Name: Live Cell Imaging von primären Ratten-Kardiomyozyten Neonatal Nach Adenovirale und Lentivirale Transduktion mittels konfokaler Mikroskopie Spinning-Disk- (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Erfahren Sie Live-Cell-Imaging von primären Ratten-Kardiomyozyten nach lentiviraler und adenoviraler Transduktion mittels konfokaler Spinning-Disk-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Beobachtung zellulärer Dynamiken und Proteinverteilungen in lebenden Herzzellen.

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Wir danken Dr. Alengo Nyamay'antu und Dr. Ilse Timmerman für ihre Ratschläge zur lentiviralen Verpackung. Diese Arbeit wird durch einen Scientist Development Grant 10SDG4170137 der American Heart Association unterstützt.

<ol><li>Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+the+preparation+of+homogeneous+cultures+of+isolated+heart+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells.</a> Experimental cell research. 53, 1-10 (1968).</li>
<li>Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+toxicity+of+allylamine+and+acrolein+in+cultured+myocytes+and+fibroblasts+from+neonatal+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart.</a> Toxicology. 56, 107-117 (1989).</li>
<li>MacGregor, R. R., Klein, R. M., Bansal, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+plasminogen+activator+activity+from+neonatal+rat+heart+cells+is+regulated+by+hormones+and+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Secretion of plasminogen activator activity from neonatal rat heart cells is regulated by hormones and growth factors.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 752, 331-342 (1995).</li>
<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+and+cellular+cardiology%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> Journal of molecular and cellular cardiology. 51, 288-298 (2011).</li>
<li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> The American journal of physiology. , 271-1250 (1996).</li>
<li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+genetic+manipulation+of+adult+cardiac+myocytes+for+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging.</a> J Vis Exp. 31 (31), (2009).</li>
<li>Xu, X., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+adult+rat+heart+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture of adult rat heart myocytes.</a> J Vis Exp. 28 (28), (2009).</li>
<li>Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+isolation+procedure+for+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+biochemistry+and+biophysics%22%5BJournal%5D)">An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes.</a> Cell biochemistry and biophysics. 61, 93-101 (2011).</li>
<li>Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+primary+culture+of+cardiomyocyte+from+neonatal+mice.+In+vitro+cellular+%26+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Animal%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro cellular & developmental biology.</a> Animal. 44, 45-50 (2008).</li>
<li>Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Neonatal+Mouse+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes.</a> J Vis Exp. 79 (79), (2013).</li>
<li>Kass-Eisler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+determination+of+adenovirus-mediated+gene+delivery+to+rat+cardiac+myocytes+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Quantitative determination of adenovirus-mediated gene delivery to rat cardiac myocytes in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 11498-11502 (1993).</li>
<li>Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+heart+gene+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+gene+medicine%22%5BJournal%5D)">The evolution of heart gene delivery vectors.</a> The journal of gene medicine. 13, 557-565 (2011).</li>
<li>Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMetzger%2C+JM+%22Cardiac+Cell+and+Gene+Transfer%3A+Principles%2C+Protocols%2C+and+Applications%22">Cardiac Cell and Gene Transfer: Principles, Protocols, and Applications</a>. , Humana Press. Totowa, N.J. (2003).</li>
<li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+for+delivery+of+genes+into+neonatal+and+adult+ventricular+cardiac+myocytes+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+research+in+cardiology%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo.</a> Basic research in cardiology. 97, 348-358 (2002).</li>
<li>Bonci, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced%27+generation+lentiviruses+as+efficient+vectors+for+cardiomyocyte+gene+transduction+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Advanced' generation lentiviruses as efficient vectors for cardiomyocyte gene transduction in vitro and in vivo.</a> Gene therapy. 10, 630-636 (2003).</li>
<li>Murakami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FGF+system+has+a+key+role+in+regulating+vascular+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">The FGF system has a key role in regulating vascular integrity.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 3355-3366 (2008).</li>
<li>Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinning-disk+confocal+microscopy+--+a+cutting-edge+tool+for+imaging+of+membrane+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+structure+and+function%22%5BJournal%5D)">Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic.</a> Cell structure and function. 27, 349-355 (2002).</li>
<li>Adams, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-speed+multispectral+spinning-disk+confocal+microscope+system+for+fluorescent+speckle+microscopy+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%22%5BJournal%5D)">A high-speed multispectral spinning-disk confocal microscope system for fluorescent speckle microscopy of living cells.</a> Methods (San Diego, Calif. 29, 29-41 (2003).</li>
<li>Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinning-disk+microscopy+systems.+Cold+Spring+Harbor+protocols%29%5BTitle%5D)+AND+%222010%2C+pdb+top88%2C+doi%3A10.1101%2Fpdb.top88%22%5BJournal%5D)">Spinning-disk microscopy systems. Cold Spring Harbor protocols).</a> 2010, pdb top88, doi:10.1101/pdb.top88. , (2010).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43, 25-30 (2007).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> J Vis Exp. 32 (32), (2009).</li>
<li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. 63 (63), 10-3791 (2012).</li>
<li>Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Packaging+HIV-+or+FIV-based+lentivector+expression+constructs+and+transduction+of+VSV-G+pseudotyped+viral+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs and transduction of VSV-G pseudotyped viral particles.</a> J Vis Exp. 62 (62), 10-3791 (2012).</li>
<li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic acids research. 30, (2002).</li>
<li>Erbacher, P., Roche, A. C., Monsigny, M., Midoux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+role+of+chloroquine+in+gene+transfer+into+a+human+hepatoma+cell+line+by+DNA%2Flactosylated+polylysine+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes.</a> Experimental cell research. 225, 186-194 (1996).</li>
<li>McSharry, J., Benzinger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+purification+of+vesicular+stomatitis+virus+by+polyethylene+glycol+%27precipitation%27%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Concentration and purification of vesicular stomatitis virus by polyethylene glycol 'precipitation'.</a> Virology. 40, 745-746 (1970).</li>
<li>Wulff, N. H., Tzatzaris, M., Young, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monte+Carlo+simulation+of+the+Spearman-Kaerber+TCID50%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical%22%5BJournal%5D)">Monte Carlo simulation of the Spearman-Kaerber TCID50.</a> Journal of clinical. 2, 10-1186 (2012).</li>
<li>Kaerber, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaerber%2C+G+%22Beitrag+zur+kollektiven+Behandlung+pharmakologischer+Reihenversuche.+In%3A+Beitrag+zur+kollektiven+Behandlung+pharmakologischer+Reihenversuche.+162%22">Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. In: Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. 162</a>. , Springer. Berlin, 480–483. (1931).</li>
<li>Sakurai, T., Tsuchida, M., Lampe, P. D., Murakami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+FGF+signaling+is+required+for+Cx43+phosphorylation+and+cardiac+gap+junction+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte FGF signaling is required for Cx43 phosphorylation and cardiac gap junction maintenance.</a> Experimental cell research. 319, 2152-2165 (2013).</li>
<li>Ueno, H., Gunn, M., Dell, K., Tseng, A., Williams, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+truncated+form+of+fibroblast+growth+factor+receptor+1+inhibits+signal+transduction+by+multiple+types+of+fibroblast+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">A truncated form of fibroblast growth factor receptor 1 inhibits signal transduction by multiple types of fibroblast growth factor receptor.</a> The Journal of biological chemistry. , 267-1470 (1992).</li>
<li>Li, Y., Basilico, C., Mansukhani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+transformation+by+fibroblast+growth+factors+can+be+suppressed+by+truncated+fibroblast+growth+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Cell transformation by fibroblast growth factors can be suppressed by truncated fibroblast growth factor receptors.</a> Molecular and cellular biology. 14, 7660-7669 (1994).</li>
<li>Murakami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-dependent+regulation+of+VEGF+receptor+2+expression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">FGF-dependent regulation of VEGF receptor 2 expression in mice.</a> The Journal of clinical investigation. 121, 2668-2678 (2011).</li>
<li>Bazan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractility+assessment+in+enzymatically+isolated+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+reviews%22%5BJournal%5D)">Contractility assessment in enzymatically isolated cardiomyocytes.</a> Biophysical reviews. , 231-2310 (2012).</li>
<li>Clark, W. A., Rudnick, S. J., Simpson, D. G., LaPres, J. J., Decker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+adult+cardiac+myocytes+maintain+protein+synthetic+capacity+of+intact+adult+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Cultured adult cardiac myocytes maintain protein synthetic capacity of intact adult hearts.</a> The American journal of physiology. , 264-573 (1993).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Primäre Herzmuskelzellen aus neugeborenen Ratten isoliert werden seit langem verwendet, um Funktionen Kardiomyozyten in vitro zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Isolierung von neonatalen Herzmuskelzellen aus Rattenjungen mit einer zweistufigen Enzymverdauung Verfahren wird zunächst Verdau mit Trypsin O / N bei 4 ° C und anschließend gereinigten Kollagenase. Ein Vorteil der Verwendung des gereinigten Kollagenase Schritt ist, dass der gleiche Grad von Enzym wird für alle Isolierungen eing...

Primäre Ratten-Herzmuskelzellen Neugeborenen haben lange für die Untersuchung von Herzmuskelzellen in vitro Funktion 1 verwendet. Sie sind leicht zu von Rattenjungen von mehreren etablierten Methoden 4.2 zu isolieren. Das häufigste Verfahren verwendet Kollagenase oder Trypsin Bindegewebe des Herzens vor der Zellisolierung zu verdauen. Die Forscher haben auch Methoden zur Isolierung von Herzmuskelzellen aus adulten Nagetieren 5-8 sowie 9,10 neugeborenen Mäusen entwickelt. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zum Isolieren von Kardiomyozyten aus neonatalen Ratten-Jungtieren unter Verwendung einer zweistufigen Enzymverdauung Verfahren. Trypsin wird zuerst verwendet, O / N bei 4 ° C und anschließend gereinigten Collagenase bei 37 ° C. Inkubation des Herzgewebes mit Trypsin O / N bei 4 ° C reduziert die notwendigen Schritte Ernten der Zellen im Vergleich zu Verfahren mit sequentieller Inkubation in einem warmen Enzymlösung 2. Zusätzlich kann durch Verwendung von gereinigtem Collagenase anstatt rohe Enzyme können von Los zu Los-Variabilität eliminiert werden, wodurch eine verbesserte Reproduzierbarkeit. Funktionsstudien eines bestimmten Proteins verwenden oft ein Protein-Expressionssystem unter Verwendung eines Adenovirus, 11-13 und / oder ein Lentivirus 14-16. [WARN HINWEIS] Die Virusproduktion und Manipulation sollte nach den NIH-Richtlinien durchgeführt werden. Das Adenovirus nicht in das Wirtsgenom zu integrieren. Es hat einen sehr hohen Transduktionseffizienz in den meisten Zelltypen, einschließlich teilende Zellen und nicht-teilende Zellen, wie auch primäre Zellen und etablierten Zelllinien. Dies macht das Adenovirus eine zuverlässige Vektor zur Genexpression. Hohe Konzentrationen des Proteins von dem Adenovirus-Vektor codiert entwickeln innerhalb von 48 Stunden nach Transduktion, und sie für 17 Wochen dauern. Ein Nachteil der Verwendung eines Adenovirus für die Proteinexpression ist jedoch, daß die Entwicklung eines rekombinanten adenovirus ist sowohl kompliziert als auch zeitaufwendig. Dieser Nachteil erklärt zum Teil, warum viele Forscher Lentiviren worden Drehen für rekombinante Genexpression. Im Gegensatz zu adenoviralen Konstrukte, wodurch eine lentiviralen Konstrukt ist schnell und einfach. Obwohl Lentiviren haben geringere Effizienz der Transduktion als Adenoviren, in beiden Teilen und nicht-teilende Zellen, sie in das Wirtsgenom zu integrieren. Folglich ist die Expression des transduzierten Gens für Lentiviren als für Adenoviren stabiler. Aufgrund technologischer Fortschritte in der Mikroskopie, ist es viel einfacher, lebende Zellbilder von Zellen, die rekombinanten Proteine ​​zu erfassen. Dies gilt auch bei Videorate Geschwindigkeiten des Erwerbs. Dies ermöglicht dem Prüfer, um festzustellen, wie bestimmte Veränderungen in dem Protein von Interesse in funktioneller Einfluss auf die Zelle in Echtzeit. Das konfokale Spinning-Disk-Mikroskop hat mehrere Eigenschaften, die es eine optimale Technik für liv machenE-Cell-Imaging 18,19. Die Yokogawa Spinning Disc ermöglicht viel schnellere Bildaufnahme, während zur gleichen Zeit nutzen weit weniger Strom als Laserpunkt konfokalen Mikroskopen. Beide dieser Besonderheiten sind aufgrund der sich drehenden Scheibe, die eine Vielzahl Löcher, durch die konfokale Laser gelangt gleichzeitig an die Proben enthält. Während der Erwerb, die Festplatte selbst dreht sich schnell und kontinuierlich 18-20. Durch die Verwendung des Autofokus-Systems des Mikroskops wird eine stabile Fokus über lange Zeiträume aufrechterhalten. Diese ermöglicht es Forschern, gut fokussierte Bilder Live Cell nehmen. Erworbene Bilder werden als Filmdatei gespielt. Die Bilder werden mit Bildanalyse-Software wie ImageJ 21,22, FIJI 23 oder anderen im Handel erhältlichen Software analysiert.

<table><tbody><tr><td>1 Schere zum Enthaupten</td><td>WPI</td><td>501749</td><td>Autoklav vor Gebrauch</td></tr><tr><td>1 Feine Schere zum Isolieren des Herzens und zum Zerkleinern</td><td>WPI</td><td>14393</td><td>Autoklav vor dem Gebrauch</td></tr><tr><td>2 Feine Pinzette (Dumont Nr. 5)</td><td>Sigma</td><td>F6521</td><td>Autoklav vor Gebrauch</td></tr><tr><td>3 sterilisierte 10 cm Kunststoffschalen</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Zur Herzisolierung</td></tr><tr><td>3,5 cm Glasboden Kulturschalen</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>Für die abschließende Beschichtung von Kardiomyozyten für die zukünftige Bildgebung lebender Zellen. Micro-Dishes von ibidi sind eine akzeptable Alternative.</td></tr><tr><td>3,5 cm Kulturschalen mit Glasboden</td><td>MatTek</td><td>P35G-0.17-14-C</td><td>Für TIRF oder hochauflösende</td></tr><tr><td>Bilder Ethanollösung, 70% (v/v) in Wasser</td><td>Sigma</td><td>E7148</td><td></td></tr><tr><td>2% Gelatine</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>1 Sterilisierte 10 cm Kunststoffschale</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Zur Trypsinisierung</td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Jede Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7543</td><td></td></tr><tr><td>Zwei 10 cm Kunststoff-Zellkulturschale</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Zur Auswahl</td></tr><tr><td>Autopipette</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-300</td><td>Zur Verreibung</td></tr><tr><td>Zellzähler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellometer, automatisierter Zellzähler</td><td>nexcelom</td><td></td><td>Zur Kontrolle und Zählung von Zellen</td></tr><tr><td>Mikroskop und Hämatozytometer</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Zur Kontrolle und Zählung von Zellen</td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung, 0,4%</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-19AIC</td><td></td></tr><tr><td>Inkubierender Orbitalschüttler</td><td>Sigma</td><td>Z673129</td><td>Zum Schütteln von Herzgewebe mit Kollagenase bei 37 & Grad; C bei 170-200 U/min</td></tr><tr><td>10 mg/ml BrdU-Lösung</td><td>BD Pharmingen</td><td>550891</td><td></td></tr><tr>DMEM, <td>Invitrogen</td><td>mit hohem Glukosegehalt</td><td>41965039</td><td>Medium wie im Protokoll angegeben mischen und vor Gebrauch</td></tr><tr><td>MEM-Invitrogen</td><td></td> erwärmen <td>31095029</td><td>Medium wie im Protokoll angegeben und vor Gebrauch erwärmen</td></tr><tr><td>Rinderserum</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) &nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Abschnitt 2 Lentivirale Transduktion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 Verpackung von</td><td></td><td></td><td></td>Plasmiden</tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene</td><td>12251</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Der lentivirale Transfervektor, pLVX-IRES-Puro</td><td>Clontech</td><td>632183</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (serumfreies Medium)</td><td>Invitrogen</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Transfektionsreagenz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimin" Max", (MW 40.000) - Hochwirksames lineares PEI (entspricht MW 25.000 in freier Base)&nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>24765-2</td><td>Es kann substituiert werden mit X-tremeGENE 9 von Roche</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365779001</td><td>Ersatz für PEI als Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>Chloroquin</td><td>Sigma</td><td>C6628</td> In <td>Wasser auflösen und 100 mM Stammlösung herstellen. Eine Hemmung der endosomalen Ansäuerung kann mit 10-100 μm erreicht werden; M Chloroquin.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Luer-Lok Spritze, sterilisiert</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; m Filter</td><td>Sigma</td><td>F8677</td><td>Verwenden Sie nur Filter aus Celluloseacetat oder Polyethersulfon (PES) (Low Protein Binding). Verwenden Sie keine Nitrozellulosefilter. Nitrocellulose bindet Oberflächenproteine auf der lentiviralen Hülle und zerstört das Virus.</td></tr><tr><td>Hexadimethrinbromid</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>In Wasser auflösen und 8 mg/ml Stammlösung herstellen, dann zur Sterilisation filtrieren.</td></tr><tr><td>Polyethylenglykol 6.000</td><td>Sigma</td><td>81260</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Abschnitt 3 Adenovirale Transduktion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Etwa 10 cm Zellkulturschalen</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Mikroplatte mit Deckel, flacher Boden, Gewebekultur, steril</td><td>BD Falcon 353072</td><td></td><td>Für die Titration</td></tr><tr><td>Mehrkanalpipette, 10-100 &mu; l, 8-Kanal</td><td>eppendorf</td><td>3122 000.035</td><td></td></tr><tr><td>Sektion 4 Lebendzell-Bildgebung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinning-Scheibe konfokale Mikroskopie</td><td>PerkinElmer</td><td>L7267000</td><td></td></tr><tr><td>Eine temperaturgesteuerte Kammer</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Um die Temperatur bei 37 Grad zu halten; C</td></tr><tr><td>Ein CO2 Umweltsystem</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Optional zur Aufrechterhaltung der CO2Konzentration optimale</td></tr><tr><td>CO2 Unabhängiges Medium, kein Glutamin-Invitrogen</td><td></td><td>18045-054&nbsp; &nbsp;</td><td>Für Langzeit-Zeitraffer-Aufnahmen</td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, HEPES, kein</td><td>Phenolrot-Invitrogen</td><td>21063-029</td><td>Für Langzeit-Zeitraffer-Aufnahmen</td></tr></tbody></table>

live cell imaging von primären ratten-kardiomyozyten neonatal nach adenovirale und lentivirale transduktion mittels konfokaler mikroskopie spinning-disk-

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primäre Ratten-Herzmuskelzellen Neugeborenen sind bei der Grundlagenforschung in vitro Herz-Kreislauf, weil sie leicht in großen Stückzahlen getrennt werden, in einem einzigen Verfahren. Aufgrund der Fortschritte in der Mikroskoptechnik ist es relativ einfach, Live-Cell-Bilder für die Zwecke der Untersuchung zellulärer Ereignisse in Echtzeit mit minimaler Besorgnis über Phototoxizität zu den Zellen zu erfassen. Dieses Protokoll beschreibt, wie man Live-Cell-Zeitrafferbilder von primären Ratten-Herzmuskelzellen nehmen Neugeborenen mit einem konfokalen Mikroskop Spinning-Disk folgende lentiviralen und adenovirale Transduktion, um die Eigenschaften der Zelle zu modulieren. Die Anwendung von zwei unterschiedlichen Arten von Viren macht es einfacher, eine geeignete Übertragungsrate und die Expressionsniveaus für zwei unterschiedliche Gene zu erreichen. Nun konzentriert Lebendzell Bilder können mit Autofokus-System des Mikroskops, die stabile Fokus für lange Zeiträume beibehält, erhalten werden. Gemäss dieser Methode werden die Funktionen von exogen Ingenieured Proteinen in kultivierten primären Zellen exprimiert werden, können analysiert werden. Zusätzlich kann dieses System verwendet, um die Funktionen von Genen durch die Verwendung von siRNAs sowie von chemischen Modulatoren zu untersuchen.

Die Technik, ein Lentivirus-Codierung EGFP (enhanced green fluorescent protein)-markierten Cx43 (Connexin43) oder eine mutierte Cx43 32 wurde verwendet, um EGFP-markierte Proteine ​​in Zellen zu exprimieren, und ein Adenovirus-Codierung FGFR1DN (Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 1 dominant negative illustrieren ) wurde verwendet, um in der Zelle 33-35 heruntergefahren FGF-Signalisierung. Drei Tage nach der Trennung von Kardiomyozyten wurden die isolierten Kardiomyozyten mit Lentiviren, um EGFP-...

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Bildgebung lebender Zellen mit primären neonatalen Kardiomyozyten von Ratten nach lentiviraler und adenoviraler Transduktion mittels konfokaler Spinning-Disk-Mikroskopie. Dies ermöglicht detaillierte Beobachtungen zellulärer Prozesse in lebenden Kardiomyozyten.

Live Cell Imaging von primären Ratten-Kardiomyozyten Neonatal Nach Adenovirale und Lentivirale Transduktion mittels konfokaler Mikroskopie Spinning-Disk-

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Zeitrafferaufnahmen von primären neonatalen Rattenkardiomyozyten nach lentiviraler und adenoviraler Transduktion mithilfe der konfokalen Spinning-Disk-Mikroskopie zu gewinnen. Dies wird erreicht, indem zunächst Kardiomyozyten aus neugeborenen Ratten gewonnen und die Zellen in Glasbodenschalen ausplattiert werden. Im nächsten Schritt erfolgt die Transduktion von mit EGFP markiertem Connexin 43 mittels Lentivirus, gefolgt von der Transduktion eines dominant-negativen fgfr mittels Adenovirus in den Kardiomyozyten.Der letzte Schritt besteht darin, Zeitrafferaufnahmen mithilfe der konfokalen Spinning-Disk-Mikroskopie aufzunehmen. Letztendlich kann ein Film erstellt werden, der aus den aufgenommenen Zeitrafferaufnahmen abgespielt wird. Dieser zeigt die Verteilung des mit EGFP markierten Proteins, das durch lentivirale Gene in lebenden primären Kardiomyozyten exprimiert wird, unter veränderten Zellbedingungen durch ein adenoviral exprimiertes dominant-negatives Fgfr1-Protein.Ein wesentlicher Vorteil dieser Technik besteht darin, dass man mittels einer Spinning-Disk-Konfokalmikroskopie eine Zeitrafferaufnahme an lebenden Zellen unter

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Adult Herzmuskelzellen sind primäre Zellen, die aus tierischen Herzen isoliert und kultiviert für mehrere Tage. Innerhalb dieses Zeitraums Kultur adenoviralen Gentransfer können verwendet werden, um genetisch kodierte Biosensoren (GEBS) oder fluoreszierende Fusionsproteine ​​zu exprimieren. Beide Ansätze erlauben zellulären Untersuchungen mittels der konfokalen Mikroskopie.

Isolation und genetische Manipulation von Adult Herzmuskelzellen für konfokale Imaging

Hier entwickeln wir die notwendigen Werkzeuge...

Ex vivo Live-Imaging von Single Cell Divisionen in Maus Neuroepithel

Primäre Maus-Kardiomyozyten-Kulturen sind eines der zentralen Werkzeuge für die Untersuchung von myofibrillären Organisation und Funktion. Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von primären Kardiomyozyten aus neonatalen Mäuseherzen. Die resultierenden Kulturen Kardiomyozyten können anschließend für eine Vielzahl von biomechanischen, biochemischen und zellbiologischen Assays verwendet werden.

Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

Die Isolierung von neonatalen Ratten-Kardiomyozyten ist ein zeitaufwändiges und unvorhersehbares Verfahren.  Diese Studie beschreibt Methoden zur Kryokonservierung und zum Auftauen von neonatalen Ratten-Kardiomyozyten, die eine effizientere Nutzung der Zellen ermöglichen. Die aufgetauten NRCMs können für verschiedene Experimente verwendet werden, ohne dass jedes Mal Isolationen durchgeführt werden müssen.

Isolierung und Kryokonservierung von neonatalen Rattenkardiomyozyten

Dieses Protokoll beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode für die reproduzierbare Isolierung und Langzeitkultur von adulten Maus-Kardiomyozyten mit hoher Ausbeute, Reinheit und Lebensfähigkeit.

Isolierung, Kultur und Transduction von erwachsenen Maus Kardiomyozyten

Um die Zellteilung von Zellzyklusvariationen in Kardiomyozyten zu unterscheiden, präsentieren wir Protokolle mit zwei transgenen Mauslinien: Myh6-H2B-mCh-transgene Mäuse, zur eindeutigen Identifizierung von Kardiomyozytenkernen, und CAG-eGFP-Anillin-Mäuse, zur Unterscheidung der Zellteilung von Zellzyklusvariationen.

Visualisierung von Zellzyklus-Variationen und Bestimmung der Nukleation in postnatale Kardiomyozyten

Dieses Manuskript beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Generierung und Quantifizierung verschiedener reprogrammierter kardialer Subtypen unter Verwendung einer Retrovirus-vermittelten Verabreichung von Gata4, Hand2, Mef2c und Tbx5.

Die Beurteilung Cardiomyocyte Subtypes Nach Transcription Factor-vermittelte Reprogrammierung von embryonalen Maus-Fibroblasten

Mehrere Protokolle wurden entwickelt und beschrieben für die Isolierung von verschiedenen Herzzelltypen von einem Rattenherz. Hier wird ein optimiertes Protokoll beschrieben, das die Isolierung von hochwertigen Hauptkardiometertypen (Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten) aus einer einzigen Präparation ermöglicht, wodurch die experimentellen Kosten reduziert werden.

Gleichzeitige Isolierung von hochwertigen Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten aus einem erwachsenen Rattenherz

Hier stellen wir eine Methode zur Untersuchung der Neuritenmorphogenese in postnatalen Maus-Netzhautexplantationen mittels konfokaler Zeitraffinalmikroskopie vor. Wir beschreiben einen Ansatz zur spärlichen Markierung und Erfassung von retinalen Zelltypen und deren Feinprozessen unter Verwendung rekombinanter adenoassoziierter Virusvektoren, die membrangerichtete fluoreszierende Proteine in einer Cre-abhängigen Weise exprimieren.

Zeitraffer-Bildgebung neuronaler Arborisation mittels spärlicher adenoassoziierter Virusmarkierung genetisch zielgerichteter Netzhautzellpopulationen

Es wird eine Reihe von Protokollen vorgestellt, die die Messung der kontraktilen Funktion mittels Sarkomerlängendetektion zusammen mit der transienten Messung von Kalzium (Ca2+) in isolierten Rattenmyozyten beschreiben. Die Anwendung dieses Ansatzes für Studien in Tiermodellen der Herzinsuffizienz ist ebenfalls enthalten.

Analyse der kardialen kontraktilen Dysfunktion und Ca2+ Transienten in Nagetiermyozyten

Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Transgenexpression in Ratten- und Mausherzen durch direkte intramyokardiale Injektion des Virus unter echokardiographischer Leitung. Methoden zur Beurteilung der Anfälligkeit des Herzens für ventrikuläre Arrhythmien durch die programmierte elektrische Stimulation isolierter, Langendorff-durchbluteter Herzen werden hier ebenfalls erläutert.

Virale Transgenexpression in Nagetierherzen und die Bewertung des Risikos für Herzrhythmusstörungen

Erfahren Sie Live-Cell-Imaging von primären Ratten-Kardiomyozyten nach lentiviraler und adenoviraler Transduktion mittels konfokaler Spinning-Disk-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Beobachtung zellulärer Dynamiken und Proteinverteilungen in lebenden Herzzellen.

Live Cell Imaging von primären Ratten-Kardiomyozyten Neonatal Nach Adenovirale und Lentivirale Transduktion mittels konfokaler Mikroskopie Spinning-Disk- (Video) | JoVE Journal

Live Cell Imaging von primären Ratten-Kardiomyozyten Neonatal Nach Adenovirale und Lentivirale Transduktion mittels konfokaler Mikroskopie Spinning-Disk-

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