Name: Schnelle Identifizierung von Gram-negativen Bakterien aus Blutkulturbrühe unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 29 s
Description: Lernen Sie die schnelle Identifizierung von Gram-negativen Bakterien direkt aus Blutkulturbrühe mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht eine frühere Diagnose von Blutstrominfektionen im klinischen Labor.

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<html> 1. Blutkultur Brühen Flagge als &quot;Positiv&quot; <ol><li> Entfernen Sie die signalisiert Blutkulturflasche von der kontinuierlichen Überwachung Brutschrank und legen Sie sie in einem biologischen Sicherheitsschrank. Hinweis: Die Flaschen können gefährliche Mikroorganismen enthalten und allgemeine Vorsichtsmaßnahmen befolgt werden müssen. Wegen der Gefahr von Infektions Aerosole bei der Probenahme, müssen alle Stichprobenverfahren in einem Biosafety Klasse II Sterilbank durchgeführt werden. </li></ol> 2. Gram Stain ist bereit <ol><li> Bereiten Sie eine Gram-Färbung aus dem Blut signalisiert Kulturbrühe nach lokalen institutionellen Protokolle. Hinweis: Bei gramnegativen Organismen Mikroskopie identifiziert die Blutkulturbrühe wird nach der folgenden Methode verarbeitet. Wenn Gram-positive Organismen identifiziert werden, wird eine alternative Methode Molekular Targeting genetischen Identifizierung und Resistenzmarker auf dem Medium (in diesem Artikel nicht angesprochen) 13 angelegt. </li></ol>e &quot;&gt; 3. Transfer markiert Blutkulturbrühe zu einem Serum Trennrohr <ol><li> Vorsichtig mischen die Blutkulturflasche durch Umdrehen 2-3x. </li><li> Im Rahmen der biologischen Sicherheitsschrank legen Sie eine 10-ml-Spritze mit einer Sicherheitsblutübertragungseinrichtung. </li><li> Befestigen Sie den Bluttransfer-Gerät an den Blutkulturflasche und ziehen 5 ml der Brühe in die Spritze. Übertragen Sie die angesaugte BC Brühe in einer Serumtrennrohr. </li></ol> 4. Konzentration der Blutkulturbrühe <ol><li> Zentrifugieren des Serumtrennrohr bei 1250 × g für 15 min, die ein großes Volumen an roten Blutzellen entfernt. </li><li> Absaugen und Verwerfen des Überstandes mit einer sterilen Transferpipette vorsichtig auf ca. 1 ml der Buffy-Coat unmittelbar über dem Gel / Fluid-Grenzfläche zu verlassen. Hinweis: Die Aerobic-Flaschen zeigen eine klare Trennung von roten Blutkörperchen an den Boden des Röhrchens mit dem Gel / Fluid-Grenzfläche erscheinen, eine undurchsichtige weiße Farbe. Wenn im Gegensatzangewendet, um den lytischen anaerobe Blutkulturbrühe das Gel / Fluid-Grenzfläche wird als tiefrote Farbe durch die lysierten roten Blutzellbestandteile im Überstand bleibt suspendiert. </li></ol> 5. Wiederholen Zentrifugation Waschschritte <ol><li> Vorsichtig mischen die letzten 1 ml Buffy-Coat-Flüssigkeit über der Gel-Schnittstelle mit einer sterilen Pipette und übertragen das gesamte Volumen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen dann. Zentrifugieren Sie die neue Röhre bei 288 g für 30 Sekunden. </li><li> Den Überstand mit einem Kunststoff-Einweg-1 ml Transferpipette in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und entsorgen Sie die Röhrchen mit dem Pellet. Hinweis: Es ist wichtig, in diesem Schritt, wird darauf geachtet, die Übertragung des Pellets zu vermeiden. Dies ist besonders wichtig für eine Probe aus der anaeroben BC Flasche verarbeitet, wie der Überstand bleibt und die pigmentierte Pellets ist nicht immer klar ersichtlich. </li></ol> 6. Lyse der Rest Cells </p&gt; <ol><li> Zentrifugieren Sie die Proben bei 18.407 g für 1 min und dann gründlich absaugen (und verwerfen) der Überstand mit einem spitzen, dünnen Transferpipette, um so wenig wie möglich Restflüssigkeit, ohne dass der Pellet verlassen. </li><li> Resuspendieren des Rest Pellet in 1 ml steriler DNAse und RNAse freies Wasser durch Pipettieren auf und ab. Hinweis: Einige Autoren haben die Verwendung von Alkohol-Lösungen anstelle von sterilem Wasser, um das Pellet die Bakterien nicht lebensfähig macht resuspendieren beschrieben. </li><li> Zentrifugieren Sie die resuspendierten Lösung bei 18.407 g für 1 min. </li></ol> 7. Extraktion bakterieller Proteine <ol><li> Absaugen und den Überstand verwerfen, wieder mit Aspiration mit einer feinen Spitze Pipette sicherzustellen, dass so viel Flüssigkeit wie möglich entfernt wird. </li><li> Das Pellet in 10 &amp;mgr; l Ameisensäure (70% v / v). Hinweis: Ameisensäure kann den Körper beeinflussen, wenn es eingeatmet wird oder wenn es in Kontakt mit der Haut kommt. Bei der Erstellung oder Manipulation von Lösungen ist es rMPFOHLENE, dass die Mitarbeiter mit einem Abzugsschrank neben persönlicher Schutzausrüstung. </li><li> Gut mischen mit der Pipette, um eine homogene Lösung resuspendiert gewährleisten. Verwendung der Pipettenspitze physisch stören das Pellet kann notwendig sein, um eine homogene Lösung zu gewährleisten. </li></ol> 8. Herstellung der MALDI-TOF-Zielplatte <ol><li> Impfen eine saubere MALDI-TOF-Zielplatte mit 2 ul der hergestellten Suspension pro Zielpunkt. Bereiten Sie 3 Zielstellen für jede Probe, um die gelegentliche Problem der gescheiterten liest überwinden. </li><li> Damit der MALDI-TOF-Zielplatte zu trocknen. Die Trocknungsgeschwindigkeit kann, indem man die Platte am Rand der Abzugshaube um den Luftstrom über die Platte zu maximieren erhöht werden. </li><li> Überlagern getrocknet Spot mit 1 ul der Matrixlösung (10 mg / ml α-Cyano-4-Hydroxy-Säure (HCCA), 50% Acetonitril, 2,5% Trifluoressigsäure). Hinweis: Matrix-Lösung kann den Körper beeinflussen, wenn es eingeatmet wird oder wenn es in conta kommtct mit der Haut. Bei der Erstellung oder Manipulation Lösungen empfiehlt es sich, dass die Mitarbeiter mit einem Abzugsschrank neben persönlicher Schutzausrüstung. </li><li> Damit der MALDI-TOF-Zielplatte auf dem Rand des Abzugs wie oben beschrieben zu trocknen. Gewährleisten eine homogene Zubereitung füllt jede der Zielstellen auf der Platte. </li></ol> 9. Platz MALDI-TOF-Zieltafel in das Massenspektrometer <ol><li> Legen Sie die MALDI-TOF-Zielplatte in die MALDI-TOF-Massenspektrometer. Stellen Sie sicher, die Platte sitzt bündig mit den federbelasteten Platten. Hinweis: nicht die Zielplatte nicht ein, bis alle Ziel Flecken trocken sind. </li><li> Sicherstellen, dass die Gummidichtung ist sauber von Fusseln, Staub und Haare, damit die erforderlichen Vakuumbedingungen geschaffen werden. </li><li> Schließen Sie die MALDI-TOF-Bühne Deckel und drücken Sie die &quot;In / Out&quot;-Taste auf der Vorderseite des Gerätes. Der Deckel wird nun sperren und damit das erforderliche Vakuum geschaffen werden. </li></ol> 10. MALDI-TOF-MS-SPectra Acquisition <ol><li> Öffnen Sie die MALDI Biotypisierung und Flexcontrol-Software. </li><li> Innerhalb der Typing Software wählen Sie &quot;neue Klassifizierung&quot; aus dem Dropdown-Menü &quot;Datei&quot; betitelt. Nennen Sie das Projekt und wählen Sie dann &quot;neu&quot;. Wählen Sie &quot;Weiter&quot;, um das Setup im Typing Software abzuschließen. </li><li> Innerhalb der Software-Systemsteuerung identifizieren die Grafik der Zielscheibe auf dem Bildschirm. Markieren Sie die MALDI-TOF-Ziel-Spots, die in Gebrauch sind, indem Sie die Maus über die Punkte eingeimpft, während Sie die linke Maustaste gedrückt halten. </li><li> Mit der rechten Maustaste auf eine beliebige Stelle auf der ausgewählten Zielpositionen Maustaste und wählen Sie dann &quot;addieren Analyte&quot; aus dem Dropdown-Menü. </li><li> In Blutkultur Identifikationsdaten in die Spalte &quot;ID&quot; für jede der Ziel Flecken und klicken Sie auf &quot;weiter&quot;, wenn Sie fertig. </li><li> Wählen Sie den Werbespot &quot;Taxonomie&quot; Spektrendatenbank, und wählen Sie &quot;Weiter&quot;. Hinweis: Labotorien verwenden kann zusätzliche in-house oder kommerziellen Datenbanken, um die Anzahl von Referenzspektren zu erhöhen. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Finish&quot; und der MALDI-TOF-MS-Spektren erzeugen beginnen wird. Hinweis: MALDI-TOF-Einstellungen waren nach Herstellereinstellungen (linear positiven Modus, 60 Hz Laserfrequenz, 20 kV Beschleunigungsspannung, 16,7 kV IS2 Spannung, 170 ns Verzögerung Extraktion und 2,000-20,137 m / z-Bereich). </li><li> Wenn die MALDI-Control-Software nicht auf Gipfeln zu erzeugen, kann die manuelle Erfassung von Spektren durchgeführt werden (Methode nicht beschrieben). </li></ol> 11. Beitrag Analyse Interpretation der MALDI-TOF-MS-Ticker <ol><li> Sobald die Spektren erfasst und Analyse abgeschlossen ist, wählen Sie die &quot;+&quot;-Button neben Artbestimmung auf der Typing Software, um die Identifikationsliste für jede Ziel erweitern. </li><li> Studieren Sie die Top-5-Identifikationen und stellt fest, ob die Top-5 sind ähnlich. Discordant Top 5 Gattungen mit Noten ≥ 1.7 der gleichen ZielOrt erhöht die Möglichkeit der Mischbrühen. Hinweis: MALDI-TOF-Technologie hat schlechte Empfindlichkeit für den Nachweis von Mischbrühen. Wenn beispielsweise eine Brühe enthält gemischte Spezies eine hohe Vertrauensbewertung kann nur eine der gemischten Spezies identifiziert werden. </li><li> Wenn ein Score ≥ 2.0 ist für das höchste Spiel auf einem Zielpunkt festgestellt, berichten die Arten. </li><li> Wenn die höchste Punktzahl auf einem Zielpunkt ist ≥ 1,7, aber &lt;2,0, berichten nur die Gattungen. Wenn zusätzliche Kriterien der Top-5-Identifikationen sind übereinstimmende, dann auf Artenebene zu melden. </li></ol> 12. Entfernung von MALDI-TOF-Zielplatte <ol><li> Wenn alle Spektren sind komplette drücken Sie die &quot;In / Out&quot; auf der MALDI-TOF-Maschine. </li><li> Öffnen Sie die MALDI-TOF-Zielplatte Behälter und entfernen Sie die MALDI-TOF-Zielplatte. </li><li> Wenn Sie eine wiederverwendbare MALDI-TOF-Zieltafel, sauber, alle Ziel Flecken mit Alkohol und speichern die MALDI-TOF-Platte bei RT, wenn es sauber und trocken ist. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Es ist wichtig, bei der Anwendung von MALDI-TOF-MS, um den Blutkulturbrühe, die die Post Zentrifugationsschritte werden mit ausreichender Sorgfalt durchgeführt, nicht die getrennten Komponenten remixen. Es ist besonders wichtig, die Blutkulturbestandteilen und humanen zellulären Proteine, einschließlich Hämoglobin, das Spikes Störung der MALDI-TOF-Spektren erzeugen können, zu entfernen. Obwohl MS Hersteller empfehlen der Partitur von ≥ 2,0 für Arten geschnitten und ≥ 1,7 für Gattung Identifi...

Patienten mit Infektion der Blutbahn (BSI) durch Bakterien weiterhin hohe Mortalität im Krankenhaus haben, angefangen von 6 bis 48% ein. Die Lieferung der entsprechenden Antibiotika fördert das Überleben und in der Untergruppe der Patienten mit schwerer Sepsis, jede Stunde Verzögerung, um eine geeignete Therapie korreliert mit verringerten Überlebens 2,3. Dementsprechend ist ein zentrales Ziel der klinischen Labor, um schnell zu erkennen, zu identifizieren und kommunizieren die Anwesenheit von Bakterien in Blutkulturen, klinische Entscheidungen. Es hat sich gezeigt, dass die mikrobiologischen Labor hat den größten Einfluss auf eine antimikrobielle Therapie bei der Berichterstattung über die Gram-Färbung 4 und vor kurzem eine Beobachtungsstudie gezeigt, dass Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionisation Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) direkt auf die Blutkulturbrühen durchgeführt beeinflussen Verschreibung in über einem Drittel der BSI, die durch Gram-negative Bakterien verursacht werden 5. 6,7 führte. Die Technologie ist mittlerweile etabliert und hat sich in vielen Labors für die schnelle und genaue Identifizierung von Mikroorganismen isoliert auf festen Medien 6,8 integriert. Die direkte Anwendung der MALDI-TOF-MS zu Blutkultur (BC) Brühe, die für Mikroorganismen appelliert an beide Kliniker und Laborleiter, weil das Potenzial, eine frühere Identifizierung von Mikroorganismen bei niedrigen Kosten zu erhalten &quot;positiv&quot; signalisiert haben. Der klinische Nutzen der direkten Anwendung der MALDI-TOF-MS, um den Blutkulturbrühe wurde von der breiten Palette der beobachteten Empfindlichkeiten beschränkt worden, als mit Standard-phänotypischen Kultur Methoden der Identifizierung, mit Berichten über erfolgreiche Identifizierung von Gram-negativen Bakterien bis hin verglichen 47-98,9 9-11%. Die Variation in der Empfindlichkeit wahrscheinlichbezieht sich auf die Zusammensetzung BC Brühe, Anfangsbakterienkonzentration, Variation in der Probenvorbereitung Methoden sowie die Anordnung von Gram-negativen Organismen in Studienpopulationen 9 gestoßen. Verglichen mit diesen anderen veröffentlichten Protokollen der hier vorgestellten Verfahren vermeidet die Verwendung von Ethanol, Ammoniumchlorid oder zusätzliche (nicht-Matrix) Acetonitril. Als Ergebnis wird das Bakterienpellet lebensfähig bleiben (bis zum Punkt des Proteinextraktion) unter Berücksichtigung der potentiellen phänotypischen Suszeptibilität Testverfahren unmittelbar auf diese Organismen in der Brühe verwendet werden. Darüber hinaus hat das vorgestellte Verfahren wurde gezeigt, kostengünstige, zuverlässige und rasche Identifizierung von Bakterien mit innerhalb von 25 min der Blutkultur Gramfärbung Ergebnisse mit minimalen &quot;hands on&quot; Zeit 12 ist. Diese Methode ist eine einfache Inhouse-Spin-Lyse-Protokoll unter Verwendung von Ameisensäure Extraktion Gram-negative b identifizieren direkt an positiven Blutkulturbrühen angewendetacteria mit MALDI-TOF-MS-Technologie.

<table><tbody><tr><td>BACTEC Plus Aerobic/F Medium</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>442192</td><td></td></tr><tr><td>BACTEC Lytic/10 Anaerobic/F Medium</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>442265</td><td></td></tr><tr><td>BACTEC Peds Plus Medium</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>442194</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer - Bluttransfergerät</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>364880</td><td>Einweg-Probenahmegerät, das das Risiko von Nadelstichverletzungen verringert</td></tr><tr><td>Vacutainer SST 5,0 ml, Advance plus</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>367954</td><td>Serum Trennröhrchen</td></tr><tr><td>Spritze 10 ml</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>302143</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipette</td><td>Samco, USA</td><td>222-20S</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipette (feine Spitze)</td><td>Samco, USA</td><td>232-20S</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen (2,0 ml)</td><td>Eppendorf, Hamburg, Deutschland</td><td>0030.120.094</td><td></td></tr><tr><td>Steriles Wasser (DNAse und RNAse frei)</td><td>Life Technologies, Carlsbad, California, USA</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>Matrix-Lösung&nbsp;</td><td>Bruker Daltonics, Bremen Deutschland</td><td>285074</td><td>10 mg/ml &alpha;-Cyano-4-hydroxyzimtsäure, 50 % Acetonitril, 2,5 % Trifluoressigsäure</td></tr><tr><td>Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS</td><td>Bruker Daltonics, Bremen Deutschland</td><td></td><td>Verwendung der Software BioTyper 3.1 (Build 65) und FlexControl 3.3 (Build 99)</td></tr></tbody></table>

schnelle identifizierung von gram-negativen bakterien aus blutkulturbrühe unter verwendung von maldi-tof-massenspektrometrie

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Eine wichtige Rolle der klinischen Mikrobiologie-Labor ist eine schnelle Identifizierung von Bakterien, die Infektion der Blutbahn liefern. Traditionelle Identifizierung erfordert die Subkultur der signalisiert Blutkulturbrühe mit Identifikations erst verfügbar, nachdem Kolonien auf festen Agar sind gereift. MALDI-TOF-MS ist ein zuverlässiges, schnelles Verfahren zur Identifizierung der meisten klinisch relevanten Bakterien als Kolonien auf festem Medium aufgebracht. Die Anwendung der MALDI-TOF-MS direkt an Blutkulturbrühe ist ein attraktiver Ansatz, da sie das Potenzial hat, Artbestimmung von Bakterien beschleunigen und zu verbessern klinische Management. Allerdings ist ein wichtiges Problem zu überwinden, die Pre-Analyse Entfernung von störenden Harze, Proteine ​​und Hämoglobin in Blutkulturproben, die, wenn nicht entfernt werden, stören die MS-Spektren und kann zu einer unzureichenden oder niedrigen Diskriminierung Identifizierung Partituren Ergebnis enthalten. Zusätzlich ist es notwendig, bacter konzentrierenia zu entwickeln Spektren von ausreichender Qualität. Die vorgestellte Methode beschreibt die Konzentration, Reinigung und Gewinnung von Gram-negativen Bakterien so dass für die frühzeitige Identifizierung von Bakterien aus einer Blutkultur signalisiert Brühe.

Die erzeugte MALDI-TOF MS-Spektren sind mit der integrierten Referenzspektren der Datenbank verglichen. Eine logarithmische Score ist für das Vertrauen der Partie zwischen dem Test-Isolat und der Referenzdatenbank isoliert, mit der Empfehlung von einem Score ≥ 1,7 für wahrscheinlich, Identifikation zu Gattungen Ebene (Abbildung 1) und ≥ 2,0 für wahrscheinliche Identifizierung von Arten (Abbildung erforderlich zugeordnet 2). Bericht zur Art, wenn die Punktzahl ≥ 1.7 und ...

Die Anwendung der Matrix-unterstützten Laserdesorption / Ionisation Flugzeit (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie (MS) direkt an Blutkulturbrühe beschleunigt die Identifizierung von Bakterien. Das vorgestellte Verfahren ist ein schnelles und zuverlässiges Verfahren zur Identifizierung von Gram-negativen Bakterien direkt aus Blutkulturbrühe.

Schnelle Identifizierung von Gram-negativen Bakterien aus Blutkulturbrühe unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, gramnegative Organismen direkt aus einer Blutkulturbrühe mithilfe der Maloff-Technologie nachzuweisen. Dazu werden fünf Milliliter einer positiven Blutkulturbrühe in ein Serumtrennrohr überführt und zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wird die bakterienhaltige Flüssigkeitsschicht in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und anschließend bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert. Der Überstand wird dann in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert.Das resultierende Pellet wird in Ameisensäure resuspendiert und mittels MALDI analysiert, um die vorhandenen Bakterienspezies zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der traditionellen Kultur besteht in der früheren Identifizierung gramnegativer Bakterien. Die Bedeutung dieser Technik reicht in die klinische Mikrobiologie hinein, da eine Diagnose einer Bakteriämie Auswirkungen auf die Wahl des vom Arzt verordneten Antimikrotikums hat.Den Ablauf wird Leonardo Bascu demonstrieren, einer der Techniker unserer Abteilung, der dieses Verfahren regelmäßig durchführt. Aerobe oder anaerobe Blutkulturflaschen, die nach Ermessen des klinischen Personals – gewöhnlich im Rahmen einer fieberhaften Erkrankung – entnommen wurden, werden in automatisierten Geräten inkubiert, die kontinuierlich auf das Wachstum von Bakterien überwachen. Wenn Hinweise auf ein Wachstum in einer Blutkulturflasche vorliegen, identifiziert das Gerät die signalisierende Flasche.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die signalisierte Blutkulturflasche aus dem Inkubator entnehmen. Stellen Sie sie in einen生物-sicherheitswerkbank. Bereiten Sie gemäß den lokalen institutionellen Protokollen eine Gram-Färbung aus der signalisierten Blutkulturbrühe vor und untersuchen Sie sie mikroskopisch, falls gramnegative Organismen identifiziert werden.Verarbeiten Sie die Kulturbrühe gemäß der hier beschriebenen Methode. Falls grampositive Organismen identifiziert werden, kann eine alternative schnelle molekularbiologische Methode verwendet werden. Drehen Sie die Blutkulturflasche zwei bis drei Mal um, um sie zu mischen.Danach im Sicherheitswerkbank. Befestigen Sie eine 10-Milliliter-Spritze an einem Sicherheits-Blutübertragungsgerät. Verbinden Sie das Blutübertragungsgerät mit der Blutkulturflasche und ziehen Sie fünf Milliliter der Brühe in die Spritze um.Das abgesaugte Blutkulturmedium in ein Serumtrennrohr geben und bei 1.250 × g 15 Minuten lang zentrifugieren, um rote Blutkörperchen zu entfernen. Nach der Zentrifugation zeigt die Blutkultur aus den aeroben Flaschen eine klare Trennung der roten Blutkörperchen, die sich am Boden des Rohrs abgesetzt haben, wobei die Gel-Flüssigkeits-Grenzfläche als undurchsichtig weiß erscheint. Im Gegensatz dazu erscheint die Blutkultur aus der lytischen anaeroben Blutkultur an der Gel-Flüssigkeits-Grenzfläche tiefrot gefärbt.Da die Bestandteile der lysierten roten Blutkörperchen im Überstand suspendiert bleiben, sowohl bei der einen als auch der anderen Art der Aspiration, entfernen Sie den Überstand mit einer sterilen Transferpipette, wobei Sie etwa ein Milliliter der Buffy Coat-Flüssigkeit direkt oberhalb der Grenzfläche zum Gel-Fluid belassen. Anschließend mischen Sie vorsichtig mit einer sterilen Pipette das verbleibende Milliliter Buffy Coat-Fluid oberhalb der Gel-Grenzfläche und überführen anschließend das gesamte Volumen in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie das neue Röhrchen bei 288 × g für 30 Sekunden unter Verwendung einer plastischen Einweg-Transferpipette mit einem Milliliter Fassungsvermögen.Überführen Sie das Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und entsorgen Sie das Röhrchen mit dem Pellet. In diesem Schritt ist es entscheidend, das Überführen des Pellets zu vermeiden. Dies ist besonders wichtig bei anaeroben Blutkulturproben, da der Überstand pigmentiert bleibt und das Pellet nicht immer deutlich sichtbar ist.Zentrifugieren Sie die Probe bei 18.407 × g für eine Minute und aspirieren Sie anschließend mit einer feinen Pipettenspitze vorsichtig den Überstand, um so wenig wie möglich Restflüssigkeit zu hinterlassen, ohne das Pellet zu stören. Geben Sie ein Milliliter steriles, DNA- und RNA-freies Wasser hinzu und pipettieren Sie die Lösung mehrmals auf und ab, um das verbleibende Pellet vollständig zu resuspendieren. Zentrifugieren Sie die resuspendierte Lösung erneut bei 18.407 × g für eine Minute.Nach der Zentrifugation verwenden Sie eine feine Pipettenspitze, um den Überstand abzusaugen und zu verwerfen. Achten Sie erneut darauf, so viel Flüssigkeit wie möglich zu entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 Mikrolitern 70%iger Ameisensäure.Für große Pellets kann es notwendig sein, das Volumen der Ameisensäure um 50 bis 100 % zu erhöhen. Mit der Pipette gut mischen, um eine homogene Lösung sicherzustellen; gegebenenfalls den Pellet mithilfe der Pipettenspitze mechanisch aufbrechen. Die resultierende Lösung enthält konzentrierte Bakterien, die aus der Blutkulturbrühe isoliert wurden und relativ frei von menschlichen Zellen sowie von Harzen der Blutkulturflasche sind. Mit einer Pipette je zwei Mikroliter der vorbereiteten Suspension pro Targetpunkt auf eine saubere MALDI-TOF-Targetplatte auftragen. Für jede Probe drei Targetstellen vorbereiten, um gelegentliche Probleme mit fehlgeschlagenen Messungen zu vermeiden.Stellen Sie die Platte am Rand der Abzugshaube so auf, dass die Luftzirkulation über sie maximiert wird, damit sie schnell trocknet. Überziehen Sie jeden getrockneten Fleck mit einem Mikroliter Matrixlösung. Lassen Sie die MALDI-Zielplatte am Rand der Abzugshaube trocknen. Stellen Sie wie zuvor sicher, dass eine homogene Präparation jeden der Zielbereiche auf der Platte ausfüllt.Setzen Sie die Targetplatte in das MALDI-Massenspektrometer ein. Stellen Sie sicher, dass die Platte bündig mit den federbelasteten Platten sitzt. Setzen Sie die Targetplatte nicht ein, bevor alle Targetpunkte trocken sind.Überprüfen Sie die Gummidichtung daraufhin, ob sie frei von Flusen, Staub und Haaren ist. Dies ermöglicht die Erzeugung der erforderlichen Vakuumbedingungen. Schließen Sie anschließend den Maloff-Stufen-Deckel und drücken Sie dann den Ein-Aus-Knopf an der Vorderseite des Geräts.Der Deckel verriegelt und ein Vakuum wird erzeugt. Öffnen Sie die MALDI-Typ- und Flex-Control-Software innerhalb der Typ-Software. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü mit der Bezeichnung „Datei“ die Option „Neue Klassifizierung“, benennen Sie das Projekt und wählen Sie anschließend „Neu“.Wählen Sie Weiter. Um die Einrichtung im Fenster der Flex-Steuerungssoftware abzuschließen, identifizieren Sie die Bildschirmgrafik der Zielplatte, während Sie die linke Maustaste gedrückt halten. Bewegen Sie die Maus über die beimpften Stellen und markieren Sie die verwendeten Zielstellen. Rechtsklicken Sie an einer beliebigen Stelle der ausgewählten Zielpositionen und wählen Sie anschließend „Analyten hinzufügen“ aus dem Dropdown-Menü. Fügen Sie für jede der Zielstellen die Identifizierungsdaten der Blutkultur in die ID-Spalte ein und klicken Sie auf „Weiter“. Sobald dies abgeschlossen ist, wählen Sie die kommerzielle Taxonomie-Spektrendatenbank aus, und klicken Sie auf „Weiter“. Labore können zusätzliche interne oder kommerzielle Datenbanken nutzen, um die Anzahl der Referenzspektren zu erhöhen. Klicken Sie dann auf „Fertig stellen“, und das MALDI-TOF-MS beginnt mit der Erzeugung der Spektren.Gelegentlich können höhere MALDI-TOF-Scores durch die manuelle Erfassung von MALDI-TOF-Spektren in der flexControl-Software erzielt werden. Sobald die Spektren erfasst und die Analyse in der Typisierungssoftware abgeschlossen ist, wählen Sie die Schaltfläche „Plus“ neben der Artidentifizierung, um die Identifizierungsliste für jedes Ziel zu erweitern. Untersuchen Sie die fünf besten Identifizierungen und prüfen Sie, ob diese fünf besten Ergebnisse ähnlich sind.Wenn die fünf führenden Arten mit Werten von größer oder gleich 1,7 für dieselbe Zielstelle uneinheitlich sind, kann eine Mischung aus Arten vorliegen. Beachten Sie, dass die OV-Technologie eine geringe Empfindlichkeit bei der Detektion gemischter Arten aufweist. Wenn für die beste Übereinstimmung an einer Zielstelle ein Wert von größer oder gleich 2,0 angegeben ist, geben Sie die Art an; wenn der höchste Wert an einer Zielstelle größer oder gleich 1,7, aber kleiner als 2,0 ist, geben Sie das Gen an.Nur wenn zusätzliche Kriterien der fünf besten Identifizierungen übereinstimmen, sollte bis auf Speziesebene berichtet werden. Wenn alle Spektren vollständig sind, drücken Sie die Ein-Aus-Taste am MALDI-Gerät, öffnen Sie die Halterung für die Targetplatte und nehmen Sie die Platte heraus. Falls eine wiederverwendbare MALDI-TOF-Targetplatte verwendet wird, reinigen Sie alle Targetstellen mit Alkohol und lagern Sie die MALDI-Platte bei Raumtemperatur, sobald sie sauber und trocken ist, um gramnegative Bakterien aus Blutkulturbrühe zu identifizieren. Zum Konzentrieren und Isolieren der Bakterien wurden Schleuderwaschzyklen durchgeführt, die anschließend mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert wurden.Wie in diesem hier gezeigten Videoartikel beschrieben, ist das mit MALDI-TOF-MS generierte Spektrum für Escherichia coli mit einem logarithmischen Score von 1,86 dargestellt. Rechts daneben sind die ersten fünf Übereinstimmungen, die von der Typisierungssoftware identifiziert wurden. Beachten Sie, dass die Art durchgängig als Escherichia coli mit einem Score von 1,861 angegeben wird.Da die fünf besten Übereinstimmungen E. coli sind, wird die Identifizierung als zuverlässig auf Art-Ebene betrachtet. Die mit MALDI-TOF-MS erzeugten Spektren für Pseudomonas aerogenes sind hier dargestellt. Der logarithmische Score beträgt 2,216; rechts befinden sich die ersten fünf Übereinstimmungen, die von der Typisierungssoftware identifiziert wurden.Beachten Sie, dass die Art durchgängig als Pseudomonas aerogen mit einem hohen Score von 2,216 angegeben wird. Die Identifizierung gilt als zuverlässig auf Spezies-Ebene. Die mit MALDI-TOF-MS generierten Spektren einer gemischten Blutkulturbrühe, die Esia coli und SIO marsens enthält, sind hier rechts dargestellt; die ersten fünf Übereinstimmungen durch die Typisierungssoftware zeigen sowohl Reiki coli als auch SIO marsan an.In den ersten fünf übereinstimmenden Spektren. Dieses gemischte Gen wird nur in etwa einem Drittel der gemischten Brühenkulturen identifiziert. Diese Tabelle fasst die zuvor veröffentlichten Ergebnisse der Verifizierungsstudie dieser Methode zusammen, bei der 91,8 % der monomikrobiellen Brühen einen MALDI-To-Score von weniger als 1,7 erreichten, mit einer Übereinstimmung von 100 % bzw. 97 % auf Gattungs- und Artenebene.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man eine Signal-Blutkulturflasche für die Identifizierung mittels MALDI-TOF vorbereitet. Indem wir diese Methode befolgen, können wir denselben Pellet, der für die bakterielle Identifizierung vorbereitet wurde, auch zur Herstellung eines standardisierteren Inokulums für die automatisierte Empfindlichkeitstestung verwenden. Beispielsweise ermöglicht diese Technik es Laboren, Ärzten frühzeitige Diagnosen zu liefern, was sich potenziell auf das therapeutische Vorgehen auswirken kann.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Blutkulturflaschen gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen, einschließlich der Nutzung eines biologischen Sicherheitswerks, wenn Sie mit Blutkulturflaschen arbeiten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Eine schnelle Bakterienpellet Herstellung von einer positiven Blutkultur kann als eine Probe für Anwendungen wie die Identifizierung durch MALDI-TOF, Gram-Färbung, antibiotische Resistenzprüfung und PCR-basierte Tests verwendet werden. Die Ergebnisse können schnell auf Ärzte mitgeteilt, das Ergebnis von Patienten mit Infektionen der Blutbahn zu verbessern.

Vorbereitung einer Blutkultur Pellet Rapid Identifizierung von Bakterien und Antibiotika Empfindlichkeitsprüfung

Diese Arbeit beschreibt Verfahren zur schnellen Identifizierung von Bakterien mittels MALDI-TOF MS. Zu den Identifizierungsverfahren gehören die Erfassung des Spektrums, der Aufbau einer Datenbank und Folgeanalysen. Es werden zwei Identifizierungsmethoden vorgestellt, die auf dem Ähnlichkeitskoeffizienten und die auf Biomarkern basierende Methode.

Die Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie und einer Kundendatenbank zu den Bakterien Indigene auf eine einzigartige Höhle Umwelt (Kartchner Caverns, AZ, USA) Charakterisieren

Matrixgestützte Laserdesorption/Ionisationszeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) und molekulare Techniken (16S rRNA-Gensequenzierung) ermöglichen die Identifizierung seltener bakterieller Krankheitserreger in der Routinediagnostik. Das Ziel dieses Protokolls liegt in der Kombination beider Techniken, die zu genaueren und zuverlässigeren Daten führt.

Identifizierung von Rare bakteriellen Erregern von 16S rRNA-Gen-Sequenzierung und MALDI-TOF-MS

Die Massenspektrometrie-basierte phyloproteomics (MSPP) wurde verwendet , um eine Sammlung von Campylobacter jejuni ssp geben. Doylei isoliert auf Stammebene im Vergleich zu multilocus Sequenz Typisierung (MLST).

Subtyping von<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Massen Isolaten Spectrometry-basierte PhyloProteomics (MSPP)

IDBac ist eine Open-Source-Pipeline für Massenspektrometrie, die Daten sowohl aus intakten Proteinen als auch aus spezialisierten Metabolitenspektren integriert, die auf Zellmaterial gesammelt werden, das aus Bakterienkolonien abgekratzt wurde. Die Pipeline ermöglicht es Forschern, schnell Hunderte bis Tausende von Bakterienkolonien in vermeintliche taxonomische Gruppen zu organisieren und sie auf der Grundlage der spezialisierten Metabolitenproduktion weiter zu differenzieren.

Verwendung der Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline zur Analyse von mikrobiellen Protein- und Spezialisierten Metabolitendaten

Hier stellen wir ein Protokoll zur schnellen Identifizierung von Proteinen vor, die von genomisch sequenzierten pathogenen Bakterien mittels MALDI-TOF-TOF-Tandem-Massenspektrometrie und Top-Down-Proteomanalyse mit eigens entwickelter Software produziert werden. Metastabile Proteinionen fragmentieren aufgrund der Asparaginsäurewirkung und diese Spezifität wird für die Proteinidentifizierung ausgenutzt.

Identifizierung antibakterieller Immunitätsproteine in Escherichia coli mittels MALDI-TOF-TOF-MS/MS und Top-Down-Proteomanalyse

Eine neuartige Probenvorbereitungsmethode wird für die Analyse von agarbasierten, bakteriellen Makrokolonien mittels matrixunterstützter Laserdesorptions-/Ionisationsbildgebungs-Massenspektrometrie demonstriert.

Untersuchung der mikrobiellen Kooperation mittels bildgebender Massenspektrometrie-Analyse von Bakterienkolonien, die während der Infektion auf Agar und im Gewebe gezüchtet wurden

EUCAST hat ein Protokoll für direkte antimikrobielle Empfindlichkeitstests (AST) für automatisierte Blutkulturen entwickelt. Die Abhängigkeit von der massenspektrometrischen mikrobiellen Identifizierung kann jedoch durch die Verwendung eines direkten Inokulumvorbereitungsprotokolls in einem automatisierten mikrobiellen Identifizierungssystem vermieden werden. Mit diesem Ansatz können AST-Berichte innerhalb von 24 Stunden nach der Probenentnahme bereitgestellt werden.

Direkte mikrobielle Identifizierung mit einem automatisierten mikrobiellen Identifizierungssystem zur Erleichterung der EUCAST RAST-Methode ohne Massenspektrometrie

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