Name: SIVQ LCM-Protokoll für das Instrument ArcturusXT (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Lernen Sie das SIVQ-LCM-Protokoll für das ArcturusXT-Instrument zur effizienten Laser-Mikrodissektion von Gewebeproben. Diese Methode ermöglicht präzise Zellisolierung für molekulare Analysen.

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Die Studie wurde zum Teil durch die Interne Research Program der National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research unterstützt.

Das beschriebene Protokoll wurde in Übereinstimmung mit den NIH Regeln für die Verwendung von menschlichen Gewebeproben verwendet. 1. Gewebepräparation <ol><li> Vor Beginn erhalten menschlichen Gewebeproben nach Institutional Review Board (IRB)-Protokolle. </li><li> Wählen Sie die Art des Gewebes / der Zellenblock und die entsprechenden Verarbeitungsverfahren [Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE), gefroren, oder Ethanol-fixierten und in Paraffin eingebetteten (Efpe)]. Formalin-Fixierung sorgt für eine optimale Histologie, gefolgt von Ethanol-Fixierung und schockgefroren. Jedoch kann die Fixierung und Gewebebearbeitungsmethoden DNA, RNA und Protein-Menge und Qualität für nachfolgende molekulare Analyse beeinflussen und sollten berücksichtigt werden. </li><li> Schneiden Sie die Gewebe / Zellblockabschnitte auf den Objektträger Art (Glas, Glas-Membran-oder Metallrahmen Membran) der Wahl. SIVQ Analyse funktioniert genauso gut auf allen drei Folientypen. Bitte beachten Sie, dass die Pseudo-Deckglas-Methode (siehe unten) mit Xylol und Ethanol kann auf den Metallrahmen Membran Objektträgern durchgeführt werden, da der Schieber muss auf der Stufe invertiert werden. </li><li> Wählen Sie ein oder chemisch-IHC-basierte Gewebe Fleck auf Zellen von Interesse aus dem Hintergrund zu identifizieren. Beachten Sie, dass Färbeverfahren können auch auf DNA-, RNA-und Protein-Qualität und Quantität des Gewebes. Testen Sie das Gewebe nach dem Färben auf die Grundlinie Qualität von Biomolekülen, bevor Sie fortfahren mit dem Protokoll zu beurteilen. Immunhistochemie (IHC) mit DAB 15, Immunfluoreszenz, schnell rot, de-novo-, Toluidinblau und Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) (unveröffentlichte Daten): SIVQ-LCM hat sich auf Gewebe / Zytologie Folien mit Buntdurchgeführt worden. </li></ol> 2. Specimen Imaging <ol><li> Last gleitet auf den Motortisch des Mikrodissektionsgerät und starten Sie die zugehörige Software. Wählen Sie die Kontrollkästchen, um die Positionen der geladenen Folien bestimmen und sicherzustellen, dass die aufgenommenen Bilddateien sind im JPEG-Format gespeichert werden. </li><li> Optimieren Sie die imAlter Qualität durch die Anpassung der Helligkeit und Schärfe des Bildes auf dem Bildschirm, entweder mit dem manuellen Fokus-Rad oder über die Software der Dissektion Instruments. <ol><li> Mit der Bild-Toolbox-Software innerhalb der Dissektion Instruments, stellen Sie die Helligkeit der Lampe und Kamera-Gewinn entsprechend. Beispiel Werte sind Helligkeit = 60 und Gain = 220, mit dem Diffusor. </li><li> Konzentrieren Sie sich entweder manuell oder mit der Autofokus-Funktion in der Software. </li></ol></li><li> Nehmen Sie ein Thumbnail-Übersicht Bild von der Folie, um einen Fahrplan für die Dissektion Prozess zu ermöglichen. <ol><li> Für eine optimale Bildqualität eines uncoverslipped Rutsche, nutzen Sie den Diffusor unterhalb des Kondensators auf das Instrument, oder, eine kleine Menge (~ 30 ul) entweder Ethanol oder Xylole um die feuerfeste Index (pseudo-Deckglas) zu verbessern. Bei der Verwendung von Xylol, bewusst sein, sie sind giftig und ordnungsgemäße Sicherheitsmaßnahmen verwendet werden müssen, einschließlich der Verwendung von einer Abzugshaube und Schutzlaborkittel, Schutzbrille und Handschuhe. </li><li> Stellen Sie den LCM Kappe auf der Folie, bis das Ethanol oder Xylole Lösung wurde komplett gelöscht oder das Polymer auf der Kappe verzerrt. </li></ol></li><li> Navigieren Sie die Folie und die Aufnahmen der Bereiche zu 10X, 20X oder 40X Vergrößerung seziert werden. Wenn nötig, das Image mit einer Software wie Autokorrektur (in Microsoft Office Picture Manager) wie zuvor beschrieben 22. Die Bilder müssen im JPEG-Format, um sie in den automatisierten Auswahlsoftware wieder importiert werden, damit erfasst werden. </li></ol> 3. Algorithmus Analyse der Bild <ol><li> Über aufgenommenen Bilder von der Mikrodissektionsgerät auf die SIVQ-Ordner. Installieren und öffnen Sie die ArcturusXT, Autoscan und SIVQ Softwarepakete auf dem Computer auf die Dissektion Gerät angebracht sind. Für den Zugriff auf die Software SIVQ, kontaktieren Sie bitte Dr. Ulysses Balis (ulysses@med.umich.edu). </li><li> Offene SIVQ und laden Sie das aufgenommene Bild (jpeg) von Interesse. &lt;/ Li&gt; <li> Navigieren Sie zu dem Bereich von Interesse und / oder die Größe der Anzeigefenster (Viewport-5 &amp; 6). In der SIVQ Software Viewport 5 zeigt die Vorverarbeitung Bild-und Viewport-6 zeigt die Post-Processing-Bild 16. </li><li> Wählen Sie die Größe des Rings und der Anzahl der Vektor-Ringe zu verwenden. </li><li> Wählen Sie das Prädikat Bild-Funktion, um mit der rechten Maustaste darauf in Viewport 6 erfasst werden. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Scan&quot;, um das Bild zu analysieren. </li><li> Stellen Sie die statistische Wahrscheinlichkeit Bildabgleich mit den beiden Gleitschienen. Der obere Balken stellt die Gesamt Vektor Spezifität und wird verwendet, um Bereich von der ersten Scan auszuschließen sind (mit Sensibilität, wie durch die ausgewählten Variablen &quot;Stat&quot; definiert), die übermäßige enthalten Bereich darstellen kann. Umgekehrt ist der untere Schieber verwendet, um die Empfindlichkeit zu erhöhen, nachdem eine Prüfung durchgeführt wird, mit der Absicht der Erhöhung der Fläche, die als eine Übereinstimmung klassifiziert wird. Beide Schieberegler utiren den &quot;Stat&quot;-Variable als Anfangsgrundlinie Empfindlichkeitsschwelle. </li><li> Um das Bild zu speichern, klicken Sie auf &quot;Speichern als jpeg&quot; (Bild wird nun im Ordner c :/ vq_test / Bilder gespeichert). </li><li> Analyse des Bildes mit dem Algorithmus. Der Ausgang des Analysealgorithmus muss in einer kommentierten Bild führen, damit es in SIVQ-LCM verwendet werden. Derzeit ist die aktuelle Version des SIVQ Kerntriebwerk in der Beta-Version Testen mit der Erwartung, dass die volle Produktionsversion (verfügbar ab Q1 2014) wird eine vollständige Software Development Kit (SDK) und Application Programming Interface (API) für die vereinfachte Integration von nehmen User-generierten Raumfilter und nachgelagerten Workflow Datenverarbeitungsschritte mit dem Kernring passenden Motor. Das SDK wird mit einem kompletten Satz der Dokumentation verteilt werden. <ol><li> Sicherzustellen, dass die SIVQ heatmap wird auf eine gleichmäßige rote Farbe verändert. </li></ol></li><li> Exportieren Sie das Bild. Es ist wichtig, wieder einzubetten, die die Positionskoordinaten in der pOST-Analyse-JPEG-Bild mit Hilfe eines HEX-Editor, um in der Datei-Header aus dem Originalbild Dissektionsinstrument einfügen. Die entsprechenden Daten können zwischen &quot;Start of Image&quot;-Marker (0xFF, 0xD8) und dem ersten &quot;Define Quantisierung Table&quot;-Marker (0xFF, 0xDB) gefunden werden. </li></ol> 4. Microdissection <ol><li> Platzieren Sie den LCM Kappe in der Mitte der Region von Interesse, wo die Bilder wurden für die Analyse eingefangen SIVQ. </li><li> Kalibrieren und Qualitätskontrolle (QC) die UV / IR-Laser und die Parameter, einschließlich Energie, Dauer-, Laser-Standorten und UV Schnittgeschwindigkeit (wie vom Hersteller empfohlen) optimieren. Führen Sie diese Kalibrierungen vor dem erneuten Import der Bild analysiert. </li><li> Offene AutoScanXT (automatisierte Auswahl-Software) und importieren Sie die analysierte Bild von c :/ vq_test Ordner / Bilder. </li><li> Trainieren Sie die automatisierte Software, um die Auswahl SIVQ Annotation erkennen und schaffen die Dissektion der Karte. <ol><li> Um ein Trai erstellenning-Datei, wählen vier Regionen von Interesse (durch &quot;blaue Kreise&quot; gekennzeichnet) auf der &quot;rote Farbe&quot; der SIVQ analysierte Bild. </li><li> Wählen Sie die Hintergrundbereiche (durch das &quot;rote Quadrate&quot; gekennzeichnet), die nicht seziert werden. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Analyze&quot;-Taste, um die Trainingsdatei, die für die spätere Verwendungen gespeichert werden können, zu erzeugen. </li></ol></li><li> Führen Mikrodissektion mit der entsprechenden Infrarot-(IR) und / oder Ultraviolett (UV)-Laser. <ol><li> Kopieren Sie die ausgewählten Bereiche auf die &quot;Live&quot;-Bild. </li><li> In der &quot;microdissect&quot; Toolbox, wählen Sie die entsprechende Capture IR-oder UV-Schneid Tasten. </li></ol></li><li> Nachdem die Präparation abgeschlossen ist, bewegen Sie den LCM Kappe an der QC-Station und erfassen ein Bild der präparierten Gewebe / Zellen. Ein weiterer Ansatz ist die Kappe auf einen leeren Bereich der Folie vor dem Verschieben in den QC-Station zu platzieren, ermöglicht dies dem Benutzer, Bilder bei verschiedenen Vergrößerungen zu nehmen. </li><li>Nehmen Sie ein Bild der Gewebebereich von Interesse nach Mikrodissektion zur weiteren Beurteilung Hebeeffizienz. </li><li> Wenn die gewünschten Zellen wurden erfolgreich seziert wurde, klicken Sie auf den &quot;gegenwärtigen Zeitpunkt&quot; in der ArcturusXT Software und entfernen Sie die LCM Kappe, um die molekulare Extraktionsverfahren für Downstream-Analyse zu starten. </li></ol>

<ol><li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+molecular+analysis+of+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278, 1481-1483 (1997).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li>
<li>Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+mammalian+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of mammalian tissue.</a> J Vis Exp. (8), (2007).</li>
<li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+in+Barrett%27s+esophagus%3A+laser+capture+versus+whole+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian journal of gastroenterology. 44, 787-795 (2009).</li>
<li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection.</a> Nature. 1, 586-603 (2006).</li>
<li>Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contaminating+cells+alter+gene+signatures+in+whole+organ+versus+laser+capture+microdissected+tumors%3A+a+comparison+of+experimental+breast+cancers+and+their+lymph+node+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+experimental+metastasis%22%5BJournal%5D)">Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases.</a> Clinical & experimental metastasis. 25, 81-88 (2008).</li>
<li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components%3A+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in molecular biology. 980, 61-120 (2013).</li>
<li>Silvestri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+pathway+biomarker+analysis+of+human+cancer+reveals+requirement+for+upfront+cellular-enrichment+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+investigation%3B+a+journal+of+technical+methods+and+pathology%22%5BJournal%5D)">Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 90, 787-796 (2010).</li>
<li>Eberle, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoguided+laser+assisted+microdissection+techniques+for+DNA+methylation+analysis+of+archival+tissue+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+molecular+diagnostics+%3A+JMD%22%5BJournal%5D)">Immunoguided laser assisted microdissection techniques for DNA methylation analysis of archival tissue specimens.</a> The Journal of molecular diagnostics : JMD. 12, 394-401 (2010).</li>
<li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctions+in+gastric+cancer+gene+expression+signatures+derived+from+laser+capture+microdissection+versus+histologic+macrodissection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+medical+genomics%22%5BJournal%5D)">Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection.</a> BMC medical genomics. 4, 48(2011).</li>
<li>Klee, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sample+acquisition+and+linear+amplification+on+gene+expression+profiling+of+lung+adenocarcinoma%3A+laser+capture+micro-dissection+cell-sampling+versus+bulk+tissue-sampling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+medical+genomics%22%5BJournal%5D)">Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling.</a> BMC medical genomics. 2, 13(2009).</li>
<li>Zheng, J., Garg, S., Wang, J., Loose, D. S., Hauer-Jensen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissected+mucosa+versus+whole+tissue+specimens+for+assessment+of+radiation-induced+dynamic+molecular+and+pathway+changes+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissected mucosa versus whole tissue specimens for assessment of radiation-induced dynamic molecular and pathway changes in the small intestine.</a> PloS one. 8, e53711(2013).</li>
<li>Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+enriched+populations+of+neurons+or+single+neurons+for+gene+expression+analysis+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li>
<li>Iyer, E. P., Cox, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+Drosophila+peripheral+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons.</a> J Vis Exp. (39), (2010).</li>
<li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIVQ-aided+laser+capture+microdissection%3A+A+tool+for+high-throughput+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+pathology+informatics%22%5BJournal%5D)">SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling.</a> Journal of pathology informatics. 2, 19(2011).</li>
<li>Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+Invariant+Vector+Quantization%3A+A+pattern+matching+algorithm+for+multiple+classes+of+image+subject+matter+including+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol+Inform%22%5BJournal%5D)">Spatially Invariant Vector Quantization: A pattern matching algorithm for multiple classes of image subject matter including pathology.</a> J Pathol Inform. 2, 13(2011).</li>
<li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+complex+cancer+morphology+detection+using+the+SIVQ+pattern+recognition+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Cell+Pathol+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Optimization of complex cancer morphology detection using the SIVQ pattern recognition algorithm.</a> Anal Cell Pathol (Amst). , (2011).</li>
<li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+architectural+and+cytologic+drive+n+image+algorithms+for+prostate+adenocarcinoma+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+cellular+pathology%22%5BJournal%5D)">Integration of architectural and cytologic drive n image algorithms for prostate adenocarcinoma identification.</a> Analytical cellular pathology. 35, 251-265 (2012).</li>
<li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+area+calculation+of+histopathologic+features+using+SIVQ%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Cell+Pathol+%28Amst%22%5BJournal%5D)">Automated area calculation of histopathologic features using SIVQ.</a> Anal Cell Pathol (Amst. 34, (2011).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+vector+selection+of+SIVQ+and+parallel+computing+integration+MATLAB%3A+Innovations+supporting+large-scale+and+high-throughput+image+analysis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Automated vector selection of SIVQ and parallel computing integration MATLAB: Innovations supporting large-scale and high-throughput image analysis studies.</a> Journal of pathology. 2, 37(2011).</li>
<li>Roy Chowdhuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semiautomated+laser+capture+microdissection+of+lung+adenocarcinoma+cytology+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cytol%22%5BJournal%5D)">Semiautomated laser capture microdissection of lung adenocarcinoma cytology samples.</a> Acta Cytol. 56, 622-631 (2012).</li>
<li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Microarrays+%28IMA%29%3A+Digital+Pathology%27s+Missing+Tool%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Image Microarrays (IMA): Digital Pathology's Missing Tool.</a> Journal of pathology. 2, (2011).</li>
<li>Hanson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+microdissection+adapted+to+commercial+laser+dissection+instruments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments.</a> Nature. 6, 457-467 (2011).</li>
</ol>

Michael R. Emmert-Buck ist ein Erfinder auf NIH-statt Patente für Laser Mikrodissektion und erhält lizenzbasierten Vergütungen durch die NIH Technologie-Transfer-Programm.

Wir stellen ein Protokoll für die Anwendung SIVQ-LCM auf immun Epithelzellen aus FFPE menschlichem Brustgewebe microdissect. Die Verwendung eines Bildanalysealgorithmus, wie SIVQ, reduziert die Menge der Handhabungszeit für die Mikrodissektion Prozess erforderlich. Dies ist eine potentiell wichtige Neuerung, da Bediener Zeit und Mühe ist typischerweise der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für die präzise Präparation von Zellen von Interesse. In dem vorliegenden Protokoll, die wir speziell angepasste unser Verfahren a...

Ursprünglich in der Mitte der 1990er Jahre entwickelt, die Laser Mikrodissektion (LCM) ermöglicht dem Benutzer, genau zu erfassen spezifische Zellen oder Zellbereiche von einem histologischen Gewebeschnitt mittels mikroskopischer Visualisierung 1, 2. Viele Studien, die molekulare Analyse von LCM gegen Kratzer Gewebe veranschaulichen den Wert der Methode 12.3. Darüber hinaus gibt es drei Videoprotokoll Veröffentlichungen über die Technologie, die für die Anzeige von 13, 14 verfügbar sind. Doch trotz seiner bewährten Wert, LCM kann langwierig und mühsam sein, wenn das Ziel von Interesse ist eine verteilte Zellpopulation in einer heterogenen Gewebeschnitt, oder wenn eine große Anzahl von Zellen sind für bestimmte Downstream-Anwendungen wie Proteomics erforderlich. Die Belastung für den menschlichen Bediener platziert führte uns zu einer halbautomatischen Präparation Ansatz für LCM durch die Kombination eines leistungsfähigen Bildanalyse-Algorithmus, um die LCM-Verfahren 15 führen zu entwickeln. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; In Zusammenarbeit mit der University of Michigan, unserem Labor am NIH erweitert die bereits entwickelten und berichtete ortsinvariantem Vektor-Quantisierung (SIVQ)-Algorithmus in einer Art und Weise, um es in semi-automatisiert das Gewebe Auswahlprozess, damit Eigen geführt Mikrodissektion, wodurch ein Werkzeug zur Verfügung mit dem Pathologen oder Lebenswissenschaftler im Auge. Ortsinvariantem Vektor-Quantisierung (SIVQ) ist ein Algorithmus, der Benutzer einfach &quot;Klick&quot; auf einem histologischen Merkmal von Interesse, um einen Ring-Vektor (Prädikat Bild Funktion), die verwendet werden können, um den gesamten histologischen Bild erstellen zu suchen, die Anpassung der statistischen Schwelle erlaubt nach Bedarf 16-21. Die entstehende Wärme Karte zeigt die Qualität der Übereinstimmungen mit dem Anfangsbild Prädikat-Funktion und wird anschließend in einer einzigen Farbe (rot) Beschriftungskarte, die in das LCM Instrument importiert werden können umgewandelt. Anschließend wird die automatisierte Auswahl-Software, AutoScanXT, verwendet, um eine Karte zu ziehen Basisauf SIVQ Anmerkungs Führung der Erfassung der Zielzellen aus der Gewebeprobe. Das detaillierte Protokoll beschreibt die Umsetzung der in den SIVQ Mikrodissektion Workflow.

<table><tbody><tr><td>Objektträger aus positiv geladenem Glas</td><td>Thermo Scientific</td><td>4951Plus-001</td><td></td></tr><tr><td>Xylole, ACS-Reagenz usw. 98,5 % Xylole + Ethylbenzolbasis&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>247642</td><td>VORSICHT: BITTE VERWENDEN SIE DIE RICHTIGEN SICHERHEITSMASSNAHMEN.</td></tr><tr><td>Ethylalkohol, U.S.P. 200 Proof, wasserfrei</td><td>The Warner-Graham Company</td><td>6.505E+12</td><td>ACHTUNG: BITTE VERWENDEN SIE DIE RICHTIGEN SICHERHEITSVERFAHREN.</td></tr><tr><td>Arcturus CapSure Macro LCM Caps</td><td>Life Technologies</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>ArcturusXT Laser Mikrodissektionsinstrument</td><td>Life Technologies</td><td>ARCTURUSXT</td><td></td></tr><tr><td>AutoScanXT Software</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Ein optionales Bildanalyseprogramm für das ArcturusXT Laser Mikrodissektionsgerät. Diese Software wird für SIVQ-LCM benötigt.</td></tr><tr><td>Räumlich invariante Vektorquantisierung (SIVQ)</td><td>University of Michigan</td><td></td><td>Diese Toolsuite ist für die akademische Zusammenarbeit öffentlich zugänglich. Für den Zugang zum SIVQ-Algorithmus wenden Sie sich bitte an Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu]</td></tr></tbody></table>

sivq lcm-protokoll für das instrument arcturusxt

SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

SIVQ-LCM ist eine neue Methode, die automatisiert und rationalisiert die traditionelle, benutzerabhängige Laser Dissektion Prozess. Es zielt darauf ab, eine fortschrittliche, schnell anpassbar Laser Dissektion Plattform-Technologie erstellen. In diesem Bericht beschreiben wir die Integration der Bildanalyse-Software ortsinvariantem Vektor Quantisierung (SIVQ) auf die ArcturusXT Instrument. Die ArcturusXT System enthält sowohl eine Infrarot-(IR) und Ultraviolett-(UV) Laser, so dass für bestimmte Zelle oder große Fläche Dissektionen. Das Hauptziel ist es, die Geschwindigkeit, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des Laser-Dissektion, Probendurchsatz zu erhöhen verbessern. Dieser neue Ansatz ermöglicht Mikrodissektion von tierischen und menschlichen Geweben in der Forschung und der klinischen Arbeitsabläufe.

Ein FFPE menschlichen Brustgewebeschnitt wurde für Zytokeratin AE1/AE3 mit einem Standard-IHC-Protokoll 23 immun. Nach dem Färben wurde das Gewebe auf dem Objektträger ArcturusXT Stufe angeordnet, und die SIVQ LCM-Protokoll wurde, wie oben beschrieben eingeleitet. Da das Gewebe nicht für die Mikrodissektion Deckglas versehen werden, die IHC + gefärbten Zellen schwierig sein, visuell zu erkennen (Abbildung 1A). Um somit eine bessere Indexanpassung und ein verbessertes Bild bereitzustellen, Xyl...

SIVQ-LCM ist ein innovativer Ansatz, der einen Computer-Algorithmus, räumlich invarianten Vektor Quantisierung (SIVQ) nutzt, um den Laser Mikrodissektion Verfahren (LCM) zu fahren. Die SIVQ LCM-Workflow die Geschwindigkeit und Genauigkeit der Mikrodissektion stark verbessert, mit Anwendungen in der Forschung und klinischen Umgebungen.

SIVQ LCM-Protokoll für das Instrument ArcturusXT

SIVQ-LCM is a new methodology that automates and streamlines the more traditional, user-dependent laser dissection process.&#160;It aims to create an ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe der ortsunabhängigen, vektorbasierten Quantifizierung oder SIVQ-Bildanalyse in Kombination mit Laser-Mikrodissektion (LCM) Gewebemerkmale von Interesse zu identifizieren und gezielte Mikrodissektionen schnell durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst Bilder des Zielgewebes für die SIVQ-Analyse aufgenommen werden. Anschließend erfolgt die SIVQ-Analyse, und die SIVQ-Anmerkung wird in das Mikrodissektionsgerät zur Verarbeitung importiert.Schließlich können die gewünschten Zellen mittels S-I-V-Q-L-C-M für die nachgeschaltete molekularbiologische Analyse isoliert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass S-I-V-Q-L-C-M den Prozess der Auswahl und mikrochirurgischen Dissektion großer Zielbereiche vereinfacht, die andernfalls mit herkömmlichen Methoden der Laser-Mikrodissektion herausfordernd und zeitaufwändig wären. Die Durchführung des Verfahrens wird Dr. Avi Rosenberg, ein klinischer Fellow in unserem Labor, demonstrieren, um die interessierenden Gewebeproben abzubilden.Laden Sie zunächst die Objektträger auf die motorisierte Probenebene des Mikrodissektionsgeräts und

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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High Speed ​​Unter GHz-Spektrometer für Brillouin-Streuung Analysis

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Wir bieten einen allgemeinen Überblick über quantitative Mikroanalysemethoden zur Schätzung der Standortbelegung von Verunreinigungen und deren chemischen Zuständen, indem wir Elektronenkanalisierungsphänomene unter einfallenden Elektronenstrahl-Gesteinsbedingungen nutzen, die zuverlässig Informationen von Minderheitenarten, Lichtelementen, Sauerstoffleerständen und anderen Punkt-/Linien-/Planardefekten extrahieren.

Quantitative Atom-Standortanalyse von funktionellen Dopants/Punktdefekten in kristallinen Materialien durch Elektronenkanaling-verstärkte Mikroanalyse

Hier stellen wir ein Protokoll für die kryogene Probenvorbereitung und den Transfer von Kristallen in die Vakuumendstation auf der Beamline I23 an der Diamond Light Source für langwellige makromolekulare Röntgenkristallographie-Experimente vor.

Probenvorbereitungs- und Übertragungsprotokoll für die In-Vakuum-Langwellenkristallographie auf der Beamline I23 an der Diamantlichtquelle

Die Ionenmobilitätsspektrometrie (IMS) ist eine interessante Ergänzung zur Massenspektrometrie zur Charakterisierung von Biomolekülen, insbesondere weil sie empfindlich auf Isomerie reagiert. Dieses Protokoll beschreibt ein Tandem-IMS-EXPERIMENT (IMS/IMS), das die Isolierung eines Moleküls und die Generierung der Mobilitätsprofile seiner Fragmente ermöglicht.

Verwendung eines zyklischen Ionenmobilitätsspektrometers für Tandemionen-Mobilitätsexperimente

Dieses Papier vergleicht direkt die Auflösung, Empfindlichkeit und Bildkontraste der stimulierten Raman-Streuung (SRS) und der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS), die in dieselbe Mikroskopplattform integriert sind. Die Ergebnisse zeigen, dass CARS eine bessere räumliche Auflösung hat, SRS bessere Kontraste und spektrale Auflösung liefert und beide Methoden eine ähnliche Empfindlichkeit aufweisen.

Direkter Vergleich der hyperspektralen stimulierten Raman-Streuung und der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streumikroskopie für die chemische Bildgebung

Hier verwenden wir einen Polymerstabilisator, um metallorganische Gerüstsuspensionen (MOF) herzustellen, die eine deutlich verringerte Streuung in ihren Grundzustands- und transienten Absorptionsspektren aufweisen. Mit diesen MOF-Suspensionen bietet das Protokoll verschiedene Richtlinien zur spektroskopischen Charakterisierung der MOFs, um interpretierbare Daten zu erhalten.

Ein technischer Leitfaden für die Durchführung spektroskopischer Messungen an metallorganischen Gerüstverbindungen

Lernen Sie das SIVQ-LCM-Protokoll für das ArcturusXT-Instrument zur effizienten Laser-Mikrodissektion von Gewebeproben. Diese Methode ermöglicht präzise Zellisolierung für molekulare Analysen.

SIVQ LCM-Protokoll für das Instrument ArcturusXT

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