Demonstration der proteolytischen Aktivierung des epithelialen Natriumkanals (ENaC) durch Kombination von Strommessungen mit Nachweis der Spaltfragmente

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Wirkung von Proteasen auf den epithelialen Natriumkanal oder ENaC zu untersuchen, der heterolog in Zapfenzellen exprimiert ist. Dies wird erreicht, indem zunächst der amiloridempfindliche Gesamtzellstrom in einer Oozyte gemessen wird. Nach einer Erholungsphase der Oozyte wird diese einer Protease ausgesetzt und der Strom erneut gemessen.

Dann werden parallel Oozyten biotinyliert und einer Western-Blot-Analyse unterzogen, um das Auftreten von Gamma-ENaC-Spaltfragmenten an der Zelloberfläche zu überwachen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen einen kausalen Zusammenhang zwischen Kanalspaltung und Kanalaktivierung, basierend auf einer Kombination der Zweielektroden-Voltage-Clamp-Technik und der Biotin-Methode. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der unplanned measurement besteht darin, dass die Zellen für einen variablen Zeitraum in einem kleinen Volumen an Testlösung Proteasen oder anderen pharmakologischen Substanzen zwischen den beiden Messungen ausgesetzt werden können. Zwei Tage nach der Isolierung der Zap-Lava-Zyten und der Injektion mit CN gemäß dem Textprotokoll, verwenden Sie ND 96, um eine Spritze eines gravitationsbetriebenen Perfusionsystems zu füllen, und ND 96, das Amid enthält, um eine zweite Spritze zu füllen.

Nachdem die Spritzen 50 Zentimeter über der Badkammer montiert wurden, schalten Sie eine 150-Watt-Halogen-Kaltlichtquelle ein und stellen Sie diese auf 10 Zentimeter über der Zellbadkammer ein, um eine gute Visualisierung mit dem Binokularmikroskop zu ermöglichen. Schalten Sie die Absaugung ein und platzieren Sie das Saugrohr gegenüber dem Adapter des Überströmungsrohrs in der Oozyten-Badkammer. Anschließend stellen Sie mithilfe des IV-Gravitationsflussregelgeräts die Überströmungsgeschwindigkeit jeder Lösung auf drei bis fünf Milliliter pro Minute ein. Verbinden Sie dann mit einem Adapter die Überströmungsrohre über eine Mikropipette, bei der Polarglas-Kapillaren gezogen werden, um Spitzendurchmesser von weniger als einem Mikrometer zu erzielen, mit der Oozyten-Badkammer.

Danach die Kapillaren etwa zu einem Viertel mit dreimolarer Kaliumchloridlösung füllen. Die Kapillaren in die Elektrodenhalter der Strom- und der Spannungselektrode einführen und mithilfe der Mikromanipulatoren in ND-96, das eine zwei Mikromolar-Amid-Lösung enthält, positionieren. Um amidempfindliche Ganzzellströme zu messen, beginnen Sie damit, den VM-Offset-Knopf so einzustellen, dass das Elektrodenpotential der Spannungselektrode auf Null gebracht wird, und den VE-Offset-Knopf, um die Stromelektrode auf Null zu stellen.

Platzieren Sie eine UO-Stelle in die Badkammer und in die Nähe der Spannungssensorelektrode. Dann mit beiden Mikroelektroden vorsichtig die UO-Stelle penetrieren, das Haltepotential des Verstärkers auf minus 60 Millivolt einstellen und den Schreiber einschalten. Anschließend die Lösung mit Amiden einschalten.

Als Nächstes beginnen Sie mit der Aufzeichnung und stellen gegebenenfalls die Verstärkung ein. Sobald der gemessene Strom eine stabile Plateauphase erreicht hat, wechseln Sie auf eine amidfreie Lösung. Wenn erneut ein Stromplateau erreicht ist, schalten Sie die Perfusionslösung zurück auf die amidhaltige Lösung. Danach, sobald der Strom der UO-Stelle den ursprünglichen Grundstrom erreicht hat, schalten Sie die Spannungsfixierung aus und ziehen die Elektroden vorsichtig zurück, um die Wiederhermetisierung der Plasmamembran an den Einstichstellen zu ermöglichen.

Platzieren Sie die Uoc-Stelle in eine Vertiefung einer 96-Loch-Platte, die 100 bis 150 Mikroliter proteasefreie ND-96-Lösung enthält, und lassen Sie sie dort fünf Minuten lang, bevor Sie die UOC-Stelle in eine proteasehaltige Lösung oder in eine Kontrolllösung ohne Protease überführen. Wiederholen Sie 30 Minuten nach der Inkubation die Strommessung, entsorgen Sie defekte Oozyten unter dem Stereomikroskop und bereiten Sie Anti-96 mit und ohne geeignete Protease vor. Bereiten Sie Pasteur-Pipetten vor, indem Sie sie beschriften und ihre Spitzen kurz überflammen, um Verletzungen der Oozyten zu vermeiden.

Füllen Sie jedes Loch einer sechs-Loch-Platte mit 2,5 Milliliter ND 96 bei Raumtemperatur oder ND 96, das eine Protease enthält. Geben Sie anschließend 30 Zellen pro Loch hinzu und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nachdem Sie 2,5 Milliliter ND 96 zu den Löchern einer neuen sechs-Loch-Platte hinzugefügt haben, überführen Sie jede Gruppe von Oozyten in ein mit ND 96 gefülltes Loch.

Bewegen Sie die Zellen nacheinander in zwei zusätzliche Vertiefungen mit ND 96, um jegliche verbleibende Protease abzuwaschen, und inkubieren Sie sie in der letzten Vertiefung fünf Minuten lang. Bereiten Sie Biotin gemäß dem Textprotokoll in Biotin-Elutionspuffer vor. Nachdem jede Gruppe von Oozyten in eine Vertiefung mit 2,5 Milliliter Biotin-Elutionspuffer gegeben wurde, 15 Minuten unter leichtem Schütteln inkubieren. Danach jede Gruppe von Oozyten in eine Vertiefung mit 2,5 Milliliter Stopfpuffer überführen, um die Biotinreaktion zu beenden, anschließend in eine zweite Portion Stopfpuffer übertragen und fünf Minuten lang inkubieren.

Unter sanfter Agitation überführen Sie jede Gruppe von Oozyten in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und lysieren die Zellen mithilfe von einem Milliliter Lysepuffer, ergänzt mit Proteaseinhibitoren, indem Sie sie durch eine 27-Gauge-Nadel ziehen. Zentrifugieren Sie die Lysate 10 Minuten bei 1500 × g. Überführen Sie das S natin in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen, das TRITTON X 100 und MP 40 enthält, und inkubieren Sie die Röhrchen 20 Minuten auf Eis. Nachdem Sie 100 Mikroliter Vagaro-Beads pro Oozytengruppe mit AC equilibriert haben, fügen Sie diese unter wiederholtem Vortexen zur Proteindetergenslösung hinzu und inkubieren die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius mit Rotation von oben.

Am nächsten Tag die Proben drei Minuten bei 1500 × g zentrifugieren. Dann das Überstand in ein neues Röhrchen überführen, um Aktivierungs-Spaltprodukte an der Zelloberfläche nachzuweisen. Die Gelproben reparieren, indem die Perlen mit Lysepuffer dreimal gewaschen werden, bevor zwei X SDS-PAGE-Probenpuffer zugegeben wird. Nachdem die Proben drei Minuten bei 20.000 × g zentrifugiert wurden, den Überstand in neue Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren.

Analysieren Sie die Proben mittels Western Blot gemäß dem Textprotokoll, um zu untersuchen, ob das Serinprotease Plasmin ENaC-vermittelte Ströme aktivieren kann. Die Delta-IE einzelner ENaC-exprimierender Zellen wurde vor und nach einer 30-minütigen Inkubation der Zellen in proteasefreier oder Plasmin enthaltender Lösung bestimmt. Mithilfe der hier gezeigten Zweielektroden-Spannungsklemmtechnik erhöhte die Exposition gegenüber Plasmin in jeder gemessenen Zelle die Delta-IE.

Im Gegensatz dazu hatte die Inkubation in proteasefreier Lösung einen vernachlässigbaren Effekt. Diese Abbildung vergleicht die Wirkung von Chi-Trypsin auf den Wildtyp-ENaC und auf ENaC mit mutierten Spaltstellen für Prostasin und Plasmin. Wie hier zu sehen ist, verzögert der mutierte Kanal die Aktivierung des durch Chi-Trypsin vermittelten ENaC-Stroms und verringert sie.

Außerdem erzeugt es im Vergleich zum Wildtyp-ENaC mit einer verminderten Rate ein Spaltungsfragment. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie eine Kombination der beschriebenen Methoden genutzt werden kann, um die stimulierende Wirkung von Proteasen auf das Auftreten im Inneren mit dem Auftreten von Spaltprodukten an der Zelloberfläche zu korrelieren. Dies kann für eine breite Palette von Anwendungen nützlich sein, beispielsweise um ähnliche Fragen bezüglich der Regulation anderer Ionenkanäle, Transporter oder transmembranarer Rezeptoren zu untersuchen.