Name: Glutamin Flux Imaging Verwendung genetisch codierten Sensoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Glutamin-Transport in lebenden Zellen mit FRET-Sensoren in Echtzeit abbilden. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Transporteraktivitäten mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wurde vom NIH 1R21NS064412, NSF Zuschuss 1052048 und Jeffress Memorial Trust Stipendium J-908 unterstützt.

1. Probenvorbereitung Hinweis: In vielen Fällen Perfusionsexperimenten abzuwaschen einen erheblichen Teil der Zellen, welche eine frustrierende Problem werden kann. Obwohl es nicht notwendig für alle Zelllinien, Deckbeschichtung Glasflächen mit Poly-L-Lysin (1,0 ml/25 hinzufügen cm 2 von 0,01% Lösung auf die Oberfläche, Inkubation&gt; 5 min, zweimal waschen mit Zellkultur-Wasser und trocken in die Biosicherheitswerkbank) fördert die Zellhaftung. Beachten Sie außerdem, der Biosicherheitsstufe (BSL) der Zelllinie verwendet, und folgen Sie dem von der örtlichen Umwelt-und Sicherheitsbüro genehmigt Standardverfahren. In diesem Experiment wurden COS-7-Zellen aufgrund der niedrigen endogenen Glutamin Transportaktivität (siehe Abbildung 4). <ol><li> Samen COS7-Zellen bei ~ 70-80% Konfluenz in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) + 10% Kälberserum und kosmische 100 U / ml Penicillin / Streptomycin, entweder auf sterile 25-mm-Glasdeckgläschen in 6-Well-Kultur platziertGericht oder 8-Well-Glasboden-Rutschen. Bei 37 ° C, 5% CO 2, 100% Feuchtigkeit für 24 Stunden. </li><li> Tauschen das Wachstumsmedium DMEM + 10% Kälberserum kosmischen (keine Antibiotika), entsprechend dem Protokoll des Herstellers. Wachsen O / N bei 37 ° C, 5% CO 2 bei 100% Feuchtigkeit. </li><li> In jeweils 0,4 mg von Plasmid-DNA, die Glutamin-Sensor (pcDNA3.1, Trage FLIPQTV3.0 Sensor unter CMV-Promotor 10) und der mCherry-markierten ASCT2 10 bis 50 ml Serum-freien Medien (OPTI-MEM) kodiert und vorsichtig mischen. </li><li> 1 ml Transfektionsreagenz auf 50 ml Serum-freien Medien. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Die beiden Lösungen mischen DNA (Schritt 1.3) und Transfektionsreagenz (Schritt 1.4) enthält und Inkubation für 20 min. </li><li> Fügen Sie vorsichtig das Transfektionsreagenz auf der Oberseite der Zellen und vorsichtig durch Schwenken der Kammer. Inkubation für 24 Stunden bei 37 ° C, 5% CO 2, 100% Feuchtigkeit. </li><li> Nach 24 Stunden tauschen die mittel-bis DMEM + 10% Cosmic Kälberserum(CCS) + 100 Einheiten Penicillin / Streptomycin. </li><li> Die Zellen werden abgebildet 48-72 Stunden nach der Transfektion. </li></ol> 2. Perfusion Experiment Anmerkung: Für COS7-Zellen in diesem Experiment verwendet wurden Perfusionsmedien und Kammer bei RT gehalten und Umgebungs CO 2-Konzentration. Allerdings, wenn die Zellen verwendet werden, erfordern eine höhere Temperatur-und CO 2-Konzentrationssteuerung für das Überleben, erhitzt Mikroskoptisch und / oder eine Umgebungskammer verwendet werden. <ol><li> Bereiten Perfusionspuffer AF (Siehe Liste der Materialien). Bringen Hähne zu 50 ml Spritzen, schließen Sie die Hähne dann füllen sie mit den Perfusionslösungen. Öffnen Sie den Hahn für eine kurze Zeit, um den Kopfraum in den Hahn mit dem Puffer zu füllen. </li><li> Schalten Sie den 8-Kanal-, Schwerkraft-Feed Perfusion System mit einer Perfusion Bleistift, und wählen Sie dann &quot;Manual Mode&quot; unter Funktion Option Wählen. Stellen Sie einen Abfallbehälter unter die Perfusion Bleistift. </li><li> Manuellaktivieren Sie die Ports, indem Sie die entsprechenden Zahlen und füllen Sie die Schläuche mit 10-ml-Spritze, die Wasser, und schließen Sie dann den Hafen. Sobald die Anschlüsse mit Wasser gefüllt sind, stellen Sie die Spritzen mit Puffer AF auf dem Port 1-6 von Perfusions-System, und öffnen Sie dann die Hähne. Die Ports öffnen wieder, um das Wasser in der Rohrleitung mit den Puffern zu ersetzen. Die Strömungsgeschwindigkeit sollte etwa 0,8 ml / min. </li><li> Drücken Sie einmal auf die Abbrechen-Perfusion-Controller, um wieder in das Menü &quot;Select Function&quot; zu gehen. Umschalten zur Option &quot;Programm bearbeiten&quot;, geben Sie dann die Perfusion Protokoll in Tabelle 1 angegeben. Speichern Sie die Perfusion-Programm. </li><li> Nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator. Zweimal waschen mit der Perfusions-Puffer und dann die Zellen gesetzt auf der Bühne. Schließen Sie das System, um die Perfusion der Kammer. Wenn eine offene Kammer verwendet wird, der Aufbau einer weiteren Pumpe, die Perfusionslösung aus der Kammer entfernt. </li><li> Öffnen Slidebook Software. Starten Sie eine neue Folie. Hinweis: DerFolgende Vorgehensweise nur auf Slidebook Software, andere Software wie MetaFluor und Nis-Element kann auch für die Art der hier beschriebenen Abbildungs ​​verwendet werden. Theoretisch Experimente durchgeführt mit jeder Software, die zeit natürlich Bildgebung ermöglicht werden, und die Bildsequenzen post-experimentell mit einer Software wie ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) oder Fidschi analysiert werden (http:/ / fiji.sc / Fidschi). Allerdings ist Software, die Echtzeit-Überwachung von Akzeptor / Donor-Verhältnis ermöglicht sehr nützlich. </li><li> Befestigen Sie die Folie auf dem Fluoreszenzmikroskop Bühne. Finden Sie die Zellen co-exprimieren den Sensor und ASCT-mCherry unter Verwendung geeigneter Filtersätze (siehe Liste der Materialien) unter der Funktion &quot;FOCUS&quot;. Passen Gewinn, indem Sie auf Registerkarte &quot;Camera&quot; und schieben Sie die Schieberegler unter &quot;Gewinn&quot;. Auch, stellen Sie die Neutraldichtefilter Einstellung von neutral Dropdown-Menü Dichtefilter. Hinweis: Wenn die Filterwürfel enthält nicht ein Auge Filter, verwenden Sie nicht die Augen Stücke seit Short-Anregungslichtwellenlänge ist schädlich für die Augen. Verwenden Sie den Computer-Bildschirm, um die Zellen statt finden. </li><li> Erwerben Sie Bilder von Zellen with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (Filter werden in der Materialliste angegeben). Klicken Sie auf &quot;Bilder&quot; und dann in den Erwerb Fenster legen Sie die Filter, die gehen, verwendet werden. Klicken Sie auf &quot;TEST&quot;-Taste, um die Belichtungszeit, indem Sie die gewünschte Belichtungszeit in das Feld neben den Filtereinstellungen anpassen. Anmerkung: Alle drei Kanäle müssen für die gleiche Länge freigelegt werden. Beim Einstellen der Bildparameter, die voraussichtliche Änderung FRET-Effizienz zu erhöhen und falten berücksichtigen: zum Beispiel, wenn die FRET-Effizienz wird erwartet, dass während des Experiments bis 2-fache zu gehen, sollten Abbildungsparameter eingestellt werdenso daß die Intensität der Donor-Akzeptor ab em im Ruhezustand sollten 50% des Maximalwertes, der vom Instrument aufgenommen werden kann &lt;, so daß der Kanal nicht während des Experiments gesättigt. Signal aus den markierten Zellen sollten mindestens drei-mal höher als die in dem Hintergrundbereich ist. </li><li> Zeichnen Sie eine Region von Interesse mit Regionen Werkzeug in der Software. Alternativ kann auch eine Software-Funktion, um Pixel oberhalb bestimmter Intensität wählen verwendet werden, und dann in Regionen umgewandelt. Um dies zu tun, klicken Sie auf Maske - Segment, dann bewegen Sie den Schieberegler, um die gewünschten Bereiche zu markieren. </li><li> Wählen Sie &quot;Zeitablauf&quot; in der Capture-Typ Box, geben Sie dann das Intervall (10 sec in diesem Experiment) und Zeitpunkte für das Experiment. </li><li> Zeichnen Sie eine Region in einem Gebiet ohne fluoreszierenden Zellen. Dieser Bereich ist für die Hintergrund Subtraktion verwendet. Rechtsklick auf die Region gezogen, und setzen Sie ihn dann als Hintergrund. Hinweis: Idealerweise sind Zellen, die keinet exprimieren die Sensoren als dem Hintergrundbereich verwendet werden, um sowohl die Autofluoreszenz und dem von der Kamera erfassten Fluoreszenz Hintergrund zu berücksichtigen. Wenn keine solchen Zellen sind in dem Sichtfeld zur Verfügung, zumindest ein Bereich ohne die Zellen zu verwenden, um für die Hintergrundfluoreszenz zu berücksichtigen. </li><li> Wählen Sie das gewünschte Programm unter &quot;Select Function - Ausführen von Programmen&quot;-Option. Schalten Sie auf die gespeicherte Programm (siehe Schritt 2.3), und drücken Sie ENTER auf der Perfusions-Controller dann. Jetzt wird das Programm geladen ist, und schlagen Sie eine beliebige Taste wird die Durchblutung zu starten. </li><li> Stellen Sie sicher, Perfusion und der Abbildungs ​​Experiment zu starten in der gleichen Zeit, indem Sie auf &quot;Start&quot; im Aufnahmefenster in der gleichen Zeit wie das Drücken einer Taste auf der Perfusions-Controller. Hinweis: Es wird empfohlen, den Zeitpunkt, wo die Lösungen ausgetauscht wurden (dies kann über &quot;NOTES&quot;-Funktion auf der Registerkarte Erwerb gefunden geführt werden) aufzeichnen. </li><li> Führen Sie den gleichen Perfusion Protokoll using Zellen einen Sensor, der erwartet wird, um entweder gesättigt oder ungebundenen unter der experimentellen Bedingung ausdrückt. Anmerkung: Hier FLIPQTV3.0_1.5μ, die unter der experimentellen Bedingung gesättigt ist, wird als Kontrolle verwendet, Fig. 6 Solche Kontrollversuche sind notwendig, um zu bestätigen, dass die FRET-Effizienz Änderung ist auf die tatsächliche Änderung in dem Substrat nicht. aufgrund der Änderung anderer Parameter, wie zelluläre pH. </li></ol> 3. Post-Experiment Analyse <ol><li> Untersuchen Sie, wenn Probendrift während des Experiments aufgetreten. Zeichnen Regions Of Interest (ROI) ist auf der am Zeitpunkt 0 aufgenommene Bild, bewegen Sie den Schieberegler an der Oberseite der Imaging-Fenster und überprüfen, ob die Zellen fallen aus der ROIs in Bilder später im Experiment gemacht. </li><li> Wenn ja, dann verwenden Sie die Tracking-Funktion für die Drift durch erste korrigieren, Erstellen von Masken um die Zellen durch Auswahl Mask - Segment, schieben Sie die Zeile, die den Cutoff auf hig gibthlight die Regionen mit Zellen. Verfolgen Sie die Regionen durch Klicken Mask - Particle Tracking - Grundpartikelverfolgung. </li><li> Neu zeichnen die ROIs und Hintergrundbereich, wenn notwendig. </li><li> Exportieren der Durchschnittsintensität der ROIs im Laufe des Experiments. Klicken Sie auf Statistiken - Export - Ratio / Timelapse-Daten. </li><li> Wenn FRET-Effizienz und Quantifizierung der Substratkonzentration ist nicht notwendig, den Zeitverlauf des Grundstückes des Intensitätsverhältnisses (Donor-Akzeptor Ex em, / Donor Donor ex em) als Proxy für die Dynamik des Substrats. Um das cytosolische Konzentration zu bestimmen, die Berechnung der maximalen und minimalen Verhältnisänderung (dh an der Sättigungs und Abwesenheit des Substrats bezeichnet), &amp;Dgr; r max - &amp;Dgr; min, durch nicht-lineare Regression der Δratio (&amp;Dgr; r) mit der folgenden Gleichung: ∂ r = [S] / (K d + [S]) x (&amp;Dgr; <sub&gt; max - &amp;Dgr; min) + &amp;Dgr; min wobei [S] die Substratkonzentration im Cytosol. Verwendung der &amp;Dgr; r max - &amp;Dgr; r min-Werte erhalten, Sättigung (S) des Sensors bei einer bestimmten &amp;Dgr; r wird wie folgt berechnet S = (&amp;Dgr; - &amp;Dgr; min) / (&amp;Dgr; r max - &amp;Dgr; min) S weiter in die Substratkonzentration [S] mittels der folgenden Gleichung umgewandelt werden: S = [S] / (K d + [S]) Hinweis: die Intensität der Akzeptor-Akzeptor ex em Kanal sollte auch aufgetragen zu prüfen, ob die experimentelle Bedingung beeinflusst die Fluoreszenz des Akzeptor-direkt. </li><li> Wenn eine Basisliniendrift durch Fotobleichen beobachtet wird, führen Sie eine Basislinienkorrektur. Um dies zu tun, zeichnen die Intensitäten von Donor und Akzeptor mit der Zeit (Fig. 5A). Dann identifizieren die für th verwendet Zeitpunktene Grundlinie nach der Verzögerung im Perfusionssystem und der Transportaktivität des bestimmten Zelle (Fig. 5B). </li><li> Berechnen Sie ein Polynom Armatur, die am besten beschreibt die Grundlinie. Dann normalisieren die rohe Intensität von jedem Zeitpunkt auf die Grundlinie (Abbildung 5C). Berechnen Sie die Intensitätsverhältnis (Donor-Akzeptor Ex em, / Donor Donor ex em) aus den normierten Donor-und Akzeptor-Intensitäten. </li></ol>

<ol><li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+hepatic+ammonia+metabolism%3A+the+intercellular+glutamine+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Enzyme+Regul%22%5BJournal%5D)">Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle.</a> Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).</li>
<li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+glutamine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Beitr+Infusionther+Klin+Ernahr%22%5BJournal%5D)">Hepatic glutamine metabolism.</a> Beitr Infusionther Klin Ernahr. 17, 144-157 (1987).</li>
<li>Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+glutamine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition%22%5BJournal%5D)">Hepatic glutamine metabolism.</a> Nutrition. 18, 301-303 (2002).</li>
<li>Mustroph, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).</li>
<li>Sasagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quartz-Seq%3A+a+highly+reproducible+and+sensitive+single-cell+RNA+sequencing+method%2C+reveals+non-genetic+gene-expression+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity.</a> Genome Biol. 14, R31(2013).</li>
<li>Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+cycle+of+Ca%282%2B%29+ions+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines.</a> Neuron. 33, 439-452 (2002).</li>
<li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+with+fluorescent+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging with fluorescent biosensors.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).</li>
<li>Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encodable+fluorescent+biosensors+for+tracking+signaling+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+reviews%22%5BJournal%5D)">Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells.</a> Chemical reviews. , 111-3666 (2011).</li>
<li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotech%22%5BJournal%5D)">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).</li>
<li>Gruenwald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+glutamine+transporter+activities+in+living+cells+using+genetically+encoded+glutamine+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors.</a> PLoS One. 7, e38591(2012).</li>
<li>Chaudhuri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protonophore-+and+pH-insensitive+glucose+and+sucrose+accumulation+detected+by+FRET+nanosensors+in+Arabidopsis+root+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips.</a> Plant Journal. 56, 948-962 (2008).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499, 295-300 (2013).</li>
<li>Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+RNAi+Screen+Identifies+Letm1+as+a+Mitochondrial+Ca2%2B%2FH%2B+Antiporter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter.</a> Science. , 326-147 (2009).</li>
<li>Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Muller+cell+glutamine+synthetase+rapidly+impairs+the+retinal+response+to+light%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light.</a> Glia. 30, 64-73 (2000).</li>
<li>Rothstein, J. D., Tabakoff, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+Striatal+Glutamate+Release+after+Glutamine-Synthetase+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition.</a> J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).</li>
<li>Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+amino+acid+transporter+SNAT3+by+insulin+in+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes.</a> J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).</li>
<li>Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serine%2Fthreonine+kinases+SGK1%2C+3+and+PKB+stimulate+the+amino+acid+transporter+ASCT2%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Bioph+Res+Co%22%5BJournal%5D)">The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2.</a> Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).</li>
<li>Bröer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+astroglial+ASCT2+amino+acid+transporter+as+a+mediator+of+glutamine+efflux%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux.</a> J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).</li>
<li>Wallace, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-spike+detection+in+vitro+and+in+vivo+with+a+genetic+Ca2%2B+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor.</a> Nature. 5, 797-804 (2008).</li>
<li>Haugh, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+fluorescence+microscopy+with+molecular+biosensors%3A+what+are+we+really+measuring%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring.</a> Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).</li>
<li>San Martin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+FRET+lactate+sensor+and+its+use+to+detect+the+Warburg+effect+in+single+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells.</a> PLoS One. 8, e57712(2013).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).</li>
<li>Ponsioen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+cAMP-induced+Epac+activation+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%3A+Epac+as+a+novel+cAMP+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Rep%22%5BJournal%5D)">Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator.</a> Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).</li>
<li>Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+ratio+imaging+to+profile+caspase+activity%3A+potential+application+in+multiparameter+high+content+apoptosis+analysis+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening.</a> PLoS One. 6, e20114(2011).</li>
<li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2%2B%2FH%2B+antiporter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li>
<li>Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+examination+of+fluorescence+resonance+energy+transfer-detected+metal-ion+response+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells.</a> J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).</li>
</ol>

Es gibt nichts zu offenbaren.

Der Erfolg der Imaging-Experimenten hängt von ein paar kritische Faktoren. Einer dieser Faktoren ist die Affinität von Sensoren verwendet wird, wie oben diskutiert. Absolute Konzentration des Substrats in dem subzellulären Kompartiment von Interesse ist jedoch oft unbekannt. Deshalb empfehlen wir versuchen mehrere Sensoren mit versetzten Affinitäten, die, die unter der gewünschten Versuchsbedingung am besten funktioniert. Zum Beispiel, in unserem Fall mit 1.5μ transfizierten COS7-Zellen mit Glutamin Sensoren, 100μ, 2 m ...

Aufgrund der bemerkenswerten Fortschritte in Technologien, die Untersuchung des Transkriptoms und des Proteoms auf zellulärer Ebene ermöglicht, ist es jetzt klar geworden, dass die Biochemie und die daraus resultierende Fluss von Metaboliten und Ionen sind hochZellTyp-spezifische. Beispielsweise in der Leber von Säugetieren, Glutamin sequentiellen Abbau und die Synthese gleichzeitig durch periportal Zellen und perivenösen Zellen jeweils durchgeführt, wobei Ammonium zur Harnstoffzyklus im ersten Zelltyp beim Verbrauchen von überschüssigem Ammoniak in der zweiten 1-3. In einigen Fällen wird eine signifikante biochemische Heterogenität auch in einem &quot;Zelltyp&quot; 4, 5 nachgewiesen. Zusätzlich zu einer solchen räumlichen Spezifität sind die Ebenen der zellulären Metaboliten und Ionen hoch dynamischen (z. B. Signalmoleküle, wie Ca 2 + und zyklische Nukleotide). Die räumlich-zeitliche Muster von Metaboliten und Ionen spielen oft eine entscheidende Rolle bei der Signalübertragung. MONITORING zellulären Dynamik von Metaboliten und Ionen, jedoch stellen einzigartige Herausforderung. In vielen Fällen ist die Änderung der Konzentrationen rasche und vorübergehende, durch den Fall von Signalmolekülen, wie Ca 2 +, die innerhalb von ~ 20 ms in dendritischen Dornen 6 beispielhaft abfällt. Zusätzlich Kompartimentierung biochemische Wege in und zwischen den Zellen macht es schwierig, die Dynamik von Metaboliten und Ionen-Extraktion und Quantifizierung mittels Säulenchromatographie / Massenspektrometrie-Techniken. (8 in 7 prüft) Genetisch kodierte Sensoren für biologische Moleküle sind heute weitgehend durch die hohe Raum-Zeit-Auflösung, die der Experimentator zu kurzlebig und / oder compartmentalized Molekulardynamik untersucht werden können verwendet. Diese genetisch codierten Sensoren können grob in zwei Kategorien unterteilt werden; intensitätsbasierten Sensoren und ratiometic Sensoren. Intensitätsbasierten Sensoren bestehen typischerweise aus einer Bindungsdomäne und einer Grippeorescent Protein (FP), und der gelöste Stoff der Bindung an die Bindungsdomäne verändert die Fluoreszenzintensität. Ratiometic Sensoren, auf der anderen Seite, oft nutzen Förster Resonance Energy Transfer (FRET) zwischen zwei Rahmenprogramme, die als FRET-Paar funktionieren. Diese Sensoren bestehen aus einer Bindungsdomäne und zwei RP und der gelöste Bindung induziert die Änderung in der FRET-Effizienz zwischen den beiden Rahmenprogramme. Eine große Anzahl von Sensoren für biologisch wichtige Metaboliten und Ionen wurden in den letzten zehn Jahren 8, 9 entwickelt. Einer der aufregende Möglichkeit durch solche genetisch kodierte Sensoren angeboten wird, ist ihre Verwendung bei der hochauflösende Analyse von Membrantransportprozessen, die zuvor war nicht leicht, auf der zellulären Ebene zu erkennen. Genetisch kodierte Sensoren ermöglichen die Analyse von Transportmechanismen wie die Substratspezifität und die pH-Abhängigkeit 10, 11. Darüber hinaus wird in Kombination mit den genetischen resUELLEN wie die Bibliothek von RNAi-Konstrukten zur Modellorganismen, ist es nun möglich, genomweite Suche nach neuen Transportprozesse mit genetisch codierten Sensoren durchzuführen. In der Tat, die Verwendung von genetisch codierten Sensor führen zu der Entdeckung von bisher nicht charakterisierte Transporter in mehreren Fällen 12, 13. Kürzlich wurde unserem Labor eine Reihe von FRET-Sensor für Glutamin entwickelt. Wir haben gezeigt, dass zelluläre Glutamin können unter Verwendung derartiger FRET-Glutamin Sensoren 10 visualisiert werden. Diese Sensoren bestehen aus einer FRET-Donor (mTFP1) in einen bakteriellen Glutamin Bindungsprotein glnH eingesetzt und ein FRET-Akzeptor (Venus) am C-Terminus von glnH (Abbildung 1). Effizienz dieser Sensoren FRET verringern bei Bindung an Glutamin, was zur Abnahme der Akzeptor / Donor-Intensitätsverhältnis. Feinregulierung von Glutamin Transportprozesse wichtig in biologischen Prozessen wie neurotransmission 14, 15 und die Aufrechterhaltung der Harnstoffzyklus in der Leber 1, 16, 17. Hier zeigen wir die Methodik der Analyse von Verkehrsaktivitäten mit FRET-Sensoren für Glutamin, mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop Set-up. Das Ziel der Experimente hier dargestellt sind, um Transporttätigkeiten in einer einzigen Zelle zu detektieren und Substratspezifität eines transient exprimierten Transporter zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Inverses Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX81F-3-5</td><td>Ein gleichwertiges inverses Fluoreszenzmikroskop anderer Anbieter wäre ebenfalls geeignet.</td></tr><tr><td>Anregungsfilter (mTFP1)</td><td>Omega Optical</td><td>3RD450-460</td><td>Bandbreite 450-460 nm</td></tr><tr><td>Anregungsfilter (Venus)</td><td>Chroma</td><td>ET500/20</td><td>Bandbreite 490-510 nm</td></tr><tr><td>Emissionsfilter (mTFP1)</td><td>Chroma</td><td>HQ495/30m</td><td>Bandbreite 475-505 nm</td></tr><tr><td>Emissionsfilter (Venus)</td><td>Chroma</td><td>ET535/30m</td><td>Bandbreite 520-550 nm</td></tr><tr><td>Dichroitischer Spiegel (FRET-Kanäle)</td><td>Chroma</td><td>470dcxr</td><td>Langpass, 470 nm Cut-off</td></tr><tr><td>dichroitischer Spiegel (YFP-Kanal)</td><td>Chroma</td><td>89002bs</td><td>Pässe 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm</td></tr><tr><td>mCherry Filterset</td><td>Chroma</td><td>49008</td><td>Anregung 540-580 nm, dichroitischer Langpass mit 585 nm Cut-off, Emissionsfilter 595-695 nm</td></tr><tr><td>Lichtquelle</td><td>Olympus</td><td>U-LH100L-3-5</td><td>LED- oder Halogen-Lichtquelle, die eine stabile Lichtintensität erzeugt, Quecksilberlampen werden nicht empfohlen</td></tr><tr><td>CCD-Kamera</td><td>Qimaging</td><td>Rolera-MGi EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>Apochromatisches Fluoreszenzobjektiv</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusionssystem, ValveBank II</td><td>AutoMate Scientific</td><td>[01-08]</td><td>Andere Perfusionssysteme, die einen schnellen Lösungswechsel ermöglichen, funktionieren auch</td></tr><tr><td>Laminar-Flow-Kammern</td><td>C& L Instruments</td><td>VC-MPC-TW</td><td>Andere Larminar-Flow-Kammern würden auch funktionieren.</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>mit Kammer Lab-Tek</td><td>154534</td><td>Für Experimente mit offener Kammer</td></tr><tr><td>Perfusionspumpe</td><td>Thermo Scientific</td><td>74-046-12131</td><td>Für Experimente mit offener Kammer</td></tr><tr><td>Software zur Unterstützung ratiometrischer Messungen</td><td>Intellegenent Imaging Innovation</td><td>Slidebook 5.5</td><td></td></tr><tr><td>Laminar-Flow-Biosicherheitswerkbank</td><td>ESCO</td><td>LA-3A2</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp CO2 </Unter>Inkubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-255-25</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's MEM (DMEM)</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Cosmic Calf Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH3008703</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Serumfreies Medium für die Transfektion (OPTI-MEM I)</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td>Verwendet mit Lipofectamine 2000</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin-Lösung</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>25 mm runde Glasdeckgläser</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-545-102</td><td>Falls VC-MPC-TW verwendet wird</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td>Andere Transfektionsreagenzien können ebenfalls verwendet werden.</td></tr><tr><td>Lösung A (Hank-Puffer)</td><td></td><td></td><td>9,7 g HANK-Salz (Sigma H1387), 0,35 g NaHCO3, 5,96 g HEPES auf 1 L, pH-Wert eingestellt auf 7,35 mit NaOH</td></tr><tr><td>Lösung B Lösung A</td><td></td><td></td><td>+ 0,04 mM Gln</td></tr><tr><td>Lösung C</td><td></td><td></td><td>Lösung A + 0,2 mM Gln</td></tr><tr><td>Lösung D</td><td></td><td></td><td>Lösung A + 1 mM Gln</td></tr><tr><td>Lösung E</td><td></td><td></td><td>Lösung A + 5 mM Gln</td></tr><tr><td>Lösung F</td><td></td><td></td><td>Lösung A + 5 mM Ala</td></tr></tbody></table>

glutamin flux imaging verwendung genetisch codierten sensoren

Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Genetisch kodierte Sensoren ermöglichen die Echtzeitüberwachung von biologischen Molekülen auf subzellulärer Auflösung. Eine enorme Vielzahl solcher Sensoren für biologische Moleküle wurde in den letzten 15 Jahren zur Verfügung, von denen einige unverzichtbare Werkzeuge geworden, die routinemäßig in vielen Labors verwendet werden. Eine der spannenden Anwendungen der genetisch codierten Sensoren ist die Verwendung dieser Sensoren bei der Untersuchung zellulärer Transportprozesse. Eigenschaften von Transportern wie Kinetik und Substratspezifität kann auf zellulärer Ebene untersucht werden, was Möglichkeiten für die Zelltyp-spezifische Analysen der Transportaktivitäten. In diesem Artikel werden wir zeigen, wie Transporter Dynamik kann mit genetisch kodierten Glutamin Sensor als Beispiel beobachtet werden. Experimentelles Design, technischen Details der experimentellen Einstellungen und Überlegungen für die Post-experimentelle Untersuchungen diskutiert werden.

Typische Zeitverlaufsexperimente sind in Fig. 2 dargestellt. In diesen Experimenten FRET Glutamin Sensoren mit Affinitäten von 8 mm (FLIPQTV3.0_8m, 2A und 2B) und 100 &amp;mgr; M (μ FlipQTV3.0_100 C und D) wurden mit coexprimiert eine Pflicht Aminosäure Tauscher ASCT2 18 in COS-7 Zellen 10. Zustrom von Glutamin als die Änderung in der Fluoreszenzintensitätsverhältnisse zwischen dem Spender (mTFP1) und dem Akzeptor (Venus) (2A und <...

Dieser Artikel soll zeigen, wie Glutamin Dynamik in lebenden Zellen mit FRET überwachen. Genetisch kodierte Sensoren ermöglichen die Echtzeitüberwachung von biologischen Molekülen auf subzellulärer Auflösung. Experimentelles Design, technischen Details der experimentellen Einstellungen und Überlegungen für die post-experimentellen Analysen werden für genetisch kodierte Glutamin Sensoren diskutiert werden.

Glutamin Flux Imaging Verwendung genetisch codierten Sensoren

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Glutamintransport mittels eines heterolog exprimierten Transporters in lebenden Zellen unter Verwendung von Förster-Resonanzenergietransfer, also FRET-Sensoren, abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst Cause-seven-Zellen mit einem Glutaminsensor und einem Transporter transfiziert werden. Der Sensor besteht aus einem FRET-Donor, der in ein bakterielles Glutamin-bindendes Protein eingefügt ist, sowie einem FRET-Akzeptor am C-Terminus des Glutamin-bindenden Proteins.Der zweite Schritt besteht darin, ein Perfusionsystem einzurichten und die Zellen in Echtzeit mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop abzubilden. Der letzte Schritt ist die Analyse der Bilder und die Visualisierung der Glutamindynamik. Letztendlich können Transportaktivitäten in einer einzelnen Zelle mithilfe dieser FRET-Sensoren nachgewiesen werden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie chromatographischen Messungen liegt in der deutlich höheren räumlichen und zeitlichen Auflösung. Diese Technik besteht aus drei Teilen: der Transfektion von Zellen mit Sensorproteinen, der Echtzeit-Bildgebung und der nachexperimentellen Analys

glutamine-flux-imaging-using-genetically-encoded-sensors

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Ein Verfahren zur Flüssig-Kultivierung und die Abgabe...

High-Throughput-Screening und Biosensorik mit Fluorescent C. elegans Die Stämme

Dieses Video zeigt die Bewertung der Glutamatfreisetzung und -clearance an einzelnen kortikostriatalen Synapsen in einem Schnitt des Mausgehirns. Die elektrische Stimulation erleichtert die Freisetzung von Glutamat an der Synapse. Das freigesetzte Glutamat verändert die Fluoreszenz des Sensorproteins, die mit der Zeit abfällt, was auf die Freisetzungs- und Clearance-Effizienz hinweist.

Analyse der Glutamatfreisetzung und -clearance an einer einzelnen Neuronensynapse in einem Maushirnschnitt

Eine Beschreibung, wie Förster Resonance Energy Transfer integriert biologischen Sensoren (FIBS) zur in-situ-Kalibrierung Metabolic Profiling vorgestellt. Die FIBS kann verwendet werden, um die intrazellulären Spiegel von Metaboliten nicht-invasiv Unterstützung bei der Entwicklung von Stoffwechselmodelle und Hochdurchsatz-Screening von Bioprozess-Bedingungen zu messen.

FIBS-fähigen Nichtinvasive Metabolic Profiling

Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung von genetisch codierte Fluorogenic Reporter in einer live Cell Imaging-Anwendung für die Prüfung der Harnblase-induzierten oxidativen Stress. Diese experimentelle Ansatz bietet unvergleichliche räumlich-zeitliche Auflösung, Sensitivität und Spezifität vieler die Unzulänglichkeiten der konventionellen Methoden zur Erkennung von toxikologischen oxidativen Stress zu vermeiden.

Imaging-Ansätze zur Bewertung der toxikologischen oxidativen Stress mit genetisch codierte Fluorogenic Sensoren

Das Ziel dieses Protokolls ist es, das Studium der NMDA-Rezeptoren (NMDAR) in einem größeren Maßstab erleichtern und ermöglichen die Prüfung der modulierende Effekte von kleinen Molekülen und deren therapeutische Anwendungen.

Eine Hochdurchsatz-Kalzium-Flux-Assay, NMDA-Rezeptoren mit Sensibilität für Glycin/D-Serin und Glutamat zu studieren

Gibberellin Wahrnehmung Sensor 1 (GPS1) ist der erste Förster Resonanz Energie Transfer-basierten Biosensor zur Messung der zellulären Ebenen der Gibberellin Phytohormone mit hoher räumlich-zeitliche Auflösung. Dieses Protokoll berichtet über die Methode zu visualisieren und zelluläre Gibberellin Ebenen mit Hilfe der genetisch codierten nlsGPS1 Biosensor in Arabidopsis Hypocotyle und Wurzelspitzen zu quantifizieren.

Visualisierung zellulären Gibberellin-Ebenen mit NlsGPS1 Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor

Extrazelluläre Glutamat-ausgelöste systemische Kalziumsignalisierung ist entscheidend für die Induktion von pflanzlichen Abwehrreaktionen auf mechanische Wunden und Pflanzenfresserangriffe in Pflanzen. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um die räumliche und zeitliche Dynamik dieser beiden Faktoren mit Arabidopsis thaliana-Pflanzen zu visualisieren, die kalzium- und glutamatempfindliche fluoreszierende Biosensoren exprimieren.

Weitfeld-Echtzeit-Bildgebung lokaler und systemischer Wundsignale bei Arabidopsis

Die Glukoseaufnahme ist in Drosophila-Motoneuronen erhöht, die von der TAR-DNA-bindenden Protein (TDP-43) -Proteinopathie betroffen sind, wie durch einen FRET-basierten, genetisch kodierten Glukosesensor angezeigt.

Messung der Glukoseaufnahme in Drosophila-Modellen der TDP-43-Proteinopathie

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Bestimmung von Unterschieden im basalen Redoxzustand und in den Redoxreaktionen auf akute Störungen in primären Hippocampus- und kortikalen Neuronen unter Verwendung der konfokalen Live-Mikroskopie. Das Protokoll kann mit minimalen Modifikationen auf andere Zelltypen und Mikroskope angewendet werden.

Live-Bildgebung des mitochondrialen Glutathion-Redox-Zustands in primären Neuronen unter Verwendung eines ratiometrischen Indikators

Dieses Protokoll bietet einen standardisierten Hochdurchsatz-Screening-Workflow für industrielle Mikroorganismen. Dabei wird eine mutierte Bibliothek mittels ARTP-Mutagenese erstellt, ein positives Tröpfchenscreening mit automatisierter Mikrofluidik durchgeführt und anschließend die Ergebnisse überprüft. Die Zuverlässigkeit des Workflows wurde durch das Screening von Hochleistungs-B . coagulans-Stämmen bestätigt.

Hochdurchsatz-Screening von L-Milchsäure-hyperproduzierenden Bacillus-Coagulans-Mutanten mittels einer automatisierten tropfen-mikrofluidischen Plattform

Erfahren Sie, wie Sie Glutamin-Transport in lebenden Zellen mit FRET-Sensoren in Echtzeit abbilden. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Transporteraktivitäten mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung.

Glutamin Flux Imaging Verwendung genetisch codierten Sensoren

Weitere Videos entdecken