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Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

Maus-Genotypisierung

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Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

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JoVE Science Education Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

Mouse Genotyping

4.7: Development and Reproduction of the Laboratory Mouse

4.15: Zebrafish Microinjection Techniques

88,943 Views

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08:27 min

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April 30, 2023

Overview

Auch wenn das menschliche Genom vor über 10 Jahren gemapped wurde, sind die Wissenschaftler noch lange nicht soweit, dass sie ein Verständnis der Funktion von jedem menschlichen Gen haben! Ein Weg um zu beurteilen, was die Funktion eines Gens ist, ist die kodierte Sequenz zu unterbrechen und danach bewertet man die Auswirkungen dieser Änderung (der Phänotyp) auf die Biologie des Tieres. Dieser Ansatz wird üblicherweise in der Maus (Mus musculus) verwendet, da sie eine hohe genetische Ähnlichkeit mit dem Menschen teilt. Um die genetischen Veränderungen der Tiere über mehrere Generationen zu verfolgen, ist es notwendig, die DNA von jeder Maus in einem Verfahren bekannt als Genotypisierung zu screenen.

Dieses Video gibt einen Überblick über die Theorie und Praxis der Genotypisierung von Mäusen. Die Diskussion beginnt mit den Grundprinzipien der Mausgenetik einschließlich einer Übersicht der Begriffe homozygot, heterozygot, Wildtyp, Mutante und Transgene. Als nächstes werden Schritt-für-Schritt-Anweisungen zum Extrahieren und Reinigen von genomischer DNA aus dem Mausgewebe dargestellt. Einige Beispiele werden bereitgestellt, die demonstrieren, wie Genotypisierungsergebnisse zu interpretieren sind aber auch wie man den Überblick über die Mäuse behält, die den gewünschten Genotyp haben. Zum Abschluss werden einige repräsentative Anwendungen des Genotypisierungsverfahrens vorgestellt um zu zeigen warum diese verbreitete Technik so wichtig für die Maus Forschung ist.

Procedure

Genotypisierung ist ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von spezifischen DNA-Sequenzen in dem Genom eines bestimmten Organismus. Da Gene den Phänotyp der Maus beeinflussen können, ist die Möglichkeit, den Aufbau oder den “Genotyp” einer individuellen Maus zu untersuchen entscheidend zur Prüfung eines Phänotyps eines spezifischen Gens. Dieses Video untersucht die Mausgenetik, demonstriert wichtigste Schritte des Genotypisierungsverfahrens und erklärt, wie man PCR-basierte Genotypisierungsergebnisse interpretiert.

Um zu verstehen, was Forscher suchen, wenn sie Mäuse genotypisieren, wollen wir einige allgemeine Manipulationen der Mausgenetik besprechen.

Um ein Gen zu untersuchen, stören Wissenschaftler häufig die Funktion dieses Gens, indem Sie dessen Gensequenz verändern. Allerdings sind Mäuse diploid, daher haben sie zwei Kopien von jedem Gen. Da die meisten Gene nur eine normale Kopie benötigen um zu funktionieren, müssen die Mäuse so gezüchtet werden, dass beide Gene inaktiviert sind, bevor man den Phänotyp untersuchen kann.

Dieser Genotyp wird als “homozygoter Knockout” oder häufiger und kürzer einfach

“Knockout” genannt. Umgekehrt wird eine normale Maus mit zwei funktionellen Kopien als “homozygoter Wildtyp” oder nur “Wildtyp” genannt. Schließlich werden die Mäuse mit nur einer funktionellen Kopie als “heterozygot” oder “Het” bezeichnet.

Anstelle des Entfernens von genetischem Material, erfordern einige Versuche das Einfügen von DNA-Sequenzen in das Genom der Maus.

Diese eingefügten DNA-Fragmente werden “Transgene” genannt und die Mäuse, die sie tragen, sind “transgene” Mäuse. Das häufigste “Transgene”, das in Mäuse eingeführt wird, reguliert die Expression des grün fluoreszierendem Proteins oder GFP aus den Quallen. Durch die Verwendung eines gewebespezifischen Promotors (eine regulatorische Sequenz, dass die Aktivität eines Gens “fördert”) um die GFP-Produktion zu steuern, können Zellen aus einem spezifischen Gewebetyp leicht durch die grüne Fluoreszenz identifiziert werden.

Da viele genetische Veränderungen nicht zu einem leicht erkennbaren Phänotyp führen, wie die GFP-Expression, müssen die Mäuse genotypisiert werden, um festzustellen, welche spezifischen Tiere in den Versuchen verwendet werden sollen. Vor der Genotypisierung müssen die Mäuse sorgfältig markiert werden, damit sie später erneut identifiziert werden können. Man benötigt etwas, dass mehr beständiger ist als das. Ein übliches Verfahren besteht darin, eine Kerbe im Ohr zu machen so dass sich die Position und die Anzahl der Kerben auf eine ID-Nummer bezieht.

Sobald die Maus markiert wurde, muss eine kleine Gewebeprobe (typischerweise 2-5 mm vom Schwanz unter Verwendung einer Rasierklinge oder einer Schere) entnommen werden, aus der die DNA extrahiert wird. Wenn man das Gewebe von mehr als einer Maus sammelt, sollte man die verwendeten Teilabschnitte der Klinge markieren, um sicherzustellen, dass nicht der selbe Teilabschnitt beim nächsten Tier verwendet wird, da dies zu Kreuzkontaminationen in den Proben führen könnte.

Um den Prozess der Trennung des genetischen Materials von den anderen Komponenten des Gewebes zu beginnen, wird die Probe in Lysepuffer aufgeschlossen, der das Enzym Proteinase K enthält. Nach einer Verdauung über Nacht, wird die Probe zentrifugiert, um Haare und andere unverdaute Materialien zu pelletieren. Um die DNA von verdautem Lysat zu isolieren, ist Alkohol eine einfache und effektive Methode, um Nukleinsäuren auszufällen. Nach einer kurzen Inkubation wird die Probe erneut zentrifugiert um die DNA in einem Pellet zu sammeln.

Nach dem Waschen mit 70% Ethanol um überschüssige Salze zu entfernen, wird das DNA-Pellet in Wasser oder Puffer resuspendiert und ist bereit für die Genotypisierung.

Es gibt viele Strategien, um festzustellen, ob eine bestimmte DNA-Sequenz in der Maus vorhanden ist. Die meisten von ihnen erfordern zuerst die Vervielfältigung der genetischen Region von Interesse unter der Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion oder PCR. Weitere Informationen zur Durchführung einer PCR sind im wissenschaftlichen Bildungsteil “Leitfaden für die PCR” von JoVE zu finden.

Eine Methode um Genotypen zu unterscheiden ist die Erkennung der Größenveränderung des PCR-amplifizierten Fragments. Nehmen wir an, dass wir nach Mäuse mit einer genetischen Insertion von 700 Basenpaaren suchen. Nach der PCR sollte die Wildtyp-Bande bei etwa 200 Basenpaaren und die transgene Bande bei etwa 900 Basenpaaren sein.

Nach dem PCR-Durchlauf müssen die Reaktionsprodukte in einem angemessenen Prozentsatz des Agarose-Gels aufgetrennt werden, so können die Größen der Fragmente unterschieden werden. Die Wildtyp-Kontrolle sollte nur eine Wildtyp-Bande bei 200 Basenpaaren haben, die transgene Kontrolle sollte eine Bande bei 900 Basenpaaren haben und die Het-Kontrolle sollten beide Banden haben. Letztendlich wird eine “ohne Template” Kontrolle durchgeführt um sicherzustellen, dass die Reagenzien keinerlei kontaminierende DNA enthalten und diese Kontrolle sollte daher keine Bande erzeugen.

Da wir nun zuversichtlich sind, dass die Kontrollen wie erwartet funktioniert haben, wollen wir einen Blick auf die unbekannten Mäuse werfen. Da Maus 1 und 2 jeweils nur eine Wildtyp-Bande haben sind sie homozygot Wildtyp. Die Mäuse 4 und 6 haben jeweils nur eine transgene Bande und sind daher homozygot Transgen.

Und die Mäuse 3 und 5 haben jeweils zwei Banden und sind daher heterozygot.

Wenn man schließlich zurückgeht um die Mäuse mit dem richtigen Genotyp zu finden muss man nur das Muster der Ohr Kerben mit der ID-Nummer der Maus vergleichen.

Nachdem wir ein Verständnis gewonnen haben was die Genotypisierung ist und wie es gemacht wird, wollen wir einen Blick auf einige Beispiele werfen, warum es nützlich ist.

In einigen Fällen sind komplexere genetische Modifikationen erforderlich, um den gewünschten Phänotyp zu erzeugen. Zum Beispiel um das Modell von Hautkrebs bei Mäusen zu etablieren sind zwei Transgene erforderlich. Eins trägt ein induzierbares “Onkogen” oder ein Gen, das Krebs verursachen kann und das Zweite trägt das Enzym Cre-Rekombinase, das nur in Hautzellen exprimiert wird und eine Sequenz ausschneidet, das die Onkogen Transkription verhindert, wodurch die Onkogen-Expression ermöglicht wird. Um Nachkommen mit beiden Transgenen zu erzeugen, werden heterozygote Mäuse mit je einem Transgene miteinander gepaart. Die Genotypisierung wird dann verwendet um die gewünschte Nachkommen zu identifizieren.

Manchmal ist es nicht möglich, Mäuse vor einem Experiment zu genotypisieren. Zum Beispiel ist es in dieser Studie über die embryonale Herzfrequenz nicht möglich das Gewebe für die Genotypisierung aus den Embryos zu entnehmen ohne ihr Verhalten zu stören. Daher werden zuerst die Positionen der Embryonen innerhalb der Mutter sorgfältig markiert und danach werden Ultraschallmessungen aufgezeichnet. Zum Schluss werden Schwanzbiopsien gesammelt um die Auswirkungen des Genotyps auf die Herzfrequenz zu bestimmen.

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur DNA-Extraktion aber es gibt viele Variationen. Zum Beispiel benötigt das direkte PCR System weniger als fünf Minuten zur Gewebe Verdauung. Darüber hinaus ist der Überstand nach der Zentrifugation vom unverdauten Material getrennt und bereit für die PCR wodurch die Notwendigkeit der DNA-Aufreinigung entfällt.

Dies war der JoVE Leitfaden für die Genotypisierung von Mäusen. In diesem Video haben wir die Grundlagen der Mausgenetik, wie man die DNA-Proben der Mäuse vorbereitet und analysiert, sowie einige praktische Anwendungen dieser Technik besprochen. Danke für das Aufpassen!

Transcript

Genotyping is the process of detecting the presence, or absence, of specific DNA sequences in a particular organism’s genome.

Since genes can influence a mouse’s phenotype, being able to probe an individual mouse’s genetic make-up, or “genotype,” is critical for attributing a phenotype to a specific gene. This video will explore mouse genetics, demonstrate key steps of the genotyping procedure, and explain how to interpret PCR-based genotyping results.

In order to understand what researchers look for when they genotype mice, let’s review some common manipulations to mouse genetics.

To study a gene, scientists frequently disrupt its function by altering its genetic sequence. However, mice are diploid, so they have two copies of any given gene. Since most genes need only one normal copy to function, the mice must be bred to produce an animal with both genes disrupted prior to studying phenotype.

This genotype is called a “homozygous knockout,” or more commonly just “knockout” for short. Conversely, a normal mouse with two functional copies is called a “homozygous wildtype,” or just “wildtype.” Finally, mice with just one functional copy are referred to as “heterozygous,” or “hets.”

Instead of removing genetic material, some experiments require the introduction of DNA sequences into the mouse genome. These inserted DNA fragments are called “transgenes,” and the mice that carry them are “transgenic.” The most common “transgene” introduced into mice is one that drives the expression of green fluorescent protein, or GFP, from jellyfish. By using a tissue-specific promoter (a regulatory sequence that “promotes” the activity of a gene) to drive GFP production, cells from a specific tissue type can be easily identified by green fluorescence.

Because many genetic changes do not lead to a readily observable phenotype, like GFP expression, mice need to be genotyped to determine which specific animal should be used in experiments. Prior to genotyping, mice should be carefully labeled so that they can be identified again later. No, you’ll need something more permanent than that. One common method is to make notches in the ear, such that the position and number of notches corresponds to an ID number.

Once the mouse is labeled, collect a small piece of tissue (typically 2 — 5 mm of tail, using a razorblade or scissors) from which to extract DNA. If you’re collecting tissue from more than one mouse, mark the used segments of the blade to ensure you won’t use the same part on the next animal, which could lead to cross-contamination in your samples.

To begin the process of separating the genetic material from other components of the tissue, the sample is digested in lysis buffer containing the enzyme proteinase K. After an overnight digestion, the sample is centrifuged to pellet hair and any other undigested material. To isolate DNA from the digested lysate, a simple and effective method is to add alcohol to precipitate nucleic acids. After a brief incubation, the sample is centrifuged again to collect the DNA in a pellet.

After washing with 70% ethanol to remove excess salts, the DNA pellet is resuspended in water or buffer and is ready for genotyping.

There are many strategies to determine whether a specific DNA sequence is present in your mice. Most of them require you to first amplify the genetic region of interest using the polymerase chain reaction, or PCR. For more information on how to set up PCR, please check out the JoVE Science Education “Guide to PCR.”

One method to distinguish genotypes is to detect changes in the size of the PCR-amplified fragment. Let’s say that you’re screening for mice with a genetic insertion of 700 base pairs. After PCR, wildtype bands are 200 base pairs, and transgene bands should be 900 base pairs.

After running your PCR, separate the reaction products on an appropriate percentage agarose gel, so you can distinguish the sizes of your fragments. The wildtype control should only have the 200 base pair wildtype band; the transgenic control should only have the one 900 base pair, transgene band; and the het control should have both bands. Finally, a “no template” control is included to be sure the reagents do not contain any contaminating DNA, and should therefore not generate any bands.

Now that we are confident that the controls worked as expected, let’s check out the unknown mice. Since mice 1 and 2 each have only one, wildtype band, they are homozygous wildtype. Mice 4 and 6 each have only one, transgene band, and are therefore homozygous transgenic.

And mice 3 and 5 each have two bands, and are therefore hets.

Finally, when you go back to find the mice with the genotype you want, you just need to match up the pattern of ear notches with the mouse’s ID number.

After gaining an understanding of what genotyping is and how it’s done, let’s look at some examples of why it’s useful.

In some cases, more complex genetic modifications are required to produce the desired phenotype. For example, to establish this model of skin cancer in mice, two transgenes are required. One carries an inducible “oncogene,” or a gene that can cause cancer, and the second carries the enzyme Cre recombinase, which is only expressed in skin cells and excises a sequence that prevents oncogene transcription, thereby allowing oncogene expression. To produce offspring with both transgenes, mice heterozygous for each are mated. Genotyping is then used to identify the desired offspring.

Sometimes it may not be possible to genotype mice before an experiment. For example, in this study of embryonic heart rate, it is not feasible to collect tissue for genotyping from the embryos without disrupting their behavior. Therefore, the embryo positions within the mother are first carefully labeled, then ultrasound measurements are recorded. Finally, tail biopsies are collected to determine the effect of the genotype on heart rate.

This video has demonstrated one method of DNA extraction, but there are many variations. For example, the Direct PCR system requires less than five minutes of tissue digestion. Additionally, after spinning down undigested material, the supernatant is ready for PCR, eliminating the need for DNA purification.

You’ve just watched JoVE’s guide to genotyping mice. In this video, we’ve reviewed the basics of mouse genetics, how to prepare and analyze mouse DNA samples, as well as some practical applications of this technique. Thanks for watching!

Tags

Mouse Genotyping DNA Sequences Genotype Phenotype PCR-based Genotyping Mouse Genetics Genetic Manipulation Homozygous Knockout Wildtype Heterozygous Transgenes Transgenic Mice