Name: Oberschenkelknochenmark-Aspiration im Live-Mäuse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Lernen Sie die Aspiration von Knochenmark aus dem Oberschenkelknochen lebender Mäuse. Diese nicht-tödliche Methode ermöglicht serielle Probenahmen für hämatologische und Transplantationsstudien.

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O.A.-W. wird unterstützt durch einen NIH K08 Clinical Investigator Award (1K08CA160647-01), einen U.S. Department of Defense Postdoctoral Fellow Award in Bone Marrow Failure Research (W81XWH-12-1-0041), das Josie Roberston Investigator Program und einen Damon Runyon Clinical Investigator Award mit Unterstützung der Evan's Foundation.

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Tier Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUCs) am Memorial Sloan-Kettering Cancer Center genehmigt. 1. Aspiration von Knochenmark (BM) Zellen aus dem Femur <ol><li> Anesthetize die Maus, die Oberschenkelknochenmarkpunktion mit Isofluran (1-4%) mit einer Genauigkeit Verdampfer verabreicht unterziehen wird. Narkosetiefe sollte alle 5-10 min durch die Beobachtung, dass es keine Veränderung der Atemfrequenz mit chirurgischen Manipulation und / oder Ohr, Zehen und Schwanz Prise verbunden überwacht werden während des gesamten Verfahrens. Anästhesie mit Isofluran induziert und auch während des gesamten Verfahrens mit Isofluran aufrechterhalten. Ein Bezugs vorprozessualer Dosis von Buprenorphin in einer Dosis von 0,05-0,1 mg / kg subkutan alle 6-12 Stunden können verwendet werden, um Schmerzen, die mit dem Verfahren als adj zugeordnet verhindernUNCT zu der Carprofen. </li><li> Anwenden Augensalbe für die Augen der Maus nach der Induktion der Anästhesie von Hornhaut Trocknen zu verhindern. </li><li> Das Fell wird vorsichtig von einem Hautbereich etwa 150% größer als die Fläche des beabsichtigten Aspiration Seite abgeschnitten. Lose Fell mit einem feuchten Gaze entfernt. Bitte halten Sie die Maus auf einem umlauf warmem Wasser Pad oder andere sichere thermostatisch gesteuerte Oberfläche zu Unterkühlung während des Verfahrens zu verhindern. </li><li> Desinfizieren Sie die gesamte Bein mit der Oberschenkelknochen, die Streben mit drei Sätzen von Wechsel Peelings (abwechselnd entweder mit einem PVP-Jod (Betadine) oder Chlorhexidin (Nolvasan) Peeling und 70% igem Alkohol oder 70% Ethanol getränkten Gaze Schwämme) unterzogen werden. </li><li> Befeuchten Sie ein 0,5 ml Tuberkulin-Spritze (Volumen: 0,5 cm ³; Weite: 27,5 G) mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), bevor Absaugen des BM. Füllen Sie die Spritze mit 200-500 ul PBS und sofort vertreiben die PBS. Wiederholen Sie diesen Vorgang 2-3 times. </li><li> Halten Sie das Schienbein gebogen vom Oberschenkelknochen durch Drücken der Tibia entweder mit dem Ringfinger oder dem fünften Finger. Zu bestätigen, dass eine geeignete Anästhesieebene erreicht ist. Die Spritze wird mit dem Daumen und dem Zeigefinger gehalten wird. Dies ermöglicht die Kondylen ausgesetzt sein und erleichtert das Einführen der Nadel. </li><li> Nach Benetzung der Spritze und stechen Sie die Nadel durch die Patellasehne, sodass die Nadel sicher zwischen den beiden Kondylen des Oberschenkelknochens eingelegt. Durch Halten der Diaphyse der Nähe der Epiphyse des Femurs mit dem Daumen und dem Zeigefinger wird die Nadel in den Schaft des Oberschenkelknochens leicht eingeführt. </li><li> Schwenken der Nadel nach außen und oben, so daß sie parallel mit der Achse des Femurs ist. Diese Maßnahme erleichtert Abruf von Knochenmark Inhalte aus dem Femurschaft. </li><li> Drehen Sie die Nadel im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn und schieben Sie sie langsam in die Oberschenkelmarkhöhle. Überprüfen Sie die korrekte Positionierung der Nadel durch leichtes Bewegen des syRinge seitlich. </li><li> Ziehen Sie die Nadel Kolben zurück, wodurch Unterdruck, während Sie die Nadel hin und her in der BM Höhle. Hinweis: Das Volumen des angesaugten BM ungefähr 5 &amp;mgr; l entspricht, die typischerweise 0,4-0,8 x 10 &amp;sup6; mononukleare Zellen sein. Erfolgreiche Aspiration wird visuell durch das Auftreten von Blut in der Spitze der Nadel in der Basis der Spritze bestätigt werden. Wenn kein Blut in der Spritze gesehen ist es wahrscheinlich, daß ein kleiner Knochen oder Gewebefragment in der Nadel stecken. Dies kann von der Nadel durch Bewegen des Kolbens nach oben und unten in PBS (dies ist ein Grund, warum der Spritze sollte mit PBS vor dem Absaugen des BM vorgefüllt werden) entfernt werden. Wenn das Gewebe nicht aus der Spritze verdrängt werden, verwenden Sie eine neue Nadel und Spritze (wieder nass die Spritze mit 200-500 ul PBS). </li><li> Sobald BM erfolgreich von der Oberschenkelknochen angesaugt, entfernen Sie die Nadel und Spritze aus dem Oberschenkelknochen und Maus. </li><li> Bewegen saugten BM zu einem Mikrozentrifugenröhrchen prmit 500 ul PBS efilled. Für die meisten Anwendungen, die BM-Zellen sollten dann auf Eis bis zur weiteren Verarbeitung, wenn möglich gehalten werden. </li><li> Nach Abschluss des Verfahrens, verwalten Analgetikum mit Carprofen 5 mg / kg subkutan. Entfernen Sie dann mit der Maus aus der Narkose und legen Sie auf einem Heizkissen, bis vollständig erholt. HINWEIS: Es sollte keine Komplikationen oder Stress erlebt nach der Aspiration Verfahren, wenn es richtig gemacht ist. </li><li> Vor der Rückkehr Mäuse mit dem Gehäuse-Bereich, sicherzustellen, dass sie in der Lage, ambulate und Nahrung und Wasser zu erreichen sind. Beachten Sie die Mäuse auf Anzeichen von Stress oder Infektionen nach dem Eingriff in der nächsten 24 Stunden. Symptome sind: konstant Blutungen, Anämie, Lethargie. Wenn eines dieser Zeichen sind nach dem Eingriff zu sehen ist, sollte das Tier (e) eingeschläfert werden. Hinweis: BM Aspiration / Probenahme kann wiederholt werden, aber der Vorgang wiederholen sollte auf der gegenüberliegenden Oberschenkelknochen wiederholt Trauma der gleichen Bein verhindern, durchgeführt werden. Es gibt wenig Informationen über die frequency dass BM Aspiration durchgeführt werden. Oberschenkelknochenmarkpunktion ist in der Regel nicht häufiger als alle 2 Wochen wiederholt. </li></ol> 2. Beurteilung der Zellgehalt in Aspirated BM Cells <ol><li> Pellet-Zellen aus BM Aspiration und in ein Mikrozentrifugenröhrchen durch Zentrifugation bei 300 g für 5 min abgerufen bei 4 ° C oder RT. </li><li> Saugt den Überstand und das Pellet in 500 &amp;mgr; l von roten Blutkörperchen ACK-Lysepuffer (&quot;Ammoniumchlorid-Kalium&quot; Lysepuffer). </li><li> Die Zellen in rot Zelllysepuffer Inkubation für 10 min und dann 1 ml PBS und Spin-Down der Mischung wieder bei 300 g für 5 min bei 4 ° C oder RT. Hinweis: Die roten Blutkörperchen lysiert Pellet besteht nun aus BM mononukleären Zellen. Diese können für FACS-Färbung, Zellzählung, Transplantation, Zytospin Analyse und / oder einer anderen Nutzung (wie BM-Zellen von Mäusen geerntet geopfert würde verwendet werden) resuspendiert werden. </li></ol>

<ol><li>Sundberg, R., Hodgson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspiration+of+bone+marrow+in+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Aspiration of bone marrow in laboratory animals.</a> Blood. 4, 557-561 (1949).</li>
<li>Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+technique+for+intrafemoral+injection+and+bone+marrow+sampling+in+mouse+transplant+models%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+lymphoma%22%5BJournal%5D)">Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models.</a> Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).</li>
<li>Warner, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+cooperating+genetic+events+in+the+leukemic+transformation+of+normal+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells.</a> Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).</li>
<li>Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-initiating+cells+in+human+T-lymphoblastic+leukemia+exhibit+glucocorticoid+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance.</a> Blood. 116, 5268-5279 (2010).</li>
<li>Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+isolation%2C+and+stimulation+of+quiescent+primitive+leukemic+progenitor+cells+from+patients+with+acute+myeloid+leukemia+%28AML%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML).</a> Blood. 101, 3142-3149 (2003).</li>
<li>Nolta, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gold+standard+improves%3A+a+better+assay+for+HSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The gold standard improves: a better assay for HSCs.</a> Blood. 106, 1141-1142 (2005).</li>
<li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121, 1109-1121 (2005).</li>
<li>Purton, L., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+factors+in+murine+hematopoietic+stem+cell+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays.</a> Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).</li>
<li>Dykstra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+propagation+of+distinct+hematopoietic+differentiation+programs+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo.</a> Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).</li>
<li>Jordan, C., Lemischka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+and+systemic+analysis+of+long-term+hematopoiesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse.</a> Genes & development. 4, 220-232 (1990).</li>
<li>Challen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnmt3a+is+essential+for+hematopoietic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation.</a> Nature genetics. 44, 23-31 (2012).</li>
<li>Hess, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+based+on+CD133+and+high+aldehyde+dehydrogenase+activity+isolates+long-term+reconstituting+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells.</a> Blood. 107, 2162-2169 (2006).</li>
<li>Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+myeloerythroid+repopulation+after+intrafemoral+transplantation+of+NOD-SCID+mice+reveals+a+new+class+of+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells.</a> Nat Med. 9, 959-963 (2003).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Serien BM Anspruch ist ein Routineverfahren entscheidend für die klinische Untersuchung von hämatologischen Erkrankungen beim Menschen. Die Fähigkeit, einen analogen seriellen Abtastung BM in Mäusen für die Charakterisierung der zellulären Zusammensetzung und Bestandteile BM gesamten langwierigen Experimente ebenfalls sehr wertvoll. Dieses Verfahren ist nützlich für die Charakterisierung von HSPC, ohne Einbußen bei der Maus, sondern auch zum Nachweis der Anwesenheit von zusätzlichen Zelltypen im Knochenmark in Fällen, i...

Alle Blutzellen stammen aus hämatopoetischen Stammzellen (HSCs). Verfahren, die den Zugang zum Knochenmark (BM) ermöglichen, dem Ort der überwiegenden Mehrheit der HSCs bei Mäusen und Menschen, ohne dass Tiere getötet werden müssen, bieten eine Ressource zur seriellen Überwachung der Quelle der Hämatopoese. Das übergeordnete Ziel des hier beschriebenen Verfahrens besteht darin, ein detailliertes Protokoll für die Probenahme von BM-Zellen aus dem Oberschenkelknochen lebender Mäuse bereitzustellen, das repräsentatives Material für die Zellen liefert, das durch konventionelle Ernte von BM-Zellen durch Tötung der Mäuse gewonnen würde. Der Vorteil dieses Verfahrens gegenüber der herkömmlichen Entnahme von BM-Zellen besteht darin, dass dieses Verfahren keine Tötung von Mäusen erfordert und daher eine Längsschnittuntersuchung des Knochenmarkkompartiments von Mäusen im Laufe der Zeit ermöglicht. 
Obwohl dieses Verfahren zur Knochenmarkaspiration bei Mäusen in einer Reihe von Studien verwendet und bereits beschrieben wurde (siehe Sundberg et al. Für einen historischen Rückblick1) wurden bisher keine formalen Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Veranschaulichung dieser Technik veröffentlicht. Dieses Protokoll ermöglicht die routinemäßige Serienprobenahme des BM zu Zwecken wie der Beurteilung der Transplantation von Zellen, die exogen in die Maus eingeführt wurden, in den BM (wie dies in Xenotransplantat-Studien der Fall wäre, z. B.2,3), der Analyse des Chimärismus im BM zum Vergleich mit dem des peripheren Blutes (wo die Ergebnisse nicht unbedingt kongruent sind), der Überwachung der Häufigkeit bestimmter Zelltypen, die normalerweise im Knochenmark angereichert sind, wie z. B. hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen; und Entnahme von BM-Zellen für ex vivo-Kulturen und/oder Transplantationen. Darüber hinaus kann die Bestimmung des Knochenmarkgehalts in Mausmodellen hämatologischer Erkrankungen sehr nützlich sein, da die Aspiration bei der Beurteilung der hämatologischen Krankheitslast zu Zeitpunkten hilfreich ist, zu denen die Erkrankung im peripheren Blut möglicherweise nicht offensichtlich ist3-5. Darüber hinaus kann diese Technik verwendet werden, um das Ansprechen hämatologischer Erkrankungen im Knochenmark auf Arzneimittel zu bewerten, die in therapeutischen Studien verabreicht wurden. Daher ist das hier beschriebene Verfahren ideal für Forscher, die Zugang zu hämatopoetischen Knochenmarkzellen von Mäusen für zytologische Analysen, durchflusszytometrische Analysen, In-vitro-Kultivierungen und/oder In-vivo-Transplantationsstudien erhalten möchten, ohne dass die Mäuse geopfert oder geschädigt werden müssen. 
Das hier beschriebene Protokoll für die Probenahme von BM ist der Technik, die für die intrafemorale Injektion von Material direkt in die Knochenmarkhöhle verwendet wird, sehr ähnlich3,6. Der Hauptunterschied besteht darin, dass dieses Protokoll das Verfahren zur Entnahme von Zellen aus dem Knochenmark detailliert beschreibt, im Gegensatz zur direkten Instillation von Material in den Knochenmarkhöhlenraum, wie es bei der intrafemoralen Injektion der Fall ist.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>PAA</td><td>K41-001</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysepuffer</td><td>Hausgemacht</td><td></td><td>in 1 L. pH 7,2 ~ 7,4 einstellen und steril filtrieren mit 0,22 &mu; m Vakuumfilter.</td></tr><tr><td>8,3 g Ammoniumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>1 g Kaliumbicarbonat</td><td>Fisher Scientific</td><td>P184-500</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l 0,5 M EDTA pH 8</td><td>Gibco</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA</td><td>E15-842</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml Tuberkulinspritze 27,5 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Steriles Zellsieb 70 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran, USP</td><td>Attane</td><td>NDC:66794-014-25</td><td></td></tr><tr><td>Nadel mit stumpfem Ende</td><td>Stemcell Technologies</td><td>28110</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide-Nadel 23 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305193</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Spritze Luer-Lok-Spitze</td><td>Becton Dickinson 309657</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platte, die nicht mit Gewebekulturen behandelt wurde, 6 Well</td><td>Becton Dickinson</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>12 x 75 mm 5 ml Tuben&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>352054</td><td>FACS Färbung</td></tr><tr><td>12 x 75 mm 5 ml Gefäße mit Cello-Sieb-Kappe</td><td>Becton Dickinson</td><td>352235</td><td>FACS Färbung</td></tr><tr><td>NK1.1 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>108723</td><td></td></tr><tr><td>CD11b APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>101225</td><td></td></tr><tr><td>CD45R (B220) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103223</td><td></td></tr><tr><td>CD3 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>100222</tr><tr><td>Ly-6G und Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>108423</td><td></td></tr><tr><td>Ter119 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>116223</td><td></td></tr><tr><td>CD19 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>302217</td><td></td></tr><tr><td>CD4 APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>317417</td><td></td></tr><tr><td>CD117 (c-KIT) PE</td><td>BioLegend</td><td>105808</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>122513</tr><tr><td>CD34 APC</td><td>Biolegend</td><td>128612</td><td></td></tr><tr><td>CD16/32 e450</td><td>eBioscience</td><td>48-0161-82</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32670</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434</td><td>STEMCELLTECHNOLOGIES</td><td>3434</td><td>Für Methocellulosekultur</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Crescent Chemical Unternehmen</td><td>C11045850</td><td>1 Dosis (5 mg/kg)</td></tr><tr><td>Durchflusszytometer, LSRFortessa</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puralube Tierarztsalbe (sterile Vaseline-Augensalbe)</td><td>Dechra-US</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr></tbody></table>

oberschenkelknochenmark-aspiration im live-mäuse

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Die serielle Probenahme der zellulären Zusammensetzung des Knochenmarks (BM) ist ein routinemäßiges Verfahren, das für die klinische Hämatologie von entscheidender Bedeutung ist. Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes schrittweises technisches Verfahren für ein analoges Verfahren an lebenden Mäusen, das eine serielle Charakterisierung von im BM vorhandenen Zellen ermöglicht. Dieses Verfahren ermöglicht Studien, die darauf abzielen, das Vorhandensein von exogen verabreichten Zellen im BM von Mäusen nachzuweisen, wie dies beispielsweise in Xenotransplantat-Studien der Fall wäre. Darüber hinaus ermöglicht dieses Verfahren die Entnahme und Charakterisierung von Zellen, die mit dem BM angereichert sind, wie z. B. hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs), ohne dass Mäuse getötet werden müssen. Angesichts der Tatsache, dass die zelluläre Zusammensetzung des peripheren Blutes nicht unbedingt die Proportionen und Arten der im Knochenmark vorhandenen Stamm- und Vorläuferzellen widerspiegelt, sind Verfahren, die den Zugang zu diesem Kompartiment ermöglichen, ohne dass die Mäuse beendet werden müssen, sehr hilfreich. Die Anwendung der femoralen Knochenmarkaspiration wird hier für die zytologische Analyse von Knochenmarkzellen, die durchflusszytometrische Charakterisierung des hämatopoetischen Stamm-/Vorläuferkompartiments und die Kultivierung von sortierten HSPCs, die durch femorale BM-Aspiration gewonnen wurden, im Vergleich zur konventionellen Knochenmarkentnahme veranschaulicht.

Oberschenkel BM Aspiration von einer Live-C57/B6 Maus wurde genutzt, um BM mononuklearen Zellen, gefolgt von herkömmlichen BM Ernte der gleichen Maus nach der Opfer zu erhalten. BM mononukleären Zellen durch die beiden Verfahren erhalten wurden dann mit (1) zytologische Analyse der BM-Zellen untersucht, (2) Bestimmen der relativen Häufigkeit von hämatopoetischen Stammzellen / Vorläuferzellen (HSPCs) und (3) ex-vivo-Kultur von sortierten HSPCs. Im letzteren Experiment linien negativen Sca1 + c-Kit wurden + (LSK)...

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur seriellen Probenahme von Femurknochenmark (BM), ohne dass Mäuse getötet werden müssen. Dieses Verfahren ermöglicht Längsschnittstudien der BM-Zusammensetzung von Mäusen im Zeitverlauf und ermöglicht den seriellen Zugang zu Zellen innerhalb des BM für ex vivo- und Transplantationsstudien.

Oberschenkelknochenmark-Aspiration im Live-Mäuse

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die hämatopoetischen Zellen aus dem Knochenmarkraum des Femurs einer lebenden Maus sicher zu aspirations. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Tuberkulinspritze mit PBS befüllt wird. Im zweiten Schritt wird das Bein der Maus sorgfältig in dem für die Gewinnung des Knochenmarks optimalen Winkel positioniert.Die hämatopoetischen Zellen werden anschließend aus dem Markraum des Femurs aspiriert, und die roten Blutkörperchen werden entfernt. Letztendlich kann der erfolgreiche Aspirationsvorgang des Knochenmarks durch zytometrische und zytologische Analysen sichtbar gemacht werden. Den Vorgang demonstriert der junge Rock Chung, ein äußerst talentierter Techniker aus unserem Labor.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der herkömmlichen Knochenmarkentnahme, liegt darin, dass mit ihr ein Teil der hämatopoetischen Zellen des Knochenmarks gewonnen werden kann, während das Tier am Leben bleibt und somit eine fortgesetzte Beobachtung sowie serielle Analysen möglich sind. F, nachdem die Sedierung durch Zupressen der Zehe bestätigt wurde, Augensalbe auf die Augen der anästhesierten Maus auftragen, um eine Austrocknung der Hornhaut zu verhindern, und das Bein rasieren, um die Haut freizulegen. Die sterile chirurgische Vorbereitung der Haut erfolgt anschließend durch Abwaschen der Region mit Chlorhexidin-Desinfektionsmittel, gefolgt von einem Alkohltupfer.Dieser Vorgang wird dreimal durchgeführt, wobei für jedes Tier eine neue, ungeöffnete sterile Spritze und Nadel verwendet werden. Stellen Sie sicher, dass eine geeignete Narkoseebene erreicht wurde. Befeuchten Sie danach eine 0,5-Milliliter-Tuberkulinspritze mit steriler PBS-Lösung und saugen Sie 200 bis 500 Milliliter der Kochsalzlösung zwei- bis dreimal auf, um sie anschließend sofort wieder auszustoßen.Verwenden Sie dann einen der beiden letzten Finger einer Hand, um die Tibia vorsichtig von dem Femur wegzubiegen, um die Exposition des kondylären Raums des Femurs und das Einführen der Nadel zu erleichtern. Führen Sie nun die Nadel durch die Patellasehne, sodass sie sicher zwischen den beiden Kondylen des Femurs sitzt. Halten Sie mit Daumen und Zeigefinger der anderen Hand die Diaphyse nahe der Epiphyse des Femurs fest, um ein leichtes Einführen der Nadel in den Knochenkörper zu ermöglichen.Wenn kein Blut in der Spritze sichtbar ist, liegt es wahrscheinlich daran, dass ein kleines Knochen- oder Gewebestückchen in der Nadel steckt. Dieses kann durch Bewegen des Kolbens auf und ab in PBS aus der Nadel entfernt werden. Falls das Gewebe nicht aus der Spritze gelöst werden kann, verwenden Sie eine neue Nadel und Spritze.Befeuchten Sie die Spritze erneut mit 200 bis 500 Mikrolitern PBS. Drehen Sie dann die Nadel im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn, während Sie sie gegen den kondylären Raum drücken, sodass sie parallel zum Schaft des Femurs verläuft, um die Entnahme des Knochenmarkinhalts aus dem Femurschaft zu erleichtern.Drehen Sie die Nadel im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn, während Sie sie langsam in die Markhöhle des Femurs vorschieben. Bestätigen Sie die korrekte Positionierung der Nadel, indem Sie die Spritze vorsichtig seitlich bewegen. Ziehen Sie dann vorsichtig den Spritzenkolben zurück, wodurch ein Unterdruck entsteht, während Sie die Nadel innerhalb der Knochenmarkhöhle vor und zurück bewegen.Ein erfolgreicher Aspirationsvorgang wird durch das Erscheinen von Blut an der Spitze der Nadel am Ansatz der Spritze bestätigt. Sobald das Knochenmark erfolgreich aus dem Femur aspiriert wurde, entfernen Sie die Nadel aus dem Knochen und überführen Sie das aspirierte Knochenmark in eine Mikrozentrifugenröhrchen, das bereits mit 500 Mikrolitern PBS auf Eis vorgefüllt ist. Nach der Verabreichung eines Analgetikums lassen Sie die Maus unter einer Wärmelampe ausklingen, bevor Sie sie in den Haltungsbereich zurückbringen.Stellen Sie sicher, dass sie in der Lage sind, sich fortzubewegen und Futter sowie Wasser zu erreichen. Danach bringen Sie die Maus in ihren Käfig zurück und beobachten das Tier in den nächsten 24 Stunden nach dem Eingriff auf Anzeichen von Belastung oder Infektion. In der Zwischenzeit zentrifugieren Sie die Knochenmarkzellen, entfernen vorsichtig das PBS und resuspendieren das Pellet.In 500 Mikroliter Erythrozyten-Lysepuffer nach 10 Minuten die Zellen mit einem Milliliter PBS waschen. Das Pellet enthält Knochenmark mononukleärer Zellen, das für experimentelle Analysen verwendet werden kann. Diese ersten Abbildungen zeigen, wie mithilfe morphologischer und durchflusszytometrischer Analysen ähnliche Typen und Anteile von Gesamtzellen sowie hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen sowohl bei der Aspiration des Femurknochenmarks als auch bei der konventionellen Knochenmarkgewinnung beobachtet werden können.Hier wird der Prozentsatz der liniegnegativen, SKA-1-positiven, c-Kit-positiven und myeloischen Vorläufer-Subpopulationen als Frequenz der gesamten lebenden Zellen bei drei unabhängigen Aspirationen und einer konventionellen Markentnahme gezeigt. Diese Daten zeigen eine Abnahme der liniegnegativen, SKA-1-positiven, c-Kit-positiven und myeloischen Vorläufer-Subpopulationen im Knochenmark, das mittels Femuraspiration gewonnen wurde, im Vergleich zur konventionellen Markentnahme. Dieser Unterschied war für die Population statistisch nicht signifikant.Jedoch führt die Sortierung von liniegnegativen, Sca-1-positiven, c-Kit-positiven Zellen, gefolgt von einer Kultur ex vivo in Methylcellulose, zu einer ähnlichen Anzahl an Kolonien und Zelltypen wie bei der Aspiration des femoralen Knochenmarks. Wie beim konventionellen Knochenmarksgewinn umfassen die beobachteten und gezählten Kolonietypen in beiden Kulturen granulozytäre, erythrozytäre, monozytäre und megakaryozytäre koloniebildende Einheiten, granulozytär-monocytoide koloniebildende Einheiten sowie erythroide Burst-bildende Einheiten One Master. Diese Technik kann bei korrekter Durchführung innerhalb von 10 Minuten pro Maus durchgeführt werden, wenn man diesem Protokoll folgt.Andere Methoden wie die intrafemorale Knochenmarkinjektion können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise welchen Effekt ein Xenotransplantat menschlicher hämatopoetischer Zellen in immundefiziente Mäuse hat.

femoral-bone-marrow-aspiration-in-live-mice

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Tiermodelle werden häufig genutzt, um Krebs Metastasen in Knochen zu untersuchen. In diesem Protokoll werden wir zwei gängige Methoden der Tumorinokulation für Knochenmetastasen Studien beschreiben und beschreiben Sie kurz einige Analysen genutzt werden, um zu überwachen und zu quantifizieren diese Modelle.

Models von Knochenmetastasen

Dieses Video beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von frischem ganzem Knochenmark aus den Hintergliedmaßen der Maus, um ganze BM-Defekte bei Patienten mit Blutkrankheiten wie Leukämie zu untersuchen.

Knochenmarkentnahme aus der Hintergliedmaße der Maus

Monozyten sind Schlüsselregulatoren der angeborenen Immunität und spielen eine entscheidende Rolle bei der Erneuerung des peripheren mononukleären phagozytischen Systems und im Falle von Entzündungen. Dieses Manuskript beschreibt das Verfahren der Echtzeit-Bildgebung des Schädeldachknochenmarks der Maus, um den Mobilisierungsmechanismus der Monozyten zu untersuchen.

Tracking-Maus-Knochenmark-Monozyten<em&gt; In-vivo-</em

Eine Strategie zur quantitativen Analyse histologischer Daten im Knochenmark wird vorgestellt. Die konfokale Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten Zellen in Gewebeschnitten führt zu 2-dimensionalen Bildern, die automatisch analysiert werden. Co-Lokalisationsanalysen verschiedener Zelltypen werden mit Daten aus simulierten Bildern verglichen, um quantitative Informationen über zelluläre Interaktionen zu erhalten.

Automatisierte Quantifizierung Hämatopoetische Zell - Stromal Cell Interactions in histologische Bilder unentkalkte Knochen

Das Protokoll beschreibt ein neuartiges Maus-Femur-Fensterkammermodell, das verwendet werden kann, um die Bewegung von Zellen im femoralen Knochenmark in vivo zu verfolgen. Die Intravital-Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie wird verwendet, um drei Komponenten des femoralen Knochenmarks (Gefäße, Kollagenmatrix und Neutrophile) im Zeitverlauf abzubilden.

Femur Fensterkammer Modell für<em&gt; In Vivo</em&gt; Zelltracking im Knochenmark der Maus

Intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) von der Calvarium wird in Kombination mit genetischen Tiermodelle zur Untersuchung der Referenzfahrt und Engraftment des blutbildenden Zellen des Knochenmarks (BM) Nischen angewendet.

Kombination von intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) mit genetischen Modellen Engraftment Dynamik der blutbildenden Zellen des Knochenmarks Nischen zu studieren

Das murine geschlossenen femoralen Fraktur-Modell ist eine leistungsfähige Plattform, Frakturheilung zu studieren und neue therapeutische Strategien zur Knochenregeneration zu beschleunigen. Das Ziel dieses chirurgischen Protokolls soll einseitige geschlossenen femorale Frakturen bei Mäusen mit einem intramedullären Stahl-Stab Femur zu stabilisieren.

Die Generation der geschlossenen femoralen Frakturen bei Mäusen: ein Modell zur Knochenheilung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Verarbeitung von frischem Knochenmark (BM) vor, das von der Maus oder dem Menschen isoliert ist, um die analyse von Neutrophilenzellen durch die hochdimensionale Massenzytometrie (Cytometrie durch Time-Of-Flight, CyTOF) zu verarbeiten.

Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen

Wir beschreiben drei Methoden der Knochenmarktransplantation (BMT): BMT mit Ganzkörperbestrahlung, BMT mit abgeschirmter Bestrahlung und BMT-Methode ohne Vorkonditionierung (adoptive BMT) zur Untersuchung der klonalen Hämatopoese in Mausmodellen.

Knochenmarktransplantationsverfahren bei Mäusen zur Untersuchung der klonalen Hämatopoese

Dieses Protokoll beschreibt die intrafemorale Injektion einiger hämatopoetischer oder leukämischer Stammzellen, einschließlich geneditierter Zellen, in murine Xenotransplantatmodelle, die nicht nur eine schnelle und sichere Transplantation von Zellen, sondern auch serielle Analysen des Knochenmarks ermöglichen.

Vereinfachte intrafemorale Injektionen mit lebenden Mäusen ermöglichen eine kontinuierliche Knochenmarkanalyse

Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung von Knochenmark-Mikroumgebungspopulationen aus murinen Modellen myelodysplastischer Syndrome und akuter myeloischer Leukämie vorgestellt. Mit dieser Technik werden Veränderungen in der nicht-hämatopoetischen Knochenmarknische, einschließlich der endothelialen und mesenchymalen Stromazellen, mit Fortschreiten der Erkrankung identifiziert.

Identifizierung von Knochenmark-Mikroumgebungspopulationen beim myelodysplastischen Syndrom und der akuten myeloischen Leukämie

Lernen Sie die Aspiration von Knochenmark aus dem Oberschenkelknochen lebender Mäuse. Diese nicht-tödliche Methode ermöglicht serielle Probenahmen für hämatologische und Transplantationsstudien.

Oberschenkelknochenmark-Aspiration im Live-Mäuse

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