SIVQ LCM-Protokoll für das Instrument ArcturusXT

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die räumlich invariante Vektorquantisierung oder SIVQ-Bildanalyse in Kombination mit der Lasererfassung MICRODISSECTION oder LCM zu verwenden, um interessante Gewebemerkmale zu identifizieren und schnell eine gerichtete Mikrodissektion durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst Bilder des Zielgewebes für SIVQ aufgenommen werden. Anschließend wird die SIVQ-Analyse durchgeführt und die SIVQ-Annotation zur Verarbeitung in das Mikrodissektionsgerät importiert.

Letztendlich können die interessierenden Zellen mit S-I-V-Q-L-C-M für die nachgelagerte molekulare Analyse isoliert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass S-I-V-Q-L-C-M den Prozess der Auswahl und Mikrodissektion großer Zielbereiche rationalisiert, die sonst mit herkömmlichen Laser-Capture-Mikrodissektionstechniken schwierig und zeitintensiv wären. Dr. Avi Rosenberg, ein klinischer Mitarbeiter in unserem Labor, wird das Verfahren vorführen, um die interessierenden Gewebeproben abzubilden.

Laden Sie zunächst die Objektträger auf den motorisierten Tisch des Mikrodissektionsinstruments und starten Sie die zugehörige Software. Aktivieren Sie dann die entsprechenden Kontrollkästchen, um die Positionen der geladenen Folien festzulegen, und stellen Sie sicher, dass die aufgenommenen Bilddateien im JPEG-Format gespeichert werden. Passen Sie die Helligkeit und den Fokus des Bildes auf dem Bildschirm an, um die Bildqualität zu optimieren.

Drehen Sie dann mit der inspect-Toolbox den Diffusor ein und stellen Sie eine Lampenhelligkeit von 60 und eine Kameraverstärkung von zwei 20 ein. Klicken Sie im Übersichtsfenster mit der rechten Maustaste, um auszuwählen, Einstellungen zu speichern und zu speichern. Nehmen Sie ein Miniaturbild der Folie auf, um eine Roadmap für den Präparierungsprozess zu erstellen.

Passen Sie eine Vergrößerung an und suchen Sie den Interessenbereich. Nehmen Sie dann ein Bild des Bereichs für die Algorithmusanalyse der aufgenommenen Bilder auf. Beginnen Sie mit der Übertragung der Bilder in den SIVQ-Ordner.

Öffnen Sie dann SIVQ und laden Sie das aufgenommene Bild von Interesse. Navigieren Sie zum Interessenbereich, und passen Sie die Größe der fünf und sechs Anzeigefenster des Ansichtsfensters an, ohne die Vergrößerung des Bildes anzupassen. Wählen Sie dann die Größe des Ringvektors und die Anzahl der Ringe aus, die für die Analyse verwendet werden sollen.

Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Prädikatbild-Feature, das im Fenster Viewport sechs erfasst werden soll, wählen Sie Heatmap aus, und klicken Sie dann auf Nach X scannen, um das Bild zu analysieren. Verwenden Sie dann den oberen der beiden horizontalen Schieberegler, um die Gesamtvektorspezifität anzupassen. Verwenden Sie den unteren Balken, um die Empfindlichkeit nach der Durchführung der Haut zu erhöhen.

Um den als Übereinstimmung klassifizierten Bereich zu vergrößern, deaktivieren Sie das Optionsfeld für die Heatmap, um sicherzustellen, dass die SIVQ-Heatmap in eine einheitliche rote Farbe geändert wird, und erhöhen Sie die Farbgröße. Speichern Sie das Bild, indem Sie auf die Schaltfläche Bild speichern klicken. Konvertieren Sie dann die BMP-Ausgabe in ein JPEG-Dateiformat.

Verwenden Sie dann einen Hex-Editor, um die Positionskoordinaten, die zwischen dem Beginn der Bildmarkierung und der ersten definierten Quantisierungstabellenmarkierung gefunden wurden, aus dem ursprünglichen Bild des Präparierinstruments in den Dateikopf des JPEG nach der Analyse einzufügen, bevor Sie mit der Mikrodissektion beginnen. Platzieren Sie die Laser-Capture-MIKRODISSEKTION oder LCM-Kappe in der Mitte des interessierenden Bereichs, in dem die Bilder für die SIVQ-Analyse aufgenommen wurden. Optimieren Sie nach der Kalibrierung der UV- und Infrarotlaser die Parameter, einschließlich der Leistungsdauer, der Laserpositionen und der UV-Schnittgeschwindigkeit.

Öffnen Sie dann die automatisierte Auswahlsoftware und importieren Sie das analysierte Bild. Erstellen Sie eine neue Analysedatei, um die automatisierte Auswahlsoftware so zu trainieren, dass sie die SIVQ-Annotation erkennt. Wählen Sie nun die Hintergrundbereiche aus, die durch die blauen Quadrate des SIVQ-analysierten Bildes markiert sind.

Wählen Sie dann die durch die roten Kreise markierten Regions of Interest oder R OIS aus, und klicken Sie auf Lernen, um die Trainingsdatei zu generieren. Kopieren Sie die markierten Bereiche in das Live-Bild. Um mit der Mikrodissektion zu beginnen, wählen Sie die Mikrodissektion-Toolbox und wählen Sie die entsprechenden Schaltflächen für die Infrarotaufnahme oder den UV-Schnitt.

Nachdem die Präparierung abgeschlossen ist, bringen Sie die LCM-Kappe zur Qualitätskontrollstation und nehmen Sie ein Bild der präparierten Probe auf. Wenn die gewünschten Proben erfolgreich präpariert wurden, klicken Sie auf die Schaltfläche "Aktueller Schritt" und entfernen Sie die LCM-Kappe, um das molekulare Extraktionsverfahren für die nachgelagerte Analyse zu starten. In diesem repräsentativen Experiment wurde ein in Formalin fixiertes, in Paraffin eingebettetes menschliches Brustgewebe unter Verwendung eines immunhistochemischen Standardprotokolls immungefärbt für Cytokeratin AE eins, AE drei.

Da dieses Gewebe nicht für die Mikrodissektion abgedeckt werden kann, können die immunhistochemisch gefärbten Zellen visuell schwer zu beurteilen sein. Um eine bessere Indexübereinstimmung und ein verbessertes Bild zu gewährleisten, wurden dem Gewebeschnitt Xylole zugesetzt, um ein Pseudo-Deckglas zu erzeugen. Anschließend wurde ein JPEG-Bild des Pseudo-Cover-Slip-Bereichs aufgenommen und zur Algorithmusanalyse in SIVQ importiert.

Ein Prädikatbildmerkmal, das als dunkelbrauner DAB-Fleck beobachtet wurde, wurde vom Benutzer ausgewählt und der SIVQ-Algorithmus für die Bildanalyse initiiert. Die SIVQ-Heatmap wurde dann in eine rote Farbe umgewandelt, die von der automatisierten Auswahlsoftware erkannt wird, und die Xylole wurden verdampfen gelassen. Anschließend wurde die SIVQ-Heatmap in die automatisierte Auswahlsoftware importiert.

Zum Schluss wurden die markierten Zellen mit dem Infrarotlaser präpariert. Die LCM-Kappe wurde dann in die Qualitätskontrollstation des Mikrodissektionsinstruments gebracht und visuell inspiziert, um den Erfolg der Dissektion zu beurteilen. Das verbleibende Gewebe wurde ebenfalls inspiziert und die SIVQ-Heatmap wieder importiert.

Um die Effizienz der Mikrodissektion weiter zu bestätigen: Nach der Beherrschung kann S-I-V-Q-L-C-M in wenigen Minuten pro Objektträger durchgeführt werden, was einen angereicherten Input für eine Vielzahl von nachgelagerten Analysetechniken liefert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie S-I-V-Q-L-C-M in Ihren Mikrodissektions-Workflow implementieren können.