Elektro Faser-Gerüste von Poly (Glycerin-dodecandioat) für Ingenieurnervengewebe aus embryonalen Stammzellen der Maus
18. Juni 2014
Synthese und Herstellung von elektro langen Fasern sich über eine größere Ablagefläche über einen neu gestalteten Sammler aus einem neuartigen biologisch abbaubaren Polymer namens Poly (Glycerin-Dodecanoat) (PGD) wurde berichtet. Die Fasern waren in der Lage, das Wachstum von pluripotenten Zellen aus Maus-Stammzellen zu unterstützen.
Bei diesem Verfahren werden von Electros gesponnene lange Fasern aus einem neuartigen biologisch abbaubaren Polymer namens Polyglycerin Dote Cano Eight hergestellt. Richten Sie zunächst den neu entwickelten Kollektor ein und bereiten Sie die polymere Lösung für das Elektrospinnen vor, indem Sie eine Spritze und eine Pumpe verwenden und die Lösung zum Kollektor abgeben. Übertragen Sie dann die resultierende Fasermatte zur Vernetzung in eine Kulturschale.
Als nächstes säen Sie embryonale Stammzellen der Maus auf den geschnittenen Fasern. Letztendlich können die Ergebnisse zeigen, dass die embryonalen Stammzellen der Maus überleben und sich auf den Fasergerüsten zu Nervenzellen differenzieren können. Im heutigen Video haben wir Ihnen gezeigt, wie Sie das Biomaterial aus der Herstellung von Synzellen vorbereiten und schließlich diese Elektrospan-Fasern für die Zellkultur verwenden können.
Vor allem, wenn wir mit der aus Poly gewonnenen Zelle und der Fleckenzelle kombinieren. Sie könnten in Zukunft eine sehr wichtige Anwendung für die Zellabgabe und die Herstellung eines funktionsfähigen Gewebes haben. Gewebe invis heute, dass sie Ihnen eine schreckliche Prozedur demonstrieren wird.
Sie ist das Größte in meinem Labor. Schneide die Alufolie in ein rechteckiges Stück. Falten Sie das rechteckige Stück zu einem rechteckigen Streifen und befestigen Sie es senkrecht mit Klebeband an einer flachen Metallplatte.
Die Länge des Streifens hängt von der Größe der Fasermatte ab, die für die Polymerlösung benötigt wird. Gemischtes Glycerin und Do Decandiic in einem molaren Verhältnis von eins zu eins bei 120 Grad Celsius für 100 Stunden. Um ein Polyglycerin zu erhalten, löst das decanische Polymer Polyethylenoxid und Gelatine in 65%igem Ethanol mit einem Gewichtsverhältnis von 1,5 bis drei bis 95,5 in einer 15-Milliliter-Tube auf.
Ziehen Sie die Kappe fest und erhitzen Sie die Mischung im Ofen bei 60 Grad Celsius für eine Stunde und rühren Sie alle 15 Minuten, bis die Grundlösung homogen ist. Für das Elektrospinnen mischen Sie das PGD-Polymer und die Basallösung. In einem Gewichtsverhältnis von vier bis sechs fügen Sie 0,1 % Riboflavin in die Mischung hinzu und mischen Sie sie gut.
Führen Sie die Polymerlösung in eine Fünf-Milliliter-Standardspritze mit einer 18-Gauge-Nadel aus abgestumpftem Edelstahl ein. Führen Sie dann die Spritze in eine Spritzenpumpe ein. Befestigen Sie das geerdete Kabel einer Hochspannungsstromquelle an der Metallplatte und das positiv geladene Kabel an der Nadel.
Passe auch den Abstand zwischen der Nadel und der Alufolie an. Auf 15 Zentimeter abstreifen. Platzieren Sie nun die Spritzenpumpe in einem Winkel von ca. 15 Grad zur Horizontalen, um eine Aggregation der Fasern an der Vorderseite des Streifens zu verhindern.
Schalten Sie die Spritzenpumpe ein und stellen Sie die Durchflussmenge der Pumpe auf 0,6 Milliliter pro Stunde ein. Schalten Sie die Hochspannungsquelle ein und stellen Sie die Betriebsspannung auf 14,6 Kilovolt ein. Nachdem die Entnahme abgeschlossen ist, setzen Sie die Fasermatte 60 Minuten lang UV-Licht aus, um sie zu vernetzen.
Übertragen Sie die Fasermatte vom Alufolienstreifen in eine 100 Millimeter Petrischale. Schneiden Sie die Fasermatte mit der chirurgischen Klinge in runde, gleich große Stücke und legen Sie die Stücke in eine 24-Well-Platte. Setzen Sie die Platte dann für eine weitere 20-minütige Sterilisation mit UV-Licht aus, um die Zellen vor der Behandlung zu behandeln.
Tauchen Sie die Faserproben in einen Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung und inkubieren Sie sie am nächsten Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius. Saugen Sie das PBS vorsichtig an. Geben Sie in jede Vertiefung einen Milliliter Differenzierungsmedium und inkubieren Sie drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius.
Nach dem Aspirieren des Differenzierungsmediums werden vorsichtig 0,2 Milliliter Matri-Gel zu jeder Faserprobe hinzugefügt und 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Matri-Gel von beiden. Einmal mit zwei Millilitern Differenziermedium gut nachspülen.
Geben Sie einen Milliliter Tase nach 10 Minuten bei einer Temperatur von 37 Grad Celsius in die embryonale Stammzellkulturschale der Maus. Wenn die MES-Zellen abgelöst sind, fügen Sie vier Milliliter Differenzierungsmedium hinzu. Sammeln Sie die schwimmenden MES-Zellen fünf Minuten lang in einer 15-Milliliter-Röhrchenzentrifuge bei 400 g.
Suspendieren Sie die pelletierten Zellen in vier Millilitern Differenzierung. Mittel. Übertragen Sie 200 Mikroliter der Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie 10 Differenzierungsvolumina hinzu. Mittel. Übertragen Sie 15 Mikroliter der verdünnten Zellsuspension in eine Kammer auf dem Hämozytometer.
Zählen Sie mit einem Deckglas die Zellen im ein Millimeter großen Quadrat in der Mitte und in den vier Eckquadraten des Hämozytometers. Lass dich nun fünfmal 10 auf den vierten fallen. ES-Zellen der Maus langsam in die Mitte der Faserproben aufbringen.
Geben Sie einen Milliliter Differenzierungsmedium in jede Vertiefung und kultivieren Sie sie bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für die Zellanhaftung. Wachstum und Differenzierung. Füllen Sie jeden zweiten Tag den einen Milliliter Differenzierungsmedium auf.
Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu messen, aspirieren Sie das alte Medium aus jeder Vertiefung und fügen Sie einen Milliliter eines Verdünnungsreagenzes von eins zu 10 und eines Fluoreszenzreagenzes in die Kultur hinzu. Medium Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für vier Stunden vor direktem Licht. Übertragen Sie dann dreifache Proben von 100 Mikrolitern aus jeder Vertiefung auf eine 96-Well-Platte und messen Sie die Fluoreszenz Rasterelektronenmikroskopische Bilder wurden verwendet, um die Morphologie der elektrogesponnenen Fasern zu bewerten.
Die Durchmesser dieser Fasern aus 40%iger PID-Konzentration liegen hier im Mikrometerbereich. Differenzierte embryonale Stammzellen der Maus wurden drei Tage lang auf den Fasern kultiviert und mit konfokaler Mikroskopie das exprimierte grün fluoreszierende Protein sichtbar gemacht. Die erhöhte Anzahl von grün fluoreszierenden Zellen am sechsten Tag deutet darauf hin, dass die Fasergerüste sowohl die Zelladhäsion als auch die Zellproliferation unterstützen können.
Zu- und Fluoreszenzmessungen zeigten, dass die Beschichtung mit Matrigel und Laminin zu einer gleichwertigen Zellviabilität und einer relativ höheren Proliferation führte. Die Flury-Potenz und die neuralen Zellmarker wurden am ersten Tag durch Echtzeit-PCR quantifiziert. Die Mehrzahl der MES-Zellen, die auf Fasern kultiviert wurden, exprimierten die Pluripotenzmarker.
OCT vier nano und SOX zwei. Eine kleinere Untergruppe exprimierte die neuralen Stammzellmarker PAC sechs und Neston. Nach zwei Wochen in Kultur gab es erhöhte Expressionsniveaus einiger neuraler Zellmarker, wie z. B. Karte zwei und DCX sowie Oligodendrozytenmarker Oligo eins und Astrozytenmarker.
GFAP Einmal gemeistert. Diese Technik kann in zwei bis drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
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Übersicht
Diese Studie beschreibt die Synthese und Herstellung elektrogesponnener langer Fasern unter Verwendung eines neuartigen biologisch abbaubaren Polymers, Poly(glycerin-Dodecanoat) (PGD). Die Fasern unterstützen das Wachstum von pluripotenten Mausstammzellen und zeigen damit ihr Potenzial für biomedizinische Anwendungen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biomaterialien
- Zellkultur
- Elektrospinnen
Hintergrund
- Das Elektrospinnen ist eine Technik zur Herstellung von Fasern aus Polymerlösungen.
- Biologisch abbaubare Polymere sind wichtig für die Entwicklung nachhaltiger Materialien in biomedizinischen Anwendungen.
- Maus-Pluripotente Stammzellen können sich in verschiedene Zelltypen differenzieren, einschließlich neuronaler Zellen.
- Die Herstellung von Gerüsten, die das Zellwachstum unterstützen, ist entscheidend für das Gewebeengineering.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer neuen Methode zur Herstellung langer Fasern aus PGD.
- Beurteilung der Fähigkeit dieser Fasern, das Zellwachstum zu unterstützen.
- Aufzeigen der potenziellen Anwendung dieser Fasern in der Gewebeengineering.
Verwendete Methoden
- Herstellung einer polymeren Lösung für das Elektrospinnen.
- Verwendung eines neu konzipierten Sammlers zur Faserausscheidung.
- Übertragung der Fasermatten in Kulturschalen zur Vernetzung.
- Besiedlung von embryonalen Mausstammzellen auf den Fasern.
Hauptergebnisse
- Die elektrogesponnenen Fasern wurden erfolgreich aus PGD hergestellt.
- Maus-embryonale Stammzellen konnten auf den Faserscaffolds überleben.
- Die Zellen differenzierten sich in neuronale Zellen, wenn sie auf den Fasern kultiviert wurden.
- Die Studie zeigt die Machbarkeit der Verwendung von PGD-Fasern für Zellkultur-Anwendungen auf.
Schlussfolgerungen
- Elektrogesponnene PGD-Fasern können das Wachstum und die Differenzierung von Stammzellen unterstützen.
- Diese Methode bietet einen neuen Ansatz zur Herstellung von Biomaterialien für das Gewebeengineering.
- Weitere Forschung ist erforderlich, um das volle Potenzial dieser Fasern in der regenerativen Medizin zu erschließen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht die Herstellung biologisch abbaubarer elektrogesponnener Gerüste, die die neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus unterstützen und eine reproduzierbare Plattform für die Validierung von Zielstrukturen in frühen Stadien bei Modellen neurodegenerativer Erkrankungen bieten. Durch die Bereitstellung eines anpassbaren Mimikums der extrazellulären Matrix mit mechanischen Eigenschaften, die denen von Nervengewebe ähneln, verbessert die Methode die Vorhersagegenauigkeit in stammzellbasierten Assays und verringert biologische Unschärfen in präklinischen Entwicklungsprozessen zur Risikominimierung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch kontrollierte Differenzierung pluripotenter Stammzellen in neuronale Linien auf definierten Biomaterialien.
- Operationaler Wert: Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung, indem ein standardisierter Substrat zur Beurteilung von Stammzellüberleben, -proliferation und -differenzierung bereitgestellt wird.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die mechanistische Risikominimierung, indem Wechselwirkungen mit der extrazellulären Matrix in einem krankheitsrelevanten System modelliert werden, bevor eine Validierung am lebenden Organismus erfolgt.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Wirkstoff-Screening-Untersuchung vor, indem eine konsistente Zelladhäsion und -vermehrung auf elektrogesponnenen Fasern etabliert wird.
- Operativer Wert: Löst das Problem der Assay-Standardisierung durch hochreproduzierbare Protokolle zur Herstellung und Vernetzung der Fasern und ermöglicht somit zuverlässige quantitative Auswertungen.
- Skalierbarkeit: Unterstreicht das Potenzial zur Wiederverwendung der Plattform aufgrund kostengünstiger Materialien und eines einfachen Aufbaus, was die skalierbare Erzeugung von neuronalen Gewebemodellen unterstützt.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Erläutert die Krankheitsrelevanz durch die Differenzierung entlang neuraler Linien, wodurch eine Abstimmung mit Biomarker-Studien in präklinischen Modellen neuronaler Verletzung oder Degeneration ermöglicht wird.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Beschreibt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem eine stabile Markerexpression (z. B. MAP2, DCX, GFAP) über einen Zeitraum von zwei Wochen nachgewiesen wird, was Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch unterstützt.
- Prädiktive Risikominderung: Konzentriert sich auf matrixvermittelte Signaleffekte als mechanistischen Filter für Leitverbindungen, die auf Signalwege der neuronalen Regeneration abzielen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Stammzellerzeugung bis zur neuronale Phänotyp-Charakterisierung und ermöglicht die Überprüfung von Hypothesen und die Aufklärung von Signalwegen, bevor Ansatzpunkte identifiziert werden.
- Entdeckungsbiochemie: Erläutert, wie die Methode die Hypothesenprüfung unterstützt, indem sie eine kontrollierte Differenzierung von embryonalen Mausstammzellen in neuronale Subtypen auf abstimmbaren Gerüsten ermöglicht.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft für Assays durch reproduzierbare Fasernherstellung und Vernetzung, die eine konsistente Nachbildung der extrazellulären Matrix für die Wirkstoffbewertung sicherstellt.
- Analytik: Betont quantitative Ausgaben wie Fluoreszenzintensität, Echtzeit-PCR für Pluripotenz- und neuronale Marker (OCT4, SOX2, PAX6, Nestin, MAP2, DCX, OLIG1, GFAP) sowie Vitalitätsassays, die einen vergleichenden Analysenansatz unter verschiedenen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Methode mit der präklinischen Kontinuität durch langanhaltende Expression neuronaler und glialer Marker über zwei Wochen, was eine risikobasierte Bewertung entlang biologischer Marker unterstützt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt die Methode als wiederverwendbare Fähigkeit dar, basierend auf kostengünstigen Materialien, einfachen Geräten (Spritzenpumpe, Hochspannungsquelle) und standardisierter Vernetzung, was den Einsatz in mehreren Projekten ermöglicht.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagbare Zuverlässigkeit bei den Ergebnissen der Stammzelldifferenzierung, Verringerung mechanistischer Unschärfen in Modellen neuralen Gewebes und Zielvalidierung mittels expressionsbasierter, linien-spezifischer Marker.
- Operativer Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der Faserherstellung durch einfache Elektrospinnanlage und UV-Vernetzung.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen durch frühzeitige phänotypische Screening-Verfahren, Kapital-Effizienz durch kostengünstige Gerüstmaterialien und reduziertes biologisches Risiko in späteren Entwicklungsstadien durch Absicherung matrixabhängiger Mechanismen.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten für die Regeneration neuralen Gewebes basierend auf dosisabhängigen Veränderungen der Differenzierungseffizienz oder Markerexpression auf standardisierten Gerüsten.
Durchführungsüberlegungen
- Notwendige wissenschaftliche Fachkenntnisse in der Polymersynthese, Elektrospinnung und Kultivierungstechniken von Stammzellen.
- Zu den erforderlichen Geräten gehören eine Spritzenpumpe, eine Hochspannungsquelle, eine UV-Vernetzungsanlage und eine Fluoreszenz- oder konfokale Mikroskopie für die Auswertung.
- Die Standardisierung über Teamgrenzen hinweg erfordert gemeinsame Protokolle für Faserdimensionen, Vernetzungsdauer und Zellansaatdichte, um die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Laboren sicherzustellen.
- Anpassungsüberlegungen beinhalten die Anpassung der Polymerkonzentration, des Kollektordesigns und der Vernetzungszeit je nach Herkunft der Stammzellen oder Zielgeweben.
- Praktische Einschränkungen umfassen die Variabilität des Faserdurchmessers, die die Zellausrichtung beeinflusst, sowie die Notwendigkeit, die Beschichtung (z. B. Matrigel, Laminin) für spezifische neuronale Subtypen zu optimieren.
