Transplantation von Pulmonalklappe Mit einem Maus-Modell der heterotopen Herztransplantation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der Neubildung von Gewebe, der Verdickung der Herzklappe und der Entwicklung einer Stenose in einer gewebeengineeringbasierten Herzklappe zugrunde liegen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Lungenherzkappe aus dem Herzzellgewebe eines Spendermäuses entnommen wird. Im zweiten Schritt wird das gesamte Herz von einem zweiten Spender entnommen.

Die spendende pulmonale Herzklappe wird anschließend in das Spenderherz implantiert, und das Herz mit der neuen Herzklappe wird heterotop in eine empfängende Maus transplantiert. Letztendlich kann die Funktion des transplantierten Herzens sowie der Blutfluss durch die Pulmonalklappe mittels eines Hochfrequenz-Ultraschallsystems im Pulswellen-Doppler-Modus überwacht werden. Der Hauptvorteil der Verwendung des Mausmodells gegenüber anderen großen Tiermodellen liegt darin, dass das murine Modell die Nutzung einer breiten Palette molekularer Reagenzien ermöglicht, die es uns erlauben, die zellulären und molekularen Mechanismen, die der Bildung von vaskulärem Neogewebe bei der Entwicklung von Stenosen und gewebetechnisch hergestellten Herzklappen zugrunde liegen, zu untersuchen. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund der Komplexität der Überlebens-Mikrochirurgie Schwierigkeiten.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die korrekte Durchführung der Anastomosierung an den Transplantationsstellen schwer zu erlernen ist und da es schwierig ist, die Anastomosierung an Gefäßen mit kleinem Durchmesser ohne Blutung durchzuführen. Um die Spender-Lungenklappe zu entnehmen, klemmen Sie zunächst den Brustbereich einer sechs bis acht Wochen alten weiblichen Spendertiermaus der Linie C57BL/6 und positionieren die Maus in dorsaler Rückenlage. Nach Eröffnung des Thorax freilegen Sie das Herz, führen einen kleinen Schnitt am rechten Vorhof durch und spülen den linken Ventrikel mit eiskalter Kochsalzlösung aus. Danach dissezieren Sie die Lungenarterie stumpf von der Aorta ascendens ab und schneiden die Lungenklappe zusammen mit einem zwei Millimeter langen Abschnitt der Lungenarterie aus. Lagern Sie die Lungenklappe anschließend bis zu zwei Stunden vor der Transplantation in einer kalten Lösung aus Heparin und Kochsalzlösung, bis die Spenderherz entnommen wird.

Nach Durchführung einer Thorakotomie an einer euthanasierten weiblichen Spendertiermaus im Alter von sechs bis acht Wochen, einer C57BL/6-Maus, wie zuvor grob demonstriert, trennen Sie das Herz, die Vena cava inferior, die Vena cava superior, die Aorta ascendens, die Pulmonalarterie und die Lungenvene ab. Spülen Sie die Vena cava inferior mit eiskaltem, sterilen Kochsalzlösung aus und ligieren Sie anschließend die Vena cava inferior, die Vena cava superior und die Lungenvene mit einer 6,0 Seidennaht. Schneiden Sie dann oberhalb der Ligaturen ab, die Aorta und die Pulmonalarterie mit einem zwei Millimeter breiten Saum und entfernen Sie die Pulmonalklappe, um die pulmonale Herzklappe auf das Spenderherz zu transplantieren. Legen Sie zunächst die Klappe in das Spenderherz ein und orientieren Sie das Gewebe.

Verwenden Sie anschließend 10-0-Monofileinheften auf konischen Nadeln, um eine Naht auf der rechten Seite der Klappe anzubringen, um diese zu fixieren. Bringen Sie danach fünf bis sechs kontinuierliche Nähte entlang der anderen Seite der Lungenklappe an. Nachdem die vordere Seite der Klappe versorgt ist, drehen Sie das Herz horizontal und nähen Sie die Rückseite der Lungenklappe an das Spenderherz.

Dann ligieren Sie die Lungenvene des Spenderherzens und entnehmen das Herz. Anschließend wird das Herz bis zu zwei Stunden vor der Implantation in eine kalte Heparin-Salzlösung gelegt. Überprüfen Sie nun die Sedierung einer sechs bis acht Wochen alten weiblichen Empfängermaus der C57BL/6-Linie durch Zehenquetschung.

Und danach, nachdem das Bauchhaar abgeschnitten und die Augen mit steriler Augensalbe bestrichen wurden, das Tier in Rückenlage positionieren, den Bauch mit Betadine- und Alkoholtüchern desinfizieren und die Maus mit einem sterilen Tuch abdecken, wobei nur der Schnittbereich freiliegt. Anschließend einen medianen Laparotomieschnitt von unterhalb des Schwertfortsatzes bis in den über dem Schambein liegenden Bereich durchführen. Danach einen selbsthaltenden Retraktor einsetzen und die Därme in mit Kochsalzlösung angefeuchteter Gaze einwickeln.

Definieren Sie grob die infrarenale Aorta und die Vena cava. Legen Sie anschließend zwei Seidenligaturen (6-0) an, um die Aorta und die untere Vena cava proximal und distal zu umschließen und abzubinden. Um die Durchblutung zu unterbinden, verwenden Sie eine 30-G-Nadel, um eine Aortotomie in der Bauchaorta und eine Venotomie in der unteren Vena cava anzulegen.

Erweitern Sie die Öffnung mit der Schere auf die Größe der Spender-Aorta und des Arteria-pulmonalis. Legen Sie das Spenderherz auf die rechte Seite der Aorta abdominalis und bedecken Sie es mit feuchter steriler Gaze, die Sie weiterhin feucht halten. Sichern Sie die Spender-Aorta mit einem Stich am proximalen Ende der Öffnung in der Aorta abdominalis und setzen Sie anschließend vier bis fünf kontinuierliche Nähte vom distalen Ende der Aorta abdominalis aus.

Drehen Sie das Herz auf die linke Seite. Bedecken Sie es mit in Kochsalzlösung getränkter Gaze und nähen Sie das distale Ende der Bauchaorta mit vier bis fünf weiteren fortlaufenden Nähten zu. Sichern Sie die Spender-Lungenarterie mit einer Naht am proximalen Ende der Öffnung in der unteren Hohlvene und setzen Sie anschließend vier bis fünf fortlaufende Nähte vom distalen Ende der unteren Hohlvene aus.

Anschließend spülen Sie den Lumen der unteren Hohlvene CVA mit Heparin und Kochsalzlösung aus. Schließen Sie die rechte Wand der Spender-Lungenarterie und der Empfänger-unteren Hohlvene CVA mit kontinuierlichen Nähten am distalen Ende. Entfernen Sie nun die distale Ligatur und tragen Sie ein topisch resorbierbares steriles Hämostyptikum auf, um die Blutung zu kontrollieren.

Wenn die Blutung vollständig gestoppt ist, entfernen Sie die proximale Naht und kontrollieren Sie die zweite Blutung auf dieselbe Weise; das transplantierte Herz wird innerhalb von fünf Minuten nach erfolgreicher Anastomose zu schlagen beginnen. Danach bringen Sie die Därme zurück und schließen Sie die Bauchmuskulatur und die Haut in zwei Schichten mit sechs Einzelknopfnähten. Schließlich injizieren Sie subkutan 0,5 Milliliter physiologische Kochsalzlösung und stellen die Maus in einen Erholungskäfig auf eine Wärmematte, bis das Tier vollständig beweglich ist.

Nach der Erholung das Tier allein in einem neuen Käfig mit Papierunterlage unterbringen und Schmerzmittel verabreichen. Trinkwasser für 48 Stunden bereitstellen. In diesen Bildern ist das implantierte Herz im Bauchraum direkt nach der Herztransplantation sowie fünf Minuten nach der Transplantation dargestellt.

Nach dem Entfernen der Nähte an beiden Seiten der Aorta und der unteren Hohlvene beginnt das Herz innerhalb von ein bis zwei Minuten zu schlagen und nimmt eine hellere Färbung an, während das Blut zirkulieren beginnt. Achten Sie auf die stärkere Dilatation des rechten Vorhofs. Während sich der Herzschlag allmählich verstärkt und nach 24 Stunden stabilisiert, kann der Blutfluss durch die implantierte Pulmalklappe 10 Tage nach der Implantation perkutan gemessen werden.

Mithilfe eines Ultraschallsystems mit hoher Frequenz und pulswellenartigem Doppler-Modus können die Positionen der Aorta, des rechten Ventrikels, der implantierten Pulmonalklappe und der Pulmonalarterie im B-Modus beobachtet werden. Das gelbe Messvolumen-Overlay befindet sich an der implantierten Pulmonalklappe, wie in der schematischen Darstellung veranschaulicht. Wie im Diagramm dargestellt, wird die QRS-Welle des Spenderherzens rhythmisch und unabhängig von der Welle des Empfängerherzens erfasst, mit einer Spitzengeschwindigkeit von etwa 100 Millimetern pro Sekunde.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, jegliche Blutung an der Transplantationsstelle der Pulmonalventil oder an einer Osmose zwischen der Spender-Aorta und der abdominalen Aorta des Empfängers nach diesem Eingriff vollständig zu stoppen. Andere Methoden, wie beispielsweise die Transplantation von gewebetechnisch hergestellten Herzklappen an transgenen Mäusen, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen bezüglich der Herkunft der Zellen, die die erkrankte Herzklappe besiedeln, zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür entwickelt haben, wie man die pulmonale Herzklappe gewinnt, wie man einen Herzklappenersatz und eine heterotopische Herztransplantation in einem Mausmodell durchführt.