Name: Elektro Faser-Gerüste von Poly (Glycerin-dodecandioat) für Ingenieurnervengewebe aus embryonalen Stammzellen der Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung elektrogesponnener Fasern aus Poly(Glycerin-Dodecandioat) für Gewebeengineering. Diese Methode unterstützt das Wachstum und die neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus.

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Diese Arbeit wurde mit den Einrichtungen des Biomedical Engineering Department an der Florida International University durchgeführt.

1. Elektrospinning Collector Setup- <ol><li> Schneiden die Aluminiumfolie in einem rechteckigen Stück. </li><li> Falten Sie das rechteckige Stück in einen rechteckigen Streifen, und befestigen Sie es senkrecht zu einer flachen Metallplatte mit Klebeband (Abbildung 1). Hinweis: Die Größe der Fasermatte hängt von der Länge und Breite des Streifens. Somit kann die Bandabmessungen nach Bedarf eingestellt werden. </li></ol> 2. Polymere Herstellung der Lösung <ol><li> Mischen Glycerin und Dodecandisäure (DDA) in einem Molverhältnis von 1:1 in einem Becherglas bei 120 ° C für 100 h PGD-Polymer zu erhalten. </li><li> Auflösen Poly (ethylenoxid) (PEO) und Gelatine in 65% Ethanol mit einem Gewichtsverhältnis von 1.5:3:95.5 in einem 15 ml-Röhrchen, den Verschluss und die Mischung in einem Ofen bei 60 ° C für 1 h unter Rühren bis es eine homogene Lösung (Grundlösung). </li><li> Für Elektro, mischen Sie die PID-Polymer und die Grundlösung in 4.06 Gewichts-Verhältnis. Hinweis: PID-Konzentration hat eine big Wirkung auf Faserdurchmesser. 30% -50% Prozent PID akzeptabel Fasern mehr als 5 cm mit einer erhöhten Faserdurchmessern zu erzeugen. </li><li> In 0,1% Riboflavin der Polymerlösung und gut mischen. </li></ol> 3. Elektrospinning <ol><li> Feed der Polymerlösung in eine 5 ml Standardspritze mit einer 18 G abgestumpft Nadel aus Edelstahl. </li><li> Legen Sie die Spritze in eine Spritzenpumpe. </li><li> Befestigen des geerdeten Anschluß eines Hochspannungsleistungsquelle mit der Metallplatte und dem positiv geladenen führen zu der Nadel. </li><li> Den Abstand zwischen der Nadel und der Aluminiumfolienband 15 cm. </li><li> Zeigen die Spritzenpumpe in einem Winkel von etwa 15 ° mit der Horizontalen, um die Aggregation der Fasern an der Vorderseite des Streifens zu verhindern. </li><li> Schalten Sie die Spritzenpumpe und die Durchflussrate der Pumpe bis 0,6 ml / Std. </li><li> Schalten Sie die Hochspannungsquelle und stellen Sie die Betriebsspannung von 14,6 kV. </li></ol> 4.Faserverarbeitung <ol><li> Nach Abschluss der Sammlung ist, setzen die Fasermatte mit UV-Licht für 60 min für die Vernetzung. </li><li> Übertragen der Fasermatte aus der Aluminiumfolienstreifen auf eine 100 mm Petrischale, und setzen diese mit UV-Licht für weitere 20 min zur Sterilisation. </li><li> In einer biologischen Sicherheitsschrank, schneiden Sie die Fasermatte in runde Stücke der gleichen Größe mit einem Skalpell und legen Sie die Stücke in eine 24-Well-Platte. </li><li> Für Zellvorge Impfbehandlung tauchen Faserproben in 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Am folgenden Tag, sorgfältig absaugen PBS, 1 ml Differenzierungsmedium (DMEM/F12, N2 und FGF2) (siehe Rezept in der Materialtabelle) in jede Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C für 3 Stunden. </li><li> Saugen Differenzierungsmedium vorsichtig, fügen 0,2 ml Matrigel jedem Faserprobe und bei 37 ° C für 30 min. Hinweis: Laminin kann auch für Faserbeschichtung verwendet werden. 0,2 ml von 20 ug / ml Lamininan die Faser und Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 Stunden. </li><li> Über Matrigel vorsichtig aus jedem Well. Spülen mit 2 ml Differenzierungsmedium einmal. Anmerkung: Die Faserproben sind bereit für die Zellkultur. </li></ol> 5. Zellaussaat auf Fibers <ol><li> 1 ml der Accutase auf der MES-Zellkulturschale und Inkubation für 10 min bei 37 ° C </li><li> Nach 10 min werden die MES-Zellen von der Kulturschale abgelöst. 4 ml Differenzierungsmedium mit der Platte. Sammeln Sie die schwimmenden MES-Zellen in ein 15-ml-Tube und Pipetten Zellen nach oben und unten, um Kolonien (ca. 15x) zu brechen. </li><li> Zentrifuge bei 400 × g für 5 min und resuspendieren Zellen in 4 ml Differenzierungsmedium. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. Transfer von 200 &amp;mgr; l der Zellsuspension in ein 15 ml-Röhrchen und verdünnte es 10x mit Differenzierungsmedium. Übertragen 15 &amp;mgr; l der verdünnten Zellsuspension in eine Kammer auf der Zählkammer mit einem Deckglas vorhanden. Zählendie Zellen in der Mitte Platz 1 mm und die vier Ecken Quadrate der Zählkammer unter dem Mikroskop. Hinweis: Zelle pro ml = die Durchschnittszahl pro Quadrat x Verdünnungsfaktor x 10 4 </li><li> Legen Sie ca. 5 x 10 4 MES-Zellen auf jede gut. Langsam fallen die Zellsuspension auf die Mitte der Faserproben, statt ein Abrutschen auf die Seite des Brunnens, die Lösung aus dem Ablassen der Fasermatte zu verhindern. </li><li> 1 ml Differenzierungsmedium in jede Vertiefung, und halten Sie die Platte in einem Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2, um Zellen Befestigung, Wachstum und Differenzierung zu ermöglichen. </li><li> Saugen Sie das alte Medium aus jeder Vertiefung und ersetzen jeden zweiten Tag mit 1 ml frischem Differenzierungsmedium. </li></ol> 6. Zellviabilitätsmessungen <ol><li> Saugen Sie das alte Medium aus jedem Well. </li><li> Mischen 1/10 Volumen von Resazurin Fluoreszenz-Reagenz mit Kulturmedium und Zugabe von 1 ml in jede Vertiefung. </li><li> Incubaß bei 37 ° C und 5% CO 2 für 4 Stunden, vor Licht geschützt. </li><li> Nach 4 Stunden, dann 100 ul 3x des Reagenz aus jeder Vertiefung in eine 96-Well-Platte und dann die Proben sind bereit, auf einem Fluoreszenz-Spektralphotometer mit 560EX nm/590EM Filtereinstellungen gemessen werden. </li></ol> 7. Real Time PCR <ol><li> Nach 14 Tagen Kultur hinzufügen Lyse-Puffer zu den Proben zu isolieren, und die Gesamt-RNA aus den Zellen an der Faserproben. </li><li> Verwenden Sie 4 ul von Gesamt-RNA in cDNA in 20 ul Reaktions Skalen Synthese durch reverse Transkription. </li><li> Die PCR-Reaktionsgemisch in jedem optischen Röhre: 10 ul Master Mix (2x), 0,2 &amp;mgr; l Farbstoff, 8 &amp;mgr; l Nuklease-freiem Wasser, 1 &amp;mgr; l cDNA und 1 ul Primer (Primer in dieser Studie sind in Tabelle 1 aufgeführt). </li><li> Stellen Sie das PCR-Programm: ein. 95 ° C 2.20 min, 1 Zyklus b. 95 ° C 3 sec → 60 ° C 1 min, 40 Zyklus c. 95 ° C 15 s, 1 d-Zyklus. 60 ° C 1min, 1 Zyklus e. 95 ° C 15 sec, 1 Zyklus. Wählen Vergleichs C T-Methode, um die relative Genexpression zu bestimmen. </li><li> Nach der PCR beendet ist, analysieren die Echtzeit-PCR-Ergebnisse mit StepOne-Software und exportieren Sie die Ergebnisse in Excel. </li></ol>

<ol><li>Migneco, F., Huang, Y. -C., Birla, R. K., Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly+%28glycerol-dodecanoate%29%2C+a+biodegradable+polyester+for+medical+devices+and+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Poly (glycerol-dodecanoate), a biodegradable polyester for medical devices and tissue engineering scaffolds.</a> Biomaterials. 30, 6479-6484 (2009).</li>
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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Grenzen der einfachen Kollektoren oder die Komplexität der Drehkollektoren, die derzeit zum Elektro erhöhen die Beschränkung der Erhalt der gewünschten Länge und Größe der Fasermatte für einige Anwendungen verwendet werden. Zusätzlich Übertragen Fasern aus dem Erdkollektor in die Kulturschale oder anderen Substraten 5 ist eine Herausforderung. In diesem Bericht wird ein neu gestalteten Sammler, durch das Hinzufügen einer Aluminiumfolienstreifen mit der geerdeten Kollektor hergestellt, konnte die große Fas...

Elektrospinnen ist eine der wirksamsten Methoden, um die Verarbeitung der Mikro-zur Nanometer-Größe Fasergerüste herzustellen. Das Grundprinzip der Elektro beinhaltet eine Taylor-Konus der Lösung, die an der Öffnung der Nadel durch Anlegen einer Hochspannung zwischen der Nadelspitze und einem geerdeten Kollektor gehalten wird. Wenn die elektrostatische Abstoßung in der Lösung überwindet die Oberflächenspannung, wird eine geladene Flüssigkeitsstrahl von der Nadelspitze ausgestoßen wird, durch die Luft mit Lösungsmittelverdampfung, und wird schließlich auf der geerdeten Kollektor abgeschieden. Die Spritzenpumpe stellt einen kontinuierlichen Fluss von Lösung aus der Spinndüse austretende und damit mehrere Kopien der elektrogesponnenen Fasern in kurzer Zeit hergestellt werden. Im Verlauf Verlassen der Spinndüse zu dem Kollektor zu gelangen, wird der geladene Strahl durchlaufen Dehnung und Schlag nach einer Anzahl von Parametern, die die Viskosität und die Oberflächenspannung der Polymerlösung enthalten, die elektrostac Kraft in der Lösung, und die Wechselwirkung des externen elektrischen Feldes, usw. 2. In der Elektrospinnverfahren dient ein Sammler als ein leitfähiges Substrat, wo die Mikro-bis Nanometer-Fasern abgelagert werden könnte. In dieser Studie wurde eine neue Art von Fasersammler wurde entwickelt, um Fasermatten mit der gewünschten Größe (Länge x Breite) zu erhalten. Traditionell wird die Aluminiumfolie als Kollektor verwendet, aber es ist schwierig, die Fasern von der flachen Oberfläche an ein anderes Substrat zu übertragen. Die Schwierigkeiten bei der Ernte eine intakte Fasermatte von einem traditionellen Sammler war vor allem aufgrund der Tatsache, dass die elektrogesponnenen Fasern legen stark an die Sammler-Oberfläche. Daher modifizierten wir die Sammler durch Falten ein Stück Aluminiumfolie zu einem rechteckigen Streifen und Befestigung senkrecht zu einer flachen Metallplatte. Die elektrogesponnenen Fasern in dem Bereich zwischen der Spitze des Streifens und der Metallplatte, die leicht auf einen anderen übertragen werden können substrat gestrecktE. Das Interesse an thermisch vernetzten elastomeren Polymeren wächst schnell, weil der Pionierarbeit von Robert Langer-Gruppe, die Poly (Glycerin Sebacat) (PGS), ein Polyester, der analog zu vulkanisierten Kautschuks in 2002 3. Ähnlich PGS eingeführt wurde, haben wir erfolgreich entwickelt Poly (Glycerin-Dodecanoat) (PID) durch thermische Kondensation von Glycerin und Dodecandisäure und demonstriert seine einzigartige Formgedächtniseigenschaft ein. Im Gegensatz zu steiferen synthetischen Materialien Poly (Hydroxybutyrat) oder Poly (L-lactid) (Young-Modul von 250 MPa und 660 MPa) aufweist PGD elastomere Eigenschaft wie Gummi, mit einem Young-Modul von 1,08 MPa, wenn die Temperatur über 37 ° ist C, die eine enge Übereinstimmung mit der in-situ peripheren Nerven (0,45 MPa) ist. Darüber hinaus ist die PID biologisch abbaubar und die Abbauzeit kann durch Variation des Verhältnisses von Glycerin und Dodecandisäure fein abgestimmt werden. Dodecandisäure ist ein Zwölf-Kohlenstoff-UnterPosition mit zwei endständigen Carboxygruppen, HOOC (CH 2) 10 COOH. Auch nummeriert Dicarbonsäuren wie Sebacinsäure und Dodecandisäure kann metabolisiert werden zu Acetyl-CoA und geben Sie den Tricarbonsäurezyklus (TCA) / (Zitronensäure-Zyklus). Das Stoffwechselprodukt von Dicarbonsäuren, Succinyl-CoA, ein gluconeogenetischen Vorläufer und Zwischen der TCA-Zyklus 4. So schlugen einige Studien, dass sie als alternativer Kraftstoff Substrat für die enterale und parenterale Ernährung, insbesondere bei der pathologischen Bedingungen verwendet werden. Außerdem weist eindeutige PID Formgedächtnis weil ihre Glasübergangstemperatur 31 ° C, so zeigt es verschiedene mechanische Eigenschaften bei Raumtemperatur und Körpertemperatur. In der Summe ist die PID biologisch abbaubare, biokompatible, Ausstellen einzigartigen elastischen Eigenschaften mit ähnlichen Nervengewebe mechanische Eigenschaften; Daher ist es ein geeignetes Material für Nervengewebe Technik. In diesem Protokoll wird die elektrolange Fasern überspannt eine große Ablagefläche wurden über die neu gestalteten Sammler aus PGD hergestellt. Die Fasergerüste können mit der Maus pluripotente Stammzellen Wachstum und die Differenzierung zu unterstützen.

<table><tbody><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>Dodecandisäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1009</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1890</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethylenoxid) (PEO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>182028</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>132350250</td><td>0,10</td></tr>%<tr><td>embryonale Stammzellen</td> <td>der MausGlobalStem</td><td>GSC-5002</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Becton Dickinson</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30272.02</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td>1%</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Stemgent</td><td>03-0002</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin-Fluoreszenzfarbstoff</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62758-13-8</td><td></td></tr><tr><td>SV Gesamt-RNA-Isolationssystem</td><td>Promega</td><td>Z3100</td><td></td></tr><tr><td>GoScript Reverse Transkriptionssystem</td><td>Promega</td><td>A5000</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6001</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>Fisher scientific</td><td>14-831-200</td><td></td></tr><tr><td>Hochspannungs-Stromquelle&nbsp;</td><td>Spellman High Voltage Electronics Corporation</td><td></td><td>SL30</td></tr><tr><td>UV-Licht</td><td>Philips</td><td>308643</td><td>15W/G15T8</td></tr><tr><td>Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600</td><td>Perkin Elmer</td><td>8488</td><td></td></tr><tr><td>StepOne Real-time PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td>4376357</td><td></td></tr></tbody></table>

elektro faser-gerüste von poly (glycerin-dodecandioat) für ingenieurnervengewebe aus embryonalen stammzellen der maus

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Für Tissue-Engineering-Anwendungen ist die Herstellung von biologisch abbaubaren und biokompatiblen Stützgerüste der wünschenswerteste aber schwierige Aufgabe. Von den verschiedenen Herstellungsverfahren, ist die Elektro attraktiv wegen ihrer Einfachheit und Vielseitigkeit. Zusätzlich elektrogesponnene Nano imitieren die Größe der natürlichen extrazellulären Matrix gewährleistet zusätzliche Unterstützung für das Überleben der Zelle und Wachstum. Diese Studie zeigte, die Lebensfähigkeit der Herstellung von Langfasern sich über eine größere Ablagefläche für eine neuartige biologisch abbaubare und biokompatible Polymer namens Poly (Glycerin-Dodecanoat) (PGD) 1 unter Verwendung einer neu entwickelten Kollektor für Elektro. PID zeigt einzigartige elastischen Eigenschaften mit ähnlichen mechanischen Eigenschaften von Nervengewebe, somit geeignet für neuronale Gewebe-Engineering-Anwendungen ist es. Die Synthese und Herstellung Set-up für die Herstellung von Fasergerüstmaterial war einfach, sehr gut reproduzierbar und kostengünstig. BiokompatibilitätTests könnten Zellen aus embryonalen Stammzellen der Maus abgeleitet zu haften und wachsen an den elektro PGD Fasern. Zusammenfassend dieses Protokoll ein vielseitiger Herstellungsverfahren für die Herstellung von PGD elektrogesponnenen Fasern um das Wachstum von embryonalen Maus-Stammzellen abgeleitete neuronale Linie Zellen unterstützen.

Die Hauptkomponenten der Elektro sind in Abbildung 1 dargestellt. Ein großer Größe Fasermatte wurde in der Regel durch die senkrecht befestigt Aluminiumfolienstreifen und einer flachen Metallplatte erhalten. Abbildung 2 zeigt die Kollektordesign und die Elektrofasermatte. Die Breite und Länge kann für unterschiedliche Anwendungen angepasst werden. Die Länge der Faser mit PID-Grundlösung und Polymermischung hergestellt ist, bis zu 10 cm. Die Morphologie der elektrogesponnenen Fasern ist ...

Synthese und Herstellung von elektro langen Fasern sich über eine größere Ablagefläche über einen neu gestalteten Sammler aus einem neuartigen biologisch abbaubaren Polymer namens Poly (Glycerin-Dodecanoat) (PGD) wurde berichtet. Die Fasern waren in der Lage, das Wachstum von pluripotenten Zellen aus Maus-Stammzellen zu unterstützen.

Elektro Faser-Gerüste von Poly (Glycerin-dodecandioat) für Ingenieurnervengewebe aus embryonalen Stammzellen der Maus

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Bei diesem Verfahren werden von Electros gesponnene lange Fasern aus einem neuartigen biologisch abbaubaren Polymer namens Polyglycerin Dote Cano Eight hergestellt. Richten Sie zunächst den neu entwickelten Kollektor ein und bereiten Sie die polymere Lösung für das Elektrospinnen vor, indem Sie eine Spritze und eine Pumpe verwenden und die Lösung zum Kollektor abgeben. Übertragen Sie dann die resultierende Fasermatte zur Vernetzung in eine Kulturschale.Als nächstes säen Sie embryonale Stammzellen der Maus auf den geschnittenen Fasern. Letztendlich können die Ergebnisse zeigen, dass die embryonalen Stammzellen der Maus überleben und sich auf den Fasergerüsten zu Nervenzellen differenzieren können. Im heutigen Video haben wir Ihnen gezeigt, wie Sie das Biomaterial aus der Herstellung von Synzellen vorbereiten und schließlich diese Elektrospan-Fasern für die Zellkultur verwenden können.Vor allem, wenn wir mit der aus Poly gewonnenen Zelle und der Fleckenzelle kombinieren. Sie könnten in Zukunft eine sehr wichtige Anwendung für die Zellabgabe und die Herstellung eines funktionsfähigen Gewebes haben. Gewebe invis heute, dass sie Ihnen eine schreckliche Prozedur demonstrieren wird.Sie ist das Größte in meinem Labor. Schneide die Alufolie in ein rechteckiges Stück. Falten Sie das rechteckige Stück zu einem rechteckigen Streifen und befestigen Sie es senkrecht mit Klebeband an einer flachen Metallplatte.Die Länge des Streifens hängt von der Größe der Fasermatte ab, die für die Polymerlösung benötigt wird. Gemischtes Glycerin und Do Decandiic in einem molaren Verhältnis von eins zu eins bei 120 Grad Celsius für 100 Stunden. Um ein Polyglycerin zu erhalten, löst das decanische Polymer Polyethylenoxid und Gelatine in 65%igem Ethanol mit einem Gewichtsverhältnis von 1,5 bis drei bis 95,5 in einer 15-Milliliter-Tube auf.Ziehen Sie die Kappe fest und erhitzen Sie die Mischung im Ofen bei 60 Grad Celsius für eine Stunde und rühren Sie alle 15 Minuten, bis die Grundlösung homogen ist. Für das Elektrospinnen mischen Sie das PGD-Polymer und die Basallösung. In einem Gewichtsverhältnis von vier bis sechs fügen Sie 0,1 % Riboflavin in die Mischung hinzu und mischen Sie sie gut.Führen Sie die Polymerlösung in eine Fünf-Milliliter-Standardspritze mit einer 18-Gauge-Nadel aus abgestumpftem Edelstahl ein. Führen Sie dann die Spritze in eine Spritzenpumpe ein. Befestigen Sie das geerdete Kabel einer Hochspannungsstromquelle an der Metallplatte und das positiv geladene Kabel an der Nadel.Passe auch den Abstand zwischen der Nadel und der Alufolie an. Auf 15 Zentimeter abstreifen. Platzieren Sie nun die Spritzenpumpe in einem Winkel von ca. 15 Grad zur Horizontalen, um eine Aggregation der Fasern an der Vorderseite des Streifens zu verhindern.Schalten Sie die Spritzenpumpe ein und stellen Sie die Durchflussmenge der Pumpe auf 0,6 Milliliter pro Stunde ein. Schalten Sie die Hochspannungsquelle ein und stellen Sie die Betriebsspannung auf 14,6 Kilovolt ein. Nachdem die Entnahme abgeschlossen ist, setzen Sie die Fasermatte 60 Minuten lang UV-Licht aus, um sie zu vernetzen.Übertragen Sie die Fasermatte vom Alufolienstreifen in eine 100 Millimeter Petrischale. Schneiden Sie die Fasermatte mit der chirurgischen Klinge in runde, gleich große Stücke und legen Sie die Stücke in eine 24-Well-Platte. Setzen Sie die Platte dann für eine weitere 20-minütige Sterilisation mit UV-Licht aus, um die Zellen vor der Behandlung zu behandeln.Tauchen Sie die Faserproben in einen Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung und inkubieren Sie sie am nächsten Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius. Saugen Sie das PBS vorsichtig an. Geben Sie in jede Vertiefung einen Milliliter Differenzierungsmedium und inkubieren Sie drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius.Nach dem Aspirieren des Differenzierungsmediums werden vorsichtig 0,2 Milliliter Matri-Gel zu jeder Faserprobe hinzugefügt und 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Matri-Gel von beiden. Einmal mit zwei Millilitern Differenziermedium gut nachspülen.Geben Sie einen Milliliter Tase nach 10 Minuten bei einer Temperatur von 37 Grad Celsius in die embryonale Stammzellkulturschale der Maus. Wenn die MES-Zellen abgelöst sind, fügen Sie vier Milliliter Differenzierungsmedium hinzu. Sammeln Sie die schwimmenden MES-Zellen fünf Minuten lang in einer 15-Milliliter-Röhrchenzentrifuge bei 400 g.Suspendieren Sie die pelletierten Zellen in vier Millilitern Differenzierung. Mittel. Übertragen Sie 200 Mikroliter der Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie 10 Differenzierungsvolumina hinzu. Mittel. Übertragen Sie 15 Mikroliter der verdünnten Zellsuspension in eine Kammer auf dem Hämozytometer.Zählen Sie mit einem Deckglas die Zellen im ein Millimeter großen Quadrat in der Mitte und in den vier Eckquadraten des Hämozytometers. Lass dich nun fünfmal 10 auf den vierten fallen. ES-Zellen der Maus langsam in die Mitte der Faserproben aufbringen.Geben Sie einen Milliliter Differenzierungsmedium in jede Vertiefung und kultivieren Sie sie bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für die Zellanhaftung. Wachstum und Differenzierung. Füllen Sie jeden zweiten Tag den einen Milliliter Differenzierungsmedium auf.Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu messen, aspirieren Sie das alte Medium aus jeder Vertiefung und fügen Sie einen Milliliter eines Verdünnungsreagenzes von eins zu 10 und eines Fluoreszenzreagenzes in die Kultur hinzu. Medium Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für vier Stunden vor direktem Licht. Übertragen Sie dann dreifache Proben von 100 Mikrolitern aus jeder Vertiefung auf eine 96-Well-Platte und messen Sie die Fluoreszenz Rasterelektronenmikroskopische Bilder wurden verwendet, um die Morphologie der elektrogesponnenen Fasern zu bewerten.Die Durchmesser dieser Fasern aus 40%iger PID-Konzentration liegen hier im Mikrometerbereich. Differenzierte embryonale Stammzellen der Maus wurden drei Tage lang auf den Fasern kultiviert und mit konfokaler Mikroskopie das exprimierte grün fluoreszierende Protein sichtbar gemacht. Die erhöhte Anzahl von grün fluoreszierenden Zellen am sechsten Tag deutet darauf hin, dass die Fasergerüste sowohl die Zelladhäsion als auch die Zellproliferation unterstützen können.Zu- und Fluoreszenzmessungen zeigten, dass die Beschichtung mit Matrigel und Laminin zu einer gleichwertigen Zellviabilität und einer relativ höheren Proliferation führte. Die Flury-Potenz und die neuralen Zellmarker wurden am ersten Tag durch Echtzeit-PCR quantifiziert. Die Mehrzahl der MES-Zellen, die auf Fasern kultiviert wurden, exprimierten die Pluripotenzmarker.OCT vier nano und SOX zwei. Eine kleinere Untergruppe exprimierte die neuralen Stammzellmarker PAC sechs und Neston. Nach zwei Wochen in Kultur gab es erhöhte Expressionsniveaus einiger neuraler Zellmarker, wie z. B. Karte zwei und DCX sowie Oligodendrozytenmarker Oligo eins und Astrozytenmarker.GFAP Einmal gemeistert. Diese Technik kann in zwei bis drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

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Bioengineering

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Der Prozess der Elektrospinnen Polymere für Tissue Engineering und Zellkulturen ist in diesem Artikel behandelt. Insbesondere wird das Elektrospinnen von photoreaktiven Makromere mit zusätzlichen Verarbeitungsmöglichkeiten Photostrukturierungsverfahren und Multi-Polymer-Elektrospinnen beschrieben.

Elektrospinnen Faserige Polymer Gerüste für Tissue Engineering und Cell Culture

Ausgerichtet elektroversponnenen Fasern direkt das Wachstum von Neuronen in vitro und stellen eine potentielle Komponente der Nervenregeneration Gerüsten. Wir beschreiben ein Verfahren zur Herstellung elektrogesponnenen Fasersubstrate und das Serum-freie Kultur von primären Ratten-E15 sensorischen (DRG) und motorischen Neuronen. Visualisierung von Neuronen durch Immunzytochemie ist ebenfalls enthalten.

The Culture of Primary Motor und sensorischen Neuronen in definierten Medien auf Elektrogesponnene Poly-L-Lactid Nanofiber Gerüste

Diese Arbeit wird die Herstellung von 3D-Fibrin-Gerüste für die Kultivierung und Differenzierung von Stammzellen plutipotent. Solche Gerüste verwendet werden, um die Auswirkungen von verschiedenen biologischen Verbindungen zur Stammzellforschung Verhalten Bildschirm als auch modifiziert werden, um Drug Delivery-Systemen enthalten sein.

Erstellung von 3D-Fibrin-Gerüste für Stem Cell Culture Anwendungen

Hier beschreiben wir die Verwendung eines sich selbst organisierenden 3-dimensionalen Gerüst zur Kultur humaner neuraler Vorläuferzellen. Wir präsentieren ein Protokoll, um die Zellen aus dem Gerüste Freisetzung analysiert anschließend zB mittels Durchflusszytometrie werden. Dieses Protokoll kann zu anderen Zelltypen angepasst werden, um detaillierte mechanistisch Studien durchzuführen.

Kultivierung humaner neuronaler Vorläuferzellen in einer 3-dimensionalen Self-Montage Peptide Hydrogel

Elektrogesponnene Gerüste können Post-Production für das Tissue Engineering-Anwendungen verarbeitet werden. Hier beschreiben wir Methoden für die Spinnerei komplexe Gerüste (durch aufeinander folgende Spinning), für die Herstellung dicker Gerüste (durch Multi-Schichtung mit Hitze und Dunst Glühen), für das Erreichen Sterilität (aseptische Produktion oder Postproduktion Sterilisation) und für die Erreichung entsprechenden biomechanischen Eigenschaften.

Postproduction Verarbeitung von Elektrogesponnene Fasern für Tissue Engineering

Dieses Protokoll kombiniert Elektrospinnen und Mikrosphären, um Gewebegerüste zu entwickeln, die Neuronen lenken. Der Nervenwachstumsfaktor wurde in PLGA-Mikrosphären eingekapselt und in faserige Gerüste aus Hyaluronsäure (HA) elektrogesponnen.  Die Proteinbioaktivität wurde getestet, indem die Gerüste mit den Spinalwurzelganglien des Primärkükens besät und 4-6 Tage lang kultiviert wurden.

Elektro Growth Factor Releasing Mikrosphären in Fasergerüste

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur elektroNanoFaserGerüste mit abgestuften Organisation der Fasern herzustellen und zu erforschen ihre Anwendungen bei der Regulierung der Zellmorphologie / Ausrichtung. Farbverläufe in Bezug auf physikalische und chemische Eigenschaften der Nanofasergerüste bieten eine Vielzahl von Anwendungen im Bereich der Biomedizin.

Elektronanofasergerüste mit Abstufungen in Fiber-Organisation

Einblicke in die komplexen Aktionen des Gehirns erfordern fortschrittliche Forschungswerkzeuge. Hier demonstrieren wir ein neuartiges, auf Seidenkollagen basierendes 3D-Modell von neuronalem Gewebe, das einer gehirnähnlichen Architektur ähnelt. Das Modell kann verwendet werden, um die Assemblierung neuronaler Netzwerke, die axonale Führung, Zell-Zell-Interaktionen und die elektrische Aktivität zu untersuchen.

Engineered 3D Silk-Kollagen-basierten Modell von polarisiertem Neural Tissue

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die 3D Kultur der Ratte Gehirn abgeleitet Glia-Zellen, einschließlich der Oligodendrozyten, Astrozyten und Mikroglia. Wir zeigen Primärzelle Kultur, methacrylated Hyaluronsäure (HAMA) Hydrogel Synthese, HAMAphoto-Polymerisation und Zelle Kapselung und Probe Verarbeitung für die konfokale und scanning Electron mikroskopische Bildgebung.

3D Hydrogel Kulturen von primären Gliazellen für In-vitro- Modellierung von Neuroinflammation verbessert

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von einem Zellkultursystem zu ermöglichen, Aussaat von Stammzellen auf einem leitfähigen Polymer Gerüst für in-vitro- elektrische Stimulation und anschließende in Vivo Implantation von Stammzellen entkernt Gerüst mit einer minimal-invasive Technik.

Elektrisch leitfähige Gerüst zu modulieren und Stammzellen liefern

Erfahren Sie die Herstellung elektrogesponnener Fasern aus Poly(Glycerin-Dodecandioat) für Gewebeengineering. Diese Methode unterstützt das Wachstum und die neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus.

Elektro Faser-Gerüste von Poly (Glycerin-dodecandioat) für Ingenieurnervengewebe aus embryonalen Stammzellen der Maus

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