Glutamin Flux Imaging Verwendung genetisch codierten Sensoren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Glutamintransport über einen heterologen exprimierten Transporter in lebenden Zellen mit Hilfe von Firster-Resonanz-Energietransfer- oder Bundsensoren abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst sieben Zellen mit einem Glutaminsensor und einem Transporter durchtrennt werden. Der Sensor besteht aus einem Bunddonor, der in ein bakterielles Glutamin-Bindungsprotein eingefügt wird, und einem Bundakzeptor am C-Terminus des Glutamin-Bindungsproteins.

Der zweite Schritt besteht darin, ein Perfusionssystem aufzubauen und die Zellen mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop in Echtzeit abzubilden. Der letzte Schritt besteht darin, die Bilder zu analysieren und die Glutamindynamik zu visualisieren. Letztendlich können mit diesen Bundsensoren Transporteraktivitäten in einer einzelnen Zelle detektiert werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der chromatographischen Messung besteht darin, dass Sie eine viel höhere räumliche und zeitliche Auflösung erhalten. Diese Technik besteht aus drei Teilen, der Transfektion von Zellen mit Sensorproteinen, der Echtzeit-Bildgebung und der postexperimentellen Analyse der Kosten. Sieben Zellen werden in diesem Experiment aufgrund ihrer geringen endogenen Glutamintransportaktivität verwendet.

Aussaat der Zellen mit etwa 70 bis 80 % Co-Flüssigkeit in DMEM plus 10 % kosmischem Kälberserum oder CCS und 100 Einheiten pro Milliliter. Penicillin-Streptomycin in einer Acht-Well-Glasbodenschale. Inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, 5 % CO2, 100 % Luftfeuchtigkeit.

Nach 24 Stunden. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium durch DMEM plus 10%CCS ohne Antibiotika, wachsen Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius, 5%CO2, 100%Luftfeuchtigkeit am Tag der Transfektion. Fügen Sie jeweils 0,4 Mikrogramm der Plasma-DNA hinzu, die für den Glutaminsensor kodiert, und den markierten obligatorischen Aminosäureaustauscher m cherry A SCT, zwei bis 50 Mikroliter serumfreies Medium.

Geben Sie einen Mikroliter Transfektionsreagenz zu 50 Mikrolitern serumfreiem Medium, mischen Sie es vorsichtig und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Mischen Sie anschließend die Lösung, die die DNA enthält, mit dem verdünnten Transfektionsreagenz und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach 20 Minuten die Transfektionsreagenzmischung vorsichtig auf die sieben Zellen geben und vorsichtig mischen, indem Sie die Kammer schütteln.

Inkubieren Sie nach 24 Stunden 24 Stunden bei 37 Grad Celsius, 5 % CO2 und 100 % Luftfeuchtigkeit. Ersetzen Sie das Medium durch DMEM plus 10 % CCS plus 100 Einheiten Penicillin-Streptomycin. Bringen Sie die Zellen wieder in den Inkubator, bevor Sie mit der Perfusion beginnen.

Bereiten Sie die Perfusionspuffer A bis F nach den Rezepten im Begleitmanuskript vor. Befestigen Sie stop Cox an 50 Milliliter Spritzen. Schließen Sie die Absperrhähne und füllen Sie die Spritzen mit den Perfusionslösungen.

Öffnen Sie den Absperrhahn für eine kurze Zeit, um den Kopfraum im Absperrhahn mit dem Puffer zu füllen. Schalten Sie dann die Achtkanal-Schwerkraft ein. Füttern Sie das Perfusionssystem mit einem Perfusionsstift und wählen Sie den manuellen Modus.

Unter der Option Funktion auswählen. Stellen Sie einen Abfallbehälter unter den Perfusionsstift. Für den Erfolg dieses Experiments ist es wichtig, die Perfusion so einzurichten, dass die Drift und die Lösungsverschleppung minimiert werden.

Aktivieren Sie die Anschlüsse manuell, indem Sie die entsprechenden Ziffern drücken, und füllen Sie die Schläuche mit Wasser. Mit einer 10-Milliliter-Spritze die Öffnungen verschließen, die Spritzen mit den Puffern A bis F auf die Anschlüsse eins bis sechs des Perfusionssystems setzen und die Absperrhähne öffnen. Danach.

Öffnen Sie die Anschlüsse wieder, um das Wasser in den Schläuchen durch die Puffer zu ersetzen. Die Durchflussrate sollte etwa 0,8 Milliliter pro Minute betragen. Drücken Sie einmal Abbruch auf dem Perfusionsregler, um zum Menü der Auswahlfunktion zurückzukehren.

Wechseln Sie zur Option "Programm bearbeiten" und geben Sie dann das in dieser Tabelle angegebene Perfusionsprotokoll ein. Speichern Sie das Perfusionsprogramm. Die Zellen werden 48 bis 72 Stunden nach der Transfektion abgebildet.

Waschen Sie die Vertiefungen der Glasbodenschale zweimal mit Perfusionspuffer A und achten Sie darauf, die Zellen nicht abzuwaschen. Stellen Sie die Glasbodenschale auf den Tisch des Leuchtstoffmikroskops. Schließen Sie das Perfusionssystem an die Kammer an.

Wenn eine offene Kammer verwendet wird, stellen Sie eine weitere Pumpe auf, die die Perfusionslösung aus der Kammer entfernt. Öffnen Sie die Imaging-Software für das Diabuch. Starten Sie eine neue Folie mit der Fokus-Funktion, suchen Sie Zellen coex, die den Sensor exprimieren, und A SCT zwei M Kirsche mit entsprechenden Filtersätzen.

Passen Sie die Verstärkung an, indem Sie auf die Registerkarte Kamera klicken und den Schieberegler unter Verstärkung schieben. Passen Sie außerdem die Einstellung des Neutraldichtefilters aus dem Dropdown-Menü des Neutraldichtefilters an. Klicken Sie auf Bilderfassung, und geben Sie dann im Aufnahmefenster die zu verwendenden Filter an.

Die Bilder werden in drei Kanälen aufgenommen. Donoranregung, Donor-Emission, Donor-Emission, Doneranregung, Akzeptanzmission und Akzeptoranregung Akzeptanzmission. Klicken Sie auf die Testschaltfläche, um die Belichtungszeit anzupassen, indem Sie die gewünschte Belichtungszeit in das Feld neben den Filtereinstellungen eingeben, alle drei Kanäle müssen gleich lange belichtet werden.

Zeichnen Sie einen Interessenbereich mit dem Werkzeug Regionen. Wählen Sie Zeitraffer im Feld Aufnahmetyp aus. Geben Sie dann das Intervall und die Zeitpunkte für das Experiment an.

Zeichnen Sie als Nächstes einen Bereich in einem Bereich ohne fluoreszierende Zellen, der für die Hintergrundsubtraktion verwendet werden soll. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den gezeichneten Bereich, und legen Sie ihn dann als Hintergrund fest. Im Idealfall sollten Zellen, die die Sensoren nicht exprimieren, als Hintergrundbereich verwendet werden, um sowohl die von der Kamera erfasste Autofluoreszenz als auch die Hintergrundfluoreszenz zu berücksichtigen.

Wählen Sie das gewünschte Programm unter der Option Funktion ausführen auswählen, wechseln Sie zum gespeicherten Programm und drücken Sie dann die Eingabetaste auf dem Perfusionscontroller. Das Programm ist nun geladen, und wenn Sie eine beliebige Taste drücken, wird die Perfusion gestartet, um sicherzustellen, dass sowohl die Perfusion als auch das Bildgebungsexperiment gleichzeitig starten. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Start" im Aufnahmefenster, während Sie gleichzeitig eine Taste auf dem Perfusionscontroller drücken.

Hier sind typische Zeitverlaufsexperimente mit Zellen gezeigt, die Coex-Zellen, die die a s, CT, zwei Transporter exprimieren, und Bundglutaminsensoren mit Affinitäten von acht Millimolaren und 100 Mikromolaren. Der Einstrom von Glutamin wird als Änderung der Fluoreszenzintensitätsverhältnisse zwischen dem Donor mtfp und dem Akzeptor Venus nachgewiesen. Der Einstrom von Glutamin in Gegenwart von Alanin ist ebenfalls ein nachgewiesenes Substrat.

Auch Spezifitäten von Transportern können mit Hilfe der Sensoren untersucht werden. Hier wurden Zellen mit Glutamin vorgeladen und dann verschiedene Aminosäuren zur extrazellulären Perfusion hinzugefügt. Acht wie erwartet: A ct zwei Substrate induzierten Glutamin flx, während Nicht-Substrat-Aminosäuren dies nicht taten.

Das Fehlen von Änderungen der Bundeffizienz bei der Zugabe eines Substrats kann mehrere Gründe haben, wie z. B. die geringe Aufnahmekapazität für das zu testende Substrat, wie sie in Zellen gezeigt wird, die den Acht-Millimolar-Sensor oder den 100-Mikromolar-Sensor exprimieren. Dies drückt jedoch nicht aus, dass der a s CT zwei Transporter bestätigt, dass die Änderung der Bundeffizienz auf die tatsächliche Änderung des Substrats und nicht auf die Änderung anderer Parameter zurückzuführen ist. Das gleiche Perfusionsprotokoll wird mit Zellen durchgeführt, die einen Sensor exprimieren, von dem erwartet wird, dass er unter den experimentellen Bedingungen gesättigt ist.

Und in diesem Beispiel beträgt die Affinität des Sensors 1,5 Mikromolaren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Dynamik von Metaboliten mit Hilfe von Bundsensoren abbilden können. Vergessen Sie nicht, dass Zellkulturen angemessen nach den Standardarbeitsanweisungen behandelt werden sollten, damit das Expositionsrisiko minimiert wird.