Name: Automatisierte Messung der Mikrozirkulation Blutflußgeschwindigkeit in Lungenmetastasen von Ratten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Lernen Sie die automatisierte Messung der Mikrozirkulations-Blutflussgeschwindigkeit in Lungenmetastasen von Ratten mittels geschlossener Thorax-Intravitalmikroskopie. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Echtzeit-Analysen des Tumormikromilieus.

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Der wissenschaftliche Rat von Dr. Timothy McMahon und Dr. Siqing Shan wird geschätzt. Die Referenten danken Dr. David Kirsch und Dr. Patricia Steeg für das großzügige Geschenk der fluoreszenzmarkierten Maussarkom- bzw. metastasierten MDAMB-231-Zellen. Diese Arbeit wurde teilweise von der U.S. Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Prime Award Nummer N66001-10-C-2134 und teilweise von der Abteilung für Radioonkologie des Duke University Medical Center finanziert.

HINWEIS: Alle in diesem Protokoll beschriebenen tierbezogenen Verfahren sind zuvor von der Duke University Institutional Animal Care und Verwenden Committee (DUIACUC) genehmigt worden. 1. Cancer Cell, Kultur und Einspritzung <ol><li> Pflegen fluoreszenzmarkierten metastasiertem Krebszellen (zB menschliche MDAMB231-GFP-Brustkrebszellen, Geschenk von Dr. Patricia Steeg, NCI und YFP-markierten Maus-Sarkom-Zellen, Geschenk von Dr. David Kirsch, Duke University Medical Center, Abteilung für Radioonkologie) in geeigneten Kulturmedium (zB Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptavidin) bei 37 ° C, bis ca. 90% konfluent. </li><li> Trypsinieren Zellen, waschen Sie sie 2-mal mit PBS, zählen, und dann spritzen sie in die Schwanzvenen von Isofluran betäubt 10 Wochen alte weibliche Nacktratten bei 5.000.000 Zellen pro Tier, mit einer Spritze mit einer 27 G-Nadel. Chirurgische Ebene anesthesIA wird durch das Fehlen einer Reaktion auf Zehenklemm verifiziert. </li></ol> 2. Überwachung von Metastasen Mit MicroCT <ol><li> Untersuchen Ratten einmal wöchentlich mit einem Mikro-CT / Mikro Irradiator, um das Vorhandensein von Metastasen über etwa 2 mm im Durchmesser im Durchmesser zu erfassen. Die Mikro-CT wird in Betrieb genommen, wie zuvor beschrieben 12. <ol><li> Betreff Ratten zu 3% Isofluran-Narkose vor der Bildgebung. Bestätigen tiefer Narkose durch toe Prise. </li><li> Nach Beginn der Anästhesie, schnell Ratten übertragen, um die Abbildungsaufnahmevorrichtung in der Abbildungskammer und schließen über ein Nasenkegel auf eine Isofluran-Luft-Gemisch bei 2,5 bis 3%. Stellen Sie die Position der Ratte in der Wiege in einer Weise, die ihre Brustkorb wird in der Photonenstrahl der MicroCT Scanner positioniert, mit den externen Positionskontrollen und Lasertrennzeichen auf dem Imaging-Docking-Station. Stellen Sie sicher, die Tür zum Imaging-Kammer geschlossen ist, um die Ermittler von den Gammastrahlen abzuschirmen. </li><li> Kontrollieren Sie die Position des Tieres wieder mitDie Farbvideokamera. Führen Sie eine niedrig auflösende CT-Bildgebung Testlauf, und verwenden Sie das resultierende Bild, um das Sichtfeld auf die xyz Abmessungen der Brusthöhle ein. </li><li> Bild der Ratte Thorax mit einer 2 mm Al-Filter bei 40 kVp, 2,5 mA und 0,008 Voxel bei 7 FPS und senden Sie das Tier in seinen Käfig. Imaging von einem Tier sollte nicht mehr als 15 oder 20 Minuten dauern. Sie ein Tier, das der Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück. Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis er wieder zu sich kam, um ausreichende Brustlage zu halten. </li><li> Bestätigen Metastasen durch das Auftreten von relativ strahlenundurchlässige Objekte, die nicht durch intrathorakale Blutgefäße erklärt werden kann (1A) </li></ol></li></ol> 3. Fenster Kammerchirurgie <ol><li> Anästhesie, Vitalzeichen und Schwanzvenenkatheter <ol><li> Wählen Tiere mit Vorhandensein von Metastasen. Injizieren Tieres mit einer intraperitonealen dose von 50 mg / kg Pentobarbital. Bestätigen Operationsebene Anästhesie durch toe Prise bevor Sie fortfahren. Hinweis: Anästhesie-Protokolle sollten auf den jeweiligen Versuchsaufbau angepasst werden. Pentobarbital wurde hier als ein lang wirkendes Narkosemittel gewählt, um die tiefe Narkose für langwierige Verfahren zu induzieren, und bietet die Möglichkeit, einfache Wieder Dosierung. , Ist der Verlust der Tiere eine Überdosierung ist jedoch ein allgemeines Problem mit Pentobarbital Narkose. Eine weitere Option, die autonomen Reflexe in einem größeren Ausmaß als Pentobarbital bewahrt wird Ketamin in Kombination mit Sedativa wie Xylazin oder Medetomidin, die jedoch erlaubt nur bei einem einzigen Wiederdosierungszyklus. </li><li> Rasur Tiere auf der Seite des Körpers, die den metastatischen Krankheit hat, und im Halsbereich, mit einer Schermaschine. Wischen Sie alle verbleibenden losen Haare aus der Haut. Nach lose Haare entfernt wird, gelten Tier Salbe für die Augen, um sie vor dem Austrocknen zu schützen. HINWEIS: athymischen Nacktratten können Rest Haar, das requi habenres Entfernung vor mit chirurgischen Verfahren fortfahren. Es ist sehr wichtig, um alle Haare gründlich zu entfernen, wie es mit chirurgischen Verfahren und Bildgebung stören. </li><li> Befestigen Sie das Tier in Rückenlage auf einer Metallplatte, die auf einem 37 ° C Wasserbad zirkuliert Heizkissen platziert wird. Die vorderen und hinteren Enden an der Platte mit Klebeband befestigt. HINWEIS: Es ist sinnvoll zu steuern und aufzeichnen Vitalfunktionen, wie Herzfrequenz und arterieller Sauerstoffsättigung des Blutes mit Hilfe eines Pulsoximeter, im gesamten chirurgischen und experimentellen Verfahren. </li></ol></li><li> Intubation <ol><li> Um einen Katheter zur Belüftung des behandelten Tieres, zuerst eine transversale zervikalen Hautinzision, gefolgt von der mittleren Trennung der Längsmuskulatur ventral der Trachea. </li><li> Verwenden Sie ein wiederholtes Öffnen-to-Schließvorgang mit einem scharfen Zange, einen Durchgang für das Nahtmaterial durch die dorsale Seite der Luftröhre zu schaffen. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt in die Luftröhre auf T-er ventralen Seite, nicht mehr als halbkreisförmige, etwa zwischen dem zweiten und dritten Trachealring. Lassen Sie eine ausreichend lange Teil der Luftröhre auf der dorsalen Oberfläche freigelegt, um die Fixierung des Luftröhrenkatheter zu ermöglichen. </li><li> Legen Sie eine 2,5 bis 3,0 mm &quot;Y&quot; Trachealkanüle in die Luftröhre, und ziehen Sie sie mit einem 4-0 Monofilamentnaht. Sicherstellen, dass die Kanüle an eine druckgeregelte Ventilator mit einer Flasche zum Ablaufkanal, der mit 6 cm Wasser gefüllt ist verbunden, um positive Lungendruck aufrechtzuerhalten. Einströmende Gas sollte 100% Sauerstoff, es sei denn experimentell anders gewünscht. </li><li> Legen eines Katheters mit einem 25-27 G Nadel und mit heparinisierter Kochsalzlösung gefüllt in eine der Schwanzvenen von Ratten, und befestigen mit Klebeband. HINWEIS: Stellen Sie sicher, Durchgängigkeit der Schwanzvenenkatheter während des gesamten Verfahrens durch mehrmaliges Einspritzen einer kleinen Menge heparinisierter Kochsalzlösung in die Schwanzvene. Auch oro-Intubation, dh die Führung eines LuftröhrenRohr über der Mündung des betäubten Tieres und an der Kehlkopf in die Luftröhre, ist eine mögliche Alternative zur Tracheotomie Verfahren, die hier beschrieben wird. Jedoch erfordert dieses Verfahren eine spezielle Ausbildung und Erfahrung, um eine Beschädigung der Luftröhre zu verhindern, und auch um die versehentliche Kanülierung der Speiseröhre zu verhindern. </li></ol></li><li> Die Anwendung der Lungenfenster <ol><li> Entfernen Sie die Haut von der Seite der Brust, wo der metastasierten Erkrankung befindet, indem Sie einen Schnitt, und dann Abtrennen der Haut mit stumpfer Präparation. Hinweis: Die Haut kann ausgeschnitten und entfernt im Anschluss an Ablösung werden </li><li> Gehen Sie durch Sezieren der zwei Schichten überlagern Muskulatur (pectoralis, serratus und Latissimus), jedoch den Zwischenrippenmuskeln intakt. Erstellen einer Perforation in den Brustraum von ungefähr 1,5 cm im Durchmesser, durch Entfernen von Abschnitten der in der Regel zwei benachbarten Rippen. Idealerweise suchen Sie die Perforation in der Region des sechsten und siebten ribs. </li><li> Osteotomie: <ol><li> Um Blutungen und Schäden an der Lungenoberfläche zu minimieren, fest halten die Rippe während des Schneidens mit einer Zahn chirurgische Zange geschnitten werden. Verwendung von chirurgischen Scheren, schneiden die mediale Seite des ersten Rippe unter einem Winkel von etwa 45 °, so dass die spitze Seite der verbleibenden Rippenknochen draußen zeigt. </li><li> Anschließend schneiden die lateralen Seite der Rippenknochen in einer ähnlichen Weise wieder Verlassen der spitzen Seite der Rippenknochen nach außen zeigen, um Schäden an der Lungenoberfläche zu verhindern. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang für die benachbarten Rippe, dann schneiden Sie die Zwischenrippenmuskeln und entfernen Sie das Stück herausgeschnitten. Während dieses Vorgangs halten Lungendruck in einer Weise, daß die mechanische Wechselwirkung zwischen der Lungenoberfläche und dem Brustkorb, minimiert. Tun Sie dies durch entsprechende Regelung Inspiration Druck auf den Ventilator. </li></ol></li><li> Einsetzen des Fensters: <ol><li> Legen Sie eine maßgeschneiderte Lungenfenster, bestehend aus einem Deckglas, das istauf einer Plexiglas Buchse (1B) befestigt ist. Befestigen des Fensters an der Buchse durch Kleben, oder durch Aufbringen einer sehr kleinen Menge an Vakuumfett. Legen Sie die Fenster so, dass Oberflächenmetastasen sind in der Nähe der Mitte des Fensters. Passen Sie bei Bedarf die eingelegte Loch, um die Mikrometastasen in die Mitte des Fensters durch eine Vergrößerung der Bohrung leicht auf der jeweiligen Seite zu bringen. HINWEIS: Metastasen auf der Pleuraoberfläche als deutlich erkennbare weiße Punkte oder Bereiche innerhalb der ansonsten rosa-lachsfarben gesunden Teile der Lungenoberfläche, die vorwiegend entlang der Risse erscheinen identifiziert werden. Während Mikro sich an anderen Bereichen der pleuralen außen auftreten, die untersuchten Zelllinien fast immer angezeigt Oberflächenmikrometastasen im perforierten Bereich, einmal Metastasen röntgenologisch festgestellt werden kann. </li><li> Nach dem Einlegen der Buchse in die Perforation und das Erstellen direktem Kontakt mit der Pleura des lung, Naht die Kanten des Fensterrahmens an das umgebende Interkostalmuskel, unter Verwendung von 4,0 Monofilamentnahtmaterial (Abbildung 1C). Verwenden Sie einen leichten Anstieg der Inspiration Druck auf das Beatmungsgerät an Restluft zu helfen, zu entkommen und um eine Dichtung zu schaffen. Anmerkung: Die Atmungsrate von Ratten kann stark variieren, abhängig von dem Zustand der Anästhesie, Status der Erregung oder Angst, die Sauerstoffkonzentration des eingeatmeten Luft (FiO 2), usw. Es ist empfehlenswert, die Atmungsrate zwischen 70 und 90 bpm einzustellen. Die Inspiration Druck sollte mit Vorsicht eingestellt werden und nicht mehr als ca. eingestellt werden. 8 cm H 2 O (0,6 mmHg), um Schäden an der Lungenoberfläche zu vermeiden. </li></ol></li><li> Die Position des Tieres in einer speziell entworfenen Rückhalter dafür ausgelegt ist, Z-Richtungsbewegung (1D) auf einer Stahlplatte, die auf einem thermo (elektrische) Heizdecke positioniert zu beseitigen, unter einem Fluoreszenzmikroskop. Steuern Sie den Körper des TieresTemperatur unter Verwendung eines rektalen Thermistor. Passen die Schrauben des Tieres Rückhalter und der Inspirationsdruck an dem Beatmungsgerät eine optimale Steuerung der Querbewegung zu erzielen. Hinweis: Natürliche Atmung in Säugetieren umfasst alle drei Richtungen der Lungenbewegung und Brust-Erweiterung: bilaterale, dorsoventralen und kraniokaudale. Um den natürlichen Atembewegung so weit wie möglich zu erhalten, ist es wichtig, in Z-Richtung Kompression auf das notwendige Maß zu minimieren. Weil die Z-Dimensionszwang hat das Potential, um Artefakte, die den Blutfluss und andere Parameter beeinträchtigt, ist es ratsam, die Bedingungen während der Serie von wiederholten Messungen im gleichen Tier konstant zu halten. </li></ol></li></ol> 4. Bildgebung und Messung von Mikrozirkulationsblutfluss <ol><li> Sammeln roter Blutkörperchen durch Herzpunktion und beschriften mit Dil (1,1 = -dioctadecyl-3,3,3 =, 3 = Tetramethyl-Indocarbocyanin Perchlorat), wie zuvor beschrieben &lt;sup&gt; 10. </li><li> Injizieren 300 ul markierte rote Blutzellen in die Schwanzvene der Ratte vor der Fensterkammer Operation durchgeführt wird, um erste Durchgang Adhäsionseffekte das Glasfenster zu vermeiden. Beseitigen Sie alle Luftblasen in der Spritze oder eines Katheters, wie Einführung von Luft in die Vene werden weitere Injektionen zu hemmen. </li><li> Bildblutung mit einem Mikroskop-CCD-Kamera bei -40ºC Chip Kühltemperatur und ungefähr 100facher Gesamtauflösung (dh mit einem 10x Mikroskopobjektiv und 10X vorgeKameraAugen). Verwenden Sie Standard-Rhodamin / TRITC Filtersätze (Anregung 450 bis 490 nm, Emission&gt; 515 nm). Notieren Sie sich die tatsächliche Bildrate und Pixelauflösung der resultierenden Bildsequenzen. Nehmen Sie mindestens 200 (im Idealfall rund 300) Bilder pro Stapel, erfolgreiche Analyse der Strömungsgeschwindigkeit zu gewährleisten. </li><li> Aufzufüllen Fluidverlust in dem Tier durch Injektion von etwa 1 ml Salzlösung ip jeden hr. HINWEIS: Experimentelle Einstellungen, eine Intervention beinhalten, wie zBein Medikament, das die Blutströmungsgeschwindigkeit in einem Lungen Krebsmetastase ändert, erfordert die wiederholte Messungen der Blutströmungsgeschwindigkeit in der Lungenmetastasenkrebs. Für diesen erweiterten Experimenten, ist es wichtig, um das Tier mit ausreichend Flüssigkeit aufzufüllen. </li><li> Euthanize die Tiere durch Infusion von 3 ml 3N KCl in die Schwanzvene </li><li> Werten Sie die Bildstapeln mit Hilfe eines veröffentlichten öffentlich zugängliche Matlab-basierten Computer-Algorithmus, schaffen Strömungsgeschwindigkeit Graustufen- und Farb codierte Karten für alle Blutfluss Spuren 10,11. Anschließend werten die resultierenden Graustufenbilder unter Verwendung gewerblicher oder öffentlich zugängliche Bildanalyse-Software, wie zum Beispiel Bild J nach Schwellen off-Werte, die keine Bewegung der Blutzellen anzugeben, dh keine aktiven Gefäßsystem. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Es wird ein Modell vorgestellt, das möglich ist, Bild Veränderungen in der Mikrozirkulation Blutfluss und andere dynamische Prozesse in Lungenmetastasen von Ratten, mit Intravitalmikroskopie und Computerblutfluss-Analyse ist. Während andere Methoden gibt, um die Mikroskopie an exponierten Lunge in offenen Brustkorb von Nagetieren durchzuführen, ist auch dieses Modell die erste Bildlungenmetastasen durch eine Brustwand Perforation in einem geschlossenen Brust-Einstellung. Mit dieser Methode wird die Machbarkeit gezeigt, ...

Die Lunge ist eines der wichtigsten Zielorgane für metastasierende Erkrankungen, und da dieser Zustand mit Chemo- und Strahlentherapie nur schwer erfolgreich zu behandeln ist, ist eine Heilung immer noch selten1,2. Spezifische pathophysiologische und mikrozirkulatorische Merkmale solider primärer und metastasierender Tumoren, wie mikroregionale Hypoxie, Diffusionslimitierung und ineffiziente Tumorgefäße, tragen wesentlich zu ihrer Resistenz gegenüber der Behandlung von Krebs bei3,4. Aufgrund der mikroskopischen Skala und der dynamischen Natur von Parametern wie dem mikrovaskulären Blutfluss ist die Intravitalmikroskopie des Tumors im lebenden Tier zu einem sehr wichtigen Forschungsinstrument auf diesem Gebiet geworden5. Während Intravitalmikroskopie-Modelle auf Tumoren in verschiedenen Organlokalisationen, einschließlich der metastasierten Lunge in einem offenen Brustkorb, angewendet wurden, wurde bisher kein Protokoll für die Erforschung von Lungenmetastasen in einer physiologisch erhaltenden, geschlossenen Brustumgebung entwickelt6,7. Ein solches Unterfangen wird insbesondere durch die Notwendigkeit erschwert, chirurgisch auf den Brustkorb zuzugreifen, ohne die Gesamtfunktion der Lungezu beeinträchtigen 7-9. Kürzlich wurde eine Methode eingeführt, mit der der pulmonale mikrozirkulatorische Blutfluss in einer engen Brustumgebung bei lebenden Ratten mit Hilfe der Intravital-Fluoreszenzmikroskopie10 abgebildet werden kann. Dieses Protokoll ermöglicht die systematische Quantifizierung der Blutflussgeschwindigkeit von injizierten, fluoreszenzmarkierten roten Blutkörperchen mittels computergestützter Analyse, während das Tier physiologisch stabil bleibt und die Integrität der Lunge erhaltenbleibt 11. In der vorliegenden Studie wird gezeigt, wie diese Technologie modifiziert werden kann, um den mikrozirkulatorischen Blutfluss in Schwanzvenen-inokulierten Lungenmetastasen auf der Pleuraoberfläche bei der immungeschwächten Ratte abzubilden und zu quantifizieren. Dieses Modell ist auch das erste, das metastasierende Lungentumoren in einer geschlossenen intravitalen Mikroskopie untersucht.

<table><tbody><tr><td>Athyme Nacktratten</td><td>Charles River</td><td>Stamm Code 316</td><td>Weibliche 10 Wochen alte athyme Nacktratten</td></tr><tr><td>Mikro-CT/Mikro-Irradiator&nbsp;</td><td>Precision X-ray Inc.</td><td>Xrad 225Cx</td><td>Verwenden Sie MicroCT zum Nachweis von Metastasen</td></tr><tr><td>DiI (1,1=-Dioctadecyl-3,3,3=,3=-Tetramethyl-indocarbocyanin-perchlorat)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>468495-100MG</td><td>Mischen Sie 100 μl gepackte rote Blutkörperchen mit 100 μl von 0,5 mg/ml DiI in 200 proof Ethanol, 2 ml 5%ige Dextroselösung in Wasser und füllen Sie bis zu einem Endvolumen von 10 ml mit Kochsalzlösung Nagetierbeatmungsgerät</td></tr><tr><td></td><td>Kent Scientific</td><td>TOPO Beatmungsgerät</td> <td>für KleintiereDas Gerät ist wichtig, um den positiven Lungendruck nach der Anwendung des Pneumothorax aufrechtzuerhalten</td></tr><tr><td>Zeiss Axioskop Fluoreszenzmikroskop aufrecht</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop</td><td>Mikroskop für die intravitale Bildgebung</td></tr><tr><td>Andor CCD-Kamera Andor</td><td></td><td>iXonEM 885</td><td>CCD-Kamera für die Live-Bildgebung des Blutflusses</td></tr><tr><td>Pulsoximeter</td><td>StarrLife</td><td>MouseOx</td><td>Pulsoximeter</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop</td><td>Fluoreszenzmikroskop</td></tr></tbody></table>

automatisierte messung der mikrozirkulation blutflußgeschwindigkeit in lungenmetastasen von ratten

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

Da die Lunge ein wichtiges Zielorgan für metastasierende Erkrankungen ist, sind Tiermodelle zur Untersuchung der Physiologie von Lungenmetastasen von großer Bedeutung. Bisher gibt es jedoch nur sehr wenige Methoden, um Lungenmetastasen dynamisch auf der Ebene der Mikrozirkulation zu untersuchen, da der Zugang zur Lunge mit einem Mikroskop schwierig ist. Hier wird eine intravitale Mikroskopiemethode vorgestellt, um die Mikrozirkulation von oberflächlichen Lungenmetastasen bei Ratten unter Verwendung eines geschlossenen Lungenfensters und einer automatisierten Analyse der Geschwindigkeit und Richtung des Blutflusses funktionell abzubilden und zu quantifizieren. Es wird gezeigt, dass diese Methode nützlich ist, um die Erhöhung der Blutflussgeschwindigkeit als Reaktion auf pharmakologische Interventionen zu messen und das bekannte gewundene Gefäßsystem solider Tumoren abzubilden. Dies ist die erste Demonstration der intravitalen Mikroskopie an Lungenmetastasen in einem geschlossenen Thoraxmodell. Aufgrund ihrer minimierten Invasivität sowie aufgrund ihrer relativen Leichtigkeit und Praktikabilität hat diese Technologie das Potenzial, in Laboratorien, die sich auf die Erforschung von Lungentumoren spezialisiert haben, weit verbreitet zu werden.

Das Gefäßsystem in soliden Tumoren ist bekannt, dass von den normalen Blutversorgung signifikant und zeigt höhere Grade der Tortuosität und höhere intervaskulären Distanzen 13. Dementsprechend Blutfließspuren in der experimentellen Lungen Brustkrebs und Metastasen Sarkom unregelmäßige Formen und große intervaskulären Lücken (2A, unteren zwei Platten) im Vergleich zu der normalen pulmonalen Mikrozirkulation (2A, oberes Feld). In einer vorherigen Studie wurde die Fähigkeit des ...

Es wird eine Methode vorgestellt, um die mikrozirkulatorische Blutflussgeschwindigkeit bei Lungenkrebsmetastasen der Pleuraoberfläche bei Ratten automatisiert unter Verwendung der geschlossenen Lungen-Intravitalmikroskopie zu messen. Dieses Modell hat das Potenzial, als weit verbreitetes Werkzeug für die physiologische Forschung an Lungenmetastasen bei Nagetieren eingesetzt zu werden.

Automatisierte Messung der Mikrozirkulation Blutflußgeschwindigkeit in Lungenmetastasen von Ratten

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein Brustfenster für die intravitale Mikroskopie bei einer Ratte mit pulmonalen Metastasen anzulegen. Dazu wird zunächst das metastasenbehaftete Tier anästhesiert, intubiert und an einen Kleintierbeatmungsapparat für die Druckbeatmung angeschlossen. Anschließend werden fluoreszenzmarkierte rote Blutkörperchen in die Schwanzvene des Tieres injiziert. Anschließend wird die Brusthöhle chirurgisch eröffnet, wobei die Lungenoberfläche nicht beschädigt wird; der Metastase wird identifiziert und ein Fenster eingesetzt. Schließlich erfolgt die mikroskopische Bildgebung des Tieres. Letztendlich ermöglicht die chirurgische Öffnung der Lunge und die Implantation eines Fensters für die akute Mikroskopie an der lebenden Ratte automatisierte Messungen des mikrozirkulären Blutflusses in Lungenmetastasen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Mikro-CT-Thoraxbildgebung, der nichtinvasiven epitthorakalen Mikroskopie und dem Mikro-PET der krebsbefallenen Lunge liegt darin, dass sie Echtzeit-Messungen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung der Mikrozirkulation pulmonaler Metastasen ermöglicht. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der pulmonalen Metastasierung zu beantworten, beispielsweise wie Therapien oder der Fortschritt des Krebses den Blutfluss und letztendlich die Hypoxie in Lungenmetastasen verändern können. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zur Diagnose und Therapie von pulmonalem metastatischem Krebs, da sie einen beispiellosen Einblick in die Dynamik des mikrozirkulativen und metabolischen Mikroumfeldes dieser metastatischen Tumoren ermöglicht.Diese Methode wird den Weg zur Erforschung der Dynamik pulmonaler Metastasen und der Mikrozirkulation ebnen und somit dazu beitragen, die derzeitigen Behandlungsstrategien zu verbessern. Personen, die mit dieser Methode neu beginnen, werden in der Regel Schwierigkeiten haben, da Erfahrung erforderlich ist, um die Einstellungen so anzupassen, dass die autonome Bewegung der Lunge minimiert wird. Nachdem gemäß dem schriftlichen Protokoll eine metastasierende Krebserkrankung bei einer Ratte induziert und bestätigt sowie die Ratte mit einer intraperitonealen Dosis Pentobarbital anästhesiert wurde, führen Sie einen Zehenquetschtest durch, um die Sedierung zu überprüfen.Rasieren Sie das Tier an der Körperseite, an der die metastatische Erkrankung vorliegt, sowie im Nackenbereich und entfernen Sie alle losen Haare von der Haut, um Störungen bei der Bildgebung zu vermeiden. Tragen Sie einen tierärztlichen Salbe auf die Augen auf, um Austrocknung zu verhindern. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf eine Metallplatte, die sich auf einer beheizten Unterlage mit 37 Grad Celsius warmem Zirkulationswasser befindet, und befestigen Sie die Vorder- und Hintergliedmaßen mit Klebeband. Befestigen Sie ein Pulsoxymeter, um die Vitalzeichen während des gesamten Eingriffs zur Intubation der Ratte zu überwachen und aufzuzeichnen. Beginnen Sie mit einem transversalen zervikalen Hautschnitt. Trennen Sie anschließend mit einer spitzen Pinzette medial die longitudinal verlaufende Muskulatur ventral zur Trachea.Wiederholen Sie eine Öffnungs- und Schließbewegung, um einen Durchgang für die Naht durch die dorsale Seite der Trachea auf der ventralen Seite zwischen dem zweiten und dritten Trachealring zu schaffen. Führen Sie einen kleinen Schnitt in die Trachea ein. Lassen Sie einen ausreichend langen Abschnitt der Trachea an der dorsalen Oberfläche freigelegt, um die Fixierung des Katheters zu ermöglichen.Als Nächstes eine Y-Trachealkanüle mit einem Durchmesser von 2,5 bis 3,0 Millimeter in die Trachea einführen und mit einer monofilen Naht der Stärke 4-0 fixieren. Um einen positiven pulmonalen Druck aufrechtzuerhalten, die Kanüle über einen druckgesteuerten Ventilator mit 100 % Sauerstoff verbinden, wobei eine Flasche, die mit sechs Zentimetern Wasser gefüllt ist, an den Ausatemkanal angeschlossen ist. Anschließend unter Verwendung einer Nadel mit 25 bis 27 Gauge und einer mit heparinisiertem Salin gefüllten Spritze einen Katheter in eine der Schwanzvenen einführen und mit Klebeband fixieren. Gemäß dem Textprotokoll zuvor gesammelte und mit DII markierte rote Blutkörperchen verwenden, um 300 Mikroliter in die Schwanzvene der Ratte zu injizieren, um ein pulmonales Fenster zu erzeugen.Erstellen Sie einen Schnitt auf der Seite der Brust mit dem Tumor und lösen Sie die Haut durch stumpfe Dissektion. Dissezieren Sie die beiden übereinanderliegenden Muskelgewebe und lassen Sie die Interkostalmuskulatur im Bereich der sechsten und siebten Rippe intakt. Erzeugen Sie eine Perforation in der Brusthöhle mit einem Durchmesser von etwa 1,5 Zentimetern, um eine Osteotomie durchzuführen.Beginnen Sie mit der Anpassung des Inspirationsdrucks am Beatmungsgerät, sodass die mechanische Wechselwirkung zwischen Lungenoberfläche und Rippenkorb minimiert wird. Entfernen Sie Abschnitte der sechsten und siebten Rippe, indem Sie die zu schneidende Rippe mit einer zahnärztlichen Pinzette festhalten und mit einer Schere schneiden. Schneiden Sie die mediale Seite der Rippe in einem Winkel von etwa 45 Grad mit der scharfen Kante nach außen. Schneiden Sie die laterale Seite des Knochens auf ähnliche Weise, wobei die spitze Seite erneut nach außen weisen soll. Um eine Beschädigung der Lunge zu vermeiden, wiederholen Sie die Osteotomie am benachbarten Rippenstück, bevor Sie die Interkostalmuskulatur durchtrennen, und entfernen Sie das ausgeschnittene Stück. Erstellen Sie ein maßgeschneidertes langes Fenster, indem Sie ein Deckglas mit Kleber oder einer geringen Menge Vakuumfett an einer Plexiglasschale befestigen.Danach die Fensterplatte so einsetzen, dass sich die Oberflächenmetastasen nahe der Mitte des Fensters befinden; gegebenenfalls die Öffnung auf einer Seite vergrößern. Nach dem Einsetzen der Hülse in die Perforation und Herstellen eines direkten Kontakts mit der viszeralen Pleura der Lunge die Ränder des Fensterrahmens mit vier einfachen monofilen Nähten an den umgebenden Interkostalmuskel annähen. Den Inspirationsdruck am Beatmungsgerät erhöhen, um das Entweichen restlicher Luft zu unterstützen und eine Abdichtung zu erzielen.Als Nächstes platzieren Sie das Tier in einer speziell angefertigten Halterung, die Bewegungen in Z-Richtung verhindert, und positionieren es auf einer beheizten Stahlplatte unter einem Fluoreszenzmikroskop. Anschließend führen Sie einen rektalen Thermistor ein, um die Körpertemperatur des Tieres zu überwachen. Stellen Sie die Schrauben der Tierhalterung und den Inspirationsdruck am Beatmungsgerät so ein, dass eine optimale Kontrolle lateraler Bewegungen erreicht wird.Für die Bildgebung und Messung des mikrozirkulativen Blutflusses. Verwenden Sie eine CCD-Kamera mit einer Chip-Kühlttemperatur von minus 40 Grad Celsius und ein 10x-Objektiv. Notieren Sie die eigentliche Bildfrequenz und Pixelauflösung der resultierenden Bildsequenzen mit standardmäßigen Rodamin-Trit-C-Filtern.Nehmen Sie mindestens 200 Bilder pro Stapel auf, um eine erfolgreiche Analyse der Strömungsgeschwindigkeit während der Bildgebungssitzung sicherzustellen, um den Flüssigkeitsverlust beim Tier auszugleichen. Um eine konstante Blutströmungsgeschwindigkeit aufrechtzuerhalten, führen Sie stündlich eine intraperitoneale Injektion von etwa einem Milliliter Kochsalzlösung durch.Töten Sie das Tier gemäß dem Textprotokoll nach Abschluss der Bildgebung. Die Gefäßversorgung von soliden Tumoren unterscheidet sich bekanntermaßen erheblich von der normalen Blutversorgung und weist stärkere Krümmungen sowie größere Abstände zwischen den Blutgefäßen auf. Entsprechend weisen, wie hier gezeigt, die Blutflussbahnen bei experimentellem pulmonalem Brustkrebs und Metastasen im Vergleich zur normalen Mikrozirkulation unregelmäßige Formen und große lückenhafte Bereiche zwischen den Gefäßen auf.In dieser Studie führte, ähnlich wie bei gesunden Lungen gezeigt, die Applikation einer Kombination aus Ephedrin und dem Endothelin-Rezeptorantagonisten Entin zu einer erhöhten Durchflussgeschwindigkeit im Maussarkom. Jeder Datenpunkt stellt den gepoolten Mittelwert aus drei Messungen mit fünfminütigen Intervallen dar, gemittelt über die an fünf Tieren erhobenen Daten. Die erste Injektion erhöhte die Durchflussgeschwindigkeit im Tumorbereich signifikant von 0,61 ± 0,12 Millimetern pro Sekunde auf 0,74 ± 0,19.Während die zweite Injektion die erhöhte Flussgeschwindigkeit bei 0,74 ± 0,19 Millimetern pro Sekunde aufrechterhielt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, beim Durchtrennen des Rippenbogens keine hervorstehenden spitzen Strukturen zu hinterlassen, da diese anschließende Verletzungen und Lungenblutungen verursachen können, nachdem sich diese entwickelt haben. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der pulmonalen Metastasenforschung, Endpunkte im Zusammenhang mit der Entwicklung von Antikrebsmedikamenten zu untersuchen, wie beispielsweise Diffusion, Einschränkung der zytotoxischen Medikamentenabgabe sowie diffusionslimitierte Hypoxie und rattenbasierte Modelle von Lungenmetastasen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den chirurgischen Zugang zum metastasierenden oder gesunden Lungenlappen der Ratte erhält und darauf eine Mikroskopie-Bildgebung durchführt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Normalen Erwachsenen vaskularisierten Säugetiergewebe, dass physiologische Angiogenese fehlt und die nicht zur chirurgischen Intervention wird verwendet, um Studie ausgesetzt worden: (i) die Initiierung und Entwicklung der Angiogenese nach intraperitonealer Verabreichung von Test-Agenten, und (ii) die Veränderung der Angiogenese nach systemischer Gabe von ausgewählten Test-Agenten.

Rat Mesenterium Angiogenese Assay

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Die isolierten durchbluteten Lungenpräparat macht es möglich, Mikrogefäßnetzwerken auf der Lungenoberfläche zu visualisieren. Hier beschreiben wir einen Ansatz zur Durchlässigkeit der einzelnen Mikrogefäße in isolierten Lungen quantifizieren mit Echtzeit-Fluoreszenz-Bildgebung.

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Die modifizierte Landis-Technik ermöglicht die paarweise Messung der hydraulischen Leitfähigkeit einzelner Mikrogefäße im Mesenterium von normalen und genetisch veränderten Ratten unter Kontroll- und Testbedingungen unter Verwendung von Mikroperfusionstechniken. Es bietet eine bequeme Methode zur Bewertung von Mechanismen, die die Durchlässigkeit von Mikrogefäßen und den transvaskulären Austausch unter physiologischen Bedingungen regulieren.

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In - vivo - Modell für die Prüfung von Wirkung von Hypoxie auf die Tumormetastasierung

Präsentiert wird hier ein Protokoll zur Untersuchung der koronaren Mikrozirkulation im lebenden murinen Herzgewebe durch ex vivo-Überwachung des arteriellen Perfusionsdrucks und -flusses, der den Druck aufrechterhält, sowie gefäßvaskulärer Baumbestandteile, einschließlich der Kapillarbetten und Pericyten, da die Septalarterie kanüliert und unter Druck steht.

Dynamische Messung und Bildgebung von Kapillaren, Arteriolen und Pericyten im Mausherz

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