Lipiddoppelschicht Vesicle Erzeugung anhand Mikrofluidik Jetting

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Phospholipid-Doppelschicht-Vesikel mit verbesserter Kontrolle über Membran, Unla, Molarität, Mono-Dispersität und den inneren Inhalt herzustellen. Mithilfe von Cad wird eine Kammer aus Acrylplatten und Naturkautschuk gefertigt. Eine suspendierte Lipiddoppelschicht wird erzeugt, indem die Kammer mit Lipiden und Lösung befüllt wird.

Anschließend wird ein Tintenstrahldrucker, der die zu verkapselnde Lösung enthält, mit der Jetting-Vorrichtung eingerichtet. Sobald die geeigneten Einstellungen festgelegt sind, erzeugen die ausgestoßenen Flüssigkeitspulse Lipiddoppelschicht-Vesikel. Letztendlich liefert das mikrofluidische Jetting reproduzierbare, monodisperse Doppelschicht-Vesikel.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Elektroformation, Emulsionsherstellung oder Tropfengenerierung liegt in einem höheren Maß an Kontrolle über die Membran, die einseitige Molarität, die Mono-Dispersität und die inneren Inhaltsstoffe. Das Verfahren wird von Johanna Harrow, einer Doktorandin aus dem Labor, demonstriert, unterstützt wird sie von Kara Patel, einer Studierenden im Bachelorstudium. Mithilfe einer CAD-Software zeichnen Sie eine Kammerform, die aus Acryl mithilfe eines Laserschneiders hergestellt werden kann. Bohren Sie zunächst je ein 1/16-Zoll-Durchgangsloch auf beiden Seiten der zusammengesetzten Acrylkammer. Diese leiten in die unendlichförmige Vertiefung ab.

Zweitens schneiden Sie mit einer Schere ein kleines Rechteck aus einer 0,2 Millimeter starken Acrylplatte aus, das als Boden der Unendlichkeitsform dient. Befestigen Sie dieses mit einem schnell trocknenden Klebstoff, wobei darauf zu achten ist, dass kein Klebstoff in die Beobachtungsbereiche gelangt. Die Acrylplatte sollte bündig mit der Kammerwand abschließen und sicher an der Unterseite der Kammer befestigt sein.

Drittens verwenden Sie einen schnell trocknenden Klebstoff, um ein dünnes Stück Naturgummifolie über die gebohrten Löcher zu kleben. Drücken Sie sie mit einer Pinzette fest an. Überprüfen Sie alle geklebten Nähte auf Dichtheit.

Es sollte keine geben. Zum Schluss mit einer 23-Gauge-Nadel Löcher in den Gummi durch die gebohrten Löcher stechen; die Spitze des piezoelektrischen Tintenstrahldrucks wird durch diese Löcher eingeführt. Lagerphospholipide sollten in Chloroform gelöst und bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.

D-P-H-P-C oder DOPC. Lipide werden in dieser Demonstration verwendet. Die in Chloroform gelösten Lipide werden in ein Glasgefäß überführt, wobei das Gefäß schräg gehalten wird, und anschließend vorsichtig unter Argon- oder Stickstoffgas getrocknet.

Stellen Sie das Gefäß anschließend mit leicht geöffnetem Verschluss unter Vakuum, um ein bis zwei Stunden lang das restliche Lösungsmittel zu entfernen. Für diesen Schritt kann alternativ auch ein Exsikkator verwendet werden. Lösen Sie nun die Lipide in Enddecking unter Zugabe von Enddecking, um eine endgültige Lipidkonzentration von 25 Milligramm pro Milliliter zu erreichen.

Versetzen Sie die Lösung im Vortex. Versiegeln Sie den Verschluss kurz mit Parafilm und führen Sie anschließend eine Ultraschallbehandlung für 15 Minuten durch. Lagern Sie diese Lösung bei minus 20 Grad Celsius.

Bereiten Sie anschließend eine Stammlösung aus Saccharose mit physiologischer Osmolarität vor. Dies ist die Jetting-Lösung. Ziehen Sie in Betracht, der Lösung einen Tropfen dunklen Lebensmittelfarbstoff oder fluoreszierende Kügelchen hinzuzufügen, um den Kontrast oder die Fluoreszenz zu verbessern.

Füllen Sie die Saccharoselösung in eine Ein-Milliliter-Spritze, um eingeschlossene Luft zu entfernen. Klopfen Sie leicht auf die Spritze, damit sich eventuelle Blasen an der Öffnung sammeln und herausgedrückt werden können. Befestigen Sie anschließend einen 33-Millimeter-0,22-Mikron-Filter an der Spritze und pressen Sie einen Tropfen durch den Filter.

Schrauben Sie nun den weiblichen Lockstoffadapter des Tintenstrahls ab und drücken Sie ihn auf das Ende des Filters. Drücken Sie etwas Flüssigkeit heraus, um eingeschlossene Luft zu entfernen. Schließen Sie schließlich die Spritze an der Oberseite der Tintenstrahlflüssigkeit an.

Sollte zur Tintenstrahltülle gelangen, wenn die Spritze korrekt angebracht wurde. Befestigen Sie zunächst die Spritzenanordnung am Mikroskopständer und schließen Sie den Tintenstrahlregler für dieses Experiment an. Der Ständer und die Spritze benötigen eine unabhängige Steuerung, wobei sowohl der Ständer als auch die Spritze in drei Dimensionen bewegt werden müssen, um eine Visualisierung zu ermöglichen.

Richten Sie eine Hochgeschwindigkeitskamera ein, die mindestens 1000 Bilder pro Sekunde aufnehmen kann. Stellen Sie sie so ein, dass die Aufnahmen durch eine bildbasierte automatische Auslösung gestartet werden. Befestigen Sie nun die Kammer mit Klebeband am Objekttisch und richten Sie die Tintenstrahldüse sorgfältig auf die Öffnung aus, die in das Gummiblatt an der Seite der Kammer gebohrt wurde.

Zuerst grob visuell ausrichten und anschließend feine Justierungen mithilfe des Mikroskops vornehmen. Nach der Ausrichtung den Spritzenkolben entlang einer Dimension zurückziehen, um die unendlichförmige Struktur zu laden. Danach sanften Druck auf den Kolben ausüben, sodass sich ein Tröpfchen an der Düse bildet.

Dies erzeugt einen ersten Gegendruck. Die Jet-Parameter müssen eingestellt werden. Anschließend werden auf dem Bildschirm spezifische Werte für eine trapezförmige bipolare Welle angezeigt: angelegte Spannung und die Anzahl der Jet-Impulse pro Trigger zur Steuerung der Vesikelgröße.

Geben Sie nun 25 bis 30 Mikroliter der Lipidlösung in die Enddekade, wobei die gesamte Oberfläche der unendlichförmigen Vertiefung bedeckt werden sollte. Fügen Sie danach in jede Vertiefung 25 Mikroliter Glucoselösung langsam und gleichmäßig am äußersten Rand hinzu; die Glucoselösung sollte sich nicht mit der Lipidlösung vermischen. Innerhalb von 10 Minuten bildet sich eine Lipiddoppelschicht im Zentrum der Kammer.

Das Aufbauen der Doppelschicht ist der kritischste Schritt, da die Doppelschicht instabil ist und je nach Vorbereitung reißen kann. Seien Sie geduldig. Es wird funktionieren, sobald Sie das Befüllen der Kammer einige Male geübt haben.

Setzen Sie nun die Tintenstrahlnadel vorsichtig wieder in die Kammer ein, wenn sich die Nadel innerhalb von 200 Mikrometern der Tröpfchengrenzfläche befindet. Membran, starten Sie den Tropfenabgabeprozess und nehmen Sie die Daten mithilfe des Tintenstrahls auf, um Einblicke in den Vesikelbildungsprozess zu erhalten. Beispielsweise beeinflusste die Variation des Abstands zwischen der Tintenstrahldüse und der Lipiddoppelschicht die Kraft, die die Membran verformt. Schließen.

Die Nähe zur Doppelschicht fokussierte den Strahl und verhinderte, dass die Membran Energie vom Punkt der Vesikelbildung weg abgab. Außerdem nahm die Geschwindigkeit des Wirbels mit der am piezoelektrischen Aktuator angelegten Spannung zu. Die Vesikelbildung wurde als Abfolge von Ereignissen nach ihrer Entstehung veranschaulicht.

Die Stabilität der Vesikel variierte in der Regel mit dem Vesikeldurchmesser, wobei kleinere Vesikel stabiler waren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mittels Mikrofluidik-Jetting Lipid-Vesikel erzeugt.