Elektro Growth Factor Releasing Mikrosphären in Fasergerüste

Dieses Protokoll kombiniert Elektrospinnen und Mikrosphären, um Gewebegerüste zu entwickeln, die Neuronen lenken. Der Nervenwachstumsfaktor wurde in PLGA-Mikrosphären eingekapselt und in faserige Gerüste aus Hyaluronsäure (HA) elektrogesponnen. Die Proteinbioaktivität wurde getestet, indem die Gerüste mit den Spinalwurzelganglien des Primärkükens besät und 4-6 Tage lang kultiviert wurden.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine facettenreiche Umgebung zu schaffen, um das Nervenwachstum und die Nervenreparatur zu unterstützen. Dies wird erreicht, indem Wachstumsfaktoren zunächst in abbaubaren Mikrosphären verkapselt werden. Der zweite Schritt besteht darin, das Stützmaterial für den Großteil der Umgebung vorzubereiten.

Anschließend werden die Mikrosphären und das Stützmaterial kombiniert und zu einem ausgerichteten Fasergerüst elektrogesponnen. Der letzte Schritt besteht darin, das Gerüst mit Neuronen der Spinalganglien des Kükens zu testen. Letztendlich wird die Immunfluoreszenzmikroskopie verwendet, um zu zeigen, dass das Wachstum und die Richtung der Neuriten im Vergleich zu Kontrollen beschleunigt wird.

Obwohl dieses System für neuronales Gewebe mit geringfügigen Änderungen an den verwendeten Proteinen und Materialien konzipiert ist, könnte es auch auf verschiedene Gewebetypen wie Herz, Lunge und Knochen angewendet werden. Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, bereiten Sie die erforderlichen Reagenzien, Lösungen von Polyvinylalkohol oder PVA mit 2 % und 0,5 Gew.-% pro Volumen in deionisiertem Wasser, eine Lösung von 2 Vol.-%, Isopropylalkohol und deionisiertes Wasser sowie eine wässrige Lösung des gewünschten hydrophilen Proteins vor. Ort. 40 Milliliter der 0,5%igen PVA-Lösung in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben und in einem kleinen Fläschchen beiseite stellen, gelöst 300 Milligramm 65 bis 35 Polymilchsäure Co-Glykolsäure oder PLGA und drei Milliliter Dichlormethan.

Ein Vortex-Mischer kann verwendet werden, um die PLGA-Auflösung von kombinierten 200 Mikrolitern Proteinlösung und vier Mikrolitern 2%iger PVA-Lösung zu beschleunigen. Gießen Sie die Protein-PVA-Mischung in die PLGA-Lösung. Die Lösungen werden meist getrennt bleiben.

Das Fläschchen wird in ein Becherglas mit Eiswasser mit einem W bei etwa 10 Watt gestellt und die Lösung fünf bis 10 Sekunden lang gerührt, bis eine gleichmäßige cremeweiße Emulsion entsteht. Gießen Sie die Emulsion in das zuvor vorbereitete 50-Milliliter-Röhrchen mit 0,5 % PVA. Mischen Sie die Lösung bei hoher Geschwindigkeit auf einem Wirbelmischer für etwa 20 Sekunden.

Die Lösung wird trüb aussehen. Die Emulsion in ein 200-Milliliter-Becherglas umfüllen und zwei Minuten lang bei 350 U/min auf eine Rührplatte stellen. 50 Milliliter 2%igen Isopropylalkohol in das Becherglas auf der Rührplatte geben.

Lassen Sie das Gemisch mindestens eine Stunde lang weiterrühren, damit das Chlormethan verdampfen und das PLGA aushärten kann. Übertragen Sie anschließend die Mikrosphärenlösung in Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie drei Minuten lang bei 425 mal G. Die Mikrokügelchen sammeln sich am Boden des Röhrchens und erscheinen weiß. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand aus dem Röhrchen über den Mikrokügelchen und bewahren Sie ihn in einer 500-Milliliter-Flasche auf.

Spülen Sie die Mikrosphären mit entionisiertem Wasser, indem Sie jedes Röhrchen zu drei Vierteln füllen und schütteln, um die Mikrosphären in der Flüssigkeit neu zu verteilen. Wiederholen Sie das Zentrifugieren, Entfernen des Überstands und Spülen der Mikrokügelchen mit entionisiertem Wasser viermal nach der letzten Spülung. Den Überstand entfernen und mit den anderen Proben in die 500-Milliliter-Flasche geben.

Frieren Sie die in den Zentrifugenröhrchen gesammelten Mikrosphären über Nacht bei minus 20 Grad Celsius ein und lyophilisieren Sie sie anschließend mindestens 24 Stunden lang. Die folgende Elektrospinnlösung sollte zuvor in deionisiertem Wasser, 2 % Gewicht pro Volumen, Meth-verwandter Hyaluronsäure oder Miha mit 3 % Gewicht pro Volumen, 900 Kilodalton Polyethylenoxid oder PEO und 0,05 % Gewicht pro Volumen hergestellt werden. Lösung für Fotoinitiatoren.

Nachdem Sie das gewünschte Volumen der Elektrospinnlösung hergestellt haben, fügen Sie Mikrokugeln in der gewünschten Konzentration von bis zu 400 Milligramm pro Milliliter hinzu. Mischen Sie die Lösung auf einem Wirbelmischer, bis die Mikrokügelchen gleichmäßig in der Lösung verteilt sind. Übertragen Sie die Lösung auf eine Spritze und befestigen Sie eine sechs Zoll große 18-Gauge-Nadel mit stumpfer Spitze.

Legen Sie die Spritze in eine Spritzenpumpe und stellen Sie sie auf 1,2 Milliliter pro Stunde ein. Klebe eine Schicht Alufolie auf den Dorn. Dies ermöglicht eine einfache Reinigung und Lagerung des fertigen Gerüsts.

Ein rotierender Dorn wird verwendet, um ausgerichtete Fasern zu erzeugen. Schließen Sie das Erdungskabel von einer Hochspannungsstromquelle an das Sammelgerät an. Verbinden Sie die positive Leitung mit der Nadel, um ein erfolgreiches Elektrospinnen zu gewährleisten.

Es ist sehr wichtig zu überprüfen, ob alle Verbindungen und Einstellungen korrekt sind. Starten Sie das Polymerpumpen und wenn die Lösung am Ende der Spritze sichtbar ist, schalten Sie die Spannungsquelle ein und stellen Sie die Spannung auf 24 Kilovolt ein. Lassen Sie die Lösung laufen, bis die gewünschte Gerüstdicke erreicht ist.

Wenn Sie fertig sind, schalten Sie die Spannungsquelle und die Spritzenpumpe aus. Um diesen Vorgang zu starten, befestigen Sie die entsprechenden Deckgläser vor dem Elektrospinner mit abnehmbarem doppelseitigem Klebeband an der Auffangfläche des Elektrospinners. Das Drehen auf die Deckgläser erleichtert die Handhabung und das Betrachten nach dem Elektrospinnen auf die gewünschte Dicke.

Wie im vorherigen Videosegment gezeigt, entfernen Sie vorsichtig die Deckgläser vom Dorn. Legen Sie die mit Gerüsten beschichteten Abdeckfolien in eine durchsichtige Stickstoffkammer und stellen Sie sicher, dass der gesamte Sauerstoff gespült wird. Stellen Sie die Kammer und das Gerüst 15 Minuten lang unter ein 10 Milliwatt Zentimeter großes, 365 Nanometer großes Licht.

Nach dem Vernetzen schlüpft die Abdeckung in eine Vertiefungsplatte in geeigneter Größe. Achten Sie darauf, dass die Gerüstseite nach oben zeigt. Legen Sie 100 bis 200 Mikroliter Medium auf jedes Gerüst in der Well-Platte. Sorgfältig.

Legen Sie ein Spinalganglia oder DRG auf jedes Gerüst im Medientröpfchen. Für ein dickes Gerüst kann es sein, dass mehr Medien benötigt werden. Das DRG muss vollständig untergetaucht sein und darf nicht schwimmen.

Inkubieren Sie das Gerüst und DRG vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius, damit die Zelle am Gerüst haften kann. Füllen Sie als Nächstes das Medium bis zum entsprechenden Niveau für das Bohrloch. Stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator und inkubieren Sie sie nach der Inkubationszeit vier bis sechs Tage lang.

Entfernen Sie das Medium vorsichtig aus jeder Vertiefung und waschen Sie es einmal vorsichtig mit PBS. Fixieren Sie die Zellen 30 Minuten lang mit 4 % Gewicht pro Volumen. Para-Formaldehyd färbt anschließend die Zellen nach einem etablierten Protokoll auf Neurofilamente und Zellkerne.

Um die Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar zu machen, platzieren Sie die Well-Platte auf dem Tisch des Mikroskops und lokalisieren Sie die Zellmasse mit den Filter- und Anregungseinstellungen für dpi. Sobald die Zelle identifiziert ist, schalten Sie den Filter auf zi. Um die ausgedehnten Neuriten sichtbar zu machen, verwenden Sie die Stichfunktion am Mikroskop, um so viele Bilder wie nötig zu sammeln und zu kombinieren, um die gesamte Struktur zu sehen.

Wiederholen Sie dies für dpi-, fite- und Hellfeld-Mikrosphären. Mit einem Durchmesser von mehr als 14 Mikrometern und einer Proteinverkapselung von über 85 % wurden nach diesem Protokoll konsistent Elektrosen hergestellt und Elektrosen zu Gerüsten gesponnen. Dieses Fluoreszenzbild zeigt repräsentative Mikrosphären mit Rod Domine in der PLGA-Hülle und darin eingekapselten BSA-Passformen.

Um die Verkapselung zu bewerten, wurden die Mikrosphären mit BSA gefüllt und über 60 Tage lang mit einem Bradford-Proteinassay auf Proteinfreisetzung getestet. Die Freisetzung beginnt mit einem ersten Ausbruch und setzt sich dann fort, wenn Mikrokugeln nach dem Elektrodrehen zerfallen. Die Mikrokügelchen sind in der gesamten 3D-Faserstruktur zu sehen.

In diesem REM-Bild des kompletten Gerüsts. Die Kugeln sind in mehreren Schichten zu sehen, die durch Pfeile gekennzeichnet sind. Dieses Bild mit hoher Vergrößerung zeigt eine Mikrokugel mit den Nanofasern des Gerüsts darüber.

Spinalganglien oder DRG wurden verwendet, um die Lebensfähigkeit des Nervenwachstumsfaktors (NGF) in den Mikrosphären innerhalb des Gerüsts zu testen. Hier sitzt die DRG auf einem Gerüst mit Mikrokugeln. Beladen mit NGF ist neben einer Mikrosphäre ohne Protein innerhalb des längeren Neurits zu sehen. Fortsätze, die sich vom DRG auf dem NGF-Gerüst erstrecken, deuten darauf hin, dass der NGF lebensfähig ist und das Wachstum fördern kann.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Protein in Mikrokügelchen einkapselt und sie in faserige Gerüste einbaut.