Einem Restriktionsenzym basierte Klonen Methode, um das Beurteilen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, aus Subtyp-C-HIV1-infizierten Individuen stammende gag-Gene in ein replikationskompetentes HIV1-Plasmid einzubauen, um den Effekt von gag-Sequenzpolymorphismen auf die Replikationskapazität von HIV1 in vitro zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst das gag-Gen aus dem Plasma des Patienten amplifiziert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die vom Patienten stammende gag-Sequenz in den replikationskompetenten infektiösen molekularen Klon MJ-four zu klonen. Anschließend wird das gag-MJ-four-Chimärenplasmid transfiziert, um infektiöse Virusstämme zu erzeugen, und titriert, um die Infektiosität an einer Indikatorzelllinie zu bewerten. Der letzte Schritt ist die Messung der in vitro-Replikationskapazität in der GXR-25-T-Zelllinie. Letztendlich wird ein radioaktiv markierter Reverse-Transkriptase-Assay verwendet, um die Virionenproduktion über die Zeit zu quantifizieren und die Virusreplikationskinetik sichtbar zu machen.

Die Methode, die wir heute beschreiben werden, kann helfen, zentrale Fragen im Bereich HIV zu beantworten. Dazu gehören die Bestimmung der Faktoren der HIV-replikativen Fitness und das Verständnis, wie die HIV-Fitness die langfristige Pathogenese beeinflusst. Die Methoden werden heute von Jessica Prince und Dan Claiborne beschrieben, zwei meiner Doktorandinnen bzw. Doktoranden.

Um dieses Verfahren zu beginnen, transkribieren Sie die cDNA aus RNA rückwärts und amplifizieren Sie die DNA-Produkte der ersten Runde unter Verwendung einer Reverse Transkriptase und einer thermostabilen DNA-Polymerase in einer One-Step-RT-PCR. Verwenden Sie anschließend ein Mikroliter der PCR-Amplifikation der ersten Runde als DNA-Vorlage, um eine geschachtelte PCR-Amplifikation der zweiten Runde durchzuführen. Fügen Sie danach drei Mikroliter 5X-Ladepuffer zu fünf Mikrolitern des Reaktionsvolumens der zweiten Runde hinzu.

Führen Sie den Vorgang bei 120 Volt an einem 1 %igen Agarose-TAE-Gel durch, das einen UV-fluoreszierenden DNA-Farbstoff enthält, bis die Banden aufgetrennt sind. Anschließend visualisieren Sie die 1,6 KB-Banden auf einem Blaulicht-Transilluminator. Danach führen Sie das verbleibende Reaktionsvolumen von 45 Mikroliter an einem 1 %igen Agarose-TAE-Gel mit DNA-Farbstoff durch. Schneiden Sie die entsprechenden Banden mit einer sauberen Rasierklinge aus und kombinieren Sie jeweils drei positive Reaktionen pro Individuum. Extrahieren Sie danach die DNA aus dem Gelschnipsel mithilfe eines Gel-Reinigungs-Kits und eluieren Sie sie in nukleasefreiem Wasser. Gefrieren Sie das Produkt bei minus 20 Grad Celsius für die spätere Verwendung. 0:15:56 In diesem Verfahren nach der Amplifikation des langen terminalen Wiederholungs-5'-UTR-Bereichs des MJ-vier-Plasmids visualisieren Sie die 1,3 KB-PCR-Produkte auf dem Transilluminator. Schneiden Sie die positiven Amplifikate aus, reinigen und gefrieren Sie sie wie zuvor beschrieben. Erstellen Sie anschließend die fusionierten MJ-vier-LTR-gag-Amplifikate mittels Spleiß-Überlappungs-Verlängerungs-PCR. Visualisieren, schneiden, reinigen und gefrieren Sie das 3,2 kb lange Amplifikat. Verdauen Sie nun 1,5 Mikrogramm MJ-vier-Plasmid und 1,5 Mikrogramm gereinigtes LTR-gag-PCR-Produkt mit dem Restriktionsendonuklease BCL-eins für 1,5 Stunden bei 50 Grad Celsius. Fügen Sie danach ein Mikroliter NGOM-vier zur Verdauungsreaktion hinzu und inkubieren Sie diese eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie anschließend 5x-Ladefarbstoff zu den Restriktionsverdauungsreaktionen hinzu. Führen Sie die gesamte Probe langsam an einem 1 %igen Agarose-TAE-Gel mit DNA-Farbstoff eine bis zwei Stunden bei 100 Volt elektrophoretisch durch. Visualisieren, schneiden und reinigen Sie die angegebenen Banden für das Klonieren wie zuvor beschrieben.

Bereiten Sie anschließend die Ligationsreaktionen unter Verwendung des gereinigten LTR-gag-Inserts und des MJ-four-Vektor-DNAs im Verhältnis von drei Teilen Insert zu einem Teil Vektor vor. Inkubieren Sie die Ligationsreaktionen über Nacht bei vier Grad Celsius.

Dann transformieren Sie chemisch kompetente JM-109-Bakterien mit den Ligationsprodukten und streichen diese auf LB-Agarplatten mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin aus. Kultivieren Sie die transformierten Bakterien bei 30 Grad Celsius für mindestens 22 Stunden. Um die Kloniergenauigkeit zu bestätigen, schneiden Sie die Mini-Präp-DNA mit den Restriktionsenzymen NGOM-vier und HPA-eins in einem Doppelverdau bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden.

Anschließend auf einem 1%igen Agarose-TAE-Gel analysieren. Berechnen Sie das erforderliche Volumen des Virus aus jedem Ansatz basierend auf der infektiösen Einheit pro Mikroliter (IU/µL), ermittelt mittels eines TZM-BL-Zell-Assays, um fünf mal 10 hoch 5 GXR-25-Zellen mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,05 zu infizieren. Tragen Sie stets geeignete persönliche Schutzausrüstung beim Arbeiten mit replikationskompetentem HIV, einschließlich eines vollständigen Kittels, Gesichtsmasken und doppelter Handschuhe. Am Tag der Infektion entnehmen Sie die Virusansätze aus dem minus 80 Grad Celsius kalten Gefrierschrank und lassen sie auftauen. Verdünnen Sie anschließend das Virus in C-R-P-M-I-Medium auf ein Volumen von 100 Mikrolitern, um eine MOI von 0,05 zu erreichen. Geben Sie es in die V-Boden-Gewebekultur-Platte mit 96 Vertiefungen, wobei jeweils eine positive und eine negative Kontrolle in jedem Satz von Replikationsexperimenten enthalten sein müssen, und richten Sie die Platte so ein, dass jede zweite Spalte leer bleibt, um Kreuzkontaminationen zwischen den Vertiefungen zu minimieren. Zählen Sie danach die GXR-25-Zellen mithilfe eines automatischen Zellzählgeräts und berechnen Sie die insgesamt benötigte Zellanzahl für alle Infektionen. Aliquotieren Sie das erforderliche Volumen in ein 50-Milliliter-Konischglas und zentrifugieren Sie, um den Zellpellet zu erhalten. Aspirieren Sie danach vorsichtig das Medium und resuspendieren Sie die Zellen in C-R-P-M-I-Medium mit einer Konzentration von fünf mal 10 hoch 5 Zellen pro 100 Mikroliter. Pipettieren Sie die Zellen in einen sterilen Sammelbehälter und mischen Sie gründlich. Verwenden Sie anschließend eine Mehrkanalpipette, um 100 Mikroliter Zellen in jede Vertiefung der 96-Loch-Platte mit dem verdünnten Virus zuzugeben und mischen Sie gründlich. Danach geben Sie zwei Mikroliter einer fünf Milligramm pro Milliliter-Polybrene-Lösung zu jeder Vertiefung hinzu und mischen die Zellen gründlich. Inkubieren Sie anschließend drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem Gewebekultur-Inkubator mit 5 % CO2.

Um die infizierten Zellen zu waschen, zentrifugieren Sie die 96-Well-V-Boden-Platte, um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie anschließend vorsichtig 150 Mikroliter des Mediums und ersetzen Sie es durch frische 150 Mikroliter C-R-P-M-I, ohne das Zellpellet zu stören. Wiederholen Sie den Vorgang noch zweimal, um die Zellen ausreichend zu waschen. Nach der letzten Zentrifugation und dem Hinzufügen von 150 Mikrolitern C-R-P-M-I resuspendieren Sie das Zellpellet mit einer Mehrkanalpipette. Geben Sie die Mischung aus jedem Well zu 800 Mikrolitern C-R-P-M-I in ein Well einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Stellen Sie die Platte dann in einen Gewebekultur-Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 Grad Celsius. Alle zwei Tage übertragen Sie 100 Mikroliter Überstand von der Oberfläche des Kulturwells in ein Well einer 96-Well-U-Boden-Platte und frieren ihn für die spätere Analyse mittels RT-Assay ein. Anschließend resuspendieren Sie die Zellen gründlich und entfernen die Hälfte des verbleibenden Volumens, um ein Überwachsen der Zellen zu verhindern. Danach stellen Sie das ursprüngliche Volumen wieder her, indem Sie 550 Mikroliter frisches C-R-P-M-I zu jedem Well hinzufügen.

Fügen Sie in diesem Verfahren ein bis zwei Mikroliter von 10 Millicurie pro Milliliter DTTP und vier Mikroliter einer einmolarigen DTT-Lösung zu jedem ein Milliliter umfassenden Aliquot der RT-Master-Mix-Lösung hinzu. Mischen Sie jeden 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrcheninhalt aus RT-Master-Mix, DTT und DTTP vorsichtig mit einer 1000-Mikroliter-Pipette und überführen Sie die Mischung in einen sterilen Auffangbehälter.

Als Nächstes pipettieren Sie 25 Mikroliter der markierten RT-Mischung in jedes Loch einer 96-Loch-PCR-Platte mit dünnen Wänden. Geben Sie fünf Mikroliter jedes Überstandes in die PCR-Platte, die die RT-Master-Mischung enthält. Versiegeln Sie anschließend die PCR-Platte mit einer klebenden Folie und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem Thermocycler. Nach der Inkubation stellen Sie mit einer 200-Mikroliter-Multikanalpipette kleine Löcher in die Folienabdeckung. Mischen Sie die Proben fünfmal. Übertragen Sie fünf Mikroliter jeder Probe auf DE-81-Papier und lassen Sie alle Proben 10 Minuten lang an der Luft trocknen. Legen Sie die Flecken in separate Waschgefäße. Waschen Sie die Flecken danach fünfmal mit 1X SSC. Anschließend waschen Sie zweimal mit 90 %igem Ethanol, jeweils fünf Minuten pro Waschgang, bevor Sie sie an der Luft trocknen lassen. Sobald sie trocken sind, wickeln Sie den Fleck vorsichtig in Frischhaltefolie ein und belichten ihn über Nacht bei Raumtemperatur in einer dicht verschlossenen Kassette gegenüber einem Phosphoscreen.

Analysieren Sie die Phosphoscreens nach der Vorbereitung mit einem Phosphor-Imager und quantifizieren Sie die radioaktiven Transkripte.

Gezeigt sind repräsentative Gelelektrophoresebilder, die die elektrophoretische Trennung der verschiedenen PCR-Amplicons darstellen, die erforderlich sind, um ein vom Patienten stammendes gag-Amplicon zu erzeugen, das in den MJ-vier-Plasmidrückgrat kloniert werden kann. Dieses repräsentative Gelelektrophoresebild zeigt die elektrophoretische Trennung von Restriktionsverdauungen zur Klonierung von Patienten-gag-Genen in MJ vier.

Und dieses repräsentative Gelelektrophoresebild zeigt die elektrophoretische Trennung von Restriktionsverdauungen einer gereinigten gag MJ-vier-Chimären-Plasmid-DNA. Dieses Diagramm veranschaulicht die Reproduzierbarkeit des Replikationsassays über die Zeit in der GXR-25-Zelllinie. Dieselben gag MJ-vier-chimären Viren wurden verwendet, um GXR-25-Zellen in zwei unabhängigen Experimenten zu infizieren, die etwa ein Jahr auseinander durchgeführt wurden.

Replikationsscores wurden durch Berechnung der Steigung der logarithmisch transformierten DLU-Werte ermittelt und diese Steigung auf den Wildtyp MJ-four normalisiert. Die beiden unabhängigen Messungen sind stark korreliert und unterstreichen die Reproduzierbarkeit von Assays, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten und mit Zellen unterschiedlicher Passage durchgeführt wurden. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet HIV/AIDS den Weg, um die viralen Determinanten der Pathogenese bei akuter Infektion mit Subtyp C, dem weltweit vorherrschenden Subtyp, zu untersuchen. Die Arbeit mit replikationskompetentem HIV kann äußerst gefährlich sein. Alle Schritte, die lebendes Virus beinhalten, sollten in einer BSL-2-plus-Einrichtung durchgeführt werden. Alle Oberflächen sollten regelmäßig dekontaminiert werden, und es ist stets eine Doppelhandschutz zu tragen.