Name: Modellierung Schlaganfall bei Mäusen: Permanent Koagulation der distalen A. cerebri media (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Lernen Sie die permanente Koagulation der distalen A. cerebri media bei Mäusen für Schlaganfallforschung. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare kortikale Infarkte mit minimaler Mortalität für translationale Studien.

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Diese Arbeit wurde durch den Exzellenzcluster der Deutschen Forschungsgemeinschaft &quot;Munich Cluster for Systems Neurology (Synergie)&quot; und von der Daimler-Benz-Stiftung, AL finanziert

Ethik-Erklärung Die in diesem Video berichtet Experimente wurden in Übereinstimmung mit den nationalen Richtlinien für den Einsatz von Versuchstieren und der Protokolle wurden von den deutschen Regierungs Ausschüsse (Regierung von Oberbayern, München, Deutschland) zugelassen durchgeführt. 10 Wochen alten, männlichen C57BL/6J-Mäuse werden in dieser Studie verwendet. Die Tiere wurden unter kontrollierter Temperatur (22 ± 2 ° C) untergebracht ist, mit einem 12 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus-Periode und den Zugang zu pelletierten Futter und Wasser ad libitum. Analgesie und Sedierung Protokolle beschrieben wurden von den lokalen Regierungsausschuss genehmigt, aber vielleicht unterscheiden von Protokollen in anderen Laboratorien. 1. Herstellung des Materials und Instrumente <ol><li> Schließen Sie die Heizdecke, um den Arbeitsbereich zu halten warm und die Maus, die Körpertemperatur während der Narkose (37 ° C) zu halten. </li><li> Bereiten autoklaviert Scheren, Pinzetten und Baumwolle, dexpanthEnol-Augensalbe und Nahtmaterial. Bereiten Sie eine Spritze mit Kochsalzlösung (ohne Nadel), um den Arbeitsbereich mit Feuchtigkeit zu halten. Bereiten Sie das Anästhesiegas (70% N 2 O + 30% O 2 + Isofluran). </li><li> Injizieren Analgetika intraperitoneal: Metamizol 200 mg / kg, Carprofen 4 mg / kg und Buprenorphin 0,1 mg / kg. </li><li> Platzieren Sie die Maus in die Induktionskammer mit einem Isofluran Flussrate von 4%, um es zu betäuben, bis spontane Bewegung von Körper und Tasthaare stoppt. </li><li> Übertragen Sie die Maus in Seitenlage mit der Nase in die Narkosemaske und halten Isofluran-Konzentration von 4% für ca. eine Minute, dann reduzieren und es bei ca. 1,5%, geeignete Anästhesie zu halten. </li><li> Bewerben Dexpanthenol Augensalbe auf beiden Augen. </li></ol> 2. Distal MCAO Modell <ol><li> Machen Sie eine 1 cm Hautschnitt zwischen dem Ohr und Auge mit wenig Betrieb Schere nach aseptischen Herstellung der Operationsstelle using Hautdesinfektionsmittel. </li><li> Trennen Sie die Haut und die Lokalisierung der Schläfenmuskel. </li><li> Wählen Sie in der Hochfrequenzgenerator die Gerinnungsfunktion, bipolare Modus 12 W und verbinden Sie die Elektrokoagulation Zange mit dem Kabel. </li><li> Fügen Sie einen Tropfen Kochsalzlösung und benutzen Sie die Zange, um den Schläfenmuskel aus dem Schädel in der apikalen und Rückenteil lösen und dadurch, so dass ein Muskellappen völlig ohne Entfernung des Muskels. </li><li> Identifizieren Sie die MCA unter der transparenten Schädel, im rostralen Teil des Schläfenbereich, dorsal der retro-orbitalen Sinus (Abbildung 2A). Wenn der MCA Bifurkation nicht sichtbar ist (aufgrund einer anatomischen Normvariante) identifizieren das Schiff meisten rostral. </li><li> Fügen Sie etwas Kochsalzlösung auf dem Schädel und dünn aus den Knochen mit dem Bohrer rechts oberhalb der MCA Zweig, bis es eine dünne und durchscheinende Textur (2B) hat. </li><li> Den Knochen vorsichtig zurückziehen über der Arterie mit einem sehr dünnen Pinzette. </li><li> Wählen bipolaren Modus in der Hochfrequenzgenerator 7 W. Coagulate die Arterie mit der Elektrokoagulations Zange proximal und distal zu der Bifurkation (Fig. 2C). Wenn der Bifurkation nicht sichtbar ist aufgrund einer anatomischen Variante, gerinnen die korrekt identifiziert MCA Zweig (siehe oben) an zwei Standorten von rd. 1 mm Abstand. Es ist nicht notwendig, um die Arterie mit der Pinzette zur Koagulation zu erreichen, berührt die Arterie genau mit der Zange auf beiden Seiten von oben ist ausreichend und verursacht weniger mechanische Schäden. </li><li> Warten Sie 30 Sekunden und sanft berühren die Arterie mit einer stumpfen Pinzette für jeden Blutfluss durch spontane Rekanalisation zu überprüfen. Im Falle der Rekanalisation einmal wiederholen Elektrokoagulation. </li><li> Stellen Sie den Schläfenmuskel, um seine Position, für den Bohrloch. </li><li> Naht der Wunde und legen Sie das Tier in einem Pflegefeld bei 32 ° C aus der Narkose zu erholen und wieder in den Käfig. In der Regel dauert es 5-10 min für das Tier vom Anesth erholenESIA. </li><li> Postoperative Analgesie Inject (ip) nach 24 h und dann täglich bis zum fünften postoperativen Tag: Carprofen 4 mg / kg. </li></ol> 3. Sham Betrieb Führen Sie alle identisch zu dem oben beschriebenen Betrieb - auch Ausdünnung des Schädels und ihre Entfernung - bis auf nicht Koagulieren der Arterie freigelegt. 4. Zylinder-Test 13 <ol><li> Legen Sie das Tier in einem transparenten Acrylglaszylinder (Durchmesser: 8 cm, Höhe: 25 cm) vor zwei Spiegel und Video 5 min. Einstellen der Kamera mittig vor den beiden Spiegeln und dem Zylinder, um eine optimale Video (3A) zu erhalten. </li><li> Für die Beurteilung der unabhängigen forelimb Gebrauch Punktzahl (1) Kontakt der Zylinderwand mit einem Vorderbein bei Voll hinten und (2) Landung mit nur einem Vorderbein auf dem Boden nach der vollständigen hinten. Graf mindestens 20 Kontakte für ein Vorderbein mit Zeitlupe oder Bild-für-frame Funktion des Video Lan Client (VLC) Freeware-Software ( <a href="http://www.videolan.org/vlc">http://www.videolan.org/vlc</a> ). </li><li> Für Baseline-Analyse vor der Operation: führen Sie den Test zweimal pro Maus, mit einem 1 Stunde Pause zwischen den Studien. Vorderbein Nutzung wird als Verhältnis der rechts / links-seitig, unabhängig forelimb Verwendung ausgedrückt. </li><li> Nach der Koagulation MCA: zweimal wieder den Test durchführen pro Maus, mit einem 1 Stunde Pause zwischen den Studien wie oben angegeben. </li></ol> 5. Perfusion <ol><li> Betäuben der Tiere (z. B. durch Ketamin und Xylazin 120/16 mg / kg Körpergewicht, jeweils). </li><li> Befestigen Sie das Tier in Rückenlage und öffnen Sie die Bauchhöhle mit einem medianen Schnitt. Rippen und Brustbein entfernen. Machen Sie einen kleinen Schnitt in den rechten Vorhof. Legen Sie eine Perfusionskanüle in der linken Herzkammer und langsam mit 20 ml Kochsalzlösung durchströmen. </li><li> Enthaupten, das Tier, öffnen Sie die Schädeldecke und sanft lösen das Gehirn aus der Schädelbasis. </li><li&gt; Frieren Sie die Gehirne in -40 ° C kaltem Isopentan für 10 min. Danach entfernen Sie die Gehirne von Isopentan und speichern bis zur weiteren Analyse bei -80 ° C </li></ol> 6. Infarktvolumetrie <ol><li> Kryoschneiden: Schneiden Sie die Gehirne seriell auf einem Kryostaten bis 20 um dicke Schnitte jede 400 um auf Folien und Dias lagern bei -20 ° C </li><li> Kresylviolett (CV)-Färbung: <ol><li> Bereiten Sie die Farblösung: Mischen Sie 0,5 g CV-Acetat in 500 ml H 2 O. Rühren und Hitze (60 ° C), bis sich Kristalle gelöst sind. Lassen Sie die Lösung kühl und speichern in einer dunklen Flasche. Aufwärm bis 60 ° C und Filter vor jedem Gebrauch. </li><li> Trocknen der Objektträger bei Raumtemperatur 30 min. Danach legen sie in 95% Ethanol für 15 min und dann in 70% Ethanol für 1 Minute und danach in 50% Ethanol für 1 min. </li><li> Objektträger in destilliertem Wasser für 2 min, aktualisieren destilliertem Wasser und legen Sie sie in 1 min. Danach legen Sie die Folien in Färbelösung (60 ° C) foder 10 Minuten und waschen Sie sie zweimal in destilliertem Wasser für 1 min. </li><li> Objektträger in 95% igem Ethanol für 2 min. Dann legen Sie sie in 100% Ethanol für 5 min, aktualisieren Sie die 100% Ethanol und legen Sie sie in 2 min. Danach decken die Objektträger mit Montagemedium. </li><li> Analyse: Scannen Sie die Folien und analysieren die indirekte Infarktvolumen durch das Verfahren Swanson 14 für Ödeme zu beseitigen: (Ischämische Gebiet) = (Cortex Bereich der kontralateralen Seite) - (Nicht-ischämischen Kortex Bereich der ipsilateralen Seite) (Abbildung 4A). </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

Das vorliegende Protokoll beschreibt die experimentellen Schlaganfallmodell der distalen, permanent MCAO durch transkranielle Elektrokoagulation - die so genannte &quot;Gerinnungsmodell&quot;. Dieses Modell hat sich inzwischen zu einem der am häufigsten verwendeten Tiermodelle in der experimentellen Schlaganfallforschung 12. Im Vergleich zu anderen Brenn Gehirn Ischämie-Modellen, die Gerinnungs Modell wie in diesem Video vorgestellt hat den Vorteil einer sehr kurzen Betriebszeit von ca. 10 min, wenn sie von einem ausgebildeten Wissenschaftler durchgeführt. Daher kann kurze Narkose mal in diesem Modell, das eine günstige Eigenschaft eines experimentellen Schlaganfallmodell ist, weil die Auswirkungen von Anästhetika auf die Neuroprotektion und Schlaganfall Ergebnis ist bekannt, 15 erreicht werden. Außerdem ist, wie zuvor von Carmichael et al. 11 beschrieben, wir bestätigen, daß die resultierende Infarktvolumen und Lokalisierung nach distal Permanent MCA Koagulation entspricht ischämische Hirnläsionen in den meisten menschlichenSchläge im Verhältnis zur Größe des Gehirns. Menschen Schlaganfall ist vor allem klein mit Läsionen von ca. 5-15% der Halbkugel, auf der Grundlage früherer Bevölkerungsstudien und klinische Bildgebung Studien 16-18, im Gegensatz zu den umfangreichen Schlaganfall Läsionen mit Druck Hirnödem, die in weniger als 10% auftreten klinischen streicht 19. Dadurch kann Schlaganfall Läsionen in der MCA-Gebiet von rund 12% des von dem vorgestellten Modell erreicht Hemisphäre als translatorisch relevanten Schlagvolumen betrachtet werden. Es hat jedoch zu berücksichtigen, dass verschiedene Mausstämme verwendet oder Anästhesie-Protokolle könnte die daraus resultierende Läsion Volumen 20 zu beeinflussen. Die Sterblichkeit im Beobachtungszeitraum nach Schlaganfall Induktion in diesem Modell ist praktisch nicht vorhanden. Die Gesamtmortalität von weniger als 5% besteht hauptsächlich aus Todesfälle während des Betriebs aufgrund von Narkosekomplikationen oder Opfer wegen Erreichen der Ausschlusskriterien. Um die niedrigen v rechtfertigenariability dieses Modell und seine hervorragende Reproduzierbarkeit, empfehlen wir die folgenden Ausschlusskriterien: 1) Eine Subarachnoidalblutung während der Operation. 2) Betriebszeit länger als 15 min. 3) Rekanalisation des MCA nach zwei Versuchen für Elektrokoagulation mit nur vorübergehenden MCAO. Darüber hinaus müssen die Tiere täglich nach MCAO (Grund physiologische Verhalten, Pelz Aussehen und Körpergewicht), für Schmerzen, Beschwerden oder Krankheit Verhalten steuern sucht werden. Verschiedene Maßnahmen können zur Analyse von Schlaganfall Ergebnis wie Laser-Speckle-Messung, Magnetresonanztomographie, Verhaltenstests oder histologische Analyse durchgeführt werden. In diesem Protokoll stellen wir beispielhafte Verfahren zur Verhaltensanalyse und Infarktvolumen-Analyse. Mehrere Test zur Verhaltensanalyse nach fokaler Hirnischämie wurden entwickelt und in experimentellen Schlaganfallforschung. Geeignete Tests für sensomotorischen Dysfunktion zuvor von unserer Gruppe in diesem Schlaganfallmodell 21,22 verwendeten wirre der Rotarod Test 23, Sticky-Label-Test 24, Ecke Test 25 und der Zylinder Test 13, die in diesem Video gezeigt wird. Der Zylinder stellt konsequent Testmotor Asymmetrie in der akuten Phase nach distal permanenten MCAO und erkennt in Folge wieder der motorischen Funktion auch. Trotz der offensichtlichen Vorteile, haben einige Einschränkungen dieser Schlaganfallmodell berücksichtigt werden. Zuerst wird eine Trepanation des Schädels, um die Arterie zu koagulieren benötigt, wodurch eine potentielle Zugangs für peri-operative Infektionen des Gehirns, auch von bakteriellen Infektionen der Operationswunde, Schläfenmuskel oder das Gehirn selbst nie von uns festgestellt oder von anderen mit diesem Modell dokumentiert. Außerdem können mechanische Schäden an der Rinde während der Herstellung und Koagulation nicht ausgeschlossen, sondern kann durch sorgfältige Bohren und Entfernen des Schädels, konstanten Befeuchtung der Operationsstelle und minimale ne begrenzt<html> cessary Elektrokoagulation (siehe Ausschlusskriterien). Obwohl der Verlauf der MCA wie in Fig. 2 dargestellt ist, in der Mehrzahl von C57BL / 6 Mäusen, beschreiben wir in dem Protokoll, wie in der normalen Schwankungen des Behälters natürlich fortfahren Modell Variabilität zu minimieren. Darüber hinaus empfehlen wir die Verwendung von mehreren (3 im Falle der Bifurkation; 2 ohne Bifurkation der MCA) Okklusion Websites, um das Risiko von Teil Rekanalisation des MCA, die in unserer Erfahrung ist ein wichtiger Faktor für die Variabilität dieses Modells zu minimieren. Hinsichtlich der Verhaltenstests können nur geringfügige Verhaltensdefizite in der oben genannten Verhaltenstests nachgewiesen werden, und funktionelle Regeneration innerhalb der ersten Woche nach dem Schlaganfall beobachtet. So könnte fortgeschrittenen Testsysteme mit höherer Empfindlichkeit und qualitativen Testparameter wie dem Fach Erreichen Test 27 besser geeignet, um langfristige funktionelle Ergebnis in diesem Modell zu erkennen. NHALT &quot;&gt; Schließlich wird ein zuvor beschriebenen thromboembolischen Schlaganfall-Modell 26 sieht jedoch aufgrund der permanenten Koagulation des MCA keine Reperfusion erhalten werden, die eine in einem wesentlichen Anteil von Schlaganfallpatienten durch spontane oder Gerinnsel-Lyse-Therapie 28 beobachtet Merkmal ist. die Möglichkeit für eine kostenlose Schlaganfall-Modell mit Reperfusion der kortikalen Gehirn Ischämie. Zusammengenommen ist die hohe Reproduzierbarkeit, die mögliche Langzeitbeobachtung durch minimale Sterblichkeit und dem vergleichbaren relativen Infarktvolumen und Lokalisierung in Bezug auf die Menschen Schlaganfall unterscheiden die &quot;Gerinnungsmodell&quot; als ein wertvolles Modell für die Grundlagen-und translationalen Schlaganfallforschung.

Der Schlaganfall ist die dritthäufigste Todesursache und eine der Hauptgründe für erworbene Invalidität bei Erwachsenen in den Industrieländern ein. Etwa 80% dieser akuten neurologischen Erkrankung wird durch Ischämie Gehirn von einer Behinderung der Hirndurchblutung verursacht wird, während resultierenden etwa 15% werden durch eine Hirnblutung 2 verursacht. Trotz der anhaltenden Forschung ist die intravenöse Verabreichung von Gewebe-Plasminogen-Aktivator die einzige zugelassene pharmakologische Behandlung von ischämischen Schlaganfalls so weit und nur für eine Minderheit der Schlaganfall-Patienten aufgrund der kurzen Zeitfenster genehmigt von 4,5 Stunden nach Symptombeginn 3,4. Da es keine in vitro-Modelle, die richtig zu modellieren können die komplexen Wechselwirkungen zwischen dem Gehirn, Gefäße und systemische pathophysiologischen Mechanismen bei Schlaganfall, sind Tiermodelle unerlässlich für die präklinische Schlaganfallforschung. Deshalb haben mehrere ischämischen Schlaganfall Modelle in einer Variablen entwickeltschaft der Arten. Eines der am häufigsten verwendeten Taktmodelle ist die &quot;Filament-Modell&quot;, wo ein Nahtmaterialfaden wird transient in die innere Halsschlagader eingeführt und weitergeleitet, bis die Spitze verschließt den Ursprung der mittleren Hirnarterie (MCA), was zu einem Stopp des Blutflusses und anschließende Hirninfarkt subkortikaler und im Falle einer längeren Verschluss auch kortikalen Regionen 5,6. In photothrombotic Modelle von ischämischen Schlaganfall wird ein photo Okklusion des bestrahlten kortikalen Gefäß nach Injektion eines Photosensibilisators was zu kleinen, örtlich umschriebene Läsionen 7 gelöst. Die permanente Okklusion der MCA distalen lenticulostriatal der Arterien durch eine Ligation der Arterie, seine vorübergehende Kompression oder durch dauerhafte Koagulation 8,9 erreicht werden. Die daraus resultierende Infarkt in diesem Modell betrifft vor allem die Neocortex 10, weil der Verschluss der MCA in diesem Modell ist distal der lenticulostriatal Arterien, die die Basalganglien liefern. Da die Mehrheit der menschlichen Schlaganfall Läsionen im Gebiet der mittleren Hirnarterie befindet, alle gängigen Taktmodelle ähneln Verschlüsse der MCA oder einer ihrer Äste 11. Die MCA ist einer der großen Arterien, die Blut zum Gehirn liefert; es ergibt sich aus der A. carotis interna, Routen entlang des Sulcus lateralis, wo es dann Niederlassungen und Projekten in die Basalganglien und den Seitenflächen der Stirn-, Scheitel-und Schläfenlappen, einschließlich des primären motorischen und sensorischen Kortex. Die rechten und linken MCA an der vorderen Hirnarterien verbunden ist und der hintere Kommunikation Arterien, die den posterioren cerebralen Arterien zu verbinden, wodurch der Kreis von Willis (Abbildung 1). Wie bereits von Carmichael et al. Berichtet 11, Infarkte durch das distale Middle Cerebral Ar modelliertBatterie Occlusion (MCAO)-Modell bei Mäusen umfassen etwa 10-15% der Hemisphäre, wodurch ein Großteil der menschlichen Schlaganfall Läsionen, die in der Rinden MCA Gebiet befinden 11,12 imitiert. Im Jahr 1981 Tamura et al. Beschrieben eine permanente, transkranielle MCAO Gerinnungsmodell bei Ratten 8. Aber die von Tamura beschriebenen Modell einbezogen einen proximalen Verschluß der MCA um die weitere distale Gabelung der Arterie zu umgehen. Somit wird die ursprüngliche &quot;Tamura Modell&quot; induziert nicht nur kortikalen Läsionen im Striatum als auch, ähnlich wie die von der &quot;Filament-Modell&quot; 6 erhaltenen Läsionen. Hier beschreiben wir die permanente distalen MCAO-Modell durch transkranielle Elektrokoagulation bei Mäusen. Ähnliche histologische und funktionelle Methoden Außerdem berichten wir, um den Hub Ergebnis in diesem Modell zu analysieren. Alle Methoden sind auf entwickelt und in unseren Labors verwendet Standard-Betriebsverfahren.

<table><tbody><tr><td>Kamera Canon Eos 500D</td><td>Canon</td><td></td><td>Optik: 18-55 mm; 30 fps; 640 x 480 Videofunktion</td></tr><tr><td>Spiegel</td><td>Kristallform</td><td>2677089</td><td>30 x 30 cm&nbsp;</td></tr><tr><td>Transparenter Acrylglaszylinder</td><td>H& S Kunststofftechnik</td><td></td><td>Durchmesser: 8 cm,&nbsp; Höhe: 25 cm</td></tr><tr><td>Heizdecke</td><td>FHC DC Temperaturregler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feinschere</td><td>FST</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Mayo Schere</td><td>FST</td><td>1410-15</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>FST</td><td>11616-15</td><td></td></tr><tr><td>Baumwolle</td><td>NOBA Verbondmitel Danz</td><td>974116</td><td></td></tr><tr><td>Kochsalzlösung</td><td>Braun</td><td>131321</td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen pommade</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Abbot</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>Anästhesiesystem für Isofluran</td><td>Dräger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Elektrochirurgiegerät</td><td>ERBETOM ICC 80/50 HF-Chirurgieger&auml; t</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Proxxon</td><td>D-34343</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Inresa Arzneimittel GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylacin</td><td>Albrecht</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5ml Spritze&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td>Braun</tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung PH: 7.4</td><td>Apotheke Innestadt Uni München</td><td>P32799</td><td></td></tr><tr><td>Isopentan</td><td>Fluka</td><td>59070</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Thermo Scientific CryoStarNX70</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Objektträger</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Cresylviolett</td><td>Sigma Life Science</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma Life Science</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 70%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>521005</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 96%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>522078</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 99%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>ETO-5000-99-1</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histokit Eindeckmedium</td><td>Roth</td><td>6638.1</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6J Mäuse</td><td>Charles River</td><td>000664</td><td></td></tr></tbody></table>

modellierung schlaganfall bei mäusen: permanent koagulation der distalen a. cerebri media

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Der Schlaganfall ist die dritthäufigste Todesursache und die Hauptursache für erworbene Invalidität bei Erwachsenen in entwickelten Ländern. Nur sehr begrenzte Therapieoptionen sind für einen kleinen Teil der Schlaganfall-Patienten in der Akutphase zur Verfügung. Die aktuelle Forschung ist intensiv auf der Suche nach neuen therapeutischen Strategien und konzentriert sich zunehmend auf die Unter akuten und chronischen Phase nach Schlaganfall, weil mehr Patienten könnte die für therapeutische Interventionen in einem längeren Zeitfenster sein. Diese verzögerten Mechanismen gehören wichtige pathophysiologische Vorgänge wie zB nach Schlaganfall Entzündung, Angiogenese, neuronale Plastizität und Regeneration. Um diese Mechanismen zu analysieren und anschließend zu bewerten neuartiger Medikamente werden experimentelle Taktmodelle mit klinischer Relevanz, niedrige Sterblichkeit und hohe Reproduzierbarkeit gefragt. Außerdem Mäusen sind die kleinsten Säugetiere, in dem ein Brenn Schlaganfallläsion induziert werden und für die ein breites Spektrum von transgenen Modellenzur Verfügung. Deshalb beschreiben wir hier das Maus-Modell der transkraniellen, permanent Koagulation der mittleren Hirnarterie über Elektrokoagulation distalen lenticulostriatal der Arterien, die so genannte &quot;Gerinnungsmodell&quot;. Das resultierende Infarkt in diesem Modell ist hauptsächlich in der Rinde liegt; die relative Infarktvolumen im Verhältnis zur Größe des Gehirns entspricht der Mehrheit der menschlichen Schlägen. Darüber hinaus wird das Modell erfüllt die genannten Kriterien Reproduzierbarkeit und geringer Mortalität. In diesem Video zeigen wir die chirurgischen Methoden der Schlaganfallinduktion in der &quot;Gerinnungsmodell&quot; und berichten histologische und funktionelle Analyse-Tools.

Aufgrund der kurzen Zeit der Anästhesie und moderate Schädigung des Gehirns, etwa 10 min nach der Überführung in ihre Käfige alle Tiere wach waren, frei in den Käfig und die Interaktion mit Wurfgeschwister. Die Mortalität während der MCAO Operation war weniger als 5%, vor allem aufgrund des zufälligen Subarachnoidalblutung oder falsche Narkose. Die Mortalität während der 7-tägigen Beobachtungszeit nach Schlaganfall Induktion tritt nur sehr selten in etwa 1-2% der Tiere. Bei dem Betrieb Serie von 10 Tieren für diesen Bericht alle Tiere überlebten die Operation und das 7 Tage Beobachtungszeitraum, keiner von ihnen musste wegen Ausschlusskriterien ausgeschlossen werden. Behavioral Defizite nach MCA Koagulation wurden von der Testzylinder 13 Analyse Vorderpfote Verwendung Asymmetrie bewertet. In diesem Test wird das Verhältnis der unabhängigen linken und rechten Vorderpfote Verwendung zu den angegebenen Zeitpunkten nach der Induktion Takt gemessen und mit 24 erhaltenen Ausgangswerteh vor MCAO (3B). Die Tiere präsentiert eine wesentliche Änderung in den Extremitäten Verwendung Asymmetrie für kombinierte Wand Exploration in der Testzylinder 24 h (1,72 ± 0,326, p &lt;0,05) und 3 Tage (1,36 ± 0,17, p &lt;0,05) nach MCAO. Obwohl das Verhältnis im 1. wöchigen Beobachtungszeit verbessert war Motors Asymmetrie noch erhebliche 7 Tage nach MCAO (1,35 ± 0,29, p &lt;0,05) im Vergleich zu den Ausgangswerten. Wir führten Infarktvolumetrie mit Kresylviolett gefärbten Serien koronalen Hirnschnitten von 7 Tagen nach Schlaganfall Induktion (4B). Die mittlere Infarktvolumen betrug 15,4 mm 3, wobei aus 12% einer Gehirnhälfte (4C). Die Variabilität dieses Schlaganfallmodell ist mit einer Standardabweichung von etwa 10% außergewöhnlich niedrig. Die Läsion Bereich umfasst den somatosensorischen und motorischen Kortex mit nur geringen Neigung von subkortikalen Strukturen. Darüber hinaus Lokalisation des InfarktesGebiet ist in hohem Maße vorhersehbar mit minimaler Variabilität als in der schematischen Verteilungsdiagramm (Fig. 4D) gezeigt. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51729/51729fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des Circle of Willis. Die arterielle Kreis von Willis wird von den mittleren Hirnarterien (MCA) und der vorderen Hirnarterien (ACA), die Abzweigung von der A. carotis interna (ICA), als auch durch die gebildete posterioren Hirnarterien (PCA) und die hintere Kommunikation Arterien (PComA). Die MCA läuft in die seitliche Sulcus wo es sich zur Großhirnrinde. Die dominierende MCA Zweig liefert den größten Teil des motorischen Kortex und ein Teil des somatosensorischen Kortex wird permanent durch die nachgewiesene Modell (Acoma = Anterior Kommunikation Arterie verschlossen, BA = Basilararterie; Suca = Superior-Kleinhirnlar Arterie). <img alt="Figur 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51729/51729fig2highres.jpg" width="400" /> 2. Transcranial Ansicht nach Entfernen der Schläfenmuskel und schematische Ansicht der MCA-Okklusion. (A) Nach dem Entfernen der Schläfenmuskel die kortikalen Arterien durch die teilweise durchscheinend Maus Schädel (in 8-12 Wochen alte Mäuse) betrachtet werden. Die dominierende MCA Zweig kann im rostralen Teil der zeitliche Sicht sowie weitere kortikale Arterien Verzweigung von der MCA und der PCA in der Schwanzteil identifiziert werden. (B) Schematische Darstellung auf der Dominante MCA Zweig im vorherrschende Variante mit einer Verzweigung auf der seitlichen temporalen Cortex nach dem Bohren ein Bohrloch und Entfernen des Schädels. (C) schwarze Quadrate die MCA Koagulation Stellen an den proximalen und distalen Seiten der Verzweigung. 3. Analyse von Verhaltensdefiziten. (A) Zylinder-Versuchsaufbau: Die Maus ist in einem vertikalen Zylinder gelegt und Spiegel sind zurück, um alle Bewegungen mit einer Videokamera registrieren sich (B) Vorderbein Verwendung Asymmetrie wurde mit der Zylinder Test analysiert.. Links / rechts-Verhältnisse von unabhängigen forelimb Verwendung wurden 24 Stunden vor der MCAO und zu den angegebenen Zeitpunkten nach der Induktion Takt berechnet. N = 10, * p &lt;0,05 zwischen den angegebenen Zeitpunkt und Baseline (Kontroll-) Wert. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51729/51729fig4highres.jpg" width="500" /> Abbildung 4. Volumen Infarkt-Analyse und der Infarkt Ergebnis nach distal MCAO. (A) Repräsentatives Bild einer Kresylviolett gefärbt koronalen BHin Abschnitt 7 Tage nach MCAO. Die gelbe Linie ist die Auswahl der kontralateralen (rechts) Kortex Anzeige-und die rote Linie ist die Auswahl der nicht-Infarkt (gebeizt) Kortex der ipsilateralen Gehirn. Der blasse Bereich in der linken Hemisphäre zeigt die Infarktgewebebereich. (B) Infarktvolumen Analyse von 10 Gehirnen (jeder Punkt repräsentiert ein einzelnes Gehirn) 24 Stunden, 3 Tage und 7 Tage nach distal MCA Koagulation. Die horizontale rote Linie stellt die mittlere, Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. (C) Vertreter Kresylviolett gefärbt koronalen Hirnschnitten alle 400 um 7 Tage nach MCA Koagulation. (D) Schematische Verteilung der Infarkthirngewebe von 7 Tagen nach MCAO. Jede Seite zeigt die gesammelten Informationen der Infarktverteilung (Farbkodierung wie angegeben) bei der gegebenen Abschnitt in Bezug auf Bregma (modifizierte Bild aus:. Liesz A et al, Gehirn, 2011, mit Genehmigung von Oxford University Press). &lt;a href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/51729/51729fig4highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Verschiedene Mausmodellen der mittleren Hirnarterie (MCAO) sind weit verbreitet in der experimentellen Hirnforschung. Hier zeigen wir das Modell der transkraniellen Dauer distalen MCAO, die im Einklang kortikalen Infarkt von einer Größe, die von der Mehrheit der menschlichen ischämische Schlaganfälle auferlegt Schaden produziert.

Modellierung Schlaganfall bei Mäusen: Permanent Koagulation der distalen A. cerebri media

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine dauerhafte Okklusion der distalen Arteria cerebri media bei einer Maus herbeizuführen, wodurch ein Infarkt entsteht, der hauptsächlich im Kortex liegt und in etwa vergleichbar groß ist mit menschlichen Schlaganfällen. Dies wird erreicht, indem zunächst vor der Operation eine Baseline für die Asymmetrie der Gliedmaßenbenutzung ermittelt wird. Der nächste Schritt des Verfahrens ist die Durchführung der Schlaganfallinduktion durch Elektrokoagulation der distalen Arteria cerebri media.Nach der Operation werden fokale sensomotorische Defizite durch die Bewertung der Asymmetrie der Vierbeinnutzung getestet. Der letzte Schritt besteht darin, das Infarctvolumen mittels Kristallviolett-Färbung zu analysieren. Letztendlich sind die resultierenden kortikalen Läsionen mäßig groß mit geringer Variabilität, was diese Technik zu einem wertvollen Modell für die grundlegende und translationsorientierte Schlaganforschung macht.Die Hauptvorteile dieser Technik im Vergleich zu anderen gängigen Schlaganfallmodellen liegen darin, dass die Sterblichkeitsrate bei diesem Modell minimal ist, ebenso wie das Infarktvolumen und die Lokalisation. Der Neokortex stellt die Mehrheit der menschlichen Schlaganfälle dar und ist hochgradig reproduzierbar. Im Allgemeinen fällt es einzelnen Anwendern bei dieser Methode zunächst schwer, die Schädeldecke schonend zu entfernen, um mechanische Läsionen zu minimieren.Zweitens ist die korrekte Identifizierung und ordnungsgemäße Zuordnung der distalen mittleren Saliararterie für dieses Modell von entscheidender Bedeutung. Zuerst injizieren Sie 30 Minuten vor Beginn der Operation Analgetika. Schalten Sie die Heizdecke für die Maus ein und stellen Sie sie auf 37 Grad Celsius für die Operation ein.Als Nächstes sicherstellen, dass das Narkosegas, bestehend aus 70 % Stickstoff, 30 % Sauerstoff und Isofluran, bereitsteht. Danach die Maus in einer Induktionskammer 4 % Isofluran aussetzen, bis sie sich nicht mehr bewegt. Anschließend die Maus auf der Wärmematte positionieren und für eine zusätzliche Minute 4 % Isofluran verabreichen.Nach der Minute ändern Sie die Isofluran-Konzentration auf 1,5 %. Überprüfen Sie nun die ausreichende Anästhesie der Maus mittels Zehenquetschung und tragen Sie andernfalls Dexamethason-Ethanol auf die Augen auf. Beginnen Sie die Operation mit einem ein Zentimeter langen Schnitt zwischen Ohr und Auge. Trennen Sie die Haut und identifizieren Sie den Musculus temporalis.Stellen Sie nun am Hochfrequenzgenerator die Funktion auf Koagulation, den Modus auf bipolar, die Leistung auf 12 Watt ein und schließen Sie die Pinzette an. Geben Sie am Präparat einen Tropfen Kochsalzlösung auf den freigelegten Musculus temporalis. Trennen Sie anschließend mit der Elektrokauter-Pinzette den Musculus temporalis an seinen apikalen und distalen Anteilen vom Schädel ab.Das Ergebnis ist eine gelockerte Muskeldecke. Identifizieren Sie nun die mediale zerebrale Arterie oder A. cerebri media (MCA) unterhalb des durchsichtigen Schädels. Sie befindet sich im rostralen Teil des temporalen Bereichs, dorsal zum retroorbitalen Sinus.Verwenden Sie einen Bohrer, um den Knochen direkt über dieser Arterie so lange zu dünneren, bis er durchlässig ist. Halten Sie den Schädel während des Bohrens mit Kochsalzlösung feucht. Entfernen Sie nun mit sehr feinen Pinzetten vorsichtig den Knochen, um den MCA-Zweig freizulegen.Stellen Sie den Hochfrequenzgenerator auf sieben Watt ein. Koagulieren Sie nun die Arterie mit der Elektrokoagulationszange, indem Sie sie sanft berühren, ohne sie zu greifen. Koagulieren Sie die Arterie sowohl proximal als auch distal zur Gabelung. Bei einer anatomischen Variante ohne Gabelung der A. cerebri media koagulieren Sie die Arterie so proximal wie möglich an zwei Stellen, die etwa einen Millimeter voneinander entfernt liegen, nach der Koagulation.Warten Sie 30 Sekunden und berühren Sie dann die Arterie vorsichtig mit stumpfen Pinzetten. Danach bringen Sie den Muskel in seine ursprüngliche Position zurück, die das Bohrloch bedeckt. Nähen Sie die Wunde und legen Sie das Tier in eine Pflegebox bei 32 Grad Celsius, um sich von der Anästhesie zu erholen, und kehren Sie es anschließend in den Käfig zurück.Im Allgemeinen dauert es fünf bis zehn Minuten, bis sich das Tier von der Anästhesie erholt hat. Der Zylindertest überprüft, ob ein Gliedmaßen bevorzugt wird. Stellen Sie das Tier in einen transparenten Acrylglaszylinder, der von zwei rechtwinklig angeordneten Spiegeln flankiert wird.Videoaufnahme des Tieres für fünf Minuten gegenüber dem Scheitelpunkt der beiden Spiegel auf der anderen Seite des Zylinders. Nach jedem Versuch den Zylinder und die Tischplatte mit 60 % Ethanol abwischen. Anschließend eine Einzelbildanalyse durchführen.Werten Sie den Test aus, indem Sie den Kontakt einer der vier Pfoten mit dem Zylinder beim vollständigen Aufstellen zählen, sowie das Landen mit einem der vier Gliedmaßen. Nach einer vollständigen Aufstellbewegung müssen mindestens 20 Kontakte eines der vier Gliedmaßen pro Versuch erzielt werden. Kryoschnitte, jeweils seriell aus dem Gehirn in 20 Mikrometer dicken Schnitten im Abstand von 400 Mikrometern. Sammeln Sie die Schnitte auf Objektträgern zur Lagerung bei minus 20 Grad Celsius.Mithilfe dieses Schnittprotokolls können alle Schnitte, die den Infarktbereich eines Gehirns abdecken, auf einen Objektträger aufgebracht werden. Färben Sie die Schnitte mit einem standardmäßigen Cresylviolett-Protokoll, um den Bereich des infarzierten Gewebes in jedem Gehirnschnitt sichtbar zu machen. Die Objektträger können anschließend eingedeckt, gescannt und mit der Swanson-Methode zur Ödemanalyse ausgewertet werden.Die Korrekturmortalität aufgrund der MCA-Okklusionschirurgie lag unter 5 %, hauptsächlich bedingt durch subarachnoidale Blutungen oder eine fehlerhafte Anästhesie. Kein Tier starb während des Beobachtungszeitraums. Für diese Analyse im Hinblick auf die Nutzung von PA wurde die Asymmetrie mittels des Zylindertests nach Schlaganfallinduktion gemessen und mit den Basiswerten vor der MCA-Okklusion verglichen. Eine signifikante Gliedmaßenasymmetrie zeigte sich 24 Stunden nach dem Schlaganfall, die sich innerhalb der ersten Woche nach dem Schlaganfall teilweise erholte, eine Woche nach dem Schlaganfall.Die Induktion eines Infarkts mit violettem Kamm-Färbung ergab ein durchschnittliches Infarktvolumen von 15,4 Kubikmillimetern, was etwa 12 % einer Gehirnhemisphäre entspricht. Die Standardabweichung dieses Modells ist sehr gering. Außerdem wies die Infarktlokalisation eine minimale Variabilität auf.Einmal eingerichtet, kann dieser Eingriff bei korrekter Durchführung innerhalb von 10 Minuten abgeschlossen werden. Neben den gezeigten Zylindertests und der Kristallviolett-Färbung können andere etablierte Verhaltensprüfungen und histologische Methoden verwendet werden, um das Ergebnis weiter zu charakterisieren und spezifische Forschungsfragen zu beantworten. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie eine permanente distale MCA-Occlusion bei Mäusen durchgeführt wird.Wir empfehlen dringend die Verwendung von standardisierten Arbeitsanweisungen und detaillierter Dokumentation, um die Reproduzierbarkeit der Methode sicherzustellen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Filamentous Verschluss der mittleren Hirnarterie ist ein gemeinsames Modell für die Untersuchung einen ischämischen Schlaganfall bei Mäusen.

Modeling Stroke in Mice - Middle Zerebralarterie mit dem Filament-Modell

Wir zeigen in dem Video ein Verfahren zur Herstellung einer mittleren Zerebralarterie in erwachsenen Mäusen mit einem intraluminalen Monofilament. Wir zeigen auch, wie man das Ausmaß der Hirninfarkt von 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Färbung zu bewerten.

Mouse Model of Middle Zerebralarterie

Die intraluminale Mitte Zerebralarterie (MCAO) Modell ist die häufigste verwendete Modell unter experimentellen Schlaganfall-Modellen. Hier zeigen wir Ihnen das gesamte Modell im Detail mit der Führung des Laser-Doppler-Flussmessung und seine repräsentative Ergebnisse.

Intraluminale Nahen Zerebralarterie (MCAO) Modell des ischämischen Schlaganfalls mit Laser-Doppler-Flussmessung Guidance in Mäuse

A. cerebri media (MCA) Ligation ist eine Technik, fokaler zerebraler Ischämie im Tiermodell zu studieren. Bei dieser Methode ist die mittlere Hirnarterie durch Kraniotomie freigelegt und ligiert durch Kauterisation. Diese Methode liefert gut reproduzierbare Infarktvolumen und erhöhte postoperative Überlebensrate im Vergleich zu anderen Methoden zur Verfügung.

Die Anwendung des dauerhaften mittleren Hirnarterie Ligation in der Maus

Der intraluminale cerebri Okklusion in Mäusen wird hier vorgestellt. Das Ausmaß der Hirninfarkt wird durch eine neurologische Partitur und Cresylviolett Färbung, eine alternative Färbung zur TTC bietet den großen Vorteil, dass sie parallel viele interessante Marker testen ausgewertet.

Maus-Modell der Intraluminal MCAO: Hirninfarkt Evaluation durch Cresylviolett Staining

Intraluminal Filament Okklusion der mittleren zerebralen Arterie ist das am häufigsten verwendete in Vivo Modell der experimentellen Schlaganfall bei Nagetieren. Ein alternativer chirurgischer Ansatz ermöglichen gemeinsame Halsschlagader Reparatur erfolgt hier, wodurch der Reperfusion der gemeinsame Halsschlagader und eine vollständige Reperfusion auf das mittlere zerebrale Arterie-Gebiet.

Mittlere zerebrale Arterie Okklusion so dass Reperfusion über gemeinsame Halsschlagader Reparatur bei Mäusen

Hier wird das photothrombotische Schlaganfallmodell beschrieben, bei dem ein Schlaganfall durch den intakten Schädel erzeugt wird, indem eine permanente mikrovaskuläre Okklusion mittels Laserbeleuchtung nach Verabreichung eines lichtempfindlichen Farbstoffs induziert wird.

Modellierung von Schlaganfällen bei Mäusen: Fokale kortikale Läsionen durch Photothrombose

Verschiedene Modelle des mittleren Hirnarterienverschlusses (MCAo) werden in der experimentellen Schlaganfallforschung eingesetzt. Hier wird ein experimentelles Schlaganfallmodell der transienten MCAo über die Arteria carotis externa (ECA) beschrieben, das darauf abzielt, den menschlichen Schlaganfall nachzuahmen, bei dem der zerebrovaskuläre Thrombus aufgrund einer spontanen Gerinnsellyse oder -therapie entfernt wird.

Modellierung des Schlaganfalls bei Mäusen: Vorübergehender Verschluss der mittleren Hirnarterien über die Arteria carotis externa

Dieses Protokoll demonstriert ein einzigartiges Mausschlagmodell mit einem mittelgroßen Infarkt und einer ausgezeichneten Überlebensrate. Dieses Modell ermöglicht es präklinischen Schlaganfallforschern, die Dauer der Ischämie zu verlängern, gealterte Mäuse zu verwenden und langfristige funktionelle Ergebnisse zu bewerten.

Ein modifiziertes transkranielles Modell für den Verschluss der mittleren Hirnarterie zur Untersuchung von Schlaganfallergebnissen bei gealterten Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt das Modell der transienten fokalen zerebralen Ischämie bei Mäusen durch intraluminalen Verschluss der mittleren Hirnarterie. Darüber hinaus werden Beispiele für die Ergebnisbewertung mit Hilfe von Magnetresonanztomographie und Verhaltenstests gezeigt.

Transienter mittlerer Hirnarterienverschluss Modell des Schlaganfalls

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Etablierung eines distalen Modells für einen Verschluss der mittleren Hirnarterie (dMCAO) durch transkranielle Elektrokoagulation bei C57BL/6J-Mäusen vor und bewerten das anschließende neurologische Verhalten und die histopathologischen Merkmale.

Induktion eines akuten ischämischen Schlaganfalls bei Mäusen mit der Technik des distalen Mittelarterienverschlusses

Lernen Sie die permanente Koagulation der distalen A. cerebri media bei Mäusen für Schlaganfallforschung. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare kortikale Infarkte mit minimaler Mortalität für translationale Studien.

Modellierung Schlaganfall bei Mäusen: Permanent Koagulation der distalen A. cerebri media

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