Name: Fokus Formation: Ein Assay auf Zellbasis, um das onkogene Potential eines Gens zu bestimmen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Lernen Sie den Focus-Formation-Assay zur Bestimmung des onkogenen Potenzials eines Gens in Maus-Fibroblasten. Diese Methode nutzt Retroviren und Kristallviolett-Färbung zur Quantifizierung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von der NIH Direktor Neue Innovator Award Program (ED) unterstützt. AA wurde zum Teil von Undergraduate-Auszeichnungen von der National Cancer Institute und der National Science Foundation unterstützt.

1. Die Herstellung der viralen Vektoren Die codierenden Sequenzen für das Gen von Interesse, sowie die positive und negative Kontrollen werden durch traditionelle Klonierungsverfahren (PCR-Amplifikation, Restriktionsspaltung und Ligation) in pBaBepuro eingefügt. Es gibt vier Restriktionsstellen auf dem Vektor, wobei die DNA eingefügt werden kann: BamHI, SnaBI, SalI und EcoRI. <ol><li> Bereiten Transfektion-grade Plasmid-DNA aus kompetenten Zellen mit dem QIAGEN Plasmid Midi Kit. </li><li> Messen DNA-Konzentration mit einem NanoDrop2000 Spektralphotometer. </li></ol> 2. Retrovirus Produktion Die Plat-E Verpackungszelllinie wird verwendet, um ecotrope Retrovirus, das die cDNA von Interesse für NIH 3T3-Zellen liefern produzieren wird. <ol><li> Gründung Plat-E Kulturen aus eingefrorenen Zellen <ol><li> Tauen schnell Plat-E-Zellen in einem 37 ° C Wasserbad und Transfer zu einem 15 ml konischen Röhrchen. Langsam 9 ml Plat-E-Medium (Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) + 10% fötalem Rinderserum (FBS) + Penicillin und Streptomycin). </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 180 x g für 5 min und den Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren der Zellen mit 10 ml von PLAT-E-Medium, und in ein 10 cm Kulturschale. </li><li> Inkubieren der Zellen in einem 37 ° C, 5% CO 2 kultiviert, bis sie 80-90% Konfluenz (etwa 2 Tage). </li></ol></li><li> Zell Splitting <ol><li> Saugen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. </li><li> 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA und Inkubation für 1 min bei RT. </li><li> Trennen Sie die Zellen, die durch Fingertippen, 10 ml Plat-E-Medium, und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Tube. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 180 x g für 5 min und den Überstand verwerfen. </li><li> Die Zellen mit 10 ml Plat-E-Medium und Saatgut in neue Gerichte zu 1: 4-1: 6 Verdünnungen. </li></ol></li><li> Plat-E Seeding und Transfektion <ol><li> Seed 2 x 10 6Zellen pro 10 cm Kulturschale mit Plat-E-Medium ohne Antibiotika. </li><li> Die Zellen O / N Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Am nächsten Tag, Transfer 300 ul Opti-MEM in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Hinzufügen 27 ul Polyethylenimin (PEI), ein kostengünstiges Transfektionsreagenz 12, auf die vorbereitete Rohr mit Opti-MEM. Vorsichtig mischen Finger klopfen und Inkubation für 5 min bei RT. </li><li> In 9 ug Transfektion-Grade-Plasmid-DNA in der Opti-MEM / PEI Rohr, vorsichtig mischen durch Vortexen und Inkubation für 15 min bei RT. </li><li> Fügen Sie die DNA / PEI Komplex tropfenweise in die Plat-E Gericht, und Inkubation O / N bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Am nächsten Tag, saugen Sie den Medium, das das Transfektionsreagenz und 10 ml frisches Plat-E-Medium (ohne Antibiotika). </li><li> Rückkehr der Zellen in den Inkubator. </li></ol></li></ol> 3. NIH 3T3 Cells and Infection <ol><li> Gründung NIH3T3 Kulturen und Seeding <ol><li> Tauen schnell NIH 3T3-Zellen in einem 37 ° C Wasserbad und Transfer in ein 15-ml-Tube. Langsame Zugabe von 9 ml NIH 3T3-Medium (DMEM + 10% FBS). </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 180 x g für 5 min und den Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren der Zellen mit 10 ml von NIH 3T3-Medium und in ein 10 cm Kulturschale. </li><li> Inkubieren der Zellen in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. Es ist sehr wichtig, dass die NIH 3T3 Zellen werden stets underconfluent (50-60%), wenn die Frequenz der spontanen Transformation (und daher basale Foci-Bildung) erhöht, wenn eine Kultur Konfluenz erreicht. </li><li> Seed 3 x 10 5 Zellen pro 10 cm Schale und Inkubation O / N für die Infektion am nächsten Tag. </li></ol></li><li> Infektion <ol><li> Ernte der retroviralen Überstand vom PLAT-E-Schale unter Verwendung einer 10 ml Plastikspritze, die durch Filtrieren über eine 0,45 um Porengrße Nylonmembranfilter, und Überführung in eine 15 mlRohr. </li><li> 10 ml frisches Plat-E-Medium zu den Zellen (ohne Antibiotika), und bringt sie in den Inkubator. </li><li> Saugen Sie das Medium aus dem NIH 3T3 Zell Gericht angesteckt zu werden, und mit 5 ml regelmäßigen NIH 3T3 Medium und 5 ml virushaltige Überstand gefiltert. </li><li> Hinzufügen Polybren in die Schale in einer Konzentration von 6 ug / ml. </li><li> Die Zellen O / N bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Am nächsten Tag, wiederholen Sie die Schritte 3.2.1 - 3.2.5 für eine zweite Runde der Infektion. </li><li> Ersetzen Sie die virushaltige Medium mit regelmäßigen NIH 3T3 Medium. </li><li> Lassen Sie die NIH 3T3-Zellen zu 2-3 Wochen wachsen, Ersetzen des Mediums wie nötig. Überprüfen der Expression des Proteins von Interesse durch herkömmliche Protein Elektrophorese und Immunoblot auf ganzer Zellysate von Replika-Platten. </li></ol></li></ol> 4. Die Färbung und Quantifizierung <ol><li> Kristallviolett-Färbung <ol><li> Saugen Sie das NIH 3T3 Medium und Ort der Gerichteauf Eis. </li><li> Die Gerichte mit eiskaltem PBS zweimal waschen. </li><li> Befestigen Sie die Zellen mit eiskaltem Methanol für 10 min. </li><li> Entfernen Sie die Gerichte aus Eis, saugen Sie den Methanol und 3 ml 0,5% Kristallviolett-Lösung in 25% Methanol (RT) gemacht. </li><li> Das Geschirr Inkubation für 5 min bei RT. </li><li> Saugen Sie das Kristallviolett-Lösung und spülen Sie sorgfältig die Schale mit Milli-Q H 2 O, bis keine Farbe löst sich in der Spülung. </li><li> Lassen Sie die Gerichte nach O / N auf einem Labortisch trocknen (unbedeckt). </li></ol></li><li> Foci Quantifizierung <ol><li> Sobald die Gerichte sind trocken, mit einem Lineal, um die dunkel gefärbten Sammlungen von Zellen auf der Platte zu messen. Zählen nur jene, die größer als 5 mm im Durchmesser, wie die &quot;Foci&quot;. Nehmen Sie die Anzahl der Brennpunkte und berechnen Mittelwerte und die Bedeutung im Vergleich zu den Kontrollen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+assays+for+Ras+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Biological assays for Ras transformation.</a> Methods in enzymology. , 255-395 (1995).</li>
<li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCelis%2C+JE+%22Cell+biology+%3A+a+laboratory+handbook%22">Cell biology : a laboratory handbook</a>. , 3rd edn, Elsevier Academic. 345-352 (2006).</li>
<li>Raptis, L., Vultur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoplastic+transformation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Neoplastic transformation assays.</a> Methods in molecular biology. 165, 151-164 (2001).</li>
<li>Johnson, P. J., Coussens, P. M., Danko, A. V., Shalloway, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpressed+pp60c-src+can+induce+focus+formation+without+complete+transformation+of+NIH+3T3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Overexpressed pp60c-src can induce focus formation without complete transformation of NIH 3T3 cells.</a> Molecular and cellular biology. 5, 1073-1083 (1985).</li>
<li>Bonner, T. I., Kerby, S. B., Sutrave, P., Gunnell, M. A., Mark, G., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+biological+activity+of+human+homologs+of+the+raf%2Fmil+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22IMolecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Structure and biological activity of human homologs of the raf/mil oncogene.</a> IMolecular and cellular biology. 5, 71400-71407 (1985).</li>
<li>Yancopoulos, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-myc+can+cooperate+with+ras+to+transform+normal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">N-myc can cooperate with ras to transform normal cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 5455-5459 (1985).</li>
<li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+activity+of+purinergic+receptor+P2Y%2C+G+protein+coupled%2C+8+revealed+by+retroviral+expression+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+lymphoma%22%5BJournal%5D)">Transforming activity of purinergic receptor P2Y, G protein coupled, 8 revealed by retroviral expression screening.</a> Leukemia & lymphoma. 48, 978-986 (2007).</li>
<li>Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plat-E%3A+an+efficient+and+stable+system+for+transient+packaging+of+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses.</a> Gene. 7, 1063-1066 (2000).</li>
<li>Morgenstern, J. P., Land, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+mammalian+gene+transfer%3A+high+titre+retroviral+vectors+with+multiple+drug+selection+markers+and+a+complementary+helper-free+packaging+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line.</a> Nucleic acids research. 18, 3587-3596 (1990).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+bioanalytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 397, 3173-3178 (2010).</li>
<li>Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+5%27+and+3%27+long+terminal+repeat+promoter+function+in+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Comparison of 5' and 3' long terminal repeat promoter function in human immunodeficiency virus.</a> Journal of virology. 68, 3830-3840 (1994).</li>
<li>Fukumoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective+gene+transfection+by+DNA+compaction+at+pH+4.0+using+acidified%2C+long+shelf-life+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine.</a> Cytotechnology. 62, 73-82 (2010).</li>
<li>Fox, E. J., Wright, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-phase-specific+expression+of+the+Mad3+gene+in+proliferating+and+differentiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">S-phase-specific expression of the Mad3 gene in proliferating and differentiating cells.</a> The Biochemical journal. 359, 361-367 (2001).</li>
<li>Yun, J. S., Rust, J. M., Ishimaru, T., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+of+the+Mad+family+member+Mad3+in+cerebellar+granule+neuron+precursor+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">A novel role of the Mad family member Mad3 in cerebellar granule neuron precursor proliferation.</a> Molecular and cellular biology. 27, 8178-8189 (2007).</li>
<li>Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mad3+negatively+regulates+B+cell+differentiation+in+the+spleen+by+inducing+Id2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression.</a> Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).</li>
<li>Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cerebellar+proliferation+to+tumorigenesis%3A+new+insights+into+the+role+of+Mad3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3.</a> Cell cycle. 7, 423-427 (2008).</li>
<li>Barisone, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+MXD3+in+proliferation+of+DAOY+human+medulloblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells.</a> PloS One. 7, e38508(2012).</li>
<li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112, 193-205 (2003).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die FFA bietet eine schnelle und einfache Methode, um eine maligne Transformation in vitro zu bewerten. Es ist offen für das Screening einer relativ großen Anzahl von Kandidaten-Gene und ihrer bescheidenen technischen Anforderungen machen es kosteneffektiv. Ferner können zwei oder mehr Gene coexprimiert werden (manchmal als &quot;Kooperation&quot; assay), die tumorigene Potenzial der Kombination zu bewerten. Die Vorteile dieses Tests verlassen sich auf ihre einfache Technik, die einfache Quantifizierung und sei...

Tumorzellen von ihren normalen Gegenstücken durch eine Vielzahl von Änderungen zu unterscheiden, von den Mustern der Genexpression Epigenomics morphologischen und proliferative Veränderungen. Unter den letzteren eine geringere Abhängigkeit von Serum, Kontaktverlust (Dichte) Inhibition des Erwerbs von verankerungsunabhängiges Proliferation und schließlich die Fähigkeit, Tumoren zu bilden, wenn sie in Tiere injiziert sind nützlich, messbare Indikatoren Entartungs 3. Mehrere in vitro- und in vivo-Assays für zelluläre Transformation entwickelt worden. In-vitro-Assays zielen auf die Identifizierung und Messung von Veränderungen der Kulturmorphologie (Fokus-Assay), Kultur Dynamik (Wachstumsrate, Sättigungsdichte) und Wachstumsfaktor (Wachstums verringerten Serum) oder Ankerplatz (Wachstum in Weichagar) Anforderungen. Der Goldstandard für die Bestimmung der bösartigen Natur eines Zelltyps bleibt der Tumorbildung (Xenografts) in Versuchstieren. Jedoch ter kostet und Länge der in vivo-Studien nicht immer machen sie zu rechtfertigen als ersten Validierungsschritt oder Screening von Kandidaten Onkogene. Obwohl keine in vitro-Test liefert eine definitive Beurteilung der onkogenen Potentials eines Gens, sie geben Einblick in onkogene Potenzial, das in vivo-Studien gezieltere Zukunft kann. Eine der am weitesten verbreiteten Systeme zur Bewertung der onkogenen Potential in vitro wird die Fokusbildungs-Assay 2. Dieser Ansatz beruht auf der Verwendung von NIH 3T3-Maus-Fibroblasten, einer nicht-transformierten Zelllinie, die starke Kontakthemmung zeigt. Überexpression eines Onkogens zu einem Verlust der Wachstumsdichte abhängig; transformierte Zellen können dann wachsen in mehreren Schichten bildet &quot;Foci&quot;, leicht gegen den Hintergrund Monoschicht von nicht-transformierten Zellen visualisiert. Die Fokusbildungs-Assay, dann misst die Fähigkeit eines Kandidaten-Onkogens zur malignen Transformation zu induzieren, wie durch den Verlust des Kontakts belegt INHIBition als messbare Phänotyp. Die FFA wurde zur Transformation durch die Überexpression von Proteinkinasen (zB Src 4, BRAF 5), Transkriptionsfaktoren (zB N-myc 6), G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (zB P2RY8 7) und GTPasen (zB evaluieren Ras 1), unter anderem. Die relative Leichtigkeit dieses Assays ist es eine gute Wahl, die eine schnelle und optisch klare Antwort, ob die Überexpression des Gens ausreicht, um NIH 3T3-Maus-Fibroblasten-Zellen zu transformieren in vitro bereitstellt. Die in diesem Protokoll beschrieben FFA verwendet die Plat-E Verpackungszelllinie 8, die viralen Verpackungsproteine ​​enthält, und der retrovirale Vektor pBabePuro 9 (Addgene Plasmid 1764) zu Retrovirus zu produzieren. Nach Transfektion mit dem pBaBepuro Konstrukt das Gen von Interesse enthält, wird das PLAT-E-Zellinie ecotropen Retroviren, die verwendet werden können, um NIH 3T3 Zellen zu infizieren, zu erzeugen. Tseine Methode der viralen Gentransfer ist effizienter als herkömmliche chemische Transfektionsmethoden und bietet einen Weg, um nachhaltig das Gen 10 auszudrücken. Sobald sie in das Genom der NIH-3T3-Zellen eingebaut wird, wird die Überexpression des Gens von Interesse von der viralen langen terminalen Wiederholungen (LTR) -Promotor 11 angetrieben. Diese konstante Ausdruck kann verwendet werden, um festzustellen, ob das Gen von Interesse hat onkogene Aktivität, wie durch die Bildung von Foci auf den NIH 3T3-Zellen gemessen werden.

<table><tbody><tr><td>pBABE-puro-Vektor</td><td>Addgene</td><td>Plasmid 1764</td><td>Klonierungsvektor</td></tr><tr><td>Platinum-E Retrovirale Verpackungszelllinie, Ecotropic</td><td>Cell Biolabs, Inc.</td><td>RV-101</td><td>Zelllinie für die Virusproduktion</td></tr><tr><td>NIH 3T3 Zelllinie murine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93061524</td><td>Zelllinie für den Fokusbildungsassay</td></tr><tr><td>10 ml BD Luer-Lok Spitzenspritze</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td>Reagenz für die Virusproduktion</td></tr><tr><td>0,45 &mu; m Puradisc Spritzenfilter</td><td>Whatman</td><td>6750-2504</td><td>Reagenz für die Virusproduktion</td></tr><tr><td>Polyethylenimin (PEI)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966-2</td><td>Zelltransfektionsreagenz</td></tr><tr><td>Polybrene Infektions- / Transfektionsreagenz</td><td>EMD Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td>Zelltransfektionsreagenz</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Fisher Scientific</td><td>C581-25</td><td>Zellfärbereagenz</td></tr><tr><td>Plasmid Plus Midi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12945</td><td>Plasmidaufreinigung</td></tr><tr><td>BD Falcon Gewebekulturschalen</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td>Zellkultur-Zubehör</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Zellkulturmedien</td></tr><tr><td>0,05 % Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Zellkulturzubehör</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum</td><td>Medium Gibco</td><td>31985-062</td><td>Zellkulturmedien</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>Zellkulturmedien</td></tr></tbody></table>

fokus formation: ein assay auf zellbasis, um das onkogene potential eines gens zu bestimmen

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Die maligne Transformation von Zellen ist typischerweise mit einer erhöhten Proliferation, dem Verlust der Kontakthemmung, dem Erwerb eines verankerungsunabhängigen Wachstumspotenzials und der Fähigkeit, Tumore zu bilden, bei Versuchstieren verbunden1. In NIH-3T3-Zellen ist bekannt, dass der Ras-Signaltransduktionsweg viele dieser Ereignisse auslöst, die sogenannte Ras-Transformation. Die Einführung eines überexprimierten Gens in NIH-3T3-Zellen kann die morphologische Transformation und den Verlust der Kontakthemmung fördern, was dazu beitragen kann, das onkogene Potenzial des interessierenden Gens zu bestimmen. Ein Assay, der eine einfache Methode zur Bewertung eines Aspekts des Transformationspotenzials eines Onkogens bietet, ist der Focus Formation Assay (FFA)2. Wenn sich NIH-3T3-Zellen in Kultur normal teilen, tun sie dies, bis sie eine konfluente Monoschicht erreichen. In Gegenwart eines überexprimierten Onkogens können diese Zellen jedoch beginnen, in dichten, mehrschichtigen Foci1 zu wachsen, die durch Kristallviolett- oder Hema-3-Färbung sichtbar gemacht und quantifiziert werden können. In diesem Artikel beschreiben wir das FFA-Protokoll mit retroviraler Transduktion des interessierenden Gens in NIH 3T3-Zellen und wie die Anzahl der Herde durch Färbung quantifiziert werden kann. Die retrovirale Transduktion bietet eine effizientere Methode der Genübertragung als die Transfektion, und die Verwendung eines ökotropen murinen Retrovirus bietet eine biologische Sicherheitskontrolle bei der Arbeit mit potenziellen menschlichen Onkogenen.

MXD3 eine basische Helix-Loop-Helix-Leucin-Zipper (bHLHZ) Transkriptionsfaktor, der ein Mitglied der MYC / MAX / MAD-Netzwerk ist. Es ist ein atypisches Mitglied der Familie MAD 13-15, und es wurde berichtet, dass bei der Karzinogenese 16,17 beteiligt sein. Im Vergleich zu pBaBepuro (negative Kontrolle) und MYC (positive Kontrolle), die NIH 3T3 Geschirr wo MXD3 überexprimiert wurde, hatten signifikant weniger Foci (1A). Die Daten in Abbildung 1B wurden aus verschie...

Der Fokus Formation Assay bietet eine einfache Methode, um die transformierende Potential eines Kandidaten Onkogen zu bewerten.

Fokus Formation: Ein Assay auf Zellbasis, um das onkogene Potential eines Gens zu bestimmen

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Fokusbildungs-Assay in Mausfibroblasten-Zelllinien mithilfe eines Retrovirus durchzuführen, um das onkogene Potenzial eines Gens zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Sequenz des interessierenden Gens in einen retroviralen Vektor kloniert wird. Der zweite Schritt besteht darin, retrovirale Partikel unter Verwendung des viralen Vektors und der PLA-e-Verpackungszellen herzustellen.Anschließend wird das Retrovirus verwendet, um NIH 3T3-Mausfibroblasten zu infizieren, um das transformierende Potenzial des Gens von Interesse zu bewerten. Im letzten Schritt werden die NIH 3T3-Zellen zwei bis drei Wochen lang proliferieren gelassen, gefolgt von einer Kristallviolettfärbung, um die Anzahl der gebildeten Herde zu quantifizieren. Letztendlich dient der Fokusformationsassay dazu, zu zeigen, ob eine Überexpression eines Gens von Interesse ausreicht, um ein dichteunabhängiges Wachstum in Mausfibroblasten auszulösen.Mithilfe dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Krebsbiologie beantworten, beispielsweise die Untersuchung des onkogenen Potenzials eines Gens. Zunächst wird der virale Vektor wie im textlichen Protokoll beschrieben hergestellt. Anschließend werden Plat-E-Kulturen aus gefrorenen Zellen angelegt, indem die Plat-E-Zellen schnell in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius aufgetaut und danach in ein 15-Milliliter-Konischgefäß überführt werden.Langsam neun Milliliter PLA-E-Medium in den 15-Milliliter-Konikalrohr geben. Das Rohr bei 180 × g fünf Minuten lang zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Die Zellen mit 10 Millilitern Plat-E-Medium resuspendieren und in eine 10-Zentimeter-Kulturschale überführen.Dann inkubieren Sie die Zellen in einem 37 °C warmen Inkubator mit 5 % CO2, bis sie 80 bis 90 % konfluent sind. Führen Sie die Zellteilung durch, indem Sie zunächst das Medium absaugen, die Zellen einmal mit PBS waschen und dann zwei Milliliter 0,05 %iger Trypsin-EDTA-Lösung hinzufügen und eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren. Lösen Sie die Zellen durch vorsichtiges Antippen der Flasche mit dem Finger. Anschließend 10 Milliliter Plattenmedium hinzufügen und die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführen.Zentrifugieren Sie das Röhrchen wie zuvor und resuspendieren Sie die Zellen in 10 Milliliter Plat-E-Medium. Impfen Sie anschließend 2 Millionen Zellen pro 10-Zentimeter-Kulturschale in Plat-E-Medium ohne Antibiotika aus und lassen Sie die Zellen über Nacht inkubieren. Am nächsten Tag übertragen Sie 300 Mikroliter OptiMEM in ein 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen.Fügen Sie 27 Mikroliter Polyethylenamin zu dem vorbereiteten Röhrchen mit Optum hinzu. Vorsichtig durch Fingerklopfen mischen und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Danach neun Mikrogramm Transfektionsgrad-Plasmid-DNA zu dem Röhrchen geben, vorsichtig durch Vortexen mischen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Anschießend die Mischung tropfenweise in die Platte E-Schale geben und über Nacht inkubieren. Am nächsten Tag das Medium, das das Transfektionsreagenz enthält, abziehen und 10 Milliliter frisches Platte E-Medium hinzufügen, bevor die Zellen zurück in den Inkubator gegeben werden, um NIH drei T drei-Kulturen anzulegen. Zunächst die Zellen schnell in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auftauen und in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführen.Langsam neun Milliliter NIH drei, T drei Medium zu den Zellen hinzufügen, das Gefäß 5 Minuten bei 180 ×g zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Anschließend die Zellen in 10 Milliliter NIH drei, T drei Medium resuspendieren und in eine 10 Zentimeter große Kulturschale überführen. Die Zellen in einem 37 °C warmen Inkubator mit 5 % CO2 inkubieren, wobei sie unterkonfluent gehalten werden sollen, da die Häufigkeit spontaner Transformation dabei zunimmt.Wenn eine Kultur Konfluenz erreicht hat und dreimal 10 hoch fünf NIH 3T3-Zellen pro 10-Zentimeter-Platte wachsen, über Nacht inkubieren, um am nächsten Tag die Infektion durchzuführen. Am nächsten Tag das retrovirale Überstandmedium von der Plat-E-Platte mittels einer 10-Milliliter-Wegwerfspritze gewinnen, durch einen Nylonmembranfilter mit einer Porengröße von 0,45 Mikrometern filtrieren und in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführen. Vor dem Zurückstellen in den Inkubator 10 Milliliter frisches Plat-E-Medium zu den Zellen geben.Entfernen Sie anschließend das Medium aus der zu infizierenden NIH-3T3-Zellkultur und geben Sie fünf Milliliter reguläres NI-H-3-T-3-Medium sowie fünf Milliliter virushaltigen filtrierten Überstand hinzu. Fügen Sie danach Polybrain zur Kultur hinzu. Die endgültige Konzentration beträgt sechs Mikrogramm pro Milliliter.Inkubieren Sie die Zellen über Nacht, bevor Sie die Infektionsschritte für eine zweite Infektionsrunde wiederholen. Ersetzen Sie nach der Infektion das Virus-haltige Medium durch reguläres IH drei T drei Medium. Lassen Sie die IH drei T drei Zellen zwei bis drei Tage wachsen und ersetzen Sie das Medium nach Bedarf für die Kristallviolett-Färbung.Aspirieren Sie das NIH-3T3-Medium und stellen Sie die Platten auf Eis. Spülen Sie die Platten zweimal mit eiskalter PBS. Fixieren Sie die Zellen mit eiskaltem Methanol für 10 Minuten.Entfernen Sie die Schalen anschließend vom Eis und aspirieren Sie das Methanol. Geben Sie drei Milliliter einer in 25 % Methanol hergestellten 0,5 %igen Kristallviolett-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Schalen fünf Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation aspirieren Sie die Kristallviolett-Lösung und spülen die Schale vorsichtig mit Milli-Q-Wasser, bis beim Spülen keine Farbe mehr abgeht.Lassen Sie die Petrischalen über Nacht unbedeckt auf der Laborbank trocknen. Sobald die Petrischalen trocken sind, messen Sie mit einem Lineal die Kolonien und zählen Sie diejenigen, die einen Durchmesser von mehr als fünf Millimetern aufweisen. Die Zahl MXD drei ist ein basischer Helix-Loop-Helix-Leucin-Zipper-Transkriptionsfaktor, der ein atypisches Mitglied der MAD-Familie darstellt, und es wurde berichtet, dass er im Vergleich zur negativen Kontrolle und zur positiven Kontrolle an der Karzinogenese beteiligt ist.Die NIH-3T3-Platten, in denen MXD3 überexprimiert wurde, wiesen signifikant weniger Foci auf. Die Daten wurden aus mehreren Experimenten gesammelt, um die Signifikanz zu bestimmen, und aus diesem Assay wurden dieselben Trends beobachtet. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass MXD3 gemäß diesem Verfahren nicht als Onkogen funktioniert.Andere Methoden wie der Fokusformationsassay mit Genkombinationen, die Proliferation in weichem Agar und die Zellzyklusanalyse können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Beurteilung der Rolle eines Gens der Interesse bei der Onkogenese und Pathogenese zu beantworten.

focus-formation-cell-based-assay-to-determine-oncogenic-potential

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Video beschreibt einen Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien, um die Auswirkungen eines PADI-Enzyminhibitors und BB-Cl-Amidin auf die Tumorigenität von Brustkrebs in vitro zu testen. Dieser Assay ermöglicht auch die quantitative Beurteilung des Zelltransformationspotenzials im Rahmen genetischer Störungen.

Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien: Eine Methode zum Testen der Auswirkungen neuartiger Verbindungen auf die Proliferation von Krebszellen

Dieses Video beschreibt den Koloniebildungs-Assay, der hilft, die Fähigkeit von Lungenkrebszellen zu bestimmen, sich unbegrenzt zu vermehren und einzelne Kolonien zu bilden. Wir können die Wirkung eines Antikrebsmittels auf die koloniebildenden Zellen analysieren, indem wir die Veränderungen in der Anzahl und/oder Größe der resultierenden Kolonien analysieren.

Colony Formation Assay: Bewertung der Wirksamkeit von Antikrebsmitteln auf koloniebildende Lungenkrebszellen

Dieses Video beschreibt das Protokoll für Methylcellulose-basierte Koloniebildungseinheiten oder CFU-Assays, die helfen, die Anzahl der Kolonien zu identifizieren und zu zählen, die von leukämischen Zellen als Reaktion auf die Behandlung mit Antikrebspräparaten gebildet werden.

CFU-Assay auf Methylcellulose-Basis: Eine Methode zur Bestimmung der Wirkung von Anti-Krebs-Wirkstoffen auf die Koloniebildung in leukämischen Zellen

Das Erreichen einer Systemebene Verständnis zellulärer Prozesse ist ein Ziel der modernen Zellbiologie. Wir beschreiben hier Strategien zum Multiplexen Luciferase Reporter von verschiedenen zellulären Funktion Endpunkte zur Genfunktion mit genomweiten RNAi-Bibliotheken zu verhören.

Ein Multiplex-Luciferase-basierte Screening-Plattform zur Abfrage Krebs-assoziierte Signaltransduktion in kultivierten Zellen

Der Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien ist eine Methode, die verwendet wird, um zelluläres Verankerungsunabhängiges Wachstum in vitro zu bestätigen. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine stringente Methode zum Nachweis des tumorigenen Potenzials transformierter Zellen und der tumorsuppressiven Wirkung von Proteinen auf transformierte Zellen zu veranschaulichen.

Die Soft-Agar Koloniebildungstest

Die Identifizierung neuartiger Wirkstoffziele, die von präklinischen Tests zu Versuchen am Menschen übergehen, ist eine wissenschaftliche Priorität. Zu diesem Zweck beschreiben wir hier einen funktionellen genomischen Ansatz, um die Auswirkungen der Genverarmung auf Sphäroide von Krebszelllinien zu untersuchen, die menschliche Krebserkrankungen in vivo besser modellieren.

Functional Genomics Screening Verwendung zur Identifizierung möglicher neuer Wirkstoff-Targets in Cancer Cell Sphäroid-Kulturen

Wir haben ein neuartiges Protokoll für das Studium der heterozellulären Populationsdynamik als Reaktion auf Störungen entwickelt. Dieses Manuskript beschreibt eine bildgebende Plattform, die quantitative Datensätze zur gleichzeitigen Charakterisierung mehrerer zellulärer Phänotypen heterocyclischer Populationen in einer robusten Weise erzeugt.

Diskriminierung und Charakterisierung von Heterocellular Populationen mit quantitativen Imaging-Techniken

Hier beschreiben wir Protokolle für die genetischen und chemischen Validierung von c-Fos und Dusp1 als Medikament Ziel bei Leukämie mit in vitro und in vivo genetische und humanisierte Mausmodelle. Diese Methode kann auf jedes beliebige Ziel für genetische Validierung und therapeutische Entwicklung angewendet werden.

Methoden zur Bewertung der Rolle von c-Fos und Dusp1 in Abhängigkeit der Onkogen

Dieses Protokoll beschreibt eine reproduzierbare Methode zur Isolierung von Mausrhabdomyosarkom Primärzellen, Tumorsphärenbildung und -behandlung und Allograft-Transplantation ausgehend von Tumorsphärenkulturen.

Tumorsphäre Ableitung und Behandlung von primären Tumorzellen isoliert von Maus Rhabdomyosarkomen

Intrinsisch ungeordnete Domänen sind wichtig für die Funktion des onkogenen Fusionstranskriptionsfaktors. Um diese Proteine therapeutisch anzugreifen, ist ein detaillierteres Verständnis der Regulationsmechanismen dieser Domänen erforderlich. Hier verwenden wir Transkriptomik, um wichtige strukturelle Merkmale der intrinsisch gestörten EWS-Domäne im Ewing-Sarkom abzubilden.

Kartierung der Struktur-Funktions-Beziehungen ungeordneter onkogener Transkriptionsfaktoren mittels Transkriptomanalyse

Dieses experimentelle Protokoll bietet eine stabile, kosteneffiziente und effiziente Methode, die lncRNA-Knockdown mit koloniebildenden Assays kombiniert, um die Wirkung von lncRNA auf die Proliferation von Osteosarkomzellen zu quantifizieren.

Kolonienbildungsassay zur Erkennung der Proliferationskapazität von LncRNA-Knockdown-Osteosarkomzellen

Lernen Sie den Focus-Formation-Assay zur Bestimmung des onkogenen Potenzials eines Gens in Maus-Fibroblasten. Diese Methode nutzt Retroviren und Kristallviolett-Färbung zur Quantifizierung.

Fokus Formation: Ein Assay auf Zellbasis, um das onkogene Potential eines Gens zu bestimmen

Weitere Videos entdecken