Feeder freie Ableitung von Neural Crest Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Neuralleisten-Vorläuferzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen in einem kurzen, reproduzierbaren und definierten Protokoll zu generieren. Diese Zellen können dann entweder für die Untersuchung von Neuralleisten-bedingten Erkrankungen in vitro oder für die fortgesetzte Differenzierung dieser Zellen zu Nachkommenzellen verwendet werden. Dies wird erreicht, indem zunächst eine hohe Dichte an humanen pluripotenten Stammzellen in einer Monoschicht auf Matrigel plattiert wird.

Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen unter Verwendung einer definierten Sequenz und Kombination von kleinen Molekülen, die wichtige Signalwege beeinflussen, in Neuroepithelzellen zu differenzieren. Als nächstes werden die Neuroepithelzellen plattiert und weiter zu Neuralleisten-Vorläuferzellen differenziert. Der letzte Schritt besteht darin, die Neurokammzellen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung zu isolieren.

Letztendlich werden Immunfluoreszenz und funktionelle Assays wie die Fähigkeit der Zelle zur Migration verwendet, um zu zeigen, dass die richtigen Neuralleistenzellen erzeugt wurden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Protokollen zur Gewinnung von Neurokammzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen besteht darin, dass sie kürzer ist. Es sind nur 18 Tage.

Es ist reproduzierbarer, da es keine MS-Fünf-Feeder-Zellen gibt. Es ist einfach, es hochzuskalieren, und es ist unter menschlichen pluripotenten Stammzelllinien hochgradig reproduzierbar. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Untersuchung von Mechanismen menschlicher Krankheiten, die mit der Neurore-Linie zusammenhängen, und zeigen das Potenzial zur Verbesserung der Detailgenauigkeit der In-vitro-Modellierung und des Wirkstoffscreenings dieser Krankheiten.

Vor Beginn dieses Protokolls wurde sichergestellt, dass die Kolonien menschlicher pluripotenter Stammzellen groß genug sind, um mit dem Auge gesehen zu werden, und dass sie immer noch scharfe Kanten mit wenigen differenzierenden Zellen an ihren Rändern aufweisen. Dann, wenn die H-PSCs bereit sind, gespalten zu werden, saugen Sie das Medium einmal mit fünf Millilitern eines XPBS an und fügen Sie vier Milliliter mit 0,05 %-Trips in EDTA zu den Zellen hinzu. Schütteln Sie die Schale zwei Minuten lang horizontal, bis die embryonalen Fibroblasten der Maus unter dem Mikroskop zu sehen sind, die sich als einzelne Zellen von der Platte abheben.

Die HPSC-Kolonien bleiben als Kolonien an der Schale haften, aspirieren dann sofort und gründlich das Trypsin und lassen die Platte zwei bis vier Minuten lang bei Raumtemperatur stehen. Geben Sie zwei Milliliter HES-Medium in die Platte und verwenden Sie eine P 1000-Pipette, um die Zellen zu lösen. Wenn sich die Zellen nicht leicht abheben lassen, inkubieren Sie die Platte für weitere zwei bis drei Minuten.

Bei Raumtemperatur wird die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt, das acht Milliliter HES-Medium enthält, ergänzt mit 10 mikromolaren Y2 7 6 3 2 Dihydrochlorid. Aspirieren Sie dann das Matrigel aus einer zuvor behandelten 10-Zentimeter-Schale und plättieren Sie die Zellen im Verhältnis eins zu eins oder eins zu zwei auf die mit Matrigel behandelte Platte. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator.

Füttern Sie die Zellen täglich mit HES-Medium, bis sie bereit für die Differenzierung sind. Beginnen Sie dann mit der neuronalen Differenzierung, wenn die Zellen zu 90 % bis 100 % konfluent sind. Das ist der Tag Null.

Füttern Sie die Zellen täglich vom ersten bis zum dritten Tag mit 10 Millilitern KSR-Differenzierung, Medium mit 0,1 Mikromolen, LDN 1, 9, 3, 8, 9 und 10 MIKROMOLAREN SB 4 3 1 5 42. Füttern Sie die Zellen dann am vierten und fünften Tag mit 10 Millilitern Medien mit 75 % KSR-Differenzierung, Medium 25 % und zweitem Differenzierungsmedium 0,1, mikromolaren LDN 1, 9 3, 1, 8, 9 und 10 mikromolaren SB 4 3 1 5 42. Füttern Sie die Zellen am sechsten und siebten Tag mit einem Medium, das so eingestellt ist, dass es 50 % KSR-Differenzierung, Medium und 50 % enthält, und zweitens, Differenzierungsmedium, zusätzlich zu 0,1 mikromolarem LDN, 1, 9 3, 1, 8, 9 und 10 mikromolaren SB 4 3 1 5 2.

Füttern Sie die Zellen an den Tagen acht bis neun mit 25 % KSR-Differenzierung, mittel und 75 % und zwei mit Differenzierungsmedium, beide mit 0,1 mikromolaren LDN 1 9 3 1 8, 9 und 10 mikromolaren SB 4 3 5 2. Bereiten Sie dann an Tag neun und 10 Kulturschalen mit Poly-L orhan laminin one und Fibronektin vor, wie im Textprotokoll beschrieben, die zum Replattieren verwendet werden. Die Zellen an Tag 11 füttern die Zellen mit N zwei Differenzierungsmedium, ergänzt mit 0,1 mikromolaren L DN 1 9 3, 109 und 10 mikromolaren SB 4 31 5 42. An Tag 10 an Tag 11 aspirieren Sie das Laminin on und die Fibronektinlösung aus den zuvor vorbereiteten Kulturschalen und lassen sie bei Raumtemperatur in einer Gewebekulturhaube 20 bis 30 Minuten trocknen.

Entfernen Sie anschließend das Medium aus den Differenzierungszellen und waschen Sie die Zellen einmal mit einem XPBS. Geben Sie dann acht Milliliter Acuate auf jede 10 Zentimeter große Platte und inkubieren Sie die Platten 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie nach der Inkubation einen Zelllifter, um die Zellen abzulösen, und suspendieren Sie die Zellen dann wieder in der Accutane-Lösung.

Übertragen Sie die Zellsuspension mit einer Fünf-Milliliter-Pipette in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie dann fünf Milliliter eines XPBS in das Röhrchen und drehen Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 115 Gs. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Millilitern eines XPBS. Filtrieren Sie dann die Zellsuspension durch einen 40-Mikron-Zelltrainer, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten.

Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Schleudern Sie die Zellen erneut für fünf Minuten bei 115 G herunter und resuspendieren Sie die Zellen auf eine Konzentration von 100.000 bis 150.000 Zellen pro 10 Mikroliter ergänztem N zwei Differenzierungsmedium. Verwenden Sie eine Repetierpipette, um 10 Mikroliter der Zellsuspension auf 15 Zentimeter große Kulturschalen zu spritzen, die mit Polychlorhan vorbehandelt wurden.

Laminin eins und Fibronektin. Lassen Sie die Tröpfchen 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Dann sehr vorsichtig bei 30 Millilitern des zugesetzten N zwei Differenzierungsmedien auf die Platte geben, ohne die Tröpfchen zu stören.

Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator. Füttern Sie die Zellen am 12. Tag vorsichtig mit 20 Millilitern N zwei Differenzierungsmedium mit 200 Mikromolar als Soinsäure. 20 Nanogramm pro Milliliter Neurotropher Faktor aus dem Gehirn, 100 Nanogramm pro Milliliter Fiberblast-Wachstumsfaktor acht und 20 Nanogramm pro Milliliter Sonic Hedgehog pro 15-Zentimeter-Schale.

Füttern Sie die Zellen dann von Tag 14 bis Tag 17 alle zwei bis drei Tage mit N zwei Differenzierungsmedium, das nur 200 Mikromolare als Orisäure enthält, 20 Nanogramm pro Milliliter des vom Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktors und 100 Nanogramm pro Milliliter Faserblastenwachstum. Faktor acht, bereiten Sie an Tag 16 und 17 Platten mit Poly L oder Laminin One und Fibronektin vor, die für die Neuralleistenzellen verwendet werden sollen.

Nach der Faxanalyse an Tag 18, nachdem die Zellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung sortiert wurden, zählen Sie die Neuralleistenzellen und schleudern Sie sie dann fünf Minuten lang bei 115 Gs herunter. Das Küvettenpellet in N zwei wieder aufhängen. Differenzierungsmedium ergänzt mit 10 Nanogramm pro Milliliter.

FGF zwei 20 Nanogramm pro Milliliter EGF und 10 mikromolare Y2 7 6 3 2 Dihydrochlorid in einer Konzentration von 30.000 Zellen pro 10 Mikroliter. Gründlich getrocknete Kulturschalen, die zuvor mit Poly L orhan laminin one und Fibronektin zubereitet wurden. Dann plättieren Sie etwa 50 bis 70 Tröpfchen der Zellsuspension pro 10-Zentimeter-Schale.

Inkubieren Sie die Zellen 15 bis 20 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 20 Millilitern N zwei. Differenzierungsmedium ergänzt mit 10 Nanogramm pro Milliliter. FGF zwei 20 Nanogramm pro Milliliter EGF und 10 mikromolare Y 2 7 6 3 2 Dihydrochlorid auf jede 10 Zentimeter große Schale, ohne die Tröpfchen zu stören.

Dann inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator. Nach der Inkubation, Aufrechterhaltung und Passage der Neuralleistenzellen wurden die Neuralleistenzellen gemäß dem begleitenden Textprotokoll innerhalb von 18 Tagen aus humanen pluripotenten Stammzellen gewonnen. Mit diesem neuen Feeder-freien In-vitro-Differenzierungsprotokoll.

Die Faxanalyse an Tag 18 identifizierte Zellen, die sowohl für HNK one als auch für P 75 positiv waren, was das Vorhandensein von Neuralleistenzellen bestätigte. Sowohl im Feeder-freien Differenzierungsprotokoll als auch im Feeder-Zell-abhängigen Protokoll durchliefen die Neuralleistenzellen ein Neuralroset-Stadium. Darüber hinaus ergab die Tatsache, dass sortierte Zellen eine identische Morphologie aufweisen und die Neuralleistenmarker H und K eins und ein P zwei exprimierten. Der Vergleich der globalen Genexpression von Neuralleistenzellen, die aus diesen beiden Differenzierungsprotokollen abgeleitet wurden, ergab, dass sich beide Zellgruppen eng beieinander gruppieren.

Die Analyse der Migrationskapazität der Neuralleistenzellen, die mit dem Feeder-Free-Protokoll gewonnen wurde, zeigte, dass die Zellen nach 48 Stunden erfolgreich in den Scratch migrierten. Diese Zellen haben auch das Potenzial, sich in Zellen aus dem vegetativen Nervensystem zu differenzieren, was durch eine positive Färbung für Mash One und Touch One nach weiteren vier Tagen der Differenzierung bestätigt wurde. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man humane pluripotente Stammzellen neuralisiert und progene Neurokammzellen in vitro ableitet.