Feeder freie Ableitung von Neural Crest Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, aus humanen pluripotenten Stammzellen in einem kurzen, reproduzierbaren und definierten Protokoll Vorläuferzellen der Neuralleiste zu erzeugen. Diese Zellen können anschließend entweder zur Untersuchung von Neuralleiste-assoziierten Erkrankungen in vitro oder zur weiteren Differenzierung in Nachkommenzellen verwendet werden. Dies wird erreicht, indem zunächst eine hohe Dichte humaner pluripotenter Stammzellen in einer einfachen Zellschicht auf Matrigel ausplattiert wird.

Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen mithilfe einer definierten Abfolge und Kombination von kleinen Molekülen, die wichtige Signalwege beeinflussen, in neuroektodermale Zellen zu differenzieren. Anschließend werden die neuroektodermalen Zellen erneut ausplattiert und weiter zu Neuralleistenvorläuferzellen differenziert. Der letzte Schritt ist die Isolierung der Neuralleistenzellen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung.

Schließlich werden Immunfluoreszenz und funktionelle Assays, wie beispielsweise die Migrationsfähigkeit der Zellen, verwendet, um zu zeigen, dass korrekte Neuralleistenzellen erzeugt wurden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Protokollen zur Herleitung von Neuralleistenzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen liegt in ihrer kürzeren Dauer. Sie beträgt lediglich 18 Tage.

Es ist aufgrund des Fehlens von MS5-Fütterzellen besser reproduzierbar. Es ist einfach, den Prozess hochzuskalieren, und weist eine hohe Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen menschlichen pluripotenten Stammzelllinien auf. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis zu Untersuchungen der Mechanismen menschlicher Erkrankungen, die mit der neuroektodermalen Linie assoziiert sind, und zeigt ein Potenzial für die Verbesserung der Detaillierung bei der in-vitro-Modellierung und beim Wirkstoffscreening dieser Erkrankungen.

Bevor mit diesem Protokoll begonnen wird, sicherstellen, dass die Kolonien humaner pluripotenter Stammzellen groß genug sind, um mit bloßem Auge sichtbar zu sein, und noch scharfe Ränder aufweisen, mit nur wenigen differenzierenden Zellen an ihren Rändern. Wenn die hPSCs dann bereit zum Teilen sind, das Medium abpipettieren, einmal mit fünf Millilitern 1× PBS waschen und vier Milliliter 0,05 % Trypsin in EDTA zu den Zellen geben. Anschließend die Schale zwei Minuten lang kräftig horizontal schütteln, bis unter dem Mikroskop sichtbar ist, dass die embryonalen Mausfibroblasten als Einzelzellen von der Platte abheben.

Die HPSC-Kolonien verbleiben als Kolonien an der Petrischale angeheftet, anschließend sofort und vollständig das Trypsin abpipettieren und die Platte zwei bis vier Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Fügen Sie zwei Milliliter HES-Medium zur Platte hinzu und verwenden Sie eine P-1000-Pipette, um die Zellen zu lösen. Falls sich die Zellen nicht leicht ablösen, inkubieren Sie die Platte weitere zwei bis drei Minuten.

Überführen Sie die Zellsuspension bei Raumtemperatur in ein 15-Milliliter-Konischgefäß, das acht Milliliter HES-Medium enthält, ergänzt mit 10 Mikromolar Y 2 7 6 3 2 Dihydrochlorid. Anschließend saugen Sie das Matrigel von einer zuvor behandelten 10-Zentimeter-Schale ab und impfen die Zellen im Verhältnis eins zu eins oder eins zu zwei auf die mit Matrigel behandelte Platte aus. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem 5 % Kohlendioxid-Inkubator.

Füttern Sie die Zellen täglich mit HES-Medium, bis sie zur Differenzierung bereit sind. Beginnen Sie dann die neuronale Differenzierung, wenn die Zellen zu 90 % bis 100 % konfluent sind. Dies ist der Tag null.

Füttern Sie die Zellen täglich vom Tag null bis Tag drei mit 10 Milliliter KSR-Differenzierungsmedium, das 0,1 Mikromolar LDN 193189 und 10 Mikromolar SB 431542 enthält. Anschließend füttern Sie die Zellen am Tag vier und fünf mit 10 Milliliter Medium, das 75 % KSR-Differenzierungsmedium und 25 % And2-Differenzierungsmedium sowie 0,1 Mikromolar LDN 193189 und 10 Mikromolar SB 431542 enthält. Am Tag sechs und sieben füttern Sie die Zellen mit Medium, das zu 50 % aus KSR-Differenzierungsmedium und zu 50 % aus And2-Differenzierungsmedium besteht und zusätzlich mit 0,1 Mikromolar LDN 193189 sowie 10 Mikromolar SB 431542 ergänzt wurde.

Für Tag acht bis neun die Zellen mit 25 % KSR-Differenzierungsmedium und 75 % N2-Differenzierungsmedium füttern, jeweils ergänzt mit 0,1 µM LDN193189 und 10 µM SB431542. Dann am Tag neun und zehn Kulturschalen mit Poly-L-Ornithin, Laminin-1 und Fibronectin wie im Textprotokoll beschrieben vorbereiten, die für das Umpflanzen der Zellen am Tag elf verwendet werden. Am Tag elf die Zellen mit N2-Differenzierungsmedium füttern, ergänzt mit 0,1 µM LDN193189 und 10 µM SB431542. Am Tag zehn, am Tag elf, die Laminin-1- und Fibronectin-Lösung von den zuvor vorbereiteten Kulturschalen abpipettieren und sie 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer Zellkulturbank trocknen lassen.

Als Nächstes entfernen Sie das Medium von den differenzierenden Zellen und waschen die Zellen einmal mit einem XPBS. Geben Sie dann acht Milliliter Acuat zu jeder 10-Zentimeter-Platte hinzu und inkubieren Sie die Platten 20 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation lösen Sie die Zellen mit einem Zellabstreifer ab und resuspendieren die Zellen in der Accutane-Lösung.

Mit einer fünf Milliliter-Pipette die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Konischgefäß überführen. Anschließend fünf Milliliter 1× PBS zum Gefäß hinzufügen und die Zellen fünf Minuten bei 115 × g zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und das Zellpellet in 10 Milliliter 1× PBS erneut suspendieren. Danach die Zellsuspension durch einen 40-Mikrometer-Zellfilter leiten, um eine Einzelzell-Suspension zu gewährleisten.

Zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut fünf Minuten bei 115 G und resuspendieren Sie sie in einer Konzentration von 100.000 bis 150.000 Zellen pro 10 Mikroliter ergänztem N2-Differenzierungsmedium. Verwenden Sie eine Mehrfachpipette, um 10-Mikroliter-Tropfen der Zellsuspension auf 15-Zentimeter-Kulturschalen aufzutragen, die zuvor mit Poly-L-Ornithin vorbehandelt wurden.

Laminin 1 und Fibronectin. Die Tropfen 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Dann vorsichtig 30 Milliliter des supplementierten N2-Differenzierungsmediums zur Platte geben, ohne die Tropfen zu stören.

Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Füttern Sie die Zellen am Tag 12 vorsichtig mit 20 Milliliter N2-Differenzierungsmedium, das 200 Mikromolar Ascorbinsäure, 20 Nanogramm pro Milliliter brain derived neurotrophic factor, 100 Nanogramm pro Milliliter Fibroblastwachstumsfaktor 8 und 20 Nanogramm pro Milliliter sonic hedgehog pro 15-Zentimeter-Platte enthält.

Ab Tag 14 bis Tag 17 füttern Sie die Zellen alle zwei bis drei Tage mit N2-Differenzierungsmedium, das nur 200 µM Ascorbinsäure, 20 ng/mL brain-derived neurotrophic factor und 100 ng/mL Fibroblasten-Wachstumsfaktor 8 enthält. Bereiten Sie am Tag 16 und 17 Platten mit Poly-L-Ornithin, Laminin-1 und Fibronectin vor, die für das Umpflanzen der Neuralleistenzellen verwendet werden sollen.

Nach der FACS-Analyse am Tag 18, nachdem die Zellen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung sortiert wurden, zählen Sie die Neuralleistenzellen und pelletieren Sie diese anschließend durch Zentrifugation bei 115 × g für fünf Minuten. Resuspendieren Sie das Zellpellet in N2-Differenzierungsmedium, ergänzt mit 10 Nanogramm pro Milliliter.

FGF zwei 20 Nanogramm pro Milliliter EGF und 10 Mikromolar Y 2 7 6 3 2 Dihydrochlorid in einer Konzentration von 30.000 Zellen pro 10 Mikroliter. Vollständig trocknen Sie Kulturschalen, die zuvor mit Poly-L-Ornithin, Laminin eins und Fibronectin beschichtet wurden. Anschließend geben Sie etwa 50 bis 70 Tropfen der Zellsuspension pro 10-Zentimeter-Schale auf.

Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur 15 bis 20 Minuten lang in 20 Milliliter N zwei. Differenzierungsmedium, ergänzt mit 10 Nanogramm pro Milliliter. FGF zwei 20 Nanogramm pro Milliliter EGF und 10 Mikromolar Y 2 7 6 3 2 Dihydrochlorid, jeweils pro 10-Zentimeter-Platte, wobei die Tropfen nicht gestört werden dürfen.

Anschließend die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem 5 % Kohlendioxid-Inkubator inkubieren. Nach der Inkubation die Neuralleistenzellen entsprechend dem beiliegenden Textprotokoll pflegen und weiterkultivieren; die Neuralleistenzellen wurden innerhalb von 18 Tagen aus humanen pluripotenten Stammzellen gewonnen. Unter Verwendung dieses neuen, fütterungszellenfreien In-vitro-Differenzierungsprotokolls.

Die FACS-Analyse am Tag 18 identifizierte Zellen, die sowohl für HNK-1 als auch für P 75 positiv waren, was das Vorhandensein von Neuralleistenzellen bestätigte. Bei beiden Differenzierungsprotokollen – dem nikotinfreien Protokoll und dem Protokoll, das auf Futterzellen angewiesen ist – durchliefen die Neuralleistenzellen ein neurales Rosettenstadium. Außerdem weisen die sortierten Zellen eine identische Morphologie auf und exprimieren die Marker der Neuralleiste, HNK-1 und P 75. Ein Vergleich der globalen Genexpression von Neuralleistenzellen, die aus diesen beiden Differenzierungsprotokollen stammen, ergab, dass beide Zellpopulationen eng beieinander liegen.

Die Analyse der Migrationskapazität der mit dem fütterzellenfreien Protokoll gewonnenen Neuralleistenzellen zeigte, dass die Zellen nach 48 Stunden erfolgreich in den Scratch eingewandert waren. Diese Zellen besitzen zudem das Potenzial, sich in Zellen des autonomen Nervensystems zu differenzieren, was durch eine positive Färbung für mash one und touch one nach weiteren vier Tagen Differenzierung bestätigt wurde. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man humane pluripotente Stammzellen neuralisiert und Neuroleisten-Progenitorzellen in vitro ableitet.