Umfassende Analyse der Transkription von Gehirnproben Dynamics folgenden Verhaltens Experience
August 26th, 2014
Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll, das ein umfassendes Profiling zur Analyse von Transkriptionsprogrammen anwendet, die in spezifischen Gehirnkernen von Nagetieren induziert werden, die Verhaltensparadigmen folgen. Hier wird dieser Ansatz im Zusammenhang mit der Profilierung von Genen, die im Nucleus accumbens (NAc) von Mäusen nach akuter Kokainexposition induziert werden, unter Verwendung von mikrofluidischen qPCR-Arrays veranschaulicht.
Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Transkriptionsdynamik und die definierten Gehirnkerne von Mäusen nach Verhaltenserfahrungen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem die Tiere zunächst an sie gewöhnt und ihre Bewegungsaktivität nach der Kochsalzinjektion aufgezeichnet wird. Nach der Gewöhnung wird die lokomotorische Aktivität nach einer Einzeldosis Kokain aufgezeichnet, dann werden Proben aus dem Nucleus accumbens entnommen und für die RNA-Isolierung und die CDNA-Vorbereitung verwendet.
Als nächstes wird eine QPCR-Analyse durchgeführt, um die durch das Verhalten induzierte Genexpression zu untersuchen. Letztendlich werden Ergebnisse erzielt, die die Transkriptionsdynamik nach Kokainerfahrung zeigen. Dr. Hatu, der Laborleiter, Dum Muer, ein Doktorand aus dem Labor, und Duran, ein Student aus dem Labor, werden an drei aufeinanderfolgenden Tagen das Protokoll demonstrieren. Jede Maus ist an die Handhabung und Injektion gewöhnt und organisiert die Mäuse vor Beginn des Experiments in Käfigen, so dass die Mäuse in Zukunft nicht mehr zwischen den Käfigen hin- und hergeschoben werden und die Mäuse nie für einen längeren Zeitraum isoliert bleiben.
30 Minuten vor Beginn der Untersuchung sollten alle Testkäfige in den Verhaltensraum gebracht werden, damit sich die Tiere an die Umgebung gewöhnen können. Verabreichen Sie unmittelbar nach der Injektion eine intraperitoneale Injektion von 250 Mikrolitern Kochsalzlösung und setzen Sie die Maus in eine Verhaltenskammer, um die Bewegungsaktivität 15 Minuten lang zu überwachen. Die Maus könnte für 20 Minuten in der Verhaltenskammer platziert werden.
Eine Aktivität, die von der zweiten bis zur 17. Minute überwacht wird. Wiederholen Sie diese Schritte in den folgenden zwei Tagen zur gleichen Tageszeit. Verabreichen Sie am vierten Tag je nach Gruppe eine einmalige Injektion von Kokain oder Kochsalzlösung und platzieren Sie die Maus sofort in der Kammer, um die lokale motorische Aktivität 20 Minuten lang zu ausgewählten Zeitpunkten nach der Kokainexposition zu überwachen, extrahieren Sie das Gehirn und legen Sie es für ein bis zwei Minuten in eiskalte Liquorlösung, um zu kühlen und zu härten.
Nachdem Sie das Kleinhirn entfernt und überschüssige Flüssigkeit abtransportiert haben, kleben Sie das Gehirn mit dem rostralen Teil nach oben auf das Stadium eines Vibrams. Füllen Sie die Kammer mit eiskaltem A-Liquor und schneiden Sie 200-Mikron-Schnitte, bis der Nucleus accumbens eindeutig identifiziert ist. Achten Sie beim Schneiden genau auf die Form des Corpus Callosum, die Lage und Form der vorderen Kommissur und die Herzkammern.
Sobald die richtige Region identifiziert ist, schneiden Sie zwei Abschnitte von 400 Mikrometern, von denen aus der Nucleus accumbens unter einem Stereoskop präpariert wird. Verwenden Sie eine feine Klinge, um den Nucleus accumbens von den Scheiben weg zu präparieren. Vier schnelle Durchgänge der Klinge im richtigen Bereich sollten das entsprechende Gewebe sofort isolieren.
Legen Sie das isolierte Gewebe in 900 Mikroliter Lysereagenz und lagern Sie es bis zur RNA-Extraktion bei minus 80 Grad Celsius, um die Röhrchen bei 37 Grad Celsius aufzutauen und zu homogenisieren. Mit einer 25-Gauge-Nadel können die ersten Runden schwierig sein und erfordern, dass das Gewebe gegen die Wand des Röhrchens gedrückt wird, um es in kleine Stücke zu homogenisieren. Um eine ordnungsgemäße Homogenisierung zu gewährleisten, pipettieren Sie das Lysat auf eine Kaya-Shredder-Mini-Spin-Säule und Zentrifuge.
Pipettieren Sie das Lysat in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und extrahieren Sie die RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nach der RNA-Aufreinigung wird eine reverse Transkription zu CDNA sowie eine zielspezifische Preem-Amplifikation der Proben mit Primern durchgeführt, die gegen die für die Analyse ausgewählte Gruppe von Genen gerichtet sind. Diese Vorgehensweisen sind in der Textversion des Protokolls beschrieben.
Kommerzielle mikrofluidische Chips für eine umfassende QPCR-Analyse sind in den Größen 48 x 48 erhältlich. Format, das die Analyse von 48 Proben mit 48 Sondensätzen ermöglicht, oder in einem Format von 96 x 96, in dem 96 Proben mit 96 Sonden analysiert werden. In den meisten Fällen hängt die Wahl des Chips in erster Linie von der Anzahl der analysierten Proben ab.
Bereiten Sie zunächst die Probenmischung entsprechend dem für das Experiment gewählten Chip vor. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie das 20-XDNA-Bindungsfarbstoff-Probenladereagenz pipettieren. Die Probenmischlösungen mindestens 20 Sekunden lang rühren und mindestens 30 Sekunden zentrifugieren.
Vorbereitete Reaktionen können für kurze Zeit bei vier Grad Celsius gelagert werden, bis der Chip zum Beladen bereit ist. Bereiten Sie anschließend die Assay-Mischung vor, rühren Sie die Probenmischung gründlich auf und zentrifugieren Sie, um alle Komponenten zu schleudern. Wie bereits gezeigt, verfügt der IFC-Chip des dynamischen Arrays über Einlässe für Proben und Assays sowie über spezifizierte Einlässe für die Flüssigkeit der Kontrollleitung, die zur Druckbeaufschlagung der mikrofluidischen Kammern verwendet wird.
Injizieren Sie zunächst die Flüssigkeit der Steuerleitung in jeden Akkumulator auf dem Chip. Bereiten Sie als Nächstes den Chip vor, indem Sie ihn in den IFC-Controller einfügen und das entsprechende Skript ausführen. Wenn das Skript abgeschlossen ist, entfernen Sie den grundierten Chip aus dem IFC-Controller und pipettieren Sie fünf Mikroliter jedes Assays.
Auf den Chip mischen. Geben Sie fünf Mikroliter jeder Probenmischung in die Einlässe und geben Sie den Chip mit der IFC-Controller-Software an den IFC-Controller zurück. Führen Sie das Skript aus, um die Proben und Assays auf den Chip zu laden.
Wenn das Load-Mix-Skript abgeschlossen ist, entfernen Sie den geladenen Chip aus dem IFC-Controller. Laden Sie als Nächstes den Chip auf den Thermocycler und erstellen Sie einen neuen Chiplauf, der eine Schmelzkurvenanalyse umfasst. Die Verwendung der Thermocycler-Software stellt sicher, dass die Reaktionskammern richtig erkannt werden und die Reaktion bis zum Ende ablaufen kann.
Eine Zunahme der Bewegungsaktivität zeigte sich nach einer einzigen akuten Kokaininjektion. In diesem koronalen Schnitt markierten dicke weiße Linien die Stelle der Schnitte, die gemacht wurden, um die Grenzen des Nucleus accumbens zu definieren. Während der Dissektion zeigen die Amplifikationskurven von Primern, die gegen CFOs und Phos B gerichtet sind, dass die Primerpaare ihr Zieltranskript mit einer Effizienz von etwa 100 % amplifizieren.
In jedem Zyklus zeigten die Ergebnisse, dass die Kokain-induzierte Expression von CFOs und Phos B im Nucleus accumbens eineinhalb Stunden nach der Exposition am höchsten war. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Next Generation Sequencing durchgeführt werden, um neuartige uncharakterisierte Transkripte zu identifizieren.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Überblick
Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Analyse transkriptioneller Programme in spezifischen Hirnkernen von Nagetieren nach Verhaltensparadigmen. Der Ansatz wird durch die Profilerstellung von Genen veranschaulicht, die im Nucleus accumbens (NAc) von Mäusen nach akuter Kokain-Exposition induziert werden.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Verhaltensanalyse
- Genexpressions-Profilerstellung
Hintergrund
- Transkriptionelle Dynamiken sind entscheidend für das Verständnis der Gehirnreaktionen auf Verhalten.
- Der Nucleus accumbens ist eine Schlüsselregion, die an Belohnung und Sucht beteiligt ist.
- Kokain-Exposition verändert die Genexpression im Gehirn.
- Mikrofluidische qPCR-Arrays ermöglichen eine detaillierte Gen-Profilerstellung.
Zweck der Studie
- Um transkriptionelle Veränderungen im Nucleus accumbens nach Kokain-Exposition zu untersuchen.
- Ein Protokoll für RNA-Isolierung und Genexpressionsanalyse zu etablieren.
- Um den Verhaltenseinfluss auf die Genexpression bei Nagetieren zu verstehen.
Verwendete Methoden
- Habituierung der Mäuse an Handhabung und Kochsalzinjektion.
- Aufzeichnung der lokomotorischen Aktivität nach Kokain-Verabreichung.
- Sammlung von Nucleus accumbens-Proben für die RNA-Isolierung.
- QPCR-Analyse zur Beurteilung von Genexpressionsänderungen.
Hauptergebnisse
- Transkriptionelle Dynamiken wurden nach Kokain-Exposition beobachtet.
- Spezifische Gene wurden als im NAc induziert identifiziert.
- Das Protokoll zeigte eine effektive Profilerstellung der Genexpression.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der molekularen Grundlagen der Sucht bei.
Schlussfolgerungen
- Die Studie bietet ein robustes Protokoll zur Analyse der Genexpression als Reaktion auf Verhaltensreize.
- Die Erkenntnisse erweitern das Wissen über transkriptionelle Reaktionen in der Suchtforschung.
- Dieser Ansatz kann auf andere Verhaltensparadigmen in der Neurowissenschaft angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to quantitatively assess transcriptional dynamics in defined brain regions following behavioral or pharmacological perturbations, supporting target validation in neuropsychiatric drug discovery. By providing reproducible, quantitative gene expression readouts from limited tissue samples, it enhances predictive confidence in early-stage mechanistic studies and informs go/no-go decisions for CNS-targeted therapeutics. The approach is particularly valuable for de-risking hypotheses related to addiction, reward pathways, and behavioral phenotypes prior to investment in lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional programs in nucleus accumbens to validate functional relevance of genes implicated in cocaine-induced behavioral responses.
- Operational Value: Supports robust target hypothesis testing using microfluidic qPCR to quantify gene expression changes with high sensitivity from limited brain tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream screening by establishing baseline transcriptional profiles following acute pharmacological challenge.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through standardized RNA isolation, reverse transcription, and microfluidic qPCR workflows applicable across multiple samples.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant transcriptional readouts in a well-established model of psychostimulant response, supporting biomarker alignment and mechanistic de-risking.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by delivering quantitative, multiplexed gene expression data suitable for cross-platform confirmation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven target validation and assay development prior to lead identification efforts in CNS drug discovery programs.
- Discovery Biology: Enables mechanistic interrogation of transcriptional dynamics following behavioral experience, supporting pathway clarification and target de-risking.
- Screening: Generates quantitative, multiplexed outputs that support assay readiness and reproducibility for compound screening campaigns.
- Analytics: Delivers normalized gene expression measurements from microfluidic qPCR arrays, enabling statistical comparison across experimental conditions and time points.
- Translational Research: Connects acute behavioral responses to molecular signatures in reward circuitry, supporting translational validity in addiction models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable transcriptional profiling platform applicable across diverse behavioral paradigms and pharmacological challenges in neuroscience research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking behavioral phenotypes to defined transcriptional responses in key brain regions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of gene expression analysis through standardized microfluidic qPCR protocols suitable for multi-sample processing.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of CNS targets through mechanistic insight before costly lead optimization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets by providing quantitative evidence of pathway engagement following pharmacological challenge.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroscience techniques including behavioral testing, brain dissection, and RNA handling.
- Depends on access to microfluidic qPCR platforms and associated instrumentation for high-throughput gene profiling.
- Necessitates standardized protocols for sample collection, RNA isolation, and cDNA synthesis to ensure cross-experiment consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different brain regions, species, or behavioral paradigms beyond cocaine-induced nucleus accumbens responses.
- Practical limitations include tissue yield constraints from small brain nuclei and the need for careful normalization to account for sample variability.
