagenzien</td></tr><tr><td>LB Agar, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>LB Brühe, Lennox</td><td>Fisher</td><td>BP1427-2</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Petrischalen aus Polystyrol 100 x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin-Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 14 ml Polypropylen-Rundbodenröhrchen</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>352059</tr><tr><td>NgoMIV-Restriktionsendonuklease</td><td>New England BioLabs</td><td>R0564L</td><td></td></tr><tr><td>BclI-Restriktionsendonuklease</td><td>New England BioLabs</td><td>R0160L</td><td></td></tr><tr><td>HpaI-Restriktionsendonuklease</td><td>New England BioLabs</td><td>R0105L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase, 5 U/&mu; l</td><td>Roche</td><td>10799009001</td><td></td></tr><tr><td>JM109 kompetente Zellen, >108 KBE/&mu; g</td><td>Promega</td><td>L2001</td><td></td></tr><tr><td>PureYield Plasmid Miniprep System</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0 Blaulicht-Transilluminator</td><td>Invitrogen</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 18 Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Zellkulturreagenzien</td></tr><tr><td>Amphyl Reinigungs-/Desinfektionsmittel</td><td>Fisher</td><td>22-030-394</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD, 1 ml</td><td>VWR</td><td>PAE2311</td><td>Hergestellt von Promega</td></tr><tr><td>Hexadimethrinbromid (Polybrene)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>Costar Plates, 6-Well, flach</td><td>Fisher</td><td>07-200-83</td><td>Hergestellt von Corning</td></tr><tr><td>Life Costar Plates, 24-Well, flach</td><td>Fisher</td><td>07-200-84</td><td>Hergestellt von Corning Life</td></tr><tr><td>Costar Plates, 96-Well, rund</td><td>Fisher</td><td>07-200-95</td><td>Hergestellt von Corning Life</td></tr><tr><td>Flasks, Corning Filter Top/Schräghals, 75 cm2</td><td>Fisher</td><td>10-126-37</td><td></td></tr><tr><td>Kolben, Corning Filter Top/Schräghals, 150 cm2</td><td>Fisher</td><td>10-126-34</td><td>Hergestellt von Corning Life</td></tr><tr><td>Conical Tubes, 50 ml, blaue Kappe</td><td>Fisher</td><td>14-432-22</td><td>Hergestellt von BD Biosciences</td></tr><tr><td>Conical Tubes, 15 ml, blaue Kappe</td><td>Fisher</td><td>14-959-70C</td><td>Hergestellt von BD Biosciences</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Fisher</td><td>MT25052CI</td><td>Hergestellt von Mediatech</td></tr><tr><td>RPMI, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/ Streptomycin/Glutamin, 100x</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS mit Magnesium und Calcium, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>PBS ohne Magnesium und Calcium</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Sarstedt Tuben, farblich sortiert</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.996</td><td></td></tr><tr><td>Reservoirwannen für Mehrkanal, 55 ml</td><td>Fisher</td><td>13-681-501</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Dextran</td><td>Fisher</td><td>NC9691007</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 Well Clear V Bottom Tissue Culture behandelte Mikrotiterplatte</td><td>Fisher</td><td>07-200-96</td><td>Hergestellt von Corning Life</td></tr><tr><td>HEPES, 1 M Buffer Solution</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>FBS, definiert, 500 ml</td><td>Fisher</td><td>SH30070 03</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>VWR</td><td>PAV3941</td><td>Hergestellt von Promega</td></tr><tr><td>Glutaraldehyd, Grade II, 25% in H2</td><td>O Sigma-Aldrich</td><td>G6257-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1 M Magnesiumchloridlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehydlösung, für die Molekularbiologie, 36,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Kalium Hexacyanoferrat(II)-Trihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387-100G</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhexacyanoferrat(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8131-100G</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X15-R Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>TC10 automatisierter Zellzähler</td><td>Bio-Rad</td><td>1450001</td><td></td></tr><tr><td>VistaVision inverses Mikroskop</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reverse-Transcriptase Quantification Assay Reagenzien</td></tr><tr><td>dTTP, [&alpha;-33P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCi</td><td>Perkin-Elmer</td><td>NEG605H001MC</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-Cl, pH 8,0</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15568025</td> Muss mit KOH 2 M Kaliumchlorid (KCl) <td>auf pH 7,8 eingestellt</td></tr> <tr><td></td><td>werdenLife Technologies/Invitrogen</td><td>AM9640G</td><td>Adjust bis 1 M Lösung</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Roche</td><td>11333941103</td><td></td></tr><tr><td>Polyadenylsäure (Poly rA) Kaliumsalz&nbsp;</td><td>Midland Reagenz Co.</td><td>P-3001</td><td></td></tr><tr><td>Oligo d(T) Primer</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>18418-012</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>SR, Super Resolution Phosphor Screen, Small</td><td>Perkin-Elmer</td><td>7001485</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Schutzhülse 96-Well-Platte Modell (M) Polycarbonat</td><td>Fisher</td><td>07-200-245</td><td>Hergestellt von Corning Life</td></tr><tr><td>Corning 96-Well-Mikroplatten-Aluminium-Dichtungsband, unsteril</td><td>Fisher</td><td>07-200-684</td><td>Hergestellt von Corning Life</td></tr><tr><td>DE-81 Anionenaustauschpapier</td><td>Whatman</td><td>3658-915</td><td></td></tr><tr><td>Trinatriumcitrat-Dihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>Autoradiographie-Kassette</td><td>Fisher</td><td>FB-CA-810</td><td></td></tr><tr><td>Zyklon-Lager-Phoshpor-Sieb</td><td>Packard</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

einem restriktionsenzym basierte klonen methode, um das beurteilen<em&gt; in-vitro-</em&gt; replikation kapazität von hiv-1 subtyp c-gag mj4 chimären viren

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

Die schützende Wirkung vieler HLA-Klasse-I-Allele auf die Pathogenese und das Fortschreiten der Krankheit von HIV-1 wird zum Teil auf ihre Fähigkeit zurückgeführt, konservierte Teile des HIV-1-Genoms anzugreifen, die nur schwer entkommen können. Sequenzänderungen, die auf den zellulären Immundruck zurückzuführen sind, treten während der Infektion im gesamten Genom auf und können, wenn sie in konservierten Regionen des Genoms wie Gag gefunden werden, die Fähigkeit des Virus beeinträchtigen, sich in vitro zu vermehren. Die Übertragung von HLA-verknüpften Polymorphismen in Gag auf HLA-nicht übereinstimmende Empfänger wurde mit einer reduzierten Sollwert-Viruslast in Verbindung gebracht. Wir stellten die Hypothese auf, dass dies auf eine verminderte Replikationskapazität des Virus zurückzuführen sein könnte. Hier stellen wir eine neuartige Methode zur Bewertung der in vitro Replikation von HIV-1 vor, die durch das Gag-Gen beeinflusst wird, das aus akuten Zeitpunkten von Subtyp-C-infizierten Sambiern isoliert wurde. Bei dieser Methode wird die auf Restriktionsenzymen basierende Klonierung verwendet, um das Gag-Gen in ein gemeinsames provirales Rückgrat des Subtyps C HIV-1, MJ4, einzufügen. Damit ist sie für die Untersuchung von Subtyp-C-Sequenzen besser geeignet als bisherige rekombinationsbasierte Methoden, die die In-vitro-Replikation chronisch abgeleiteter gag-pro-Sequenzen untersucht haben. Nichtsdestotrotz könnte das Protokoll für Studien mit Viren anderer Subtypen leicht modifiziert werden. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll eine robuste und reproduzierbare Methode zur Bewertung der Replikationskapazität der chimären Gag-MJ4-Viren auf einer CEM-basierten T-Zelllinie. Diese Methode wurde für die Untersuchung von chimären Gag-MJ4-Viren verwendet, die von 149 akut infizierten Sambiern des Subtyps C abstammen, und ermöglichte die Identifizierung von Rückständen in Gag, die die Replikation beeinflussen. Noch wichtiger ist, dass die Implementierung dieser Technik ein tieferes Verständnis dafür ermöglicht hat, wie die virale Replikation Parameter der frühen HIV-1-Pathogenese definiert, wie z. B. die Soll-Viruslast und den longitudinalen Rückgang der CD4+ T-Zellen.

Um dieses Protokoll, das einen proviralen Plasmid in der Lage, voll funktions Montage, Infektions Gag-Chimären erzeugt MJ4 richtig auszuführen, muss sorgfältig darauf geachtet, die entsprechenden PCR-Produkte erzeugen. Ermitteln, ob die PCR hat den entsprechend großen Gag Amplikon erzeugt wird, ist von entscheidender Bedeutung. Produkte sollten innerhalb von 100 Basenpaaren (bp) von der in 1A dargestellt ca. 1.700 bp Amplikon sein. Die genaue Länge dieses Fragments wird in Abhängigkeit von der ...

Die Pathogenese von HIV-1 wird sowohl durch virale Eigenschaften als auch durch genetische Faktoren des Wirts definiert. Hier beschreiben wir eine robuste Methode, die reproduzierbare Messungen ermöglicht, um den Einfluss der Variation der Gag-Gensequenz auf die in vitro Replikationskapazität des Virus zu bewerten.

Einem Restriktionsenzym basierte Klonen Methode, um das Beurteilen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Replikation Kapazität von HIV-1 Subtyp C-Gag MJ4 chimären Viren

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, aus Subtyp-C-HIV1-infizierten Individuen stammende gag-Gene in ein replikationskompetentes HIV1-Plasmid einzubauen, um den Effekt von gag-Sequenzpolymorphismen auf die Replikationskapazität von HIV1 in vitro zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst das gag-Gen aus dem Plasma des Patienten amplifiziert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die vom Patienten stammende gag-Sequenz in den replikationskompetenten infektiösen molekularen Klon MJ-four zu klonen. Anschließend wird das gag-MJ-four-Chimärenplasmid transfiziert, um infektiöse Virusstämme zu erzeugen, und titriert, um die Infektiosität an einer Indikatorzelllinie zu bewerten. Der letzte Schritt ist die Messung der in vitro-Replikationskapazität in der GXR-25-T-Zelllinie. Letztendlich wird ein radioaktiv markierter Reverse-Transkriptase-Assay verwendet, um die Virionenproduktion über die Zeit zu quantifizieren und die Virusreplikationskinetik sichtbar zu machen. Die Methode, die wir heute beschreiben werden, kann helfen, zentrale Fragen im Bereich HIV zu beantworten. Dazu gehören die Bestimmung der Faktoren der HIV-replikativen Fitness und das Verständnis, wie die HIV-Fitness die langfristige Pathogenese beeinflusst. Die Methoden werden heute von Jessica Prince und Dan Claiborne beschrieben, zwei meiner Doktorandinnen bzw. Doktoranden.Um dieses Verfahren zu beginnen, transkribieren Sie die cDNA aus RNA rückwärts und amplifizieren Sie die DNA-Produkte der ersten Runde unter Verwendung einer Reverse Transkriptase und einer thermostabilen DNA-Polymerase in einer One-Step-RT-PCR. Verwenden Sie anschließend ein Mikroliter der PCR-Amplifikation der ersten Runde als DNA-Vorlage, um eine geschachtelte PCR-Amplifikation der zweiten Runde durchzuführen. Fügen Sie danach drei Mikroliter 5X-Ladepuffer zu fünf Mikrolitern des Reaktionsvolumens der zweiten Runde hinzu.Führen Sie den Vorgang bei 120 Volt an einem 1 %igen Agarose-TAE-Gel durch, das einen UV-fluoreszierenden DNA-Farbstoff enthält, bis die Banden aufgetrennt sind. Anschließend visualisieren Sie die 1,6 KB-Banden auf einem Blaulicht-Transilluminator. Danach führen Sie das verbleibende Reaktionsvolumen von 45 Mikroliter an einem 1 %igen Agarose-TAE-Gel mit DNA-Farbstoff durch. Schneiden Sie die entsprechenden Banden mit einer sauberen Rasierklinge aus und kombinieren Sie jeweils drei positive Reaktionen pro Individuum. Extrahieren Sie danach die DNA aus dem Gelschnipsel mithilfe eines Gel-Reinigungs-Kits und eluieren Sie sie in nukleasefreiem Wasser. Gefrieren Sie das Produkt bei minus 20 Grad Celsius für die spätere Verwendung. 0:15:56 In diesem Verfahren nach der Amplifikation des langen terminalen Wiederholungs-5'-UTR-Bereichs des MJ-vier-Plasmids visualisieren Sie die 1,3 KB-PCR-Produkte auf dem Transilluminator. Schneiden Sie die positiven Amplifikate aus, reinigen und gefrieren Sie sie wie zuvor beschrieben. Erstellen Sie anschließend die fusionierten MJ-vier-LTR-gag-Amplifikate mittels Spleiß-Überlappungs-Verlängerungs-PCR. Visualisieren, schneiden, reinigen und gefrieren Sie das 3,2 kb lange Amplifikat. Verdauen Sie nun 1,5 Mikrogramm MJ-vier-Plasmid und 1,5 Mikrogramm gereinigtes LTR-gag-PCR-Produkt mit dem Restriktionsendonuklease BCL-eins für 1,5 Stunden bei 50 Grad Celsius. Fügen Sie danach ein Mikroliter NGOM-vier zur Verdauungsreaktion hinzu und inkubieren Sie diese eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie anschließend 5x-Ladefarbstoff zu den Restriktionsverdauungsreaktionen hinzu. Führen Sie die gesamte Probe langsam an einem 1 %igen Agarose-TAE-Gel mit DNA-Farbstoff eine bis zwei Stunden bei 100 Volt elektrophoretisch durch. Visualisieren, schneiden und reinigen Sie die angegebenen Banden für das Klonieren wie zuvor beschrieben.Bereiten Sie anschließend die Ligationsreaktionen unter Verwendung des gereinigten LTR-gag-Inserts und des MJ-four-Vektor-DNAs im Verhältnis von drei Teilen Insert zu einem Teil Vektor vor. Inkubieren Sie die Ligationsreaktionen über Nacht bei vier Grad Celsius.Dann transformieren Sie chemisch kompetente JM-109-Bakterien mit den Ligationsprodukten und streichen diese auf LB-Agarplatten mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin aus. Kultivieren Sie die transformierten Bakterien bei 30 Grad Celsius für mindestens 22 Stunden. Um die Kloniergenauigkeit zu bestätigen, schneiden Sie die Mini-Präp-DNA mit den Restriktionsenzymen NGOM-vier und HPA-eins in einem Doppelverdau bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden. Anschließend auf einem 1%igen Agarose-TAE-Gel analysieren. Berechnen Sie das erforderliche Volumen des Virus aus jedem Ansatz basierend auf der infektiösen Einheit pro Mikroliter (IU/µL), ermittelt mittels eines TZM-BL-Zell-Assays, um fünf mal 10 hoch 5 GXR-25-Zellen mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,05 zu infizieren. Tragen Sie stets geeignete persönliche Schutzausrüstung beim Arbeiten mit replikationskompetentem HIV, einschließlich eines vollständigen Kittels, Gesichtsmasken und doppelter Handschuhe. Am Tag der Infektion entnehmen Sie die Virusansätze aus dem minus 80 Grad Celsius kalten Gefrierschrank und lassen sie auftauen. Verdünnen Sie anschließend das Virus in C-R-P-M-I-Medium auf ein Volumen von 100 Mikrolitern, um eine MOI von 0,05 zu erreichen. Geben Sie es in die V-Boden-Gewebekultur-Platte mit 96 Vertiefungen, wobei jeweils eine positive und eine negative Kontrolle in jedem Satz von Replikationsexperimenten enthalten sein müssen, und richten Sie die Platte so ein, dass jede zweite Spalte leer bleibt, um Kreuzkontaminationen zwischen den Vertiefungen zu minimieren. Zählen Sie danach die GXR-25-Zellen mithilfe eines automatischen Zellzählgeräts und berechnen Sie die insgesamt benötigte Zellanzahl für alle Infektionen. Aliquotieren Sie das erforderliche Volumen in ein 50-Milliliter-Konischglas und zentrifugieren Sie, um den Zellpellet zu erhalten. Aspirieren Sie danach vorsichtig das Medium und resuspendieren Sie die Zellen in C-R-P-M-I-Medium mit einer Konzentration von fünf mal 10 hoch 5 Zellen pro 100 Mikroliter. Pipettieren Sie die Zellen in einen sterilen Sammelbehälter und mischen Sie gründlich. Verwenden Sie anschließend eine Mehrkanalpipette, um 100 Mikroliter Zellen in jede Vertiefung der 96-Loch-Platte mit dem verdünnten Virus zuzugeben und mischen Sie gründlich. Danach geben Sie zwei Mikroliter einer fünf Milligramm pro Milliliter-Polybrene-Lösung zu jeder Vertiefung hinzu und mischen die Zellen gründlich. Inkubieren Sie anschließend drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem Gewebekultur-Inkubator mit 5 % CO2.Um die infizierten Zellen zu waschen, zentrifugieren Sie die 96-Well-V-Boden-Platte, um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie anschließend vorsichtig 150 Mikroliter des Mediums und ersetzen Sie es durch frische 150 Mikroliter C-R-P-M-I, ohne das Zellpellet zu stören. Wiederholen Sie den Vorgang noch zweimal, um die Zellen ausreichend zu waschen. Nach der letzten Zentrifugation und dem Hinzufügen von 150 Mikrolitern C-R-P-M-I resuspendieren Sie das Zellpellet mit einer Mehrkanalpipette. Geben Sie die Mischung aus jedem Well zu 800 Mikrolitern C-R-P-M-I in ein Well einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Stellen Sie die Platte dann in einen Gewebekultur-Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 Grad Celsius. Alle zwei Tage übertragen Sie 100 Mikroliter Überstand von der Oberfläche des Kulturwells in ein Well einer 96-Well-U-Boden-Platte und frieren ihn für die spätere Analyse mittels RT-Assay ein. Anschließend resuspendieren Sie die Zellen gründlich und entfernen die Hälfte des verbleibenden Volumens, um ein Überwachsen der Zellen zu verhindern. Danach stellen Sie das ursprüngliche Volumen wieder her, indem Sie 550 Mikroliter frisches C-R-P-M-I zu jedem Well hinzufügen. Fügen Sie in diesem Verfahren ein bis zwei Mikroliter von 10 Millicurie pro Milliliter DTTP und vier Mikroliter einer einmolarigen DTT-Lösung zu jedem ein Milliliter umfassenden Aliquot der RT-Master-Mix-Lösung hinzu. Mischen Sie jeden 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrcheninhalt aus RT-Master-Mix, DTT und DTTP vorsichtig mit einer 1000-Mikroliter-Pipette und überführen Sie die Mischung in einen sterilen Auffangbehälter. Als Nächstes pipettieren Sie 25 Mikroliter der markierten RT-Mischung in jedes Loch einer 96-Loch-PCR-Platte mit dünnen Wänden. Geben Sie fünf Mikroliter jedes Überstandes in die PCR-Platte, die die RT-Master-Mischung enthält. Versiegeln Sie anschließend die PCR-Platte mit einer klebenden Folie und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem Thermocycler. Nach der Inkubation stellen Sie mit einer 200-Mikroliter-Multikanalpipette kleine Löcher in die Folienabdeckung. Mischen Sie die Proben fünfmal. Übertragen Sie fünf Mikroliter jeder Probe auf DE-81-Papier und lassen Sie alle Proben 10 Minuten lang an der Luft trocknen. Legen Sie die Flecken in separate Waschgefäße. Waschen Sie die Flecken danach fünfmal mit 1X SSC. Anschließend waschen Sie zweimal mit 90 %igem Ethanol, jeweils fünf Minuten pro Waschgang, bevor Sie sie an der Luft trocknen lassen. Sobald sie trocken sind, wickeln Sie den Fleck vorsichtig in Frischhaltefolie ein und belichten ihn über Nacht bei Raumtemperatur in einer dicht verschlossenen Kassette gegenüber einem Phosphoscreen. Analysieren Sie die Phosphoscreens nach der Vorbereitung mit einem Phosphor-Imager und quantifizieren Sie die radioaktiven Transkripte.Gezeigt sind repr&auml;sentative Gelelektrophoresebilder, die die elektrophoretische Trennung der verschiedenen PCR-Amplicons darstellen, die erforderlich sind, um ein vom Patienten stammendes gag-Amplicon zu erzeugen, das in den MJ-vier-Plasmidr&uuml;ckgrat kloniert werden kann. Dieses repr&auml;sentative Gelelektrophoresebild zeigt die elektrophoretische Trennung von Restriktionsverdauungen zur Klonierung von Patienten-gag-Genen in MJ vier.Und dieses repräsentative Gelelektrophoresebild zeigt die elektrophoretische Trennung von Restriktionsverdauungen einer gereinigten gag MJ-vier-Chimären-Plasmid-DNA. Dieses Diagramm veranschaulicht die Reproduzierbarkeit des Replikationsassays über die Zeit in der GXR-25-Zelllinie. Dieselben gag MJ-vier-chimären Viren wurden verwendet, um GXR-25-Zellen in zwei unabhängigen Experimenten zu infizieren, die etwa ein Jahr auseinander durchgeführt wurden.Replikationsscores wurden durch Berechnung der Steigung der logarithmisch transformierten DLU-Werte ermittelt und diese Steigung auf den Wildtyp MJ-four normalisiert. Die beiden unabhängigen Messungen sind stark korreliert und unterstreichen die Reproduzierbarkeit von Assays, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten und mit Zellen unterschiedlicher Passage durchgeführt wurden. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet HIV/AIDS den Weg, um die viralen Determinanten der Pathogenese bei akuter Infektion mit Subtyp C, dem weltweit vorherrschenden Subtyp, zu untersuchen. Die Arbeit mit replikationskompetentem HIV kann äußerst gefährlich sein. Alle Schritte, die lebendes Virus beinhalten, sollten in einer BSL-2-plus-Einrichtung durchgeführt werden. Alle Oberflächen sollten regelmäßig dekontaminiert werden, und es ist stets eine Doppelhandschutz zu tragen.

a-restriction-enzyme-based-cloning-method-to-assess-vitro-replication

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Diese visualisiert Experiment ist ein Leitfaden für die Verwendung eines fluoreszierenden molekularen Klon des HIV für Live-konfokale Abbildung Experimente.

Visualizing Zell-Zell-Transfer von HIV unter Verwendung von fluoreszierenden Klone von HIV und Live-konfokale Mikroskopie

Wir beschreiben zwei Methoden für die...

Zwei Methoden der Heterokaryon Formation zu entdecken HCV Restriktionsfaktoren

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

Das Verständnis der Konformationen von viralen Oberflächenantigenen ist erforderlich, um die Antikörperneutralisierung zu bewerten und das Design wirksamer Impfstoffimmunogene zu leiten. In dieser Arbeit beschreiben wir einen zellbasierten ELISA-Assay, der es ermöglicht, die Erkennung von trimerem HIV-1-Env, das an der Oberfläche transfizierter Zellen exprimiert wird, durch spezifische Anti-Env-Antikörper zu untersuchen.

Konformationsänderungen Auswertung der HIV-1-Trimeric Hüllglycoproteine ​​mit eine Handy-basierte ELISA-Test

Wachstumskonkurrenz zwischen nahezu isogenen Viren bietet ein sensitives Maß für die Bestimmung der relativen Replikationsfitness. Die hier beschriebenen Protokolle umfassen die Konstruktion rekombinanter HIV-1-Klone, die Virusvermehrung und Wachstumskonkurrenz sowie Analysemethoden, die optimiert sind, um empfindliche und konsistente Ergebnisse zu erzielen.

Paarweise Wachstum Wettbewerb Assay zur Bestimmung der Replication Fitness von Human Immunodeficiency Viruses

Hier wird ein Protokoll zur Erstellung eines infektiösen bakteriellen künstlichen Chromosoms vorgestellt, das eine cDNA in voller Länge der positivsträngigen genomischen RNA des Japanischen Enzephalitis-Virus enthält. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine funktionsfähige cDNA anderer positivsträngiger RNA-Viren zu konstruieren, was es zu einem leistungsstarken genomischen Werkzeug für die Untersuchung der Virusbiologie macht.

Bakterielle künstliche Chromosomen: A Functional Genomics-Werkzeug für das Studium der Positiv-Strang-RNA-Viren

Wir beschreiben eine zellbasierte Assays auf HIV-1 Fusion über den Ausdruck von grün fluoreszierendes Protein nachweisbar durch Flow-zytometrie oder Fluoreszenz-Mikroskopie melden. Es kann verwendet werden, Inhibitoren der viralen Eintrag (speziell bei der Fusion Schritt) in zellfreien und Zell-Zell-Infektion Systeme zu testen.

Ein High-Throughput Cre-Lox aktiviert virale Membran Fusion Assay Ermittlung Inhibitoren der HIV-1 Virus Membranfusion

Wir präsentieren einen Genom engineering Workflow für die Generation der neuen in-vitro-Modelle für HIV-1-Infektion, die proviralen Integration an ausgewählten genomischen Standorten zu rekapitulieren. Ausrichtung der HIV-abgeleitete Reporter wird durch CRISPR-Cas9-vermittelten, ortsspezifische Genom Manipulation erleichtert. Detaillierte Protokolle für einzellige Klon-Generierung, Screening und richtige targeting Überprüfung stehen zur Verfügung.

CRISPR-Cas9-basierte Genom Engineering Jurkat Reporter Modelle für HIV-1-Infektion mit ausgewählten proviralen Integration Websites generieren

Hier präsentieren wir einen Tiefe Sequenzierung Ansatz, der eine objektive Bestimmung der im Entstehen begriffenen 3'-Termini sowie mutagenen Profile der einzelsträngigen DNA-Moleküle enthält. Die Hauptanwendung ist die Charakterisierung der im Entstehen begriffenen retrovirale ergänzende DNAs (cDNAs), die Zwischenprodukte, die während des Prozesses der retroviralen reversen Transkription generiert.

Bestimmende 3'-Termini und Sequenzen der im Entstehen begriffenen einsträngige virale DNA-Moleküle während HIV-1 Reverse Transkription in infizierten Zellen

Ein hoher Durchsatz-Protokoll für funktionale Bewertung von HIV effiziente Reaktivierung und Clearance von latenten Proviruses ist beschrieben und durch die Auswirkungen von Interventionen auf die Transkription von HIV-Tests und Spleißen angewendet. Repräsentative Ergebnisse des Effekts der Latenz Umkehrung Agenten auf LTR-driven Transkription und Spleißen stehen zur Verfügung.

Hoher Durchsatz In Vitro Bewertung der Latenz Umkehrung Agenten auf HIV Transkription und Spleißen

In diesem Artikel beschreiben wir einige etablierte Methoden zur Bestimmung des Stresses des endoplasmatischen Retikulums (ER) und der Aktivierung der ungefalteten Proteinantwort (UPR), mit besonderem Schwerpunkt auf HIV-1-Infektionen. In diesem Artikel wird auch eine Reihe von Protokollen beschrieben, um die Auswirkungen von ER-Stress/UPR auf die HIV-1-Replikation und die Infektiosität der Virionen zu untersuchen.

Messung des Stresses des endoplasmatischen Retikulums und der entfalteten Proteinantwort in HIV-1-infizierten T-Zellen und Analyse seiner Rolle bei der HIV-1-Replikation

Erfahren Sie eine Restriktionsenzym-basierte Klonierungsmethode zur Bewertung der In-vitro-Replikationskapazität von HIV-1 Subtyp C-Gag-MJ4-Chimären. Diese Technik ermöglicht die Quantifizierung der Virionenproduktion und die Visualisierung viraler Replikationskinetiken.

Einem Restriktionsenzym basierte Klonen Methode, um das Beurteilen In-vitro- Replikation Kapazität von HIV-1 Subtyp C-Gag MJ4 chimären Viren (Video) | JoVE Journal

Einem Restriktionsenzym basierte Klonen Methode, um das Beurteilen

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