Name: Elektro Growth Factor Releasing Mikrosphären in Fasergerüste (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-16T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Lernen Sie die Herstellung von Wachstumsfaktor-freisetzenden Mikrosphären in faserigen Gerüsten durch Elektrospinnen. Diese Methode unterstützt Nervenwachstum und -reparatur mit primären Hühner-Dorsalwurzelganglien.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde teilweise durch die Richard Barber Foundation und ein Thomas Rumble Fellowship (TJW) finanziert.

1. Wasser / Öl / Wasser-Doppelemulsion Microsphere Produktion <ol><li> Erste Herstellung von 2% bzw. 0,5% w / v Lösung von Polyvinylalkohol (PVA) in entionisiertem Wasser. Rühren Sie die Lösungen bei 50 ° C, bis klar ist, kann dies mehrere Stunden dauern. Eine Lösung aus 2% v / v Isopropylalkohol in entionisiertem Wasser. </li><li> Bereiten einer wäßrigen Lösung eines hydrophilen Proteins erwünscht. Die folgende Tabelle enthält Beispielformulierungen. </li></ol><img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/51517/51517table1highres.jpg" /> Tabelle 1:. Beispiel Proteinlösungen Die folgenden Proteinlösungen wurden erfolgreich gekapselt und elektro mit diesem Protokoll. Andere hydrophile Proteinlösungen können nach Bedarf verwendet werden. <ol start="3"><li> Die 40 ml der 0,5% igen PVA-Lösung in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen und beiseite stellen. </li><li> In ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen lösen 300 mg 65:35Poly (milchsäure-co-Glykolsäure) (PLGA) in 3 ml Dichlormethan. Einem Vortex-Mischer können verwendet werden, um PLGA Auflösung zu beschleunigen. </li><li> Kombinieren Sie 200 ul der Proteinlösung und 4 ul 2% PVA-Lösung. Gießen Sie die Mischung in die Protein-PLGA-Lösung (Schritt 1.4). Die Lösungen werden meist getrennt bleiben. </li><li> Das Röhrchen wird in ein Becherglas mit Eiswasser. Mit Hilfe eines Ultraschallgeräts Zauberstab bei ~ 10 Watt (RMS), rühren Sie die Lösung für ein paar Sekunden (5-10), bis eine gleichmäßige Emulsion creme-weiß erstellt wird. </li><li> Gießen Sie die Emulsion in der 50-ml-Tube, die 0,5% PVA (Schritt 1.3). Mische die Lösung mit hoher Geschwindigkeit auf einem Vortex-Mischer für ungefähr 20 Sekunden. Die Lösung wird ein trübes Aussehen zu entwickeln. </li><li> Die Emulsion wird in einem 200 ml-Becherglas und auf einer Rührplatte bei 350 rpm für 2 min. 50 ml 2% Isopropylalkohol in das Becherglas auf der Rührplatte. Lassen Sie die Mischung weiterhin Rühren mindestens 1 Stunde auf dem DCM erlauben, zu verdampfen und das PLGA zu härten. </li><li> Transfer ter MICROSPHERE Lösung in Zentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifuge bei 425 xg für 3 min. Die Mikrosphären werden am unteren Rand des Röhrchens zu sammeln und weiß erscheinen. Den Überstand vorsichtig aus dem Rohr, über den Mikrokügelchen, und speichern Sie in einem 500-ml-Flasche. </li><li> Spülen Sie die Mikrosphären mit VE-Wasser durch das Rohr füllt drei Viertel voll und schüttelte es, die Mikrokügelchen in der Flüssigkeit zu verteilen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.10 &amp; 1.11 viermal. </li><li> Nach dem letzten Spülgang, den Überstand wieder und in der 500 ml-Flasche mit den anderen Proben. Einfrieren der in dem Zentrifugenröhrchen gesammelt Mikrokugeln, dann für mindestens 24 Stunden lyophilisiert. </li><li> Visualisieren Sie die Mikrokugeln unter einem Lichtmikroskop oder mit einem Rasterelektronenmikroskop. Mikrosphären, die nicht größer als 60 um sind für eine effektive Elektro. Wenn Mikrokügelchen zu groß sind, können länger Beschallen oder Vortexen mal im Schritt 1.6 oder 1.7 benötigt. </li> &lt;li&gt; Bewahren Sie die getrockneten Mikrokügelchen in einem -20 ° C Gefrierschrank. </li><li> Optional: Verwenden Sie ein Protein-Test, nach den Herstelleranweisungen, um die Menge an Protein in der 500-ml-Flasche von 1,10 Schritt 30 zu testen. Dies wird verwendet, um den Prozentsatz an Protein in den Mikrokügelchen eingekapselt ist, die durch Subtrahieren der Menge der Lösung ab, was in der Produktion verwendet zu berechnen. </li></ol> Hinweis: Um das Protein sichtbar zu Lage in der Mikro hinzuzufügen Rhodamin 2 ug / ml zu dem PLGA-Lösung 31 und kapseln einen FITC-konjugierten Proteins Figur 1 zeigt ein Beispiel.. 2. Das Elektro mit Mikrosphären <ol><li> Vor der Herstellung von Elektro Lösung, schaffen eine 0,5% w / v-Lösung des Photoinitiators in entionisiertem Wasser durch Lösen von 37 ° C. Dieser Prozess kann mehrere Stunden dauern. </li><li> Erstellen Sie eine 2% w / v methacrylierte Hyaluronsäure (Meha) (siehe Burdick et al. Zur Synthese) 29, 3%w / v 900 kD Poly (ethylenoxid) (PEO) und 0,05% w / v Fotoinitiatorlösung in entionisiertem Wasser. <ol><li> Berechnen Sie die korrekte Menge von Meha und PEO für die gewünschte Lautstärke. B. 10 ml Lösung benötigt das Elektro 200 mg MEHA und 300 mg PEO. </li><li> Auflösen des PEO in entionisiertem Wasser bei 90% des gewünschten Endvolumens (9 ml für dieses Beispiel). Dies kann mehrere Stunden dauern, können eine beheizte Platte rühren oder Wasserbad bei 37 ° C verwendet werden, um den Prozess zu beschleunigen. </li><li> Nächstes fügen Sie den Meha und verwenden Sie einen Wirbelmischer auf der Lösung, bis klar rühren. Das dauert nur ein paar Minuten dauern. </li><li> Schließlich fügen Sie die 0,5% Photoinitiator Lösung, um die restlichen 10% Volumen (1 ml für dieses Beispiel) zu füllen. </li></ol></li><li> Fügen Mikrokugeln bei der gewünschten Konzentration bis zu 400 mg / ml. Mischen Sie die Lösung auf einem Vortex-Mischer, bis die Mikrokugeln gleichmäßig in der Lösung verteilt. </li><li> Die Lösung wird in einer Spritze und fügen Sie eine 6-Zoll-18-Gauge-blunt Spitze Nadel. </li><li> Legen Sie die Spritze in einer Spritzenpumpe und legen Sie es auf 1,2 ml / h zu verzichten. </li><li> Kleben Sie eine Schicht Aluminiumfolie auf der Sammelplatte oder Dorn. Dies ermöglicht eine einfache Reinigung und Lagerung des fertigen Gerüst. Einen rotierenden Dorn verwendet wird, um ausgerichteten Fasern zu schaffen. Eine flache Platte oder stationären Dorn resultieren in zufällig angeordneten Fasern. </li><li> Schließen Sie das Erdungskabel von einer Hochspannungsquelle an die Auffangvorrichtung. Schließen Sie das Pluskabel an der Nadel. </li><li> Stellen Sie die Spritzenpumpe und Auffangfläche, so dass es 15 cm zwischen der Nadelspitze und Sammelfläche. </li><li> Starten Sie das Polymer Pumpen, wenn die Lösung am Ende der Spritze sichtbar ist, schalten Sie die Spannungsquelle und stellen Sie die Spannung auf 24 kV. VORSICHT: Sobald die Spannung eingeschaltet ist keine Metallteil des Systems berühren. Ladung kann auch springen kurzen Entfernungen von elektrifizierten Teile die Haut. </li><li> Führen Sie die Lösung bis desired Gerüstdicke erreicht ist. Wenn komplett auszuschalten Spannungsquelle und Spritzenpumpe. </li><li> Folie entfernen mit Gerüst befestigt. Abgeschlossen Gerüste Protein enthalten, werden in einem -20 ° C-Gefrierschrank gelagert. </li></ol> 3. Protein Bioaktivität Testing <ol><li> Vorbereitung der Zellkultur-Medien. Werden 10% v / v fötales Rinderserum, 1% v / v L-Glutamin und 1% v / v Penicillin-Streptomycin, um Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium. </li><li> Wählen Deckgläser, die vollständig in eine Well-Platte passen. </li><li> Verwenden 3 (Trimethoxysilyl) propyl-methacrylat, die Deckgläser zu behandeln, wie vom Hersteller beschrieben. Methacrylierung verbessert Gerüst Einhaltung der Deckgläser. </li><li> Bringen methacrylierte Deckgläser an den Sammelbereich der Electro mit abnehmbarem doppelseitiges Klebeband, bevor das Elektro. Spinnen auf die Deckgläser erleichtert Handhabung und Betrachtung. </li><li> Elektrospinnen, um die gewünschte Dicke, wie oben beschrieben. </li><li> EinN ach Elektro vorsichtig Deckgläser von Dorn. Legen Sie das Gerüst beschichtete Deckgläser in eine klare Stickstoffkammer und sicherzustellen, dass alle Sauerstoff gespült. </li><li> Legen Sie die Kammer und Gerüst unter 10 mW / cm 2 365-nm-Licht für 15 min. Nach der Vernetzung Ort in geeigneter Größe Well-Platte. Stellen Sie sicher, dass das Gerüst nach oben zeigt. </li><li> Ort Gerüste unter einer keimtötenden Lampe 30 min sterilisiert. Falls gewünscht Fibronektin oder anderen Protein als eine Beschichtung verwendet, um die Zellhaftung zu verbessern. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers zu beschichten Gerüste. </li><li> Ernte Hinterwurzelganglien (DRG), wie zuvor von Hollenbeck 32 beschrieben. Einer DRG für jeden Gerüst bedeckt Deck getestet benötigt. </li><li> Zeigen 100-200 ul Medium auf jedem Gerüst in der Well-Platte. Vorsichtig eine DRG auf jedem Gerüst in den Medien Tropfen. Für dicke Gerüst mehr Medien erforderlich sein; DRG müssen vollständig eingetaucht werden und nicht FLOAting. </li><li> Inkubieren des Gerüstes und DRG bei 37 ° C für 4 Stunden, damit die Zelle auf dem Gerüst haften. </li><li> Füllen Sie die Medien auf der geeigneten Ebene für das Wohl und legen Sie wieder in den Inkubator. Weiter Inkubation für 4-6 Tage. </li><li> Nach der Inkubationszeit vorsichtig die Medien von jedem gut und sanft einmal zu waschen mit PBS. Fix Zellen 30 min mit 4% w / v Paraformaldehyd. </li><li> Fleck-Zellen mit einem Antikörper-Färbung für Neurofilament. Dies ermöglicht die Visualisierung von Neuritenwachstum für die Quantifizierung. DAPI kann auch verwendet werden, um Zellkerne zu schauen. Ein Beispiel Färbungsprotokoll wurde von Sundararaghavan und Kollegen 14 beschrieben. </li><li> Visualisierung der Zellen unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops. <ol><li> Zeigen Well-Platte auf der Bühne des Mikroskops. </li><li> Suchen Sie den Zellmasse mit Hilfe der Filter und Anregung Einstellungen für DAPI. </li><li> Sobald die Zelle wechseln Sie den Filter auf FITC, um die erweiterten Neuriten zu visualisieren. Usingen die Stichfunktion am Mikroskop zu sammeln und kombinieren so viele Bilder wie nötig, um die gesamte Struktur zu sehen. Wiederholen Sie für DAPI, FITC und Hellfeld. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+migration+in+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Directed migration in neural tissue engineering.</a> Tissue Eng Part B Rev. , (2013).</li>
<li>Schmidt, C. E., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+tissue+engineering%3A+strategies+for+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 5, 293-347 (2003).</li>
<li>Madduri, S., di Summa, P., Papaloizos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+controlled+co-delivery+of+synergistic+neurotrophic+factors+on+early+nerve+regeneration+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats.</a> Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).</li>
<li>Madduri, S., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+delivery+systems+and+repair+strategies+for+damaged+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Growth factor delivery systems and repair strategies for damaged peripheral nerves.</a> J Control Release. 161, 274-282 (2012).</li>
<li>Madigan, N. N., McMahon, S., O'Brien, T., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+tissue+engineering+and+novel+therapeutic+approaches+to+axonal+regeneration+following+spinal+cord+injury+using+polymer+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Current tissue engineering and novel therapeutic approaches to axonal regeneration following spinal cord injury using polymer scaffolds.</a> Respir Physiol Neurobiol. 169, 183-199 (2009).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+growth+in+3D+collagen+gels+with+gradients+of+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties.</a> Biotechnol. Bioeng. 102, 632-643 (2009).</li>
<li>Hudson, T. W., Evans, G. R., Schmidt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+strategies+for+peripheral+nerve+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Plast+Surg%22%5BJournal%5D)">Engineering strategies for peripheral nerve repair.</a> Clin Plast Surg. 26, 617-628 (1999).</li>
<li>Kokai, L. E., Bourbeau, D., Weber, D., McAtee, J., Marra, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+growth+factor+delivery+promotes+axonal+regeneration+in+long+gap+peripheral+nerve+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Sustained growth factor delivery promotes axonal regeneration in long gap peripheral nerve repair.</a> Tissue Eng Part A. 17, 1263-1275 (2011).</li>
<li>Bronzino, J. D., Peterson, D. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBronzino%2C+JD+%22The+Biomedical+Engineering+Handbook%2C+Third+Edition+-+3+Volume+Set%3A+Tissue+Engineering+and+Artificial+Organs%22">The Biomedical Engineering Handbook, Third Edition - 3 Volume Set: Tissue Engineering and Artificial Organs</a>. , 3 edition edn, CRC Press. (2006).</li>
<li>Bell, J. H. A., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+nerve+guides%3A+materials%2C+fabrication%2C+growth+factors%2C+and+cell+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Next generation nerve guides: materials, fabrication, growth factors, and cell delivery.</a> Tissue Eng Part B Rev. 18, 116-128 (2012).</li>
<li>Ruiter, G. C. W., Malessy, M. J. A., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J., Spinner, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+ideal+conduits+for+peripheral+nerve+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgical+focus%22%5BJournal%5D)">Designing ideal conduits for peripheral nerve repair.</a> Neurosurgical focus. 26, (2009).</li>
<li>Olakowska, E., Woszczycka-Korczyńska, I., Jędrzejowska-Szypułka, H., Lewin-Kowalik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+nanotubes+and+nanofibres+in+nerve+repair.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Application of nanotubes and nanofibres in nerve repair. A review.</a> Folia Neuropathol. 48, 231-237 (2010).</li>
<li>Gunn, J., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyblend+nanofibers+for+biomedical+applications%3A+perspectives+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Polyblend nanofibers for biomedical applications: perspectives and challenges.</a> Trends Biotechnol. 28, 189-197 (2010).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Masand, S. N., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+generation+of+haptotactic+gradients+through+3D+collagen+gels+for+enhanced+neurite+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Microfluidic generation of haptotactic gradients through 3D collagen gels for enhanced neurite growth.</a> Journal of Neurotrauma. 28, 2377-2387 (2011).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+fibrous+scaffolds+with+multiscale+and+photopatterned+porosity%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Electrospun fibrous scaffolds with multiscale and photopatterned porosity.</a> Macromol Biosci. 10, 265-270 (2010).</li>
<li>Edalat, F., Sheu, I., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Material+strategies+for+creating+artificial+cell-instructive+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Material strategies for creating artificial cell-instructive niches.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23, 820-825 (2012).</li>
<li>Annabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+highly+porous+crosslinked+elastin+hydrogels+and+their+interaction+with+fibroblasts+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Synthesis of highly porous crosslinked elastin hydrogels and their interaction with fibroblasts in vitro.</a> Biomaterials. 30, 4550-4557 (2009).</li>
<li>Castaño, O., Eltohamy, M., Kim, H. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+technology+in+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrospinning technology in tissue regeneration.</a> Methods Mol. Biol. 811, 127-140 (2012).</li>
<li>Chew, S. Y., Wen, J., Yim, E. K. F., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+release+of+proteins+from+electrospun+biodegradable+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Sustained release of proteins from electrospun biodegradable fibers.</a> Biomacromolecules. 6, 2017-2024 (2005).</li>
<li>Han, D., Gouma, P. -I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+bioscaffolds+that+mimic+the+topology+of+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Electrospun bioscaffolds that mimic the topology of extracellular matrix.</a> Nanomedicine. 2, 37-41 (2006).</li>
<li>Prabhakaran, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+biocomposite+nanofibrous+scaffolds+for+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Electrospun biocomposite nanofibrous scaffolds for neural tissue engineering.</a> Tissue Eng Part A. 14, 1787-1797 (2008).</li>
<li>Xie, J., MacEwan, M. R., Schwartz, A. G., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibers+for+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibers for neural tissue engineering.</a> Nanoscale. 2, 35-44 (2010).</li>
<li>Yao, L., O'Brien, N., Windebank, A., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orienting+neurite+growth+in+electrospun+fibrous+neural+conduits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+Part+B+Appl.+Biomater%22%5BJournal%5D)">Orienting neurite growth in electrospun fibrous neural conduits.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 90, 483-491 (2009).</li>
<li>Sill, T. J., von Recum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning%3A+applications+in+drug+delivery+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering.</a> Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).</li>
<li>Ifkovits, J. L., Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+fibrous+polymer+scaffolds+for+tissue+engineering+and+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+with+depth+in+electrospun+fibrous+scaffolds+for+directed+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Gradients with depth in electrospun fibrous scaffolds for directed cell behavior.</a> Biomacromolecules. 12, 2344-2350 (2011).</li>
<li>Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P., Meinel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+matrices+for+localized+drug+delivery%3A+current+technologies+and+selected+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications.</a> Eur J Pharm Biopharm. 81, 1-13 (2012).</li>
<li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+electrospun+scaffolds+delivering+growth+factors+and+genes+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications.</a> Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).</li>
<li>Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+degradation+and+mechanical+behavior+of+photopolymerized+hyaluronic+acid+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks.</a> Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).</li>
<li>Péan, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+HSA+and+NGF+encapsulation+yields+in+PLGA+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Optimization of HSA and NGF encapsulation yields in PLGA microparticles.</a> International Journal of Pharmaceutics. 166, 105-115 (1998).</li>
<li>Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Uptake+and+Intracellular+Fate+of+PLGA+Nanoparticles+in+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The Uptake and Intracellular Fate of PLGA Nanoparticles in Epithelial Cells.</a> Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).</li>
<li>Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , Gulf Professional Publishing. (2003).</li>
<li>Boer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+sciatic+nerve+repair+with+a+poly-lactic-co-glycolic+acid+scaffold+and+nerve+growth+factor+releasing+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Rat sciatic nerve repair with a poly-lactic-co-glycolic acid scaffold and nerve growth factor releasing microspheres.</a> Microsurgery. 31, 293-302 (2011).</li>
<li>Pujic, Z., Goodhill, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+compartment+diffusion+chamber+for+studying+axonal+chemotaxis+in+3D+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A dual compartment diffusion chamber for studying axonal chemotaxis in 3D collagen.</a> Journal of Neuroscience Methods. 215, 53-59 (2013).</li>
<li>Madduri, S., di Summa, P., Papaloïzos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+controlled+co-delivery+of+synergistic+neurotrophic+factors+on+early+nerve+regeneration+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats.</a> Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphosphoester+microspheres+for+sustained+release+of+biologically+active+nerve+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor.</a> Biomaterials. 23, 3765-3772 (2002).</li>
<li>Yan, Q., Yin, Y., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+new+PLGL-RGD-NGF+nerve+conduits+for+promoting+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">Use new PLGL-RGD-NGF nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration.</a> Biomed Eng Online. 11, (2012).</li>
<li>Gungor-Ozkerim, P. S., Balkan, T., Kose, G. T., Sarac, A. S., Kok, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+growth+factor+loaded+microspheres+into+polymeric+electrospun+nanofibers+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications.</a> J Biomed Mater Res A. , (2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+proteins+in+poly%28L-lactide-co-caprolactone%29+fibers+by+emulsion+electrospinning%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of proteins in poly(L-lactide-co-caprolactone) fibers by emulsion electrospinning.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 75, 418-424 (2010).</li>
<li>Wang, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+aligned+core-shell+nanofibres+delivering+NGF+on+the+promotion+of+sciatic+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomater+Sci+Polym+Ed%22%5BJournal%5D)">The effect of aligned core-shell nanofibres delivering NGF on the promotion of sciatic nerve regeneration.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 23, 167-184 (2012).</li>
<li>Liu, J. -J., Wang, C. -Y., Wang, J. -G., Ruan, H. -J., Fan, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+regeneration+using+composite+poly%28lactic+acid-caprolactone%29%2Fnerve+growth+factor+conduits+prepared+by+coaxial+electrospinning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning.</a> J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Viele Studien haben gezeigt, dass Nervenzellen durch topographische Cues (Faserausrichtung) und chemische Signale (Wachstumsfaktoren) 1,2,10,11,35 gerichtet werden. Elektro ist ein einfaches Verfahren, um Fasern ausgerichtet erstellen. Wachstumsfaktoren fördern Nervenwachstums aber, um sie in die Nervenleitungen (NC) gehören, wird ein Verfahren zur verzögerten Freisetzung erforderlich. Um ein robustes System mit beiden Signale zu erzeugen, sollten diese beiden Signale kombiniert werden. Mehrere Verfahren wurd...

Eine der aktuellen Herausforderungen in neuronalen Gewebe-Engineering ist die Schaffung einer Nervenleitung (NC), die die extrazelluläre Matrix, wobei Nerven wachsen natürlich imitiert. Die Forschung hat gezeigt, dass Zellen reagieren auf verschiedene Faktoren in ihrer Umgebung einschließlich der mechanischen, topographisch, Klebstoff und chemische Signale 1-3. Eine der primären Herausforderungen in diesem Bereich ist die Bestimmung der geeigneten Kombination von Signalen und Herstellung ein System, das Hinweise für einen längeren Zeitraum aufrecht erhalten kann, das Zellwachstum 4 unterstützt. Peripheren Neuronen bekannt sind, um eine weiche Substrat bevorzugen, von ausgerichteten Fasern ausgerichtet werden, und auf den Nervenwachstumsfaktor (NGF) 5-7. NCs, die chemische Signale für Wochen liefern können, sind gezeigt worden, um eine verbesserte funktionelle Erholung näher an der Allografts, der aktuelle Gold-Standard für die Nervenreparatur 8,9 bieten. Zu produzieren mechanische und topographische können verschiedene Materialien und Produktionsmethoden verwendet werdenal Queues 10-13. Mechanische Signale sind inhärent für das gewählte Material, so dass die Auswahl des geeigneten Materials für die Anwendung kritischen 1,13. Produktionsmethoden zu kontrollieren topographische Hinweise sind Phasentrennung, die Selbstorganisation und das Elektro 1,13. Für Mikroanwendungen, Mikrofluidik, Photostrukturierung, Ätzen, Salz Laugen oder Gas Schäume können auch verwendet werden, 14-17. Elektro hat als beliebteste Weg, um Fasersubstraten für die Gewebekultur-Ingenieur durch seine Flexibilität und Leichtigkeit der Produktion 13,18-23 entstanden. Elektrogesponnene Nano werden durch Anlegen einer Hochspannung zu einer Polymerlösung so dass es zu sich selbst abzuwehren und erstrecken sich über eine kurze Lücke zu entladen 24 hergestellt. Eine ausgerichtete Stützgerüst kann durch Sammeln der Fasern auf einer geerdeten rotierenden Dorn erzeugt werden und blockfreien Gerüsten sind auf einer stationären Platte 25 gesammelt. Haftung Signalisierung kann durch Beschichtung der Fasergerüst wit erreicht werdenh Fibronectin oder Konjugation eines Haft Peptid, wie RGD, zu dem HA, bevor das Elektro 26. Chemische Signale, wie Wachstumsfaktoren, die am schwierigsten über längere Zeiträume aufrecht zu erhalten, weil sie benötigen eine Quelle für die gesteuerte Freisetzung. Viele Systeme wurden versucht, um eine kontrollierte Freisetzung zu elektro faserigen Netzen mit unterschiedlichem Erfolg hinzuzufügen. Diese Methoden umfassen Mischung Elektro, Emulsion Elektro, Kern-Schale-Elektro und Protein-Konjugation 27. Zusätzlich wird Elektro traditionell in einem flüchtigen Lösungsmittel, das die Lebensfähigkeit des Proteins 28 beeintrachtigt wird daher beibehalten Bioaktivität des Proteins berücksichtigt werden. Dieser Ansatz befasst sich speziell die Kombination von mechanischen, topographische, chemische und Klebesignale, um eine abstimmbare Gerüst für periphere Nerven Wachstum zu schaffen. Gerüstmechanik genau gesteuert durch Synthetisierenmethacrylierten Hyaluronsäure (HA). Die Methacrylierung Websites verwendet werden, um reaktive Vernetzer Foto anhängen. Das vernetzte Material ist nicht mehr wasserlöslich und wird ausschließlich durch Enzyme 29 gebrochen. Die Menge des Vernetzungs ändert die Abbaurate, Mechanik und anderen physikalischen Eigenschaften des Materials. Verwendung von HA mit 30% Methacrylierung, das einen Zugmodul von ca. 500 Pa hat, erzeugt ein weiches Substrat, das in der Nähe der Mutter Mechanik des Nervengewebe ist, und wird typischerweise durch Neuronen 26,29 bevorzugt. Elektrospinning auf eine rotierende Spindel wird verwendet, um ausgerichteten Fasern für eine topographische Cue erstellen. Mit Elektro zusammen mit Mikrosphären bietet chemische Signale innerhalb des Gerüsts über längere Zeiträume. Um Neuritenwachstum Mikrokügelchen, die NGF verwendet werden, um das chemische Signal erzeugen unterstützen. Anders als die meisten elektro Materialien HA ist in Wasser löslich, so dass die NGF nicht aggressiven Lösungsmitteln bei der Produktion auftreten. Um eine Haft Signal hinzuzufügen, das SCAffold mit Fibronectin beschichtet ist. Das fertige System enthält alle vier oben beschriebenen Arten von Signalen: soft (mechanisch) ausgerichtet (topographische) Fasern mit NGF freiMikroSphären (chemischen) mit Fibronektin (Klebstoff) beschichtet. Herstellung und Prüfung des Systems wird in diesem Protokoll beschrieben. Das Verfahren beginnt mit der Herstellung der Mikrokugeln mit einer Wasser-in-Öl-in-Wasser-Doppelemulsion. Die Emulsion wird mit einem Tensid, Polyvinylalkohol (PVA) stabilisiert. Die innere Wasserphase enthält das Protein. Wie es zu der Ölphase zugegeben wird, die das in Dichlormethan (DCM) gelöst PLGA Schalenmaterial, erzeugt das Tensid eine Barriere zwischen den Phasen Schutz des Proteins aus der DCM. Diese Emulsion wird als in einem anderen Wasserphase PVA enthält, um die äußere Oberfläche der Mikrokügelchen zu schaffen dispergiert. Die stabile Emulsion wird gerührt, um das DCM verdampft. Nach dem Spülen und Gefriertrocknen Sie mit dem trockenen Mikro Fortsetzung gelassen werdenaining des Proteins. Nachdem die Mikrosphären abgeschlossen werden, sind sie bereit, in Gerüste versponnen werden. Zuerst wird die Elektro Lösung herzustellen. Die Viskosität der Lösung ist wichtig, um die richtige Faserbildung. Lösungen von reinem HA diese Anforderung nicht zu erfüllen; PEO wird als Trägerpolymer zur Elektro ermöglichen zugegeben. Die Mikrokugeln werden in die Lösung und elektro was eine faserige Gerüst mit Mikrokugeln gleichmäßig verteilt zugegeben. Sobald die Produktion abgeschlossen ist, sollte das Protein getestet werden, um ihre Lebensfähigkeit zu überprüfen. Um dies zu tun, kann eine Primärzelle, die NGF reagiert werden. Dieses Protokoll verwendet Hinterwurzelganglien (DRG) 8-10 Tage alten Hühnerembryonen. Die Zellbündel werden auf das Gerüst Mikrosphären mit NGF oder diejenigen, die leer sind gefüllt ausgesät. Wenn die NGF noch lebensfähig ist, sollten Sie verbesserte Neuritenwachstum auf den NGF enthält Gerüste sehen. Wenn die NGF ist nicht mehr lebensfähig, es wirdNeuriten zu verlängern nicht fördern und sollte ähnlich der Steuerung angezeigt. Das hierin beschriebene Verfahren wird genau auf neuronale Stütz konzentriert, jedoch mit einfachen Modifikationen der Material, Elektrospinnverfahren und Proteinen kann das System für unterschiedliche Zell-und Gewebetypen optimiert werden.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>BASF</td><td>24650-42-8</td><td>Vor Licht schützen</td></tr><tr><td>PEO 900 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>189456</td><td></td></tr><tr><td>Methacryloxethylthiocarbamoyl rhodamin B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23591-100</td><td>Bereiten Sie die Stammlösung in der DMSO-Spritzenpumpe</td></tr><tr><td></td><td>vor KD Scientific</td><td>KDS100</td><td></td></tr><tr><td>Stromquelle</td><td>Gamma High Voltage</td><td>ES30P-5W</td><td></td></tr><tr><td>Motor</td><td>Triem Electric Motors, Inc</td><td>0132022-15</td><td>Muss an einen speziell angefertigten Dorn angeschlossen</td></tr><tr><td>werden Drehzahlmesser Network</td><td>Tool Warehouse</td><td>ESI-330</td><td>Zur Überwachung der Dorngeschwindigkeit</td></tr> <tr><td>verwendenOmnicure UV Spot Cure System mit Kollimationsadapter</td><td>EXFO</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>Nadeln</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-825-16H</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylalkohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136-250G</td><td></td></tr><tr><td>Isoporopylalkohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9703-100</td><td></td></tr><tr><td>BSA-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>080M7400</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Nervenwachstumsfaktor (NGF)</td><td>R& D Systems</td><td>1156-NG</td><td></td></tr><tr><td>65:35 Polymilchsäure-Glykolsäure (PLGA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001554270</td><td></td></tr><tr><td>Dichlormethan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34856-2L</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie (Bradford) Proteinassay</td><td>Thermo Scientific</td><td>1856209</td><td></td></tr><tr><td>3-(Trimethoxysilyl)propylmethacrylat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001558456</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Fisher Scientific</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

elektro growth factor releasing mikrosphären in fasergerüste

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

Dieses Verfahren beschreibt eine Methode zur Herstellung eines facettenreichen Substrats, um das Wachstum von Nervenzellen zu steuern. Dieses System integriert mechanische, topographische, adhäsive und chemische Signale. Die mechanischen Eigenschaften werden durch die Art des Materials gesteuert, das zur Herstellung der elektrogesponnenen Fasern verwendet wird. In diesem Protokoll verwenden wir 30% methacrylierte Hyaluronsäure (HA), die einen Zugmodul von ~500 Pa hat, um ein weiches faseriges Gerüst herzustellen. Durch das Elektrospinnen auf einen rotierenden Dorn werden ausgerichtete Fasern erzeugt, die einen topografischen Hinweis erzeugen. Die Haftung wird durch die Beschichtung des Gerüsts mit Fibronektin erreicht. Die primäre Herausforderung, die hier angesprochen wird, besteht darin, über längere Zeiträume ein chemisches Signal über die gesamte Tiefe des Gerüsts zu liefern. Dieses Verfahren beschreibt die Herstellung von Poly(milchsäure-co-glykolsäure) (PLGA)-Mikrosphären, die den Nervenwachstumsfaktor (NGF) enthalten, und die direkte Imprägnierung des Gerüsts mit diesen Mikrosphären während des Elektrospinnprozesses. Aufgrund der rauen Produktionsumgebung, einschließlich hoher Scherkräfte und elektrischer Ladungen, wird die Lebensfähigkeit des Proteins nach der Produktion gemessen. Das System sorgt für eine Proteinfreisetzung über 60 Tage und fördert nachweislich das Wachstum der primären Nervenzellen.

Mikrokugeln 50 ± 14 um im Durchmesser mit einer über 85% Protein Kapselung wurden konsequent produziert und elektro in Gerüsten. Größe wurde durch bildgebende Proben von Mikrosphären aus drei verschiedenen Produktionschargen bestimmt. Die Bilder, in denen auf einem optischen Mikroskop und Längen, wo gemessen mit handelsüblichen Labor-Software erfasst. Figur 1 zeigt ein Histogramm der Größenverteilung. Verkapselung Rate wurde ebenfalls aus drei separaten Mikrosphärenansätzen getestet, durch die Quantifiz...

Dieses Protokoll kombiniert Elektrospinnen und Mikrosphären, um Gewebegerüste zu entwickeln, die Neuronen lenken. Der Nervenwachstumsfaktor wurde in PLGA-Mikrosphären eingekapselt und in faserige Gerüste aus Hyaluronsäure (HA) elektrogesponnen. Die Proteinbioaktivität wurde getestet, indem die Gerüste mit den Spinalwurzelganglien des Primärkükens besät und 4-6 Tage lang kultiviert wurden.

Elektro Growth Factor Releasing Mikrosphären in Fasergerüste

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein vielseitiges Umfeld zur Unterstützung des Nervenwachstums und der Nervenreparatur zu schaffen. Dies wird erreicht, indem zunächst Wachstumsfaktoren in abbaubare Mikrosphären eingeschlossen werden. Der zweite Schritt besteht darin, das Trägermaterial für den Hauptteil des Umfelds vorzubereiten.Anschließend werden die Mikrosphären und das Trägermaterial vereint und zu einem ausgerichteten faserigen Gerüst elektrogesponnen. Im letzten Schritt wird das Gerüst mit neuronalen Zellen des dorsalen Wurzelganglions von Hühnerembryonen getestet. Letztendlich kommt die Immunfluoreszenzmikroskopie zum Einsatz, um zu zeigen, dass das Wachstum und die Ausrichtung der Neuriten im Vergleich zu Kontrollen beschleunigt sind.Obwohl dieses System für Nervengewebe konzipiert ist, könnte es bei geringfügigen Änderungen der verwendeten Proteine und Materialien auch auf verschiedene Gewebetypen angewendet werden, einschließlich Herz, Lunge und Knochen. Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, bereiten Sie die notwendigen Reagenzien vor: 2 % und 0,5 % (Gewicht pro Volumen) Lösungen von Polyvinylalkohol oder PVA in entionisiertem Wasser, eine Lösung von 2 % (Volumen pro Volumen) Isopropanol und entionisiertem Wasser sowie eine wässrige Lösung des gewünschten hydrophilen Proteins. Geben Sie 40 Milliliter der 0,5 %-PVA-Lösung in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und stellen Sie es beiseite. Lösen Sie in einem kleinen Gefäß 300 Milligramm 65 zu 35 Polylactid-co-glycolid-Säure oder PLGA in drei Millilitern Dichlormethan auf.Ein Vortex-Mischer kann verwendet werden, um die Auflösung von PLGA zu beschleunigen, indem 200 µL Proteinsolution und vier µL einer 2 %igen PVA-Lösung kombiniert werden. Geben Sie die Protein-PVA-Mischung in die PLGA-Lösung. Die Lösungen bleiben weitgehend getrennt.Stellen Sie das Vial in ein Becherglas mit Eiswasser und verwenden Sie dazu einen W ator mit etwa 10 Watt; rühren Sie die Lösung fünf bis 10 Sekunden lang um, bis eine gleichmäßige, cremig-weiße Emulsion entsteht. Gießen Sie die Emulsion in die zuvor vorbereitete 50-Milliliter-Röhrchen mit 0,5 % PVA. Mischen Sie die Lösung etwa 20 Sekunden lang mit hoher Geschwindigkeit in einem Vortex-Mischer.Die Lösung wird trüb erscheinen. Übertragen Sie die Emulsion in einen 200-Milliliter-Becher und stellen Sie diesen für zwei Minuten auf eine Rührplatte mit 350 U/min. Geben Sie 50 Milliliter 2 %iger Isopropylalkohollösung in den Becher auf der Rührplatte.Lassen Sie die Mischung mindestens eine Stunde weiter unter Rühren, damit das Chloromethan verdampfen kann und das PLGA aushärtet. Anschließend überführen Sie die Mikrosphären-Lösung in Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren sie drei Minuten lang mit 425 ×g. Die Mikrosphären sammeln sich am Boden des Röhrchens und erscheinen weiß. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand über den Mikrosphären und lagern Sie ihn in einer 500-Milliliter-Flasche. Spülen Sie die Mikrosphären mit entionisiertem Wasser, indem Sie jedes Röhrchen zu drei Vierteln füllen und schütteln, um die Mikrosphären in der Flüssigkeit erneut zu verteilen. Wiederholen Sie die Zentrifugation, das Abheben des Überstandes und das Spülen der Mikrosphären mit entionisiertem Wasser insgesamt viermal nach dem letzten Spülvorgang. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie ihn in die 500-Milliliter-Flasche mit den anderen Proben.Gefrieren Sie die in den Zentrifugenröhrchen gesammelten Mikrokugeln über Nacht bei minus 20 Grad Celsius und lyophilisieren Sie sie anschließend mindestens 24 Stunden lang. Die folgende Elektrospinnlösung sollte zuvor in destilliertem Wasser hergestellt werden: 2 % Gewicht pro Volumen Methacrylierte Hyaluronsäure oder Miha, 3 % Gewicht pro Volumen 900 Kilodalton Polyethylenglykol oder PEO und 0,05 % Gewicht pro Volumen Photoinitiatorlösung.Nachdem das gewünschte Volumen der Elektrospinnlösung hergestellt wurde, werden Mikrokügelchen in der gewünschten Konzentration bis zu 400 Milligramm pro Milliliter hinzugefügt. Die Lösung wird so lange auf einem Vortex-Mischer gemischt, bis sich die Mikrokügelchen gleichmäßig in der Lösung verteilt haben. Danach wird die Lösung in eine Spritze überführt und eine sechs Zoll lange stumpfe Nadel mit 18 Gauge angebracht.Platzieren Sie die Spritze in einer Spritzenpumpe und stellen Sie sie auf eine Abgabe von 1,2 Milliliter pro Stunde ein. Wickeln Sie eine Schicht Aluminiumfolie auf den Bolzen. Dies ermöglicht eine einfache Reinigung und Aufbewahrung des fertigen Gerüsts.Ein rotierender Mandrel wird verwendet, um ausgerichtete Fasern herzustellen. Verbinden Sie den Erdungsdraht einer Hochspannungsquelle mit der Sammelvorrichtung. Verbinden Sie die positive Leitung mit der Nadel, um ein erfolgreiches Elektrospinnen sicherzustellen.Es ist sehr wichtig, zu überprüfen, ob alle Anschlüsse und Einstellungen korrekt sind. Starten Sie das Polymerpumpen, und sobald die Lösung am Ende der Spritze sichtbar ist, schalten Sie die Spannungsquelle ein und stellen die Spannung auf 24 Kilovolt ein. Führen Sie die Lösung so lange durch, bis die gewünschte Gerüstdicke erreicht ist.Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, schalten Sie die Spannungsquelle und die Spritzenpumpe aus. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, befestigen Sie die entsprechenden Deckgläser mit abnehmbarem doppelseitigem Klebeband im Sammelbereich des Elektrospinnapparats, bevor das Elektrospinnen erfolgt. Das Aufbringen auf die Deckgläser erleichtert das Handling und die Untersuchung nach dem Elektrospinnen bis zur gewünschten Dicke.Wie im vorherigen Videosegment gezeigt, die Deckgläser vorsichtig vom Dorn entfernen. Die mit dem Gerüst beschichteten Deckgläser in eine klare Stickstoffkammer geben und sicherstellen, dass sämtlicher Sauerstoff entfernt wird. Die Kammer und das Gerüst 15 Minuten lang einer 10 Milliwatt pro Quadratzentimeter starken 365 Nanometer-Lichtquelle aussetzen.Nach der Vernetzung bringen Sie die Deckgläser in eine entsprechend große Muldenplatte ein. Stellen Sie sicher, dass die Seite mit dem Gerüst nach oben zeigt. Geben Sie 100 bis 200 Mikroliter Medium vorsichtig auf jedes Gerüst in der Muldenplatte.Platzieren Sie ein dorsales Wurzelganglion oder DRG auf jedem Scaffold in der Mediumstropfen. Bei einem dicken Scaffold kann mehr Medium erforderlich sein. Das DRG muss vollständig untergetaucht und nicht schwimmend sein.Die Gerüste und die DRG bei 37 Grad Celsius vier Stunden lang inkubieren, um die Anheftung der Zellen an das Gerüst zu ermöglichen. Danach das Medium bis zur geeigneten Höhe für die Vertiefung auffüllen. Die Platte zurück in den Inkubator stellen und vier bis sechs Tage lang nach der Inkubationszeit inkubieren.Entfernen Sie vorsichtig das Medium aus jedem Well und waschen Sie einmal mit PBS. Fixieren Sie die Zellen 30 Minuten lang mit 4 % (Gewicht pro Volumen) Paraformaldehyd. Färben Sie anschließend die Zellen für Neurofilamente und Kerne gemäß einem etablierten Protokoll. Um die Zellen mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops zu visualisieren, stellen Sie die Multiwell-Platte auf den Objekttisch des Mikroskops und suchen Sie die Zellmasse unter Verwendung der Filter- und Anregungseinstellungen für dpi. Sobald die Zelle identifiziert ist, wechseln Sie den Filter zu zi. Um die ausgewachsenen Neuriten zu visualisieren, verwenden Sie die Stitch-Funktion des Mikroskops, um so viele Bilder wie nötig aufzunehmen und zu kombinieren, um die gesamte Struktur zu erfassen.Wiederholen Sie dies für dpi-, fite- und Brightfield-Mikrokugeln. Mit diesem Protokoll wurden durchschnittlich 50 ± 14 Mikrometer durchmessende Mikrokugeln mit einer Proteineinschließungsrate von über 85 % konsistent hergestellt und zu Scaffolds elektrogesponnen. Dieses fluoreszierende Bild zeigt repräsentative Mikrokugeln mit Rhodamin D im PLGA-Mantel und eingeschlossenen BSA-Fits im Inneren.Zur Beurteilung der Einschließung wurden die Mikrokugeln mit BSA gefüllt und über einen Zeitraum von mehr als 60 Tagen auf die Freisetzung von Protein mittels Bradford-Protein-Assay untersucht. Die Freisetzung beginnt mit einem initialen Burst und setzt sich fort, während die Mikrokugeln nach dem Elektrospinnen abgebaut werden. Die Mikrokugeln sind in der gesamten dreidimensionalen faserigen Struktur sichtbar.In diesem REM-Bild des vollständigen Gerüsts sind die Kugeln in mehreren Schichten sichtbar, die durch Pfeile markiert sind. Dieses Bild mit hoher Vergrößerung zeigt eine Mikrokugel mit den Nanofasern des darüberliegenden Gerüsts.Die Rückenganglien oder DRG wurden verwendet, um die Lebensfähigkeit von Nervenwachstumsfaktor oder NGF in den Mikrokügelchen innerhalb des Gerüsts zu testen. Hier sind DRG auf einem Gerüst mit Mikrokügelchen positioniert. Beladen mit NGF wird neben einer Mikrokügelchen ohne Protein gezeigt, wobei die längeren Neuriten-Ausläufer, die von den DRG auf dem NGF-Gerüst ausgehen, darauf hinweisen, dass das NGF funktionsfähig ist und Wachstum fördern kann.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Proteine in Mikrosphären einschließt und diese in faserige Gerüste integriert.

electrospinning-growth-factor-releasing-microspheres-into-fibrous

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Der Prozess der Elektrospinnen Polymere für Tissue Engineering und Zellkulturen ist in diesem Artikel behandelt. Insbesondere wird das Elektrospinnen von photoreaktiven Makromere mit zusätzlichen Verarbeitungsmöglichkeiten Photostrukturierungsverfahren und Multi-Polymer-Elektrospinnen beschrieben.

Elektrospinnen Faserige Polymer Gerüste für Tissue Engineering und Cell Culture

Ausgerichtet elektroversponnenen Fasern direkt das Wachstum von Neuronen in vitro und stellen eine potentielle Komponente der Nervenregeneration Gerüsten. Wir beschreiben ein Verfahren zur Herstellung elektrogesponnenen Fasersubstrate und das Serum-freie Kultur von primären Ratten-E15 sensorischen (DRG) und motorischen Neuronen. Visualisierung von Neuronen durch Immunzytochemie ist ebenfalls enthalten.

The Culture of Primary Motor und sensorischen Neuronen in definierten Medien auf Elektrogesponnene Poly-L-Lactid Nanofiber Gerüste

Elektrogesponnene Gerüste können Post-Production für das Tissue Engineering-Anwendungen verarbeitet werden. Hier beschreiben wir Methoden für die Spinnerei komplexe Gerüste (durch aufeinander folgende Spinning), für die Herstellung dicker Gerüste (durch Multi-Schichtung mit Hitze und Dunst Glühen), für das Erreichen Sterilität (aseptische Produktion oder Postproduktion Sterilisation) und für die Erreichung entsprechenden biomechanischen Eigenschaften.

Postproduction Verarbeitung von Elektrogesponnene Fasern für Tissue Engineering

Biokompatiblen pH anspricht Sol-Gel-Nanosensoren können in Poly (milchsäure-co-Glykolsäure) (PLGA) elektro Gerüste eingebracht werden. Die hergestellten Selbstberichts Gerüste können für die in situ Überwachung von Mikroumgebungsbedingungen, während die Kultivierung von Zellen auf dem Gerüst verwendet werden. Dies ist vorteilhaft, da die 3D-Zellkonstrukt kann in Echtzeit, ohne den Versuch zu stören überwacht werden.

Selbstberichts Gerüste für 3-Dimensional Cell Culture

Eine Methode, um komplexe Nanofasern und Nanostrukturen aus einzelnen oder mehreren extrazellulären Matrixproteinen zu erhalten, wird beschrieben. Diese Methode verwendet Protein-Oberflächen-Wechselwirkungen zu frei stehenden Materialien auf Proteinbasis mit abstimmbaren Zusammensetzung und Architektur für den Einsatz in einer Vielzahl von Gewebe-und Biotechnologie-Anwendungen zu erstellen.

ECM-Protein-Nanofasern und Nanostrukturen Engineered Mit Oberflächen initiierte Versammlung

Synthese und Herstellung von elektro langen Fasern sich über eine größere Ablagefläche über einen neu gestalteten Sammler aus einem neuartigen biologisch abbaubaren Polymer namens Poly (Glycerin-Dodecanoat) (PGD) wurde berichtet. Die Fasern waren in der Lage, das Wachstum von pluripotenten Zellen aus Maus-Stammzellen zu unterstützen.

Elektro Faser-Gerüste von Poly (Glycerin-dodecandioat) für Ingenieurnervengewebe aus embryonalen Stammzellen der Maus

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur elektroNanoFaserGerüste mit abgestuften Organisation der Fasern herzustellen und zu erforschen ihre Anwendungen bei der Regulierung der Zellmorphologie / Ausrichtung. Farbverläufe in Bezug auf physikalische und chemische Eigenschaften der Nanofasergerüste bieten eine Vielzahl von Anwendungen im Bereich der Biomedizin.

Elektronanofasergerüste mit Abstufungen in Fiber-Organisation

Fortschritte in der Biomaterialtechnologie ermöglichen die Entwicklung dreidimensionaler Konstrukte vom Typ Mehrzelle. Wir haben Elektrospinning-Protokolle entwickelt, um drei einzelne Gerüste herzustellen, um die Hauptstrukturzellen der Atemwege zu kultivieren und ein 3D-In-vitro-Modell der Bronchiolenwand der Atemwege zu erstellen.

Anpassung der Elektrospinnverfahren für einen Dreischicht stellen drei einzigartige Umgebungen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Atemwegswand

Dieses Protokoll dient als ein umfassender Leitfaden, Gerüste über Elektrospinnen mit Polymer zu fabrizieren in eine direkte Schreibmodus schmilzt. Wir beschreiben den Prozess systematisch und definieren Sie die entsprechenden Parameter-Einstellungen für gezielte Gerüst Architekturen zu erreichen.

Elektrospinnen Schreiben von dreidimensionalen Poly(ε-caprolactone) Gerüste mit steuerbaren Morphologien für Tissue Engineering Anwendungen zu schmelzen

Dieser Artikel beschreibt die Technik der Expansion einer traditionellen, zwei-Dimension (2D) Electrospun Nanofaser-Matte in leska 3 Dimension (3D) durch die Druckentlastung der unterkritischen CO2 Flüssigkeit. Diese erweiterte Gerüste sind 3D, eng mimischen zellulären Nanotopographic Hinweise, und bewahren die Funktionen der biologischen Moleküle innerhalb der Nanofasern gekapselt.

Expansion des zwei-Dimension Electrospun Nanofaser Matten in drei Dimension Gerüste

Lernen Sie die Herstellung von Wachstumsfaktor-freisetzenden Mikrosphären in faserigen Gerüsten durch Elektrospinnen. Diese Methode unterstützt Nervenwachstum und -reparatur mit primären Hühner-Dorsalwurzelganglien.

Elektro Growth Factor Releasing Mikrosphären in Fasergerüste

Weitere Videos entdecken