Name: Live Cell Imaging von primären Ratten-Kardiomyozyten Neonatal Nach Adenovirale und Lentivirale Transduktion mittels konfokaler Mikroskopie Spinning-Disk- (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Erfahren Sie Live-Cell-Imaging von primären Ratten-Kardiomyozyten nach lentiviraler und adenoviraler Transduktion mittels konfokaler Spinning-Disk-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Beobachtung zellulärer Dynamiken und Proteinverteilungen in lebenden Herzzellen.

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Wir danken Dr. Alengo Nyamay'antu und Dr. Ilse Timmerman für ihre Ratschläge zur lentiviralen Verpackung. Diese Arbeit wird durch einen Scientist Development Grant 10SDG4170137 der American Heart Association unterstützt.

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Primäre Herzmuskelzellen aus neugeborenen Ratten isoliert werden seit langem verwendet, um Funktionen Kardiomyozyten in vitro zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Isolierung von neonatalen Herzmuskelzellen aus Rattenjungen mit einer zweistufigen Enzymverdauung Verfahren wird zunächst Verdau mit Trypsin O / N bei 4 ° C und anschließend gereinigten Kollagenase. Ein Vorteil der Verwendung des gereinigten Kollagenase Schritt ist, dass der gleiche Grad von Enzym wird für alle Isolierungen eing...

Primäre Ratten-Herzmuskelzellen Neugeborenen haben lange für die Untersuchung von Herzmuskelzellen in vitro Funktion 1 verwendet. Sie sind leicht zu von Rattenjungen von mehreren etablierten Methoden 4.2 zu isolieren. Das häufigste Verfahren verwendet Kollagenase oder Trypsin Bindegewebe des Herzens vor der Zellisolierung zu verdauen. Die Forscher haben auch Methoden zur Isolierung von Herzmuskelzellen aus adulten Nagetieren 5-8 sowie 9,10 neugeborenen Mäusen entwickelt. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zum Isolieren von Kardiomyozyten aus neonatalen Ratten-Jungtieren unter Verwendung einer zweistufigen Enzymverdauung Verfahren. Trypsin wird zuerst verwendet, O / N bei 4 ° C und anschließend gereinigten Collagenase bei 37 ° C. Inkubation des Herzgewebes mit Trypsin O / N bei 4 ° C reduziert die notwendigen Schritte Ernten der Zellen im Vergleich zu Verfahren mit sequentieller Inkubation in einem warmen Enzymlösung 2. Zusätzlich kann durch Verwendung von gereinigtem Collagenase anstatt rohe Enzyme können von Los zu Los-Variabilität eliminiert werden, wodurch eine verbesserte Reproduzierbarkeit. Funktionsstudien eines bestimmten Proteins verwenden oft ein Protein-Expressionssystem unter Verwendung eines Adenovirus, 11-13 und / oder ein Lentivirus 14-16. [WARN HINWEIS] Die Virusproduktion und Manipulation sollte nach den NIH-Richtlinien durchgeführt werden. Das Adenovirus nicht in das Wirtsgenom zu integrieren. Es hat einen sehr hohen Transduktionseffizienz in den meisten Zelltypen, einschließlich teilende Zellen und nicht-teilende Zellen, wie auch primäre Zellen und etablierten Zelllinien. Dies macht das Adenovirus eine zuverlässige Vektor zur Genexpression. Hohe Konzentrationen des Proteins von dem Adenovirus-Vektor codiert entwickeln innerhalb von 48 Stunden nach Transduktion, und sie für 17 Wochen dauern. Ein Nachteil der Verwendung eines Adenovirus für die Proteinexpression ist jedoch, daß die Entwicklung eines rekombinanten adenovirus ist sowohl kompliziert als auch zeitaufwendig. Dieser Nachteil erklärt zum Teil, warum viele Forscher Lentiviren worden Drehen für rekombinante Genexpression. Im Gegensatz zu adenoviralen Konstrukte, wodurch eine lentiviralen Konstrukt ist schnell und einfach. Obwohl Lentiviren haben geringere Effizienz der Transduktion als Adenoviren, in beiden Teilen und nicht-teilende Zellen, sie in das Wirtsgenom zu integrieren. Folglich ist die Expression des transduzierten Gens für Lentiviren als für Adenoviren stabiler. Aufgrund technologischer Fortschritte in der Mikroskopie, ist es viel einfacher, lebende Zellbilder von Zellen, die rekombinanten Proteine ​​zu erfassen. Dies gilt auch bei Videorate Geschwindigkeiten des Erwerbs. Dies ermöglicht dem Prüfer, um festzustellen, wie bestimmte Veränderungen in dem Protein von Interesse in funktioneller Einfluss auf die Zelle in Echtzeit. Das konfokale Spinning-Disk-Mikroskop hat mehrere Eigenschaften, die es eine optimale Technik für liv machenE-Cell-Imaging 18,19. Die Yokogawa Spinning Disc ermöglicht viel schnellere Bildaufnahme, während zur gleichen Zeit nutzen weit weniger Strom als Laserpunkt konfokalen Mikroskopen. Beide dieser Besonderheiten sind aufgrund der sich drehenden Scheibe, die eine Vielzahl Löcher, durch die konfokale Laser gelangt gleichzeitig an die Proben enthält. Während der Erwerb, die Festplatte selbst dreht sich schnell und kontinuierlich 18-20. Durch die Verwendung des Autofokus-Systems des Mikroskops wird eine stabile Fokus über lange Zeiträume aufrechterhalten. Diese ermöglicht es Forschern, gut fokussierte Bilder Live Cell nehmen. Erworbene Bilder werden als Filmdatei gespielt. Die Bilder werden mit Bildanalyse-Software wie ImageJ 21,22, FIJI 23 oder anderen im Handel erhältlichen Software analysiert.

<table><tbody><tr><td>1 Schere zum Enthaupten</td><td>WPI</td><td>501749</td><td>Autoklav vor Gebrauch</td></tr><tr><td>1 Feine Schere zum Isolieren des Herzens und zum Zerkleinern</td><td>WPI</td><td>14393</td><td>Autoklav vor dem Gebrauch</td></tr><tr><td>2 Feine Pinzette (Dumont Nr. 5)</td><td>Sigma</td><td>F6521</td><td>Autoklav vor Gebrauch</td></tr><tr><td>3 sterilisierte 10 cm Kunststoffschalen</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Zur Herzisolierung</td></tr><tr><td>3,5 cm Glasboden Kulturschalen</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>Für die abschließende Beschichtung von Kardiomyozyten für die zukünftige Bildgebung lebender Zellen. Micro-Dishes von ibidi sind eine akzeptable Alternative.</td></tr><tr><td>3,5 cm Kulturschalen mit Glasboden</td><td>MatTek</td><td>P35G-0.17-14-C</td><td>Für TIRF oder hochauflösende</td></tr><tr><td>Bilder Ethanollösung, 70% (v/v) in Wasser</td><td>Sigma</td><td>E7148</td><td></td></tr><tr><td>2% Gelatine</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>1 Sterilisierte 10 cm Kunststoffschale</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Zur Trypsinisierung</td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Jede Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7543</td><td></td></tr><tr><td>Zwei 10 cm Kunststoff-Zellkulturschale</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Zur Auswahl</td></tr><tr><td>Autopipette</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-300</td><td>Zur Verreibung</td></tr><tr><td>Zellzähler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellometer, automatisierter Zellzähler</td><td>nexcelom</td><td></td><td>Zur Kontrolle und Zählung von Zellen</td></tr><tr><td>Mikroskop und Hämatozytometer</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Zur Kontrolle und Zählung von Zellen</td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung, 0,4%</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-19AIC</td><td></td></tr><tr><td>Inkubierender Orbitalschüttler</td><td>Sigma</td><td>Z673129</td><td>Zum Schütteln von Herzgewebe mit Kollagenase bei 37 & Grad; C bei 170-200 U/min</td></tr><tr><td>10 mg/ml BrdU-Lösung</td><td>BD Pharmingen</td><td>550891</td><td></td></tr><tr>DMEM, <td>Invitrogen</td><td>mit hohem Glukosegehalt</td><td>41965039</td><td>Medium wie im Protokoll angegeben mischen und vor Gebrauch</td></tr><tr><td>MEM-Invitrogen</td><td></td> erwärmen <td>31095029</td><td>Medium wie im Protokoll angegeben und vor Gebrauch erwärmen</td></tr><tr><td>Rinderserum</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) &nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Abschnitt 2 Lentivirale Transduktion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 Verpackung von</td><td></td><td></td><td></td>Plasmiden</tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene</td><td>12251</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Der lentivirale Transfervektor, pLVX-IRES-Puro</td><td>Clontech</td><td>632183</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (serumfreies Medium)</td><td>Invitrogen</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Transfektionsreagenz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimin" Max", (MW 40.000) - Hochwirksames lineares PEI (entspricht MW 25.000 in freier Base)&nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>24765-2</td><td>Es kann substituiert werden mit X-tremeGENE 9 von Roche</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365779001</td><td>Ersatz für PEI als Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>Chloroquin</td><td>Sigma</td><td>C6628</td> In <td>Wasser auflösen und 100 mM Stammlösung herstellen. Eine Hemmung der endosomalen Ansäuerung kann mit 10-100 μm erreicht werden; M Chloroquin.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Luer-Lok Spritze, sterilisiert</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; m Filter</td><td>Sigma</td><td>F8677</td><td>Verwenden Sie nur Filter aus Celluloseacetat oder Polyethersulfon (PES) (Low Protein Binding). Verwenden Sie keine Nitrozellulosefilter. Nitrocellulose bindet Oberflächenproteine auf der lentiviralen Hülle und zerstört das Virus.</td></tr><tr><td>Hexadimethrinbromid</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>In Wasser auflösen und 8 mg/ml Stammlösung herstellen, dann zur Sterilisation filtrieren.</td></tr><tr><td>Polyethylenglykol 6.000</td><td>Sigma</td><td>81260</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Abschnitt 3 Adenovirale Transduktion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Etwa 10 cm Zellkulturschalen</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Mikroplatte mit Deckel, flacher Boden, Gewebekultur, steril</td><td>BD Falcon 353072</td><td></td><td>Für die Titration</td></tr><tr><td>Mehrkanalpipette, 10-100 &mu; l, 8-Kanal</td><td>eppendorf</td><td>3122 000.035</td><td></td></tr><tr><td>Sektion 4 Lebendzell-Bildgebung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinning-Scheibe konfokale Mikroskopie</td><td>PerkinElmer</td><td>L7267000</td><td></td></tr><tr><td>Eine temperaturgesteuerte Kammer</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Um die Temperatur bei 37 Grad zu halten; C</td></tr><tr><td>Ein CO2 Umweltsystem</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Optional zur Aufrechterhaltung der CO2Konzentration optimale</td></tr><tr><td>CO2 Unabhängiges Medium, kein Glutamin-Invitrogen</td><td></td><td>18045-054&nbsp; &nbsp;</td><td>Für Langzeit-Zeitraffer-Aufnahmen</td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, HEPES, kein</td><td>Phenolrot-Invitrogen</td><td>21063-029</td><td>Für Langzeit-Zeitraffer-Aufnahmen</td></tr></tbody></table>

live cell imaging von primären ratten-kardiomyozyten neonatal nach adenovirale und lentivirale transduktion mittels konfokaler mikroskopie spinning-disk-

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primäre Ratten-Herzmuskelzellen Neugeborenen sind bei der Grundlagenforschung in vitro Herz-Kreislauf, weil sie leicht in großen Stückzahlen getrennt werden, in einem einzigen Verfahren. Aufgrund der Fortschritte in der Mikroskoptechnik ist es relativ einfach, Live-Cell-Bilder für die Zwecke der Untersuchung zellulärer Ereignisse in Echtzeit mit minimaler Besorgnis über Phototoxizität zu den Zellen zu erfassen. Dieses Protokoll beschreibt, wie man Live-Cell-Zeitrafferbilder von primären Ratten-Herzmuskelzellen nehmen Neugeborenen mit einem konfokalen Mikroskop Spinning-Disk folgende lentiviralen und adenovirale Transduktion, um die Eigenschaften der Zelle zu modulieren. Die Anwendung von zwei unterschiedlichen Arten von Viren macht es einfacher, eine geeignete Übertragungsrate und die Expressionsniveaus für zwei unterschiedliche Gene zu erreichen. Nun konzentriert Lebendzell Bilder können mit Autofokus-System des Mikroskops, die stabile Fokus für lange Zeiträume beibehält, erhalten werden. Gemäss dieser Methode werden die Funktionen von exogen Ingenieured Proteinen in kultivierten primären Zellen exprimiert werden, können analysiert werden. Zusätzlich kann dieses System verwendet, um die Funktionen von Genen durch die Verwendung von siRNAs sowie von chemischen Modulatoren zu untersuchen.

Die Technik, ein Lentivirus-Codierung EGFP (enhanced green fluorescent protein)-markierten Cx43 (Connexin43) oder eine mutierte Cx43 32 wurde verwendet, um EGFP-markierte Proteine ​​in Zellen zu exprimieren, und ein Adenovirus-Codierung FGFR1DN (Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 1 dominant negative illustrieren ) wurde verwendet, um in der Zelle 33-35 heruntergefahren FGF-Signalisierung. Drei Tage nach der Trennung von Kardiomyozyten wurden die isolierten Kardiomyozyten mit Lentiviren, um EGFP-...

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Bildgebung lebender Zellen mit primären neonatalen Kardiomyozyten von Ratten nach lentiviraler und adenoviraler Transduktion mittels konfokaler Spinning-Disk-Mikroskopie. Dies ermöglicht detaillierte Beobachtungen zellulärer Prozesse in lebenden Kardiomyozyten.

Live Cell Imaging von primären Ratten-Kardiomyozyten Neonatal Nach Adenovirale und Lentivirale Transduktion mittels konfokaler Mikroskopie Spinning-Disk-

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Zeitrafferaufnahmen von primären neonatalen Rattenkardiomyozyten nach lentiviraler und adenoviraler Transduktion mithilfe der konfokalen Spinning-Disk-Mikroskopie zu gewinnen. Dies wird erreicht, indem zunächst Kardiomyozyten aus neugeborenen Ratten gewonnen und die Zellen in Glasbodenschalen ausplattiert werden. Im nächsten Schritt erfolgt die Transduktion von mit EGFP markiertem Connexin 43 mittels Lentivirus, gefolgt von der Transduktion eines dominant-negativen fgfr mittels Adenovirus in den Kardiomyozyten.Der letzte Schritt besteht darin, Zeitrafferaufnahmen mithilfe der konfokalen Spinning-Disk-Mikroskopie aufzunehmen. Letztendlich kann ein Film erstellt werden, der aus den aufgenommenen Zeitrafferaufnahmen abgespielt wird. Dieser zeigt die Verteilung des mit EGFP markierten Proteins, das durch lentivirale Gene in lebenden primären Kardiomyozyten exprimiert wird, unter veränderten Zellbedingungen durch ein adenoviral exprimiertes dominant-negatives Fgfr1-Protein.Ein wesentlicher Vorteil dieser Technik besteht darin, dass man mittels einer Spinning-Disk-Konfokalmikroskopie eine Zeitrafferaufnahme an lebenden Zellen unter gewünschten Bedingungen nach der Genexpression, die durch adenovirale oder anschließend entwickelte Transfektion induziert wurde, durchführen kann. Diese Methode kann daher Einblicke in rechte neonatale Kardiomyozyten ermöglichen. Sie ist außerdem auf andere Systeme anwendbar, wie primäre Maus-, neonatale Kardiomyozyten, primäre rechte Mausarm-Kardiomyozyten, adulte Kardiomyozyten sowie andere kultivierte Zellen. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in der Mikroskopie sind, Schwierigkeiten, scharfe Bilder aufzunehmen, da sich der Objekttisch im Laufe der Zeit leicht verschieben kann. Durch die Verwendung der automatischen Fokussierungsfunktion des Geräts kann ein stabiler Fokus aufrechterhalten werden, wodurch Forschenden die Aufnahme gut fokussierter Bilder erleichtert wird. Die in diesem Verfahren verwendeten neonatalen Kardiomyozyten werden aus ein- bis zweitagealten Rattenwelpen isoliert.Entfernen Sie das schlagende Herz so schnell wie möglich mit sterilisierten Instrumenten aus dem euthanasierten Tier und legen Sie das Herz in 30 Milliliter Eis. Abgekühltes C-M-F-H-B-S-S in einem 50-Milliliter-Konischgefäß. Typischerweise werden insgesamt 10 Herzen in zwei 50-Milliliter-Konischgefäßen gesammelt, wobei jeweils fünf Herzen in 30 Millilitern eisgekühltem C-M-F-H-B-S-S enthalten sind; für Filmaufnahmen werden zwei bis drei Herzen gesammelt.Den Probenglas vorsichtig schwenken, um die Herzen zu spülen. Alle Arbeitsschritte müssen auf Eis und in einer laminaren Luftströmungskabine durchgeführt werden. Ab diesem Punkt die Überstände verwerfen und die Herzen in eine neue sterilisierte 10 cm große Plastikschale auf Eis überführen.Seien Sie vorsichtig, um die Herzen nicht mit dem Aspirator aufzusaugen. Entfernen Sie große Gefäße und/oder unerwünschtes Gewebe von den Herzen. Geben Sie 10 Milliliter eiskalte C-M-F-H-B-S-S in die Schale, um die Herzen zu spülen.Überführen Sie anschließend alle Herzen in eine neue sterilisierte 10 cm große Kunststoffschale auf Eis. Zerkleinern Sie die Herzen mit einer Schere auf weniger als einen Kubikmillimeter. Geben Sie neun Milliliter gekühltes C-M-F-H-B-S-S zu den zerkleinerten Herzen hinzu.Geben Sie ein Milliliter kalten Trypsin hinzu. Mit C-M-F-H-B-S-S rekonstituiert. Verschließen Sie die Schale mit Paraform.Mit Aluminiumfolie abdecken und am folgenden Tag über Nacht in einen Kühlschrank stellen. Übertragen Sie am nächsten Tag das gesamte Herzgewebe mit Puffer in ein 50-Milliliter-Konischglas auf Eis. Fügen Sie einen Milliliter Trypsininhibitor in C-M-F-H-B-S-S hinzu. Verschließen Sie das 50-Milliliter-Konischglas fest, um Kontaminationen zu vermeiden.Die Röhre etwa 30 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Inkubator inkubieren, um das Gewebe und das Puffermedium auf 30 bis 37 Grad Celsius aufzuwärmen. Anschließend fünf Milliliter Kollagenase in Leibovitz L-15 hinzufügen und 45 Minuten bei 37 Grad Celsius unter leichtem Schütteln inkubieren. Nach 45 Minuten das Gewebe mittels einer automatischen Pipette 20-mal mit einer Geschwindigkeit von drei Milliliter pro Sekunde tritrieren.Lassen Sie die Gewebereste drei Minuten lang absetzen und filtrieren Sie das Überstand mit einem 70-Mikron-Zellfilter. Geben Sie fünf Milliliter des Leibovitz L 15 zu den verbleibenden Gewebeklumpen hinzu, pipettieren Sie mehrmals auf und ab und filtrieren Sie das Überstand erneut. Spülen Sie den Zellfilter mit zwei Milliliter des Leibovitz L 15.Stellen Sie die gefilterte Zelllösung 20 bis 60 Minuten in einen Abzug, damit die Kollagenase das teilweise abgebaute Kollagensediment verdauen kann. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 100 × g für fünf Minuten. Resuspendieren Sie die Zellen in 20 Milliliter DMEM, das 10 % fetalen Kälberserum und 20 Einheiten pro Milliliter enthält.Penicillin-Streptomycin inkubieren die Zellen auf zwei Kunststoff-Zellkulturschalen mit 10 Zentimeter Durchmesser für eine Stunde bei 37 Grad Celsius in einem CO2-Inkubator zur Kardiomyozyten-Selektion; Fibroblasten heften sich stärker an den Schalenboden an als Kardiomyozyten. Nach einer Stunde die Schalen vorsichtig schwenken und den kardiomyozytenhaltigen Überstand sammeln. Die Zellen bei 100 × g für fünf Minuten sedimentieren. Die Zellen in DMEM resuspendieren, das 10 % FBS, 10 Einheiten pro Milliliter Penicillin-Streptomycin und 0,1 Millimolar Bromodesoxyuridin enthält; die Zellen mit einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen pro Schale in gelatinebeschichtete Glasbodenschalen mit 3,5 Zentimeter Durchmesser ausplattieren, um sie mittels Mikroskop zu beobachten; im CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius inkubieren.Stören Sie die Zellen nach dem Ausplattieren mindestens 24 Stunden lang nicht, bevor Sie die lentivirale Transduktion der Kardiomyozyten durchführen. Lentivirale Plasmide werden verpackt und die lentivirale Lösung gemäß den in der begleitenden Veröffentlichung beschriebenen Verfahren gesammelt. Um die lentivirale Transduktion zu beginnen, entfernen Sie das Medium aus einer 3,5 cm Glasbodenschale mit neonatalen Ratten-Kardiomyozyten und geben ein Milliliter gefilterte lentivirale Lösung hinzu.Die Schale sechs Stunden lang im CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach sechs Stunden das Medium durch frisches DMEM ersetzen, ergänzt mit MEM, 5 % FBS und Penicillin-Streptomycin, und weitere drei Tage im CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius inkubieren.Die Integration des exogenen Gens in das Wirts-Genom durch Lentivirus gilt als 72 Stunden vor der Adenovirus-Transduktion abgeschlossen. Die Adenovirus-Stammlösung muss wie in der begleitenden Publikation beschrieben titriert werden. Entnehmen Sie die 3,5 cm Glasbodenkultur mit neonatalen Rattenkardiomyozyten, die einer lentiviralen Transduktion unterzogen wurden.Ersetzen Sie das Medium durch 750 µL verdünnte Adenoviruslösung. Die Reduktion des Mediumvolumens während der Transduktion auf etwa 50 % des ursprünglichen Volumens ist entscheidend für eine hohe Transduktionseffizienz. Inkubieren Sie im CO2-Inkubator bei 37 °C für vier bis acht Stunden.Als Nächstes ersetzen Sie das Medium durch frisches Medium und inkubieren Sie 24 bis 48 Stunden, bevor Sie die Zellen für Live-Cell-Imaging-Experimente verwenden. Der Bildakquisitionsvorgang, unter Verwendung eines konfokalen Spinning-Disk-Mikroskops mit temperaturgeregeltem Kammer und CO2-Umgebungssystem, wird mindestens eine Stunde vor der Bildaufnahme demonstriert. Schalten Sie das Temperaturregelungssystem ein, damit sich alle Geräte auf 37 Grad Celsius einstellen können.Schalten Sie das konfokale Spinning-Disk-Mikroskopsystem ein. Platzieren Sie die 3,5 cm große Glasbodenschale mit neonatalen Rattenkardiomyozyten auf der Stufe des konfokalen Spinning-Disk-Mikroskops in einer temperaturgeregelten Kammer. Schalten Sie den Verschluss der fluoreszierenden Lichtquelle ein und suchen Sie unter dem Mikroskop durch das Okular nach Zellen, die fluoreszierende Proteine exprimieren.Schalten Sie den Verschluss für die fluoreszierende Lichtquelle aus. Wechseln Sie den Lichtweg zum Spinning-Disk-Konfokalmikroskop. Passen Sie die Einstellungen für die Aufnahme entsprechend mithilfe der Betriebssoftware an, überprüfen Sie die auf dem Bildschirm angezeigten Bilder und stellen Sie die Einstellungen für die Fluoreszenzbildaufnahme ein.Wählen Sie beispielsweise die Kanalwechsel über Lichtpfade aus und setzen Sie Kanal eins auf EGFP, um das fluoreszierende Signal von EGFP für Kanal eins zu erfassen. Stellen Sie die Frequenz zwischen Zeitpunkten ein, indem Sie die Einstellungen für die Zeitrafferaufnahme im Betriebssoftware konfigurieren, um Zeitrafferaufnahmen durchzuführen. Um beispielsweise alle fünf Minuten einen Zeitpunkt aufzuzeichnen, wählen Sie Minuten pro Zeitpunkt aus dem Dropdown-Menü und geben Sie fünf in das Textfeld ein.Starten Sie die Zeitraffer-Aufnahme, indem Sie auf die Schaltfläche „Start“ klicken, um eine Bildsequenz aufzuzeichnen. Nach Abschluss der Bildaufnahme können die Bilder als Filmdatei abgespielt und analysiert werden. Wählen Sie gegebenenfalls mithilfe der Analyse-Software die aufgenommenen Bilder aus, die in einen Film einbezogen werden sollen.Schneiden Sie Bereiche von Interesse aus den Bildern aus und wählen Sie interessante Zeitpunkte aus, um die Dateigröße des Films zu reduzieren. Exportieren Sie die Bilder als Filmdatei im VI- oder MOV-Format. Wählen Sie ein Filmformat aus dem Formatmenü und die gewünschte Timing-Einstellung für den fertigen Film. Klicken Sie anschließend auf Exportieren.In diesem repräsentativen Experiment wurden neonatale Rattenkardiomyozyten mit einem Lentivirus, das ein mit EGFP markiertes CONEXION 43 oder eine mutierte Form von CONEXION 43 kodiert, sowie mit einem Adenovirus, das einen dominant-negativen Fibroblastenwachstumsfaktor-Rezeptor 1 (FGFR 1 dn) kodiert, transduziert. Die Expression der mit EGFP markierten Proteine wurde mittels konfokaler Spinning-Disk-Mikroskopie überprüft, während die Expression des dominant-negativen Fibroblastenwachstumsfaktor-Rezeptors durch Immunchemie und Western Blot bestätigt wurde. Zeitrafferaufnahmen von Kardiomyozyten wurden angefertigt und als Film wiedergegeben. In diesem Beispiel bewegten sich die Bilder in der XY-Ebene, möglicherweise weil die Temperaturangleichung unzureichend war oder der Modus für mehrfache Aufnahmen nicht ordnungsgemäß funktionierte.Dies stammt aus Zeitrafferaufnahmen von Kardiomyozyten, die das mutierte Connexin 43 und FGFR1 dn exprimieren. Hier war die Temperaturausgleichung ausreichend, und es wurde nur ein einzelner interessierender Bereich aufgenommen, was zu Bildern ohne Bewegung in der XY-Ebene führte. Das Schlagen der Kardiomyozyten wurde nach der Bildaufnahme bewertet, um die Zellviabilität zu bestätigen.Dieses Video zeigt, dass EGFP-exprimierende Kardiomyozyten nach 16 Stunden Zeitrafferaufnahmen ihre funktionellen Eigenschaften beibehielten und rhythmisch schlugen. Mit dieser Technik können Sie lebende Primärkardiomyozyten abbilden. Bitte bedenken Sie, dass die Arbeit mit Adenovirus und Lentivirus gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen, um beispielsweise Kontaminationen zu vermeiden, wenn Sie mit diesen Viren arbeiten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Adult Herzmuskelzellen sind primäre Zellen, die aus tierischen Herzen isoliert und kultiviert für mehrere Tage. Innerhalb dieses Zeitraums Kultur adenoviralen Gentransfer können verwendet werden, um genetisch kodierte Biosensoren (GEBS) oder fluoreszierende Fusionsproteine ​​zu exprimieren. Beide Ansätze erlauben zellulären Untersuchungen mittels der konfokalen Mikroskopie.

Isolation und genetische Manipulation von Adult Herzmuskelzellen für konfokale Imaging

Hier entwickeln wir die notwendigen Werkzeuge...

Ex vivo Live-Imaging von Single Cell Divisionen in Maus Neuroepithel

Primäre Maus-Kardiomyozyten-Kulturen sind eines der zentralen Werkzeuge für die Untersuchung von myofibrillären Organisation und Funktion. Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von primären Kardiomyozyten aus neonatalen Mäuseherzen. Die resultierenden Kulturen Kardiomyozyten können anschließend für eine Vielzahl von biomechanischen, biochemischen und zellbiologischen Assays verwendet werden.

Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

Die Isolierung von neonatalen Ratten-Kardiomyozyten ist ein zeitaufwändiges und unvorhersehbares Verfahren.  Diese Studie beschreibt Methoden zur Kryokonservierung und zum Auftauen von neonatalen Ratten-Kardiomyozyten, die eine effizientere Nutzung der Zellen ermöglichen. Die aufgetauten NRCMs können für verschiedene Experimente verwendet werden, ohne dass jedes Mal Isolationen durchgeführt werden müssen.

Isolierung und Kryokonservierung von neonatalen Rattenkardiomyozyten

Dieses Protokoll beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode für die reproduzierbare Isolierung und Langzeitkultur von adulten Maus-Kardiomyozyten mit hoher Ausbeute, Reinheit und Lebensfähigkeit.

Isolierung, Kultur und Transduction von erwachsenen Maus Kardiomyozyten

Wir beschreiben ein Protokoll zur volumetrischen Abbildung von fluoreszierenden Protein-markierten Zellen tief in intakten embryonalen und postnatalen Herzen. Durch die Verwendung von Gewebereinigungsmethoden in Kombination mit der Whole-Mount-Färbung können einzelne fluoreszierende Protein-markierte Zellen in einem embryonalen oder postnatalen Herzen klar und genau abgebildet werden.

Imaging Gelöscht Embryonale und postnatale Hearts bei Einzelzell-Auflösung

Um die Zellteilung von Zellzyklusvariationen in Kardiomyozyten zu unterscheiden, präsentieren wir Protokolle mit zwei transgenen Mauslinien: Myh6-H2B-mCh-transgene Mäuse, zur eindeutigen Identifizierung von Kardiomyozytenkernen, und CAG-eGFP-Anillin-Mäuse, zur Unterscheidung der Zellteilung von Zellzyklusvariationen.

Visualisierung von Zellzyklus-Variationen und Bestimmung der Nukleation in postnatale Kardiomyozyten

Dieses Manuskript beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Generierung und Quantifizierung verschiedener reprogrammierter kardialer Subtypen unter Verwendung einer Retrovirus-vermittelten Verabreichung von Gata4, Hand2, Mef2c und Tbx5.

Die Beurteilung Cardiomyocyte Subtypes Nach Transcription Factor-vermittelte Reprogrammierung von embryonalen Maus-Fibroblasten

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolation, Transfektion und Langzeitkultur von erwachsenen Maus- und Rattenkardiomyozyten vor.

Isolation, Transfektion und Langzeitkultur von Erwachsenenmaus und Rattenkardiomyozyten

Hier stellen wir eine Methode zur Untersuchung der Neuritenmorphogenese in postnatalen Maus-Netzhautexplantationen mittels konfokaler Zeitraffinalmikroskopie vor. Wir beschreiben einen Ansatz zur spärlichen Markierung und Erfassung von retinalen Zelltypen und deren Feinprozessen unter Verwendung rekombinanter adenoassoziierter Virusvektoren, die membrangerichtete fluoreszierende Proteine in einer Cre-abhängigen Weise exprimieren.

Zeitraffer-Bildgebung neuronaler Arborisation mittels spärlicher adenoassoziierter Virusmarkierung genetisch zielgerichteter Netzhautzellpopulationen

Es wird eine Reihe von Protokollen vorgestellt, die die Messung der kontraktilen Funktion mittels Sarkomerlängendetektion zusammen mit der transienten Messung von Kalzium (Ca2+) in isolierten Rattenmyozyten beschreiben. Die Anwendung dieses Ansatzes für Studien in Tiermodellen der Herzinsuffizienz ist ebenfalls enthalten.

Analyse der kardialen kontraktilen Dysfunktion und Ca2+ Transienten in Nagetiermyozyten

Erfahren Sie Live-Cell-Imaging von primären Ratten-Kardiomyozyten nach lentiviraler und adenoviraler Transduktion mittels konfokaler Spinning-Disk-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Beobachtung zellulärer Dynamiken und Proteinverteilungen in lebenden Herzzellen.

Live Cell Imaging von primären Ratten-Kardiomyozyten Neonatal Nach Adenovirale und Lentivirale Transduktion mittels konfokaler Mikroskopie Spinning-Disk- (Video) | JoVE Journal

Live Cell Imaging von primären Ratten-Kardiomyozyten Neonatal Nach Adenovirale und Lentivirale Transduktion mittels konfokaler Mikroskopie Spinning-Disk-

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