Umfassende Analyse der Transkription von Gehirnproben Dynamics folgenden Verhaltens Experience

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die transkriptionellen Dynamiken und definierten Hirnkerne von Mäusen nach einer Verhaltenserfahrung zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem die Tiere zunächst habituiert und ihre motorische Aktivität nach einer Injektion von Kochsalzlösung aufgezeichnet wird. Nach der Habituation wird die motorische Aktivität nach einer Einzeldosis Kokain erfasst, anschließend werden Proben aus dem Nucleus accumbens entnommen und zur RNA-Isolierung sowie zur cDNA-Präparation verwendet.

Anschließend wird eine qPCR-Analyse durchgeführt, um die durch das Verhalten induzierte Genexpression zu untersuchen. Letztendlich erhält man Ergebnisse, die die transkriptionellen Dynamiken nach einer Kokainerfahrung zeigen. Den Protokollablauf werden Dr. Hatu, die Laborleiterin, Dum Muer, eine Doktorandin aus dem Labor, und Duran, ein Bachelor-Student aus dem Labor, demonstrieren. Über drei aufeinanderfolgende Tage hinweg wird jedes Maus auf die Handhabung und Injektionsverfahren eingeschult. Vor Beginn des Experiments werden die Mäuse in Käfige eingeteilt, sodass keine Mäuse später zwischen Käfigen umgesetzt werden und keine Maus über einen längeren Zeitraum isoliert bleibt.

30 Minuten vor Beginn der Tests sollten alle Testkäfige in den Verhaltensraum gebracht werden, damit sich die Tiere an die Umgebung gewöhnen können. Verabreichen Sie eine intraperitoneale Injektion von 250 Mikrolitern Kochsalzlösung. Unmittelbar nach der Injektion wird die Maus in eine Verhaltenskammer gestellt, um die motorische Aktivität 15 Minuten lang zu überwachen. Die Maus kann auch 20 Minuten lang in der Verhaltenskammer platziert werden.

Eine Aktivität, die von Minute zwei bis 17 überwacht wird. Wiederholen Sie diese Schritte zur gleichen Tageszeit an den folgenden zwei Tagen. Am vierten Tag verabreichen Sie je nach Gruppe eine einzelne Injektion von Kokain oder Kochsalzlösung und stellen die Maus unverzüglich in die Kammer, um die lokale motorische Aktivität an ausgewählten Zeitpunkten nach der Kokainexposition 20 Minuten lang zu überwachen, entnehmen anschließend das Gehirn und legen es zur Abkühlung und Aushärtung ein bis zwei Minuten lang in eine eiskalte ACSF-Lösung.

Nachdem das Kleinhirn entfernt und überschüssige Flüssigkeit abgetupft wurde, wird das Gehirn mit dem rostralen Teil nach oben auf die Plattform eines Vibroschneiders geklebt. Die Kammer mit eiskaltem aCSF füllen und 200 µm dicke Schnitte herstellen, bis der Nucleus accumbens eindeutig identifiziert ist. Achten Sie beim Schneiden sorgfältig auf die Form des Balkens, die Lage und Form der vorderen Commissur sowie der Ventrikel.

Sobald der korrekte Bereich identifiziert ist, schneiden Sie zwei Schnitte von jeweils 400 Mikron, aus denen der Nucleus accumbens unter dem Stereomikroskop präpariert wird. Lösen Sie den Nucleus accumbens mit einer feinen Klinge vorsichtig von den Schnitten ab. Vier schnelle Bewegungen der Klinge im richtigen Bereich sollten das geeignete Gewebe unmittelbar isolieren.

Das isolierte Gewebe in 900 Mikroliter Lysepuffer geben und bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis die RNA-Extraktion beginnt. Die Röhrchen dann bei 37 Grad Celsius auftauen und homogenisieren. Mit einer 25-Gauge-Nadel kann es bei den ersten Durchgängen schwierig sein, das Gewebe zu homogenisieren, und es ist möglicherweise erforderlich, das Gewebe gegen die Röhrchenwand zu drücken, um es in kleine Stücke zu zerkleinern. Um eine vollständige Homogenisierung sicherzustellen, den Lysat auf eine Kaya-Shredder-Mini-Spin-Säule pipettieren und zentrifugieren.

Pipettieren Sie das Lysat in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und extrahieren Sie die RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nach der RNA-Reinigung erfolgt die Reverse Transkription in CDNA sowie die zielgerichtete Vorvermehrung der Proben mit Primern, die gegen die für die Analyse ausgewählte Gengruppe gerichtet sind. Diese Verfahren sind in der Textversion des Protokolls beschrieben.

Kommerzielle mikrofluidische Chips für die umfassende QPCR-Analyse sind im Format 48 × 48 erhältlich, was die Analyse von 48 Proben mit 48 Sondensätzen ermöglicht, oder im Format 96 × 96, bei dem 96 Proben mit 96 Sonden analysiert werden. In den meisten Fällen hängt die Wahl des Chips hauptsächlich von der Anzahl der zu analysierenden Proben ab.

Bereiten Sie zunächst die Probenmischung gemäß dem für das Experiment gewählten Chip vor. Seien Sie vorsichtig beim Pipettieren des 20 XDNA-Bindungsfarbstoff-Probelade-Reagenzes. Schütteln Sie die Probenmischungslösungen mindestens 20 Sekunden lang und zentrifugieren Sie sie für mindestens 30 Sekunden.

Die vorbereiteten Reaktionen können für kurze Zeit bei vier Grad Celsius aufbewahrt werden, bis der Chip zum Beladen bereit ist. Bereiten Sie als Nächstes das Assay-Gemisch vor, mischen Sie das Proben-Gemisch gründlich durch und zentrifugieren Sie es, um alle Bestandteile nach unten zu sedimentieren. Wie zuvor gezeigt, verfügt der dynamische Array-IFC-Chip über Zulauföffnungen für Proben und Assays sowie spezifische Zulauföffnungen für die Steuerflüssigkeit, die zur Druckbeaufschlagung der mikrofluidischen Kammern verwendet wird.

Zunächst injizieren Sie die Kontrolllinienflüssigkeit in jeden Akkumulator auf dem Chip. Danach bereiten Sie den Chip vor, indem Sie ihn in den IFC-Controller einsetzen und das entsprechende Skript ausführen. Sobald das Skript abgeschlossen ist, nehmen Sie den vorbereiteten Chip aus dem IFC-Controller heraus und pipettieren fünf Mikroliter jedes Assays.

Mischen Sie die Probe auf dem Chip. Geben Sie fünf Mikroliter jeder Probenmischung in die jeweiligen Zulässe und setzen Sie den Chip mit Hilfe der IFC-Controller-Software in den IFC-Controller ein. Führen Sie das Skript aus, um die Proben und Assays in den Chip zu laden.

Nachdem das Lademischungs-Skript abgeschlossen ist, entfernen Sie den beladenen Chip vom IFC-Controller. Laden Sie anschließend den Chip auf den Thermocycler und erstellen Sie einen neuen Chip-Lauf, der eine Schmelzkurvenanalyse einschließt. Stellen Sie mithilfe der Thermocycler-Software sicher, dass die Reaktionskammern korrekt erkannt werden, und lassen Sie die Reaktion bis zum Abschluss laufen.

Eine Zunahme der motorischen Aktivität war nach einer einzelnen akuten Kokaininjektion erkennbar. In diesem koronalen Schnitt markierten dicke weiße Linien die Position der Schnitte, die zur Abgrenzung der Grenzen des Nucleus accumbens angelegt wurden. Während der Dissektion zeigen die Amplifikationskurven von Primern, die gegen CFOs und phos B gerichtet sind, dass die Primerpaare ihren Zieltranskript mit einer Effizienz von etwa 100 % amplifizieren.

In jedem Zyklus zeigen die Ergebnisse, dass die durch Kokain induzierte Expression von CFOs und phospho-B im Nucleus accumbens eine und zwei Stunden nach der Exposition am höchsten war. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Next-Generation-Sequenzierung durchgeführt werden, um neuartige, bisher nicht charakterisierte Transkripte zu identifizieren.