Die Bovine Lung in der biomedizinischen Forschung: Optisch Geführte Bronchoskopie, intrabronchial Inokulation und

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Wirt-Pathogen-Interaktionen in einem bovinen Modell einer Atemwegsinfektion zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem eine Atemwegsinfektion bei Kälbern durch eine intra bronchiale Inokulation mit dem betreffenden Pathogen im Verlauf der Erkrankung ausgelöst wird. Das Tier wird wiederholt mittels Bronchoalveolärlavage untersucht.

Anschließend werden Bronchialbürstenabstriche und transbronchiale Lungenbiopsien gewonnen, um Epithelzellen bzw. alveoläres oder Lungen-Gewebe zu erhalten. Letztendlich kann eine pathogenspezifische Atemwegserkrankung beispielsweise durch entzündliche Veränderungen im Lavagefluid, durch Zytologie und durch immunhistochemischen Nachweis des Erregers bestätigt werden. Bei transbronchialen Lungenbiopsien liegt der Hauptvorteil dieses Großtiermodells im Vergleich zu anderen bestehenden Tiermodellen und Nagetieren darin, dass wir in unserem Modell den Krankheitsverlauf über einen langen Zeitraum hinweg am selben Individuum durch wiederholte Probenentnahmen untersuchen können.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Wirt-Pathogen-Interaktionen in vivo ermöglicht, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie beispielsweise alternative Pathogene oder Wirtsspezies. Die Aufrechterhaltung der Anästhesie und die Unterstützung bei der Probenentnahme wird eine Fischärztin übernehmen, sie ist Veterinärmedizinerin aus unserem Labor. Vor Beginn des Verfahrens füllen Sie drei Spritzen mit ein, zwei und fünf Milliliter des Inokulums.

Danach, nachdem die Narkose bestätigt wurde, die Zunge des Tieres herausziehen und den Hals strecken. Anschließend unter leichtem Drehen einen metallischen Spekulum in den Mund des Kalbes einführen. Den Spekulum unter Sichtkontrolle nach vorne schieben, wobei eine Taschenlampe verwendet wird, um festzustellen, wann der Kehlkopf sichtbar ist.

Als Nächstes führen Sie einen Teflon-Schlauch in den Arbeitskanal eines Endoskops ein. Der Schlauch sollte nicht aus der Spitze des Endoskops herausragen. Führen Sie das Endoskop durch das Spekulum.

Kleine Anpassungen am Spekulum können notwendig sein, um das Endoskop einzuführen. Um den Larynx zu passieren, verwenden Sie den Bronchus trachealis, der sich zur rechten Lunge verzweigt, um das Bild auf dem Monitor auszurichten. Anschließend befestigen Sie die Spritze, die fünf Milliliter Inokulum enthält, am Ende des Teflonrohrs.

Navigieren Sie die Sonde in die Äste, in denen das Inokulum abgegeben werden soll, und verabreichen Sie die entsprechende Menge des Inokulums. Befestigen Sie anschließend die Spritze, die ein Milliliter Inokulum enthält, an der Sonde. Navigieren Sie zur Bronchus traches und geben Sie das Inokulum im Coddle-Zweig ab.

Entfernen Sie das Endoskop und das Spekulum. Befestigen Sie dann die letzte Spritze an einem Aktuator und sprühen Sie je ein Milliliter des Inokulums in jedes Nasenloch. Stellen Sie das Tier in Bauchlage in seine Box zurück, damit es aufwachen kann.

Der Erholungsstall sollte klimatisiert sein. Da die Fähigkeit des Tieres zur Thermoregulation unter Vollnarkose vermindert ist, erwärmen Sie fünf Spritzen, von denen jede 20 Milliliter sterile isotonische Kochsalzlösung enthält, in einem 38 Grad Celsius warmen Wasserbad bis zum gewünschten Zeitpunkt der Probenentnahme. Führen Sie dann einen Lavagekatheter in den Arbeitskanal des Endoskops ein und bringen Sie das Endoskop in das Metallspekulum ein.

Navigieren Sie anschließend weiter in den Hauptbronchus des linken Lungenflügels, bis die Keilposition erreicht ist und das Endoskop nicht weiter vorgeschoben werden kann. Danach befestigen Sie nacheinander die Spritzen mit der warmen Natriumchloridlösung am Lavagekatheter, um die Flüssigkeit einzuspülen und direkt wieder abzusaugen.

Bewahren Sie die Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit unmittelbar nach der Gewinnung zur Verhinderung der Anheftung der alveolären Makrophagen an der Glasoberfläche in silikonisierten Glasflaschen auf Eis auf. Notieren Sie sowohl die Menge des applizierten Kochsalzlösung als auch die Menge der gewonnenen Flüssigkeit. Entfernen Sie dann den Lavagekatheter aus dem Arbeitskanal, um epitheliale Zellen zu gewinnen.

Navigieren Sie als Nächstes das Endoskop zur gewünschten Probenahmestelle. Zum Beispiel in diesem Experiment zur Bifurcatio tracheae; wenn sich das Endoskop an Ort und Stelle befindet, überziehen Sie eine Bronchialbürste mit dem Schlauch und führen Sie sie in den Arbeitskanal des Endoskops ein, bis die Spitze der Bürste auf dem Monitor erscheint. Schieben Sie die Bürste und die Kunststoffhülle etwa fünf Zentimeter vorwärts.

Dann drücken Sie den Griff der Bürste, um sie aus dem Plastikrohr herauszuziehen. Sobald die Bürste in Position ist, führen Sie sie an die Stelle, die bearbeitet werden soll. Bewegen Sie die Bürste dann vorsichtig vor und zurück, während Sie das Endoskop navigieren.

Um sicherzustellen, dass die Bürste mit der Wand des Bronchus in Kontakt steht, um die Epithelzellen abzustreifen. Beenden Sie das Reiben, wenn Blutungen auftreten. Danach bedecken Sie die Bürste mit dem Röhrchen und ziehen sie aus dem Arbeitskanal heraus.

Rollen Sie die mit Epithelzellen beschichteten Bürsten vorsichtig über bis zu fünf Objektträger und fixieren Sie die Abstriche 10 Minuten lang in kaltem Methanol. Lassen Sie die Objektträger anschließend an der Luft trocknen und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius, um eine transbronchiale Lungenbiopsie durchzuführen. Navigieren Sie danach das Endoskop zur gewünschten Probenentnahmestelle.

Beispielsweise die Pars Alis der LOAs crans wie in diesem Experiment: Öffnen und schließen Sie die Biopsiepinzette mehrmals, bevor Sie sie in den Arbeitskanal einführen, um ihre ordnungsgemäße Funktion sicherzustellen. Danach schieben Sie die Pinzette in den Coddle-Zweig der Bronchus traches, bis ein leichter Widerstand spürbar wird. Ziehen Sie die Pinzette nun zwei bis drei Zentimeter zurück und öffnen Sie sie. Führen Sie die Pinzette erneut etwa zwei Zentimeter vorwärts und schließen Sie sie anschließend.

Ziehen Sie die Pinzette zurück und entfernen Sie sie aus dem Arbeitskanal. Entfernen Sie das Gewebe vorsichtig mit einer Nadel von der Biopsiepinzette und lagern Sie es in einem geeigneten Fixiermedium, um die Entstehung autolytischer Prozesse zu verhindern. Überwachen Sie abschließend nach vollständiger Genesung des Kalbes in seiner Box erneut das Tier auf Pneumothorax für die nächsten 24 Stunden und stellen Sie Futter und frisches Wasser zur Verfügung.

Wenn das Tier die volle Bewusstseinsfähigkeit wiedererlangt hat, können gefrorene Schnitte von transbronchialen Lungenbiopsien immunhistochemisch gefärbt werden. Um den applizierten Erreger sichtbar zu machen, beachten Sie die braunen Chlamydien-Inklusionen in der Lunge dieses Tieres, das vier Tage vor der Probenentnahme mit Chlamydia C infiziert wurde. Die immunhistochemische Färbung der Lavagezellen ermöglicht die Visualisierung intrazellulärer Pathogene.

Beispielsweise sind in diesem Bild chlamydiale Inklusionen in den aus den Alveolarmakrophagen eines Kalbes gewonnenen Zellen zu sehen. Neun Tage nach intra bronchialer Inokulation mit Chlamydia können CTAC beobachtet werden. Bronchoalveoläre Lavagezellen können durch zytologische Färbung differenziert werden.

Alveolarmakrophagen sind der vorherrschende Zelltyp in der Lavageflüssigkeit. Allerdings steigt die Anzahl neutrophiler Granulozyten bei Vorliegen entzündlicher Prozesse. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann die Inokulation in 10 bis 15 Minuten und die Probenentnahme innerhalb von 20 bis 30 Minuten ordnungsgemäß durchgeführt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine intrabronchiale Inokulation an Kälbern durchführt, und wie man bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit, Bronchialbürstenabstriche und transbronchiale Lungenbiopsien am anästhesierten Tier entnimmt.