Expression von rekombinanten Cellulase aus Cel5A Trichoderma reesei In Tabakpflanzen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Zielproteine transient im Tabak zu exprimieren, um in kurzer Zeit eine Vorstellung von der Machbarkeit der Expression pflanzlicher Enzyme zu erhalten. Diese vorübergehende Expression wird durch Infiltration von Tabakblättern mit einem Stamm von Agrobacterium tumor fain erreicht, der in einem zweiten Schritt einen Vektor enthält, der das interessierende Gen enthält. Nach der Inkubation werden infiltrierte Pflanzenblätter geerntet und Proteinextrakte teilweise gereinigt, um eine funktionierende Enzymlösung zu erhalten. Anschließend wird eine Proteinanalyse durchgeführt, um die Auswirkungen der pflanzlichen Expression auf das Enzym zu beurteilen und seine enzymatische Aktivität zu überprüfen.

Es werden Ergebnisse erhalten, die die Proteingröße, mögliche Glykosylierungseffekte und enzymatische Aktivität auf der Grundlage von Western Blotting, zy und Substratabbau-Assays zeigen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zur Umwandlung von pflanzlicher Biomasse zu beantworten und kann auch Einblicke in die Aktivität von Enzymen geben, nachdem sie vorübergehend in Tabak exprimiert wurden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Infiltrationsschritte schwer zu erlernen sind, da die Blätter leicht durch die Spritzen-Herger-Kleidung beschädigt werden können, und ich werde die Experimente unter sterilen Bedingungen durchführen.

Einzelne Kolonien von Agrobacterium toan werden in einen Erlenmeyerkolben mit 10 Millilitern überführt. Hefeextraktbrühe mit Antibiotika. Dann die geimpfte Brühe 36 bis 40 Stunden lang bei 26 Grad Celsius mit 180 U/min inkubieren, anschließend 200 Mikroliter jeder Kultur in 20 Milliliter Hefeextraktbrühe mit den gleichen Antibiotika wie zuvor impfen und nach 36 bis 40 Stunden unter den gleichen Bedingungen inkubieren.

Induzieren Sie die Kulturen mit zwei Mikrolitern Acetophenon, 100 Mikrolitern 40%iger Glukoselösung und 200 Mikrolitern einem molaren MES-Puffer bei pH 5,6 und inkubieren Sie über Nacht weiter. Nehmen Sie nun die Pflanzen aus dem Gewächshaus und schneiden Sie mit einer Pipettenspitze die axiale AB-Seite des dritten bis fünften Blattes von der Spitze der Pflanze ab, um das Infiltrieren zu erleichtern. Füllen Sie dann eine Spritze mit Infiltrationsmedium und legen Sie diese auf eine der zuvor gemachten Kerben.

Stützen Sie die Spritze mit einem Finger auf der Axio-Blattseite ab und injizieren Sie das Medium vorsichtig in die intravenöse Blattzone. Um die Fluoreszenz in den Blattabschnitten zu visualisieren, die TR-Zelle exprimiert 5:00 AM Kirschglanz, verwenden die Pflanzen eine tragbare Lichtquelle, die grünes Licht ausstrahlt. Wenn sie durch einen roten Filter betrachtet wird, ist die Fluoreszenz von der Kirsche der TR-Zelle um 5:00 Uhr deutlich sichtbar.

Um die exprimierten Proteine zu extrahieren, wählen Sie Tabakblätter aus, die mit AUM infiltriert wurden, das P enthält, verfolgen Sie die ERTR-Zelle fünf A und schneiden Sie sie in ein Gramm große Stücke. Legen Sie sie anschließend in einen vorgekühlten Mörtel und fügen Sie den Proben eine angemessene Menge flüssigen Stickstoff hinzu. Mahlen Sie die Blätter mit einem Stößel zu Pulver.

Wiederholen Sie den Vorgang mit nicht infiltrierten Tabakblättern, um Kontrollproben zu erhalten. Geben Sie dann zwei Milliliter PBS, das ein millimolares Phenylmethyl-Suen-Fluorid enthält, zum gemahlenen Blattmaterial und mischen Sie, bis der Großteil des Blattmaterials in Suspension ist. Zentrifugieren Sie den Extrakt bei 15.000 GS für 20 Minuten bei vier Grad Celsius.

Entsorgen Sie dann das Pellet, das teilweise gereinigte TR-Zelle fünf A, indem Sie das S-Natin enthaltende Protein 10 Minuten lang bei 55 Grad Celsius inkubieren und weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen. Dann zentrifugieren Sie ein SNAT bei 15.000 GS für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie das Pellet und verwenden Sie das proteinhaltige Snat für alle.

Weitere Untersuchungsergebnisse. Führen Sie auch den Teilreinigungsprozess für nicht infiltrierte Pflanzen durch, um Kontrollproben zu erhalten. Bei diesem Verfahren Ethylcellulose und Wasser zu einer 1,5%igen Lösung mischen und unter Rühren inkubieren, bis sie sich aufgelöst hat.

Um A-C-M-C-S-D-S Seitengel herzustellen, ersetzen Sie einen Milliliter 1,5 %CMC durch einen Milliliter Wasser in einer 10 Milliliter SDS-Seitengel-Mischlösung und gießen Sie das Gel normal als nächstes ein, denaturieren Sie die Proben, indem Sie sie in Gegenwart von SDS kochen. Führen Sie die Elektrophorese bei 200 Volt für 50 Minuten durch, bis die Farbstofffront den Boden des Gels erreicht. Führen Sie nun eine Gelprotein-Rückfaltung auf dem Punkt 15%C-M-C-S-D-S Seitengel durch.

Unter Verwendung von 1,5 % Beta-Cyclodextrin in 20 Millimolarem Phosphatcitratpuffer bei einem pH-Wert von 6,5. Inkubieren Sie das Gel in dieser Lösung bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln für 15 Minuten. Verwerfen Sie die Beta-Cyclodextrin-Lösung und waschen Sie das Gel kurz mit Wasser, das bei Raumtemperatur in 50 Millimolar Natriumacetat-Puffer bei pH 4,8 für weitere 15 Minuten inkubiert wurde.

Führen Sie dann CMC zy mit dem 15%igen 15%-C-M-C-S-D-S-S-Seitengel durch, indem Sie das Gel 20 Minuten lang bei 50 Grad Celsius in 30 Millimolar Natriumacetatpuffer inkubieren. Um zu visualisieren, wo das CMC abgebaut wurde, färben Sie das Gel 10 Minuten lang mit einer 0,1%igen kongoroten Lösung und halten Sie es 30 Minuten lang mit einem molaren Natriumchlorid zurück oder waschen Sie das Gel mit 0,3%iger Essigsäure, bis am Ende klare Banden zu sehen sind. Für eine klarere Bildgebung unmittelbar vor der Durchführung des Assays bereiten Sie eine Pipette mit vier MUC und zwei X Arbeitslösung vor, 100 Mikroliter mit vier MUC Arbeitslösung in separate Vertiefungen einer 96-Well-Platte.

Geben Sie dann 100 Mikroliter jeder Probe in die entsprechenden Vertiefungen und führen Sie jede Probe in dreifacher Ausfertigung mit einer Anregungswellenlänge von 360 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 465 Nanometern durch. Bestimmen Sie den Null-Minuten-Zeitpunkt von vier mu Fluoreszenz durch Fluoreszenzspektroskopie. Inkubieren Sie anschließend die mit Klebedeckeln abgedeckten Platten 20 Minuten lang bei 50 Grad Celsius.

Stoppen Sie anschließend die Reaktion durch Einfrieren. Messen Sie danach die Endpunkt-mu-Fluoreszenz mit den gleichen Parametern wie für den Null-Minuten-Zeitpunkt. Subtrahieren Sie den Fluoreszenzwert bei null Minute vom Fluoreszenzwert bei 20 Minuten, um die durch die enzymatische Aktivität verursachte Änderung der Fluoreszenz unmittelbar vor der Durchführung des Assays zu bestimmen.

Bereiten Sie die A-O-C-M-C two X Arbeitslösung vor. Kombinieren Sie dann 50 Mikroliter der Probe und 50 Mikroliter der Arbeitslösung in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen. Inkubieren Sie die Proben anschließend 20 Minuten lang bei 50 Grad Celsius.

Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 250 Mikrolitern Fällungslösung. Anschließend wird jede Probe 10 Sekunden lang kräftig vortext, um eine vollständige Vermischung der Probe mit der Fällungslösung zu gewährleisten. Dann inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei Raumtemperatur und wirbeln Sie sie erneut, bevor Sie sie 10 Minuten lang bei 1000 g zentrifugieren.

Übertragen Sie danach 200 Mikroliter des SNAT aus jeder Probe auf eine 96-Well-Platte, ohne zu stören. Die enzymatische Aktivität des Pellets zeigt sich in einem höheren Gehalt an solubilisiertem Farbstoff. Messen Sie dies mittels Absorptionsspektroskopie bei einer Wellenlänge von 590 Nanometern.

In diesem Schritt. Legen Sie Kreise aus Filterpapier in 1,5- oder zwei Milliliter-Röhrchen. Geben Sie 100 Mikroliter 60 millimolares Natriumacetat und 100 Mikroliter Proben in die Filterpapierkreise und inkubieren Sie 20 Stunden lang bei 50 Grad Celsius und 300 U/min Schütteln.

Darüber hinaus werden die einzelnen Proben unmittelbar vor der Durchführung des Assays ohne Filterpapier als Kontrollen inkubiert. Bereiten Sie eine 1,5 x PABA-Arbeitslösung vor, die einen Milliliter PBA-Lösung A und neun Milliliter PABA-Lösung enthält, die bis zur Verwendung auf Eis B.Store. Bereiten Sie anschließend die Proben in thermostabilen 0,5-Milliliter-Röhrchen vor.

Die Proben bestehen aus 45 Mikrolitern Wasser, fünf Mikrolitern jeder mit Filterpapier inkubierten Lösung und 100 Mikrolitern PABA-Arbeitslösung. Führen Sie danach die Stichprobenkontrollen und fünf Standards aus, die auf die gleiche Weise vorbereitet wurden. Anschließend werden die Proben, Kontrollen und Standards genau 10 Minuten bei 100 Grad Celsius inkubiert und weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur abgekühlt.

Pipettieren Sie 100 Mikroliter der Lösung in eine 96-Well-Platte, einen Assay mit einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 410 Nanometern. Subtrahieren Sie die Kontrollwerte der einzelnen Proben von den Probenwerten des Filterpapiers, um die Menge des freigesetzten reduzierenden Zuckers zu bestimmen. Hier ist ein Bild, das sowohl die Expressionskassetten als auch die Proteinexpression in Tabakpflanzen zeigt.

So erscheint ein infiltriertes Tabakblatt unter normalem Licht und unter grünem Licht mit einem roten Filter, wobei die Expression der TR-Zelle 5:00 AM Kirsche, die durch die rote Farbe angezeigt wird, hier deutlich sichtbar ist. Die SDS-Seite Gel Western Lot und CMC zy zeigen die Größe und Aktivität der T-Zelle fünf A. Die gesamten löslichen Proteine wurden getrennt und wir können sie mit Kumasi-Blau-Färbung visualisieren. Western-Blotting gegen die Hist-Tag-Region von T-Zelle fünf A bestätigt die Proteingröße und zusätzlich wird die Cellulase-Aktivität gegen CMC durch ein mit Kongorot gefärbtes Xenotransplantat gezeigt. Was hier zu sehen ist, sind die gesamten löslichen Proteine aus den Blättern der Tabakpflanze, wobei die TR-Zelle fünf A vor und nach der thermischen Fällungsreinigung vorübergehend exprimiert wurde, wobei die TR-Zelle fünf A die größte sichtbare Bande darstellt und auch in der westlichen Charge und dem CMCs-igraph sichtbar ist.

Wir sehen auch die gesamten löslichen Proteine aus Tabakpflanzen, bei denen Tcell fünf A nicht nach thermischer Fällung auftrat, und die Proteine aus einer kommerziell erhältlichen Mischung von Tresa-Cellulase. Diese Abbildung zeigt die Quantifizierung der Enzymaktivität der TR-Zelle fünf A Die TR-Zelle fünf A wurde mit vier MUC Azo CMC oder Filterpapier inkubiert, und der Substratabbau wurde durch die Freisetzung des Fluors vier vier mu des Azofarbstoffs oder durch Quantifizierung der reduzierenden Zucker aus der Farbänderung von PBA gemessen. Nach diesem Verfahren wurde das Verfahren durchgeführt. Andere Methoden wie Protein-Targeting können verwendet werden, um zusätzliche Informationen darüber zu erhalten, wie die Proteinlokalisierung die Stabilität und Aktivität des Enzyms beeinflussen kann.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie nun ein klares Verständnis davon haben, wie man Proteine vorübergehend in Tabak exprimiert, sowie einige gute Kenntnisse darüber, wie man die enzymatische Aktivität bewertet. Umwandlung von Foro-Zellulose-Biomasse.