Name: A Step Beyond BRET: Fluoreszenz von Unbound Anregung von Lumineszenz (FUEL) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Lernen Sie die FUEL-Technik zur Erzeugung roter Photonen durch biolumineszente Bakterien und lumineszente Nanopartikel. Diese Methode erweitert die Möglichkeiten der Fluoreszenzforschung erheblich.

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Die Autoren möchten ihre Dankbarkeit für die finanzielle Unterstützung aus dem Pasteur-Stiftung in New York, um JD, AH erstrecken (JD, CS, CS), der EU-FP7-Programm &quot;Automation&quot; (SLS), dem Institut Carnot Programm 11 ( , AR, RT, SLS) und Projekt IMNOS (RT, SLS), der Conny-Maeve Charitable Foundation (SLS), die European Masters in Molecular Imaging (IT), der Region Ile-de-France-Programme MODEXA (SLS), SESAME (SLS) und DimMalInf (SLS, RT), der ANR-Programm Grandes Investissement de l&#39;avenir Infrastrukturen Nationales de Biologie-Santé: Frankreich LifebioImaging (FLI) Frankreich Life Imaging (RT, SLS), Frankreich Bioimaging (JD, SLS) und der Institut Pasteur in Paris. Außerdem möchten die Autoren zu danken für Reagenzien, José Bengoechea und Herbert Schweizer. Weiterhin würde die Autoren gerne Cindy Fevre, die die Antikörper erzeugt danken.

1. Reagenzien <ol><li> Kauf oder Leuchtbakterien entwickeln und geeignete Kulturmedien wie modifizierte Escherichia coli die Lux ABCDE 21 exprimieren, Vibrio fischeri, Photobacterium sp. Klebsiella pneumoniae 22. </li><li> Bereiten physiologischer Kochsalzlösung (0,9% NaCl) und Kultur-Media-Lösungen nach Standardrezepturen. E. coli und K. pneumoniae wurden in Luria-Bertani (LB) bei 37 º C gezüchtet und V. und Photobacterium fischeri sp in LB, ergänzt mit 0,5 M NaCl bei 22 ° C. </li><li> Kauf erwerben oder Fluoreszenzsonden wie Q-Tracker 705 (40 nm Durchmesser, die als QD705), Q-Tracker 800 (40 nm Durchmesser, die als QD800), Fluoreszenz (40 nm Durchmesser) und nicht fluoreszierenden Polystyrol-Mikrokügelchen ( 48 nm Durchmesser) und herkömmliche Fluoreszenzfarbstoffe. </li><li> Bereiten Sie die notwendigen Reagenzien für die bakterielle Kennzeichnung. </li><li> Stellen Sie Zugriff aufeine ganze Tier Biolumineszenz-Bildgeber, wie beispielsweise ein IVIS Spectrum, ist, dass in der Lage-Erfassungssignal unter einer Vielzahl von Emissionswellenlängen und Belichtungszeiten. Ein Plattenlesegerät für Biolumineszenz-Messungen wird für die meisten der hier beschriebenen Experimente ausreichen. </li></ol> 2. Zusammenfassung der Grund FUEL <ol><li> Ausgehend von einzelnen Kolonien auf Standard-Kulturplatten, Start-Nacht-Kulturen von Leuchtbakterien. Hier V. fischeri verwendet. </li><li> Der Tag des Experimentierens, initiieren neue Subkulturen und es ihnen ermöglichen, den Fortschritt, bis eine OD 600 von 1 bis 1,5 erreicht. Um vergleichbare Ergebnisse zu erzielen ist es am besten, um Bakterien in ähnlichen Wachstums Staaten, in denen sie intensive Signale erzeugen zu verwenden. Dies kann, indem die OD 600 konstant gewährleistet werden. </li><li> Kombinieren von 100 &amp;mgr; l Aliquots von jeweils entweder 5 ul QD705 oder physiologischer Kochsalzlösung (PS), und dann in 895 ul PS hinzufügen in standard spektroskopische Küvetten. Legen Sie die gefüllte Küvetten in das IVIS Spectrum und die Messungen unter den entsprechenden Filtersätze. Hierbei wurde die 710 bis 730 nm-Emissionsfilter verwendet. </li></ol> 3. FUEL über unterschiedliche Entfernungen <ol><li> Füllen zwei reduzierten Volumen (1 ml) aus Kunststoff photometrischer Küvetten mit entweder 50 ul QD705 oder 97,2 ul nicht-fluoreszierenden 48 nm Polystyrolmikrosphären in einem Gesamtvolumen von 1 ml PS. Dies gewährleistet ähnliche feste Oberfläche pro Volumen zwischen den beiden Einheiten. </li><li> Bereiten Sie eine Lichtquelle Küvette durch einschließen eine dritte Küvette mit Standard-Schwarz-Band oder einem anderen undurchsichtigen Material in der Lage ist, Licht zu blockieren. Zwei identische optische Fenster sorgfältig vorzubereiten auf gegenüberliegenden Seiten der Küvette. </li><li> Legen Sie die zuvor gefüllten Küvetten direkt auf jeder Seite der Lichtquelle Küvette. In einer 1 ml-Aliquot V. fischeri oder andere Kultur (dh Leucht E. coli oder Photobacterium sp) aus einer neuen Subkultur in die Lichtquelle einsetzen und decken Sie es mit einem undurchsichtigen Material, wie schwarzes Papier, jede leichte Verschmutzungen zu reduzieren. </li><li> Visualisieren Sie die drei Küvetten unter den entsprechenden Emissionsfilter wie der Gesamt Licht und 710-730 nm Emissionsfilter, mit Belichtungszeiten von 10, 30 und 30 Sekunden auf. </li><li> Neupositionierung sowohl externe Küvetten bei äquivalenten weiteren Abständen von der zentralen Küvette, und dann wieder zu visualisieren. Wiederholen, bis eine endgültige face-to-face (Zentral reduziert Volumen Küvette) Abstand von 3 cm erreicht. Bei jedem Schritt wird ein Fluoreszenzbild erhalten (450-480 nm Anregung, 710 bis 730 nm Emission), um die Lage QD705 validieren. </li></ol> 4. Untersuchung Mögliche FUEL Pairs <ol><li> Füllen zwei reduzierten Volumen Küvetten mit 1 ml Lösung, die entweder ein Fluorophor oder eine fluoreszierende Nanopartikel von Interesse in einem, oder PS und PS mit nicht-fluoreszierende Nanopartikel als negative Kontrolle in die andere. In the Arbeit zeigte hier eine Vielzahl von potentiellen Handel erhältlich FUEL Fluorophore und Fluoreszenz-Nanopartikel wurden untersucht, wie in Tabelle 1 dargestellt. </li><li> In einer 1 ml-Aliquot frisch V. fischeri oder andere Leuchtbakterien zu einem verdunkelten dritten Küvette mit zwei physikalisch gleiche optische Fenster auf gegenüberliegenden Seiten entfernt. Decken Sie die Küvette mit einem undurchsichtigen Substanz, wie ein Stück schwarzes Papier. </li><li> Bei einem kurzen, aber gleichen Abstand Platz die beiden reduzierten Volumen Küvetten auf beiden Seiten des abgedunkelten Küvette und visualisieren unter den entsprechenden Filter. Hier ist ein Abstand von 0,7 cm wurde verwendet. Wiederholen Sie mit den anderen Fluorophore. </li></ol> 5. Gezielte FUEL <ol><li> Bereiten Sie speziell auf die Leuchtbakterien biotinylierten Antikörpern. Zum Beispiel ist hier primären Antikörper spezifisch an K. pneumoniae (α-Kp) wurden mit einer Lösung, die EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin biotinyliert. </li&gt; <li> Überschüssiges Reagenz von den Antikörpern mit Entsalzungssäulen unter Zentrifugation (1500 × g) für 2 min. </li><li> Verwenden Sie ein Standard-Bradford-Test, um die Proteinkonzentration zu bestimmen und bestimmen den Grad der Antikörper Biotinylierung von HABA-Assay. </li><li> Erhalten, die α-KP-Biot biotinylierten Antikörpers (Ab) Chargen durch Mischen von 100 &amp;mgr; l (10 mM, in 1x PBS) mit 40 ul α-Kp Antikörper, was zu einer endgültigen Substitutionsgrad von 16 Biotinresten pro Ak und einem abschließenden Proteinkonzentration von 10 mg ml -1. </li><li> Die Verwendung mehrerer Kulturen über Nacht zu replizieren, zielen die gewaschenen Bakterien, die mit den oben genannten Antikörpern nach dem entsprechenden Protokoll. <ol><li> Insbesondere, waschen Sie die K. pneumoniae in 1x PBS und Resuspendieren in 1 × PBS auf eine OD von 4 (ca. 4 × 10 8 CFU ml -1 OD -1). </li><li> Für jede Wiederholung, Inkubation 100 ul PBS, α -Kp Antikörper (10 ul α-KP-biotB oder 10 ul PBS für die Kontrolle) und 100 &amp;mgr; l Zellen für 90 min bei 30 ° C. In 1x PBS in 196 ul PBS Waschen Sie die Zellen dreimal, und resuspendieren. </li></ol></li><li> Beschriften Sie die Zellen mit dem QD705 Streptavidin-Konjugat und teilen sie in zwei gleichwertige Bände. </li><li> Drei mal waschen und dann eine Lösung resuspendieren sie in die entsprechende Lautstärke. </li><li> Verteilen von 100 &amp;mgr; l der gewaschenen und ungewaschenen Lösungen in einzelne Vertiefungen einer schwarzen 96-Well-Platte. Messen Sie die resultierende Lumineszenz unter der Gesamt Licht, 490-510 nm und 710-730 nm-Filter. Fluorophorkonzentration kann mit 450 bis 480 nm Anregungs-und 710 bis 730 nm Emission bestimmt werden. </li></ol>

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Die Autoren erklären, konkurrierenden Interessen. JD, SB, KLR und SLS beigetragen Europäischen Patent EP10290158.4 und der Weltorganisation für geistiges Eigentum Patentanmeldung WO/2011/117847.

Die fundamentale Demonstration der FUEL kann einfach durch Mischen mit Leuchtbakterien fluoreszierende Nanopartikel oder Quantenpunkte erreicht werden. Die beiden Elemente werden physisch getrennt und bleiben über jeden effizienten RET Distanz. Schwieriger ist die Kraftstoffsignal Optimierung sowohl in vitro als auch in vivo. Unter in vitro Bedingungen, mit und ohne einem vorhandenen optischen Absorber, üblicherweise die Zugabe eines Überschusses Fluorophor ausreicht, um das Brennstoffverhalten zu maximieren. Bei hohen Konzentrationen Phänomene wie statische oder Stoßlöschung kann zu einem Verlust der Fluoreszenzsignal führen. Durchführen einer Verdünnungsreihe durch unabhängiges Variieren der Konzentration der Leuchtquelle und dem Fluorophor wird helfen, die gewünschten Konzentrationen zu optimieren. Der Aufbau und die Optimierung von FUEL unter in vivo-Konzentrationen ist viel schwieriger und muss auf einer Fall-zu-Fall-Basis behandelt werden. Es kann schwierig sein, ein Co erstellenndition wo die fluoreszierenden Einheit kann optisch durch die Leuchtquelle genutzt werden. Als solche kann beginnend mit Injektionen direkte Zusammenarbeit der beiden Gruppierungen geben Auskunft über den Erfolg der FUEL unter optimalen Bedingungen. Standard-Protokolle existieren zum Etikettieren Bakterien und eukaryontische Zellen mit fluoreszierenden Einheiten wie die Alexa Serie und QD. Oft erfordert dies Funktionalisierung von Oberflächen oder Aktivierung mit Antikörpern, die zu unerwünschten Wirkungen wie die Lebensfähigkeit der Zellen reduziert oder verändert Stoffwechselaktivität führen kann. Um dies zu überwinden, ist es wichtig zu bestimmen, die optimale Menge des Antikörpers oder Aktivierungsmittel benötigt, die zellulären Störungen minimiert und maximiert die Fluoreszenzmarkierung. Die Verwendung von Quantenpunkten ist wegen ihrer charakteristischen breiten Anregungsspektren, schmal und abstimmbare Emissionsspektren und der Möglichkeit, eine große Stokes-Verschiebung von Vorteil. Allerdings können QDs zytotoxischen und nicht wünschenswert sein kann in einigen Fällen. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; FUEL ist ein Phänomen, das in vielen Experimenten BRET 13 vorhanden ist, und ist für eine Vielzahl von Lumineszenz-und Fluoreszenzquellen. Bis jetzt wurden die Photonen von FUEL resultierenden als das Produkt von nicht-spezifischen Wechselwirkungen oder einem unglücklichen Hintergrundsignal von schlecht gestalteten BRET Experimente ergeben. Es ist nur mit der Art von Experimenten zeigte, dass hier konnten wir die Nützlichkeit dieses unerwünschte Signal zu identifizieren. In den gezeigten Beispielen verhalten sich die Leuchtbakterien als diffuses Anregungsquelle, die zur Auslösung einer Standardfluoreszenzantwort von einer Vielzahl von Fluoreszenzeinheiten. Außerdem ist es aufgrund der erheblichen Arbeitsabstand, ist es sicher zu dem Schluss, dass, während Kraftstoff kann ohne das Auftreten von BRET konstruiert werden, im allgemeinen BRET kann nicht ohne eine Beteiligung FUEL beobachtet werden. Wichtig ist, dass aufgrund des Fehlens eines Zielanforderung kann Brennstoff verwendet, um die räumliche Lücke zwischen BRET und c besteht abzudeckenonventional ganze Tier-Bildgebungsverfahren.

Die gentechnische Veränderung von Organismen wie Viren 1, 2, 3 Bakterien oder kleine Säugetiere 4 bis entweder induzieren oder konstitutiv Biolumineszenz, ist sehr erfolgreich und weithin demonstriert 5-7. Biolumineszenz in vivo eine chemilumineszierende Reaktion, die natürlich vorkommende Reagenzien, hat den Vorteil der Erzeugung von Licht, ohne die Notwendigkeit für eine externe Lichtquelle. Als solches ist die Biolumineszenz-Bildgebung nicht von den gemeinsamen Nachteile der automatischen und nicht-spezifische Signal von Fluoreszenz-Bildgebungs 8 gefunden leiden. Folglich hat die Biolumineszenz ein signifikantes Signal-zu-Rausch-Verhältnis, da jeder erfaßte Signal vom beabsichtigten Quelle stammt ausschließlich. Während viele Modelle haben die lux-Operon aus Photorhabdus luminescens (Emissionsmaximum zwischen 480 und 490 nm zentriert) für in-vitro-und in vivo-Anwendungen 9 genutzt, deren Verwendung in kleinen mammALS ist aufgrund der Natur der Abbildungsbedingungen problematisch; der durchdringenden Existenz von optischen Absorber, wie Hämoglobin und Streumittel, wie Gewebe und Knochen, stark beeinflussen blau nach gelb 3 Wellenlängen. Der Ausdruck eines konstruierten Leuchtkäfer-Luciferase (Emissionsmaximum bei 617 nm) wurde vor kurzem entwickelt und verarbeitet, die für ein Werkzeug, das stark überwindet optische Absorption 10, ist aber noch unter dem Vorbehalt Streueffekte. In Reaktion gab es mehrere Versuche, Rotverschiebung des emittierten Signals in das gewünschte optische Fenster 650-900 nm, einem Bereich minimiert Absorption und Streuung, mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET) 11-13. Als Mittel zur Signalerfassung zu verbessern, BRET, die ein Biolumineszenz-Quelle als dem Donor-Fluorophor und einem zusätzlichen als Akzeptor verwendet wurden begrenzte Erfolge verzeichnet. Ein Samen Beispiel für dieses Phänomen, &quot;selbstleuchtende Quantenpunkte4; (SIQDs) 14 bestehen aus modifizierten Renilla reniformis Luciferase mit dem externen Polymer-Lysin-Schicht gebunden von kommerziell verfügbaren Quantenpunkte (QP). Nach Substratzugabe, die resultierende Biolumineszenzreaktion induziert Fluoreszenzemission aus den Quantenpunkten, wodurch eine signifikante Produktion von roten Photonen. Allerdings sind diese SIQDs haben Anwendbarkeit in vivo Darstellung von physiologisch relevanten Ereignisse beschränkt. Diese begrenzte Anwendbarkeit ist wahrscheinlich auf die Schwierigkeiten bei der Verknüpfung der dualen Sonde mit der Organ-, Zell-oder Gen von Interesse, da die SIQDs nicht genetisch codiert werden, und daher wäre eine sekundäre Modifikation der Polymerhülle erforderlich. Um ihre Anwendbarkeit zu verbessern, alternative SIQDs, wo die Luciferasen sind direkt mit dem lumineszierenden Kern gebunden ist, wurden kürzlich 15 eingesetzt. Aufbauend auf der SIQD Konzept wurde ein mehr für BRET-System durch das Anbringen Cypridina Luciferase auf einen dadurch erreichtdocyanine Farbstoff 16, der in der Lage gezielt Tumore in Mäusen während eine beträchtliche Rotverschiebung von 460 nm bis 675 nm war. Nicht-strahlenden Energietransfer durchlaufen ist, folgt BRET die gleichen Einschränkungen wie die primäre Leuchtstoffgegen: es muss eine starke spektrale Überlappung zwischen der Donor-Emission und Akzeptor-Anregungsspektren und der Arbeitsabstand zwischen den beiden Einheiten sein müssen, in der Größenordnung von BE Förster-Radius (5-14 nm in Abhängigkeit von der Donor-Akzeptor-Paar, mit einer wirksamen maximalen Abstand von zweimal der Förster-Radius 17). Diese Abstandsabhängigkeit stark begrenzt die Ereignistypen, die mit BRET als Mittel zur Erkennung zu verbessern beobachtet werden können. Kürzlich wurde ein neuer Ansatz identifiziert und sowohl in vitro als auch in vivo Bedingungen, unter Beweis gestellt. Aufbauend auf den Grundstein für BRET, Fluoreszenz von Unbound Anregung von Lumineszenz (FUEL) 18, 19 </sup&gt; erfordert auch eine starke spektrale Überlappung zwischen der Lumineszenz-und Fluoreszenzkomponenten. Jedoch anders als BRET wird Kraftstoff völlig Strahlungsprozess, wobei die emittierten Photonen von der Leuchtquelle durch eine optisch zugänglichen Fluorophor, das anschließend emittiert ein Photon rotverschoben gemäß der Quantenausbeute Fluorophor absorbiert. Akin zu BRET kann dieser Ansatz auch verwendet, um die Zwänge der Bildgebung in der Gegenwart von optischen Absorber überwunden werden. Die resultierende rote Verschiebung gibt einen Gesamtanstieg und Spezifität in dem erfassten Signal aufgrund einer Abnahme der Dämpfung und eine Verringerung der optischen Streueffekte. Treibstoff wurde berichtet, dass zwischen Biolumineszenz Escherichia coli das lux-Operon und QD 18, 19 exprimieren auftreten. Während experimentell ähnlich den SIQDs besteht ein wesentlicher Unterschied: bei Kraftstoff, ist es nicht notwendig, daß die lumineszierenden Quelle zu sein physikalisch gebunden an das Fluorophor, das ermöglicht for genetischen Kodierung des Leuchtsonde. Aufgrund der erfolgreichen Erkennung von FUEL zwischen Leuchtbakterien und Quantenpunkte ist es möglich, dass diese Technik sowohl oberflächlich (Haut) und tiefe Gewebe (Lunge, Leber) Infektionen wie Staphylococcus aureus und Klebsiellia pneumoniae angewendet werden. Seit dem Bericht seiner experimentellen Bedeutung hat FUEL entwickelt, um eine robuste mathematische Modell 20, die verwendet werden können, um eine akzeptable Lumineszenz-und Fluoreszenzpaare vorherzusagen sind, und ihre Anwendungen haben erweitert, um den Einsatz bei der Identifizierung von photophysikalischen Eigenschaften wie Quantenausbeute aufweisen. Wir beschreiben im Folgenden einige der grundlegenden Techniken der FUEL. Zuerst zeigen wir Beweise für dieses Phänomen über kurz (um) und lang (cm) Arbeitsabstände, die sich grundlegend unterscheidet von FUEL BRET. Zweitens haben wir auf die mögliche Kraftstoffpaare zu erweitern durch die Untersuchung einer Vielzahl von Fluorophoren und fluoreszierende Nanopartikel. Third werden die Kraftstoffanwendungen durch den Vergleich gezielte und nicht gezielte FUEL Paare untersucht.

<table><tbody><tr><td>Escherichia coli die das Operon luxABCDE exprimieren&nbsp;</td><td></td><td></td><td>mit freundlicher Genehmigung von Jos&eacute; A. Bengoechea mit Genehmigung von Herbert P. Schweizer</td></tr><tr><td>Klebsiella pneumoniae 52145&nbsp;</td><td></td><td></td><td>52145 ist ein Serotyp K2-Referenzstamm</td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Standard Wachstumsmedien</td></tr><tr><td>Q-Tracker 705&nbsp;</td><td>Life Sciences</td><td>Q21061MP</td><td></td></tr><tr><td>Q-Tracker 800</td><td>Life Sciences</td><td>Q21071MP</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555</td><td>Life Sciences</td><td>S21381</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 568</td><td>Life Sciences</td><td>S11226</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 633</td><td>Life Sciences</td><td>S21375</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 700</td><td>Life Sciences</td><td>S21383</td><td></td></tr><tr><td>Nicht fluoreszierende Mikrosphären</td><td>Polysciences, Inc</td><td>15913</td><td></td></tr><tr><td>Rosa Mikrosphären</td><td>Life Sciences</td><td>F8887</td> Gelbe Mikrosphären mit <td>40 nm Durchmesser</td></tr><tr><td></td> Life <td>Sciences</td><td>F8888</td><td>40 nm Durchmesser</td></tr><tr><td>Ivis Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>21425</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin Entsalzungssäulen 7K MWCO</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>21425</td><td></td></tr><tr><td>HABA Assay-Kit&nbsp;</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>28005</td><td></td></tr><tr><td>Bradford-Assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0201</td><td></td></tr></tbody></table>

a step beyond bret: fluoreszenz von unbound anregung von lumineszenz (fuel)

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL)

Fluoreszenz von Unbound Anregung von Lumineszenz (FUEL) ist ein Strahlungs Anregungs-Emissions-Prozess, erhöhte Signal-und Kontrastverbesserung in vitro und in vivo produziert. FUEL teilt viele der gleichen Grundprinzipien wie Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET), jedoch unterscheidet sich stark in den zulässigen Arbeitsabstand zwischen der Leuchtquelle und dem fluoreszierenden Einheit. Während BRET effektiv auf ein Maximum von 2 mal dem Förster-Radius, üblicherweise weniger als 14 nm beschränkt ist, kann Kraftstoff bei Entfernungen von bis zu &amp;mgr; m oder sogar cm in Abwesenheit eines optischen Absorbers erfolgen. Hier werden wir auf das Fundament und die Anwendbarkeit der FUEL erweitern durch die Prüfung des relevanten Prinzipien, die hinter dem Phänomen und zeigen die Kompatibilität mit einer Vielzahl von Fluorophore und fluoreszierende Nanopartikel. Ferner ist die Nützlichkeit der Antikörper-bezogene FUEL sucht. Die hier gezeigten Beispiele belegen, dass FUEL für appl genutzt werdenikationen wo BRET nicht möglich ist, füllt die räumliche Lücke, die zwischen BRET und traditionelle ganze Tierbildgebung existiert.

Erweiterung der Grundlagen und Anwendbarkeit der Fluoreszenz von Unbound Anregung von Lumineszenz (FUEL) durch Vermessung der einschlägigen Grundsätze und demonstriert seine Kompatibilität mit einer Vielzahl von Fluorophore und Antikörper-bezogene Bedingungen.

A Step Beyond BRET: Fluoreszenz von Unbound Anregung von Lumineszenz (FUEL)

Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL) is a radiative excitation-emission process that produces increased signal and contrast ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Einfachheit von Brennstoff zu demonstrieren und die Erzeugung roter Photonen aufgrund strahlender Anregungsemissionsereignisse zu beobachten. Dies wird erreicht, indem biolumineszente Bakterien und lumineszente Nanopartikel zur Herstellung von Brennstoff kombiniert werden. Anschließend wird ein Biolumineszenz-Plattenreader verwendet, um die resultierenden roten Photonen zu beobachten, die aus dem Brennstoff entstehen. Es werden Ergebnisse erhalten, die zeigen, dass eine beträchtliche Menge roter Photonen erzeugt werden kann, wenn die biolumineszenten Bakterien und die Quantenpunkte in derselben Lösung gehalten werden.Ausgehend von der beobachteten Zunahme des roten Photonflusses dehnen sich die Implikationen dieser Technik auf die Überprüfung des Paradigmas des NCE-Wohnzugangs-Transfers oder von Brett aus. Dies wird häufig in der Literatur berichtet, ausgehend von einzelnen Kolonien. Beginnen Sie auf standardisierten Kulturplatten mit Übernachtkulturen lumineszierender Bakterien.Hier wurden Vibrio Fisher Eye am Tag der Experimentierung verwendet. Legen Sie frische Unterstämme an und lassen Sie diese wachsen, bis eine optische Dichte (OD) bei 600 Nanometern von 1 bis 1,5 erreicht ist. Verwenden Sie Bakterien in vergleichbaren Wachstumsphasen, in denen sie intensive Signale produzieren, um vergleichbare Ergebnisse zu erzielen.Kombinieren Sie Aliquote von jeweils 100 Mikrolitern mit entweder fünf Mikrolitern der fluoreszierenden Sonde, QD 7 0 5, oder physiologischer Kochsalzlösung. Geben Sie anschließend das Gemisch zu 895 Mikrolitern physiologischer Kochsalzlösung in standardmäßige spektroskopische Küvetten. Stellen Sie die gefüllten Küvetten in einen Ganzkörper-Biolumineszenz-Imager und nehmen Sie die Messungen unter Verwendung der geeigneten Filterkombinationen vor.Hier wurde der Emissionsfilter für 710 bis 730 Nanometer verwendet, um den Brennstoff über verschiedene Distanzen zu transportieren. Füllen Sie zwei Photometrieküvetten mit reduziertem Volumen mit jeweils 50 Mikrolitern QD 7 0 5 oder 97,2 Mikrolitern nicht fluoreszierender 48-Nanometer-Polystyrol-Mikrokugeln in einem Gesamtvolumen von einem Milliliter physiologischer Kochsalzlösung. Dies gewährleistet eine ähnliche feste Oberfläche pro Gesamtvolumen zwischen den beiden Partikeln.Bereiten Sie eine Lichtquelle qve vor, indem Sie eine dritte qve mit handelsüblichem schwarzen Klebeband oder einem anderen lichtundurchlässigen Material, das Licht blockieren kann, umhüllen. Bereiten Sie sorgfältig zwei identische optische Fenster auf gegenüberliegenden Seiten der vete vor. Geben Sie ein Ein-Milliliter-Aliquot von Vibrio fii oder einer anderen Kultur aus einer frischen Subkultur in die Lichtquellen-vete und bedecken Sie sie mit einem lichtundurchlässigen Material wie schwarzem Papier, um jegliche Lichtkontamination zu reduzieren.Platzieren Sie anschließend die zuvor befüllten Küvetten direkt auf beiden Seiten der Lichtquelle vete im Imager. Visualisieren Sie die drei Q vets unter den entsprechenden Emissionsfiltern, wie beispielsweise dem Gesamtlicht- und dem 710 bis 730 Nanometer-Emissionsfilter, mit Belichtungszeiten von jeweils 10, 30 und 30 Sekunden. Erwerben Sie ein Fluoreszenzbild bei 450 bis 480 Nanometer Anregung und 710 bis 730 Nanometer Emission, um die Position der QD 7 0 5 zu überprüfen.Positionieren Sie beide externen Quarzviskositätsmessgeräte (Q-Vets) in jeweils gleich großen, größeren Abständen zum zentralen Q-Vet neu. Anschließend visualisieren und erfassen Sie ein Fluoreszenzbild, bevor Sie diesen Vorgang erneut wiederholen, bis ein abschließender Abstand von drei Zentimetern von Gesicht zu Gesicht erreicht ist. Füllen Sie zwei Küvetten mit reduziertem Volumen mit je einer Milliliter-Lösung: In die eine geben Sie entweder ein Fluoro-4 oder ein fluoreszierendes Nanopartikel der Untersuchung, in die andere physiologische Kochsalzlösung mit nicht fluoreszierenden Nanopartikeln als Negativkontrolle.Geben Sie eine 1 ml-Aliquot frischer Vibrio-FII- oder anderer lumineszierender Bakterien in eine abgedunkelte dritte Vete, die zwei gleich große optische Fenster auf gegenüberliegenden Seiten besitzt. Decken Sie die Vete mit einem undurchsichtigen Material wie einem Stück Schwarzpapier in kurzem, aber gleichem Abstand ab. Stellen Sie die beiden Veten mit reduziertem Fassungsvermögen auf beiden Seiten der abgedunkelten Q-Vete auf und betrachten Sie sie unter geeigneten Filtern; hier wurde ein Abstand von 0,7 Zentimetern verwendet. Wiederholen Sie den Vorgang mit der anderen Bodenplatte der QD 7 0 5 gegenüber den Bakterien.Im Vergleich zu den Bakterien allein wird ein erheblicher Anstieg der Anzahl roter Photonen beobachtet. Eine Kontrollreaktion kann über weite Strecken in Abwesenheit eines Absorbers auftreten. Diese Abstandsabhängigkeit kann durch das inverse Quadratgesetz beschrieben werden.Für Punktquellen. Die gezielte Anbindung der Flora Fours an die bakterielle Membran scheint kaum oder keinen Einfluss auf die Gesamtmenge des erzeugten Brennstoffsignals zu haben. In diesem Zusammenhang bleibt der gezielte Brennstoff auch nach mehreren Waschschritten erhalten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man Brennstoff unter mehreren Modalitäten rekonstituiert, um rote Photonen aus strahlenden Anregungsemissionsereignissen zu erzeugen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir diskutieren den Bau und Betrieb einer komplexen nichtlinearen optischen System, das ultraschnelle all-optische Schaltelemente verwendet zu isolieren Raman von Fluoreszenz-Signalen. Mit diesem System sind wir in der Lage, erfolgreich getrennt Raman-und Fluoreszenz-Signale nutzen Pulsenergien und mittleren Leistungen, die biologisch unbedenklich bleiben.

Ablehnung des Fluorescence Resonance Hintergrund in und Spontane Raman Mikrospektroskopie

Die subzelluläre Lokalisierung von Proteinen ist bei der Bestimmung der räumlich-zeitliche Regulation der zellulären Signalübertragung wichtig. Hier beschreiben wir bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) als eine einfache Methode zur Überwachung der räumlichen Wechselwirkungen von Proteinen in der Zelle.

Bimolekularen Fluoreszenz Komplementation

Dieses Video beschreibt BiFC-PALM ― eine Kombination aus photoaktivierter Lokalisationsmikroskopie und bimolekularer Fluoreszenzkomplementierung ― zur Beurteilung von Protein-Protein-Wechselwirkungen. BiFC beinhaltet die Fusion von zwei fluoreszierenden Proteinfragmenten mit zwei interagierenden Proteinen von Interesse. Wenn die beiden Proteine interagieren, werden die Fragmente in die Nähe gebracht, wodurch die beiden Teile zusammenkommen und ein funktionsfähiges fluoreszierendes Protein...

Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementierungs-gekoppelte photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie

Wechselwirkungen zwischen Proteinen sind von grundlegender Bedeutung für alle zellulären Prozesse. Verwendung Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer, kann die Wechselwirkung zwischen einem Paar von Proteinen in lebenden Zellen und in Echtzeit überwacht werden. Darüber hinaus können die Auswirkungen von potentiell pathogenen Mutationen zu beurteilen.

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen Mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Wir beschreiben hier eine verbesserte Lumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (LRET) Verfahren, wo wir eine Protease-Schnittstelle zwischen dem Spender und Akzeptor-Fluorophor Stellen einzuführen. Diese Modifikation erlaubt es uns, spezifische LRET Signale aus Membranproteinen von Interesse, so dass für die Untersuchung von Membranproteinen ohne Proteinreinigung erhalten.

Lumineszenz-Resonanzenergietransfer zu Konformationsänderungen in Membranproteinen in Säugerzellen exprimiert Studieren

Studien von Biomolekülen in vivo sind entscheidend für das Verständnis der molekularen Funktion in einem biologischen Kontext. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode, die es ermöglicht, fluoreszierende Biomoleküle, wie DNA oder Proteine, in lebende Mikroorganismen zu internalisieren. Die Analyse von in vivo-Daten, die durch Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen wurden, wird ebenfalls vorgestellt und diskutiert.

Internalisierung und Beobachtung von Fluoreszenz Biomoleküle in lebenden Mikroorganismen durch Elektroporation

Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Bildgebung ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Echtzeit Zellbiologie Studien. Hier wird ein Verfahren für FRET Abbildungszellen in physiologischen dreidimensionalen (3D) Hydrogel-Mikroumgebungen herkömmlichen Epifluoreszenzmikroskopie verwendet wird präsentiert. Eine Analyse für ratiometrisches FRET-Sonden, die lineare Verhältnisse über den Aktivierungsbereich ergibt beschrieben.

FRET-Imaging im dreidimensionalen Hydrogelen

Dieses Protokoll beschreibt eine neue intraoperative Bildgebungstechnik, die einen Rutheniumkomplex als Quelle für Chemilumineszenz-Lichtemission verwendet und dadurch hohe Signal-Rausch-Verhältnisse während der in vivo-Bildgebung erzeugt. Die intraoperative Bildgebung ist ein expandierendes Gebiet, das die Art und Weise, wie chirurgische Eingriffe durchgeführt werden, revolutionieren könnte.

Eine neue Technik zur Erzeugung und Observing Chemilumineszenz in einem biologischen Rahmen

Es wird ein Protokoll für die Einrichtung eines konfokalen Standard-Laser-Scanning-Mikroskops für in vivo Förster-Resonanzenergieübertragungsmessungen mit anschließender Datenauswertung bereitgestellt.

Förster Resonanz-Energietransfermessungen in lebenden Pflanzenzellen

Dieses Protokoll beschreibt einen BRET-basierten Assay zur Messung der Wechselwirkungen der CRAF-Kinase mit 14-3-3-Proteinen in lebenden Zellen. Das Protokoll beschreibt die Schritte zur Vorbereitung der Zellen, zum Ablesen der BRET-Emissionen und zur Datenanalyse. Ein Beispielergebnis mit der Identifizierung geeigneter Kontrollen und der Fehlerbehebung für die Assay-Optimierung wird ebenfalls vorgestellt.

Biolumineszenz-Resonanz-Energietransfer (BRET)-basierter Assay zur Messung der Wechselwirkungen von CRAF mit 14-3-3-Proteinen in lebenden Zellen

Lernen Sie die FUEL-Technik zur Erzeugung roter Photonen durch biolumineszente Bakterien und lumineszente Nanopartikel. Diese Methode erweitert die Möglichkeiten der Fluoreszenzforschung erheblich.

A Step Beyond BRET: Fluoreszenz von Unbound Anregung von Lumineszenz (FUEL)

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