Modellierung Schlaganfall bei Mäusen: Permanent Koagulation der distalen A. cerebri media

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine dauerhafte Okklusion der distalen Arteria cerebri media bei einer Maus herbeizuführen, wodurch ein Infarkt entsteht, der hauptsächlich im Kortex liegt und in etwa vergleichbar groß ist mit menschlichen Schlaganfällen. Dies wird erreicht, indem zunächst vor der Operation eine Baseline für die Asymmetrie der Gliedmaßenbenutzung ermittelt wird. Der nächste Schritt des Verfahrens ist die Durchführung der Schlaganfallinduktion durch Elektrokoagulation der distalen Arteria cerebri media.

Nach der Operation werden fokale sensomotorische Defizite durch die Bewertung der Asymmetrie der Vierbeinnutzung getestet. Der letzte Schritt besteht darin, das Infarctvolumen mittels Kristallviolett-Färbung zu analysieren. Letztendlich sind die resultierenden kortikalen Läsionen mäßig groß mit geringer Variabilität, was diese Technik zu einem wertvollen Modell für die grundlegende und translationsorientierte Schlaganforschung macht.

Die Hauptvorteile dieser Technik im Vergleich zu anderen gängigen Schlaganfallmodellen liegen darin, dass die Sterblichkeitsrate bei diesem Modell minimal ist, ebenso wie das Infarktvolumen und die Lokalisation. Der Neokortex stellt die Mehrheit der menschlichen Schlaganfälle dar und ist hochgradig reproduzierbar. Im Allgemeinen fällt es einzelnen Anwendern bei dieser Methode zunächst schwer, die Schädeldecke schonend zu entfernen, um mechanische Läsionen zu minimieren.

Zweitens ist die korrekte Identifizierung und ordnungsgemäße Zuordnung der distalen mittleren Saliararterie für dieses Modell von entscheidender Bedeutung. Zuerst injizieren Sie 30 Minuten vor Beginn der Operation Analgetika. Schalten Sie die Heizdecke für die Maus ein und stellen Sie sie auf 37 Grad Celsius für die Operation ein.

Als Nächstes sicherstellen, dass das Narkosegas, bestehend aus 70 % Stickstoff, 30 % Sauerstoff und Isofluran, bereitsteht. Danach die Maus in einer Induktionskammer 4 % Isofluran aussetzen, bis sie sich nicht mehr bewegt. Anschließend die Maus auf der Wärmematte positionieren und für eine zusätzliche Minute 4 % Isofluran verabreichen.

Nach der Minute ändern Sie die Isofluran-Konzentration auf 1,5 %. Überprüfen Sie nun die ausreichende Anästhesie der Maus mittels Zehenquetschung und tragen Sie andernfalls Dexamethason-Ethanol auf die Augen auf. Beginnen Sie die Operation mit einem ein Zentimeter langen Schnitt zwischen Ohr und Auge. Trennen Sie die Haut und identifizieren Sie den Musculus temporalis.

Stellen Sie nun am Hochfrequenzgenerator die Funktion auf Koagulation, den Modus auf bipolar, die Leistung auf 12 Watt ein und schließen Sie die Pinzette an. Geben Sie am Präparat einen Tropfen Kochsalzlösung auf den freigelegten Musculus temporalis. Trennen Sie anschließend mit der Elektrokauter-Pinzette den Musculus temporalis an seinen apikalen und distalen Anteilen vom Schädel ab.

Das Ergebnis ist eine gelockerte Muskeldecke. Identifizieren Sie nun die mediale zerebrale Arterie oder A. cerebri media (MCA) unterhalb des durchsichtigen Schädels. Sie befindet sich im rostralen Teil des temporalen Bereichs, dorsal zum retroorbitalen Sinus.

Verwenden Sie einen Bohrer, um den Knochen direkt über dieser Arterie so lange zu dünneren, bis er durchlässig ist. Halten Sie den Schädel während des Bohrens mit Kochsalzlösung feucht. Entfernen Sie nun mit sehr feinen Pinzetten vorsichtig den Knochen, um den MCA-Zweig freizulegen.

Stellen Sie den Hochfrequenzgenerator auf sieben Watt ein. Koagulieren Sie nun die Arterie mit der Elektrokoagulationszange, indem Sie sie sanft berühren, ohne sie zu greifen. Koagulieren Sie die Arterie sowohl proximal als auch distal zur Gabelung. Bei einer anatomischen Variante ohne Gabelung der A. cerebri media koagulieren Sie die Arterie so proximal wie möglich an zwei Stellen, die etwa einen Millimeter voneinander entfernt liegen, nach der Koagulation.

Warten Sie 30 Sekunden und berühren Sie dann die Arterie vorsichtig mit stumpfen Pinzetten. Danach bringen Sie den Muskel in seine ursprüngliche Position zurück, die das Bohrloch bedeckt. Nähen Sie die Wunde und legen Sie das Tier in eine Pflegebox bei 32 Grad Celsius, um sich von der Anästhesie zu erholen, und kehren Sie es anschließend in den Käfig zurück.

Im Allgemeinen dauert es fünf bis zehn Minuten, bis sich das Tier von der Anästhesie erholt hat. Der Zylindertest überprüft, ob ein Gliedmaßen bevorzugt wird. Stellen Sie das Tier in einen transparenten Acrylglaszylinder, der von zwei rechtwinklig angeordneten Spiegeln flankiert wird.

Videoaufnahme des Tieres für fünf Minuten gegenüber dem Scheitelpunkt der beiden Spiegel auf der anderen Seite des Zylinders. Nach jedem Versuch den Zylinder und die Tischplatte mit 60 % Ethanol abwischen. Anschließend eine Einzelbildanalyse durchführen.

Werten Sie den Test aus, indem Sie den Kontakt einer der vier Pfoten mit dem Zylinder beim vollständigen Aufstellen zählen, sowie das Landen mit einem der vier Gliedmaßen. Nach einer vollständigen Aufstellbewegung müssen mindestens 20 Kontakte eines der vier Gliedmaßen pro Versuch erzielt werden. Kryoschnitte, jeweils seriell aus dem Gehirn in 20 Mikrometer dicken Schnitten im Abstand von 400 Mikrometern. Sammeln Sie die Schnitte auf Objektträgern zur Lagerung bei minus 20 Grad Celsius.

Mithilfe dieses Schnittprotokolls können alle Schnitte, die den Infarktbereich eines Gehirns abdecken, auf einen Objektträger aufgebracht werden. Färben Sie die Schnitte mit einem standardmäßigen Cresylviolett-Protokoll, um den Bereich des infarzierten Gewebes in jedem Gehirnschnitt sichtbar zu machen. Die Objektträger können anschließend eingedeckt, gescannt und mit der Swanson-Methode zur Ödemanalyse ausgewertet werden.

Die Korrekturmortalität aufgrund der MCA-Okklusionschirurgie lag unter 5 %, hauptsächlich bedingt durch subarachnoidale Blutungen oder eine fehlerhafte Anästhesie. Kein Tier starb während des Beobachtungszeitraums. Für diese Analyse im Hinblick auf die Nutzung von PA wurde die Asymmetrie mittels des Zylindertests nach Schlaganfallinduktion gemessen und mit den Basiswerten vor der MCA-Okklusion verglichen. Eine signifikante Gliedmaßenasymmetrie zeigte sich 24 Stunden nach dem Schlaganfall, die sich innerhalb der ersten Woche nach dem Schlaganfall teilweise erholte, eine Woche nach dem Schlaganfall.

Die Induktion eines Infarkts mit violettem Kamm-Färbung ergab ein durchschnittliches Infarktvolumen von 15,4 Kubikmillimetern, was etwa 12 % einer Gehirnhemisphäre entspricht. Die Standardabweichung dieses Modells ist sehr gering. Außerdem wies die Infarktlokalisation eine minimale Variabilität auf.

Einmal eingerichtet, kann dieser Eingriff bei korrekter Durchführung innerhalb von 10 Minuten abgeschlossen werden. Neben den gezeigten Zylindertests und der Kristallviolett-Färbung können andere etablierte Verhaltensprüfungen und histologische Methoden verwendet werden, um das Ergebnis weiter zu charakterisieren und spezifische Forschungsfragen zu beantworten. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie eine permanente distale MCA-Occlusion bei Mäusen durchgeführt wird.

Wir empfehlen dringend die Verwendung von standardisierten Arbeitsanweisungen und detaillierter Dokumentation, um die Reproduzierbarkeit der Methode sicherzustellen.