Expression von rekombinanten Cellulase aus Cel5A

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Zielproteine vorübergehend in Tabakpflanzen zu exprimieren, um innerhalb kurzer Zeit einen Eindruck von der Durchführbarkeit einer pflanzenbasierten Enzymexpression zu erhalten. Diese transiente Expression wird erreicht, indem Tabakblätter mit einem Stamm von Agrobacterium tumefaciens infiltriert werden, der als zweiten Schritt einen Vektor enthält, in den das Gen von Interesse eingebaut ist. Nach der Inkubation werden die infiltrierten Pflanzenblätter geerntet und die Proteinextrakte teilweise gereinigt, um eine funktionsfähige Enzymlösung zu erhalten. Anschließend erfolgt eine Proteinanalyse, um die Auswirkungen der pflanzenbasierten Expression auf das Enzym zu bewerten und seine enzymatische Aktivität zu bestätigen.

Es werden Ergebnisse erhalten, die die Proteingröße, mögliche Glykosylierungseffekte und enzymatische Aktivität anhand von Western Blotting-, Zymogramm- und Substratabbau-Assays zeigen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur pflanzlichen Biomasseumwandlung zu beantworten, und bietet zudem Einblicke in die Aktivität von Enzymen nach transienter Expression in Tabak. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Infiltrationsschritte aufgrund der leichten Beschädigbarkeit der Blätter durch die Spritze und Handschuhe schwer zu erlernen sind, und ich werde die Experimente unter sterilen Bedingungen durchführen.

Überführen Sie einzelne Agrobacterium-Kolonien in einen Erlenmeyerkolben mit 10 Milliliter Hefeextraktbrühe mit Antibiotika. Inkubieren Sie die beimpfte Brühe anschließend 36 bis 40 Stunden bei 26 Grad Celsius mit Schütteln bei 180 U/min. Impfen Sie danach jeweils 200 Mikroliter jeder Kultur in 20 Milliliter Hefeextraktbrühe mit denselben Antibiotika wie zuvor und inkubieren Sie unter denselben Bedingungen weitere 36 bis 40 Stunden.

Befruchten Sie die Kulturen mit zwei Mikrolitern Acetophenon, 100 Mikrolitern einer 40 %igen Glucoselösung und 200 Mikrolitern eines einmolaren MES-Puffers bei pH 5,6 und inkubieren Sie über Nacht weiter. Entnehmen Sie nun die Pflanzen aus dem Gewächshaus und verwenden Sie eine Pipettenspitze, um die abaxiale Seite des dritten bis fünften Blattes von der Pflanzenspitze aus einzukerben, um die Infiltration zu erleichtern. Füllen Sie dann eine Spritze mit Infiltrationsmedium und setzen Sie sie auf eine der zuvor angebrachten Kerben auf.

Stützen Sie die Spritze mit einem Finger auf der Seite des Axio-Blattes ab und injizieren Sie das Medium vorsichtig in die intravenöse Blattzone. Um die Fluoreszenz in den Blattabschnitten, die TR-Zelle 5:00 Uhr Kirsche exprimieren, sichtbar zu machen, beleuchten Sie die Pflanzen mit einer tragbaren Lichtquelle, die grünes Licht emittiert. Durch einen roten Filter betrachtet, wird die Fluoreszenz der TR-Zelle 5:00 Uhr Kirsche deutlich sichtbar sein.

Um die exprimierten Proteine zu extrahieren, wählen Sie Tabakblätter aus, die mit AUM, das P track ERTR Zelle fünf A enthält, infiltriert wurden, und schneiden Sie sie in Stücke zu je einem Gramm. Geben Sie diese anschließend in einen vorgekühlten Mörser und fügen Sie eine geeignete Menge flüssigen Stickstoffs zu den Proben hinzu. Zerkleinern Sie die Blätter mit einem Pistill zu einem Pulver.

Wiederholen Sie den Vorgang mit nicht infiltrierten Tabakblättern, um Kontrollproben zu erhalten. Geben Sie anschließend zwei Milliliter PBS, die ein Millimolar Phenylmethylsulfonylfluorid enthalten, zu dem zerkleinerten Blattmaterial hinzu und mischen Sie, bis der größte Teil des Blattmaterials in Suspension ist. Zentrifugieren Sie das Extrakt bei 15.000 ×g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius.

Entfernen Sie dann das Pellet und partiell gereinigte TR-Zelle fünf A, indem Sie das proteinhaltige S-Natin 10 Minuten lang bei 55 Grad Celsius inkubieren und anschließend weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen. Zentrifugieren Sie danach das SNAT 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 15.000 ×g. Entfernen Sie das Pellet und verwenden Sie das proteinhaltige SNAT für alle weiteren Schritte.

Weitere Assays. Führen Sie außerdem den partiellen Reinigungsprozess für nicht infiltrierte Pflanzen durch, um Kontrollproben zu erhalten. Mischen Sie in diesem Verfahren Ethylcellulose und Wasser, um eine 1,5%-ige Lösung zu erhalten, und inkubieren Sie unter Rühren, bis sie gelöst ist.

Um ein A-C-M-C-S-D-S-Seiten-Gel herzustellen, ersetzen Sie ein Milliliter einer 1,5 %igen CMC-Lösung durch ein Milliliter Wasser in einer 10-Milliliter-SDS-Seiten-Gel-Mischlösung und gießen Sie das Gel normal. Denaturieren Sie anschließend die Proben, indem Sie sie in Gegenwart von SDS kochen. Führen Sie die Elektrophorese 50 Minuten lang bei 200 Volt durch, bis die Farbstofffront das untere Ende des Gels erreicht hat. Führen Sie nun die Proteinfaltung direkt im Gel auf dem 0,15%-C-M-C-S-D-S-Seiten-Gel durch.

Verwenden Sie 1,5 % Beta-Cyclodextrin in 20 Millimolar Phosphat-Citrat-Puffer bei pH 6,5. Inkubieren Sie das Gel in dieser Lösung bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln für 15 Minuten. Entsorgen Sie die Beta-Cyclodextrin-Lösung und waschen Sie das Gel kurz mit Wasser, anschließend inkubieren Sie es bei Raumtemperatur in 50 Millimolar Natriumacetat-Puffer bei pH 4,8 für weitere 15 Minuten.

Danach CMC-Zy durchführen, indem das gefaltete 15 % C-M-C-S-D-S-PAGE-Gel durch Inkubation im 30 Millimolar Natriumacetatpuffer für 20 Minuten bei 50 Grad Celsius behandelt wird. Um sichtbar zu machen, wo das CMC abgebaut wurde, das Gel 10 Minuten lang mit einer 0,1 %igen Congo-rot-Lösung anfärben und anschließend mit einer einmolarigen Natriumchloridlösung für 30 Minuten entfärben oder bis klare Banden sichtbar sind; am Ende das Gel mit 0,3 %iger Essigsäure waschen. Für eine klarere Bildgebung unmittelbar vor Durchführung des Assays eine vier MUC zwei X Arbeitslösung herstellen und 100 Mikroliter der vier MUC-Arbeitslösung in separate Vertiefungen einer 96-Loch-Platte pipettieren.

Anschießend 100 Mikroliter jeder Probe in die entsprechenden Vertiefungen geben, wobei jede Probe im Dreifachansatz durchgeführt wird, unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 360 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 465 Nanometern. Den Zeitpunkt von null Minuten der vier µ-Fluoreszenz mittels Fluoreszenzspektroskopie bestimmen. Danach die Platten, die mit haftenden Deckeln abgedeckt sind, 20 Minuten lang bei 50 Grad Celsius inkubieren.

Stoppen Sie anschließend die Reaktion durch Einfrieren. Danach messen Sie die Endpunkt-Mu-Fluoreszenz unter Verwendung der gleichen Parameter wie für den Zeitpunkt null Minuten. Subtrahieren Sie den Fluoreszenzwert zur Zeit null Minuten vom Fluoreszenzwert nach 20 Minuten, um die Änderung der Fluoreszenz zu ermitteln, die durch die enzymatische Aktivität unmittelbar vor der Durchführung des Assays verursacht wurde.

Bereiten Sie die A-O-C-M-C-Zwei-X-Arbeitslösung vor. Anschließend mischen Sie 50 Mikroliter der Probe mit 50 Mikrolitern der Arbeitslösung in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen. Inkubieren Sie danach die Proben 20 Minuten lang bei 50 Grad Celsius.

Beenden Sie die Reaktion durch Zugabe von 250 Mikrolitern Präzipitationslösung. Anschließend werden die Proben jeweils kräftig 10 Sekunden lang verwirbelt, um eine vollständige Vermischung mit der Präzipitationslösung sicherzustellen. Danach werden die Proben 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und erneut verwirbelt, bevor sie 10 Minuten lang bei 1000 Gs zentrifugiert werden.

Anschließend 200 Mikroliter des SNAT von jeder Probe vorsichtig in eine 96-Well-Platte überführen, ohne den Pellet zu stören. Die enzymatische Aktivität des Pellets zeigt sich durch höhere Konzentrationen des gelösten Farbstoffs. Messen Sie dies mittels Absorptionsspektroskopie bei einer Wellenlänge von 590 Nanometern.

In diesem Schritt Filterpapierkreise in 1,5-ml- oder 2-ml-Röhrchen geben. 100 µl einer 60 mM Natriumacetat-Lösung und 100 µl der Proben zu den Filterpapierkreisen hinzufügen und 20 Stunden bei 50 °C unter Schütteln mit 300 U/min inkubieren.

Des Weiteren inkubieren Sie die einzelnen Proben unverzüglich vor der Durchführung des Assays als Kontrollen ohne Filterpapier. Bereiten Sie eine 1,5-fache PABA-Arbeitslösung vor, die ein Milliliter PBA-Lösung A und neun Milliliter PABA-Lösung B enthält. Lagern Sie die Lösung bis zur Verwendung auf Eis. Bereiten Sie anschließend die Proben in 0,5-Milliliter-thermostabilen Röhrchen vor.

Die Proben bestehen aus 45 Mikrolitern Wasser, fünf Mikrolitern jeder mit Filterpapier inkubierten Lösung und 100 Mikrolitern der PABA-Arbeitslösung. Danach werden die Probenkontrollen sowie fünf auf die gleiche Weise hergestellte Standards durchgeführt. Anschließend werden die Proben, Kontrollen und Standards genau 10 Minuten bei 100 Grad Celsius inkubiert und danach weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur abgekühlt.

Pipettieren Sie 100 Mikroliter der Lösung in eine 96-Well-Platte und führen Sie einen Assay mit einem Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 410 Nanometern durch. Subtrahieren Sie die Werte der individuellen Probenkontrollen von den Werten der Filterpapierproben, um die Menge an freigesetzten reduzierenden Zuckern zu bestimmen. Hier sehen Sie ein Bild, das die Expressionskassetten sowie die Proteinexpression in Tabakpflanzen zeigt.

So sieht ein infiltriertes Tabakblatt unter normalem Licht und unter grünem Licht mit einem roten Filter aus, wobei die Expression von TR-Zelle 5:00 Uhr Kirsche, die durch die rote Farbe angezeigt wird, hier deutlich sichtbar ist. Das SDS-Page-Gel, der Western-Blot und die CMC-Zymogramm-Analyse zeigen die Größe und Aktivität der T-Zelle fünf A. Die gesamten löslichen Proteine wurden getrennt, und wir können sie mittels Kumasisierblau-Färbung sichtbar machen. Die Western-Blot-Analyse gegen die His-Tag-Region von T-Zelle fünf A bestätigt die Proteingröße, und zusätzlich wird die Cellulase-Aktivität gegenüber CMC durch ein Zymogramm gezeigt, das mit Congo-Rot gefärbt wurde. Was hier zu sehen ist, sind die gesamten löslichen Proteine aus den Blättern der Tabakpflanze, in denen TR-Zelle fünf A vorübergehend exprimiert wurde, vor und nach der thermischen Präzipitationsreinigung, wobei TR-Zelle fünf A das größte sichtbare Band darstellt und ebenfalls im Western-Blot sowie im CMC-Zymogramm sichtbar ist.

Wir sehen außerdem die gesamten löslichen Proteine aus Tabakpflanzen, in denen Tcell fünf A nicht zusätzlich nach thermischer Präzipitation und die Proteine aus einer kommerziell verfügbaren Mischung von Tresa-Cellulase vorhanden war. Diese Abbildung zeigt die Quantifizierung der Enzymaktivität von TR Zelle fünf A. TR Zelle fünf A wurde mit vier MUC Azo CMC oder Filterpapier inkubiert, und der Substratabbau wurde durch die Freisetzung des Fluoro vier vier mu des Azofarbstoffs oder durch die Quantifizierung der reduzierenden Zuckern anhand der Farbänderung von PBA nach diesem Verfahren gemessen. Weitere Methoden wie die Proteinlokalisation können verwendet werden, um zusätzliche Informationen darüber zu erhalten, wie die Proteinlokalisation die Enzymstabilität und -aktivität beeinflussen kann.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie nun ein klares Verständnis dafür haben, wie Proteine vorübergehend in Tabak exprimiert werden können, sowie fundierte Kenntnisse darüber erworben haben, wie man enzymatische Aktivität bewertet. Für die Umwandlung von Cellulose-Biomasse.