Fokus Formation: Ein Assay auf Zellbasis, um das onkogene Potential eines Gens zu bestimmen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Fokusbildungsassay in Maus-Fibroblastenzelllinien durchzuführen, wobei ein Retrovirus verwendet wird, um das onkogene Potenzial eines Gens zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Sequenz für das interessierende Gen in einen retroviralen Vektor kloniert wird. Der zweite Schritt besteht darin, retrovirale Partikel mit Hilfe des viralen Vektors und der PLA-e-Verpackungszellen herzustellen.

Als nächstes wird das Retrovirus verwendet, um NIH-Drei-T-Drei-Maus-Fibroblastenzellen zu infizieren, um das Transformationspotenzial des interessierenden Gens zu bewerten. Der letzte Schritt besteht darin, die drei T-3-Zellen des NIH zwei bis drei Wochen lang teilen zu lassen, gefolgt von einer Kristallviolett-Färbung, um die Anzahl der gebildeten Herde zu quantifizieren. Letztendlich wird der Fokusbildungsassay verwendet, um zu zeigen, ob die Überexpression eines interessierenden Gens ausreicht, um ein dichteunabhängiges Wachstum in Maus-Fibroblastenzellen zu induzieren.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Krebsbiologie zu beantworten, wie z.B. das Screening auf das onkogene Potenzial eines Gens. Erstellen Sie zunächst den viralen Vektor, wie im Textprotokoll beschrieben. Dann etablieren Sie Plat-E-Kulturen aus gefrorenen Zellen, indem Sie Plat-E-Zellen schnell in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auftauen und dann in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen umfüllen.

Geben Sie langsam neun Milliliter PLA E Medium in das konische 15-Milliliter-Röhrchen. Das Röhrchen wird fünf Minuten lang bei 180-fachem G zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Zellen werden mit 10 Millilitern Plat-E-Medium resuspendiert und in eine 10-Zentimeter-Kulturschale gegeben.

Dann inkubieren Sie die Zellen in einem 37 Grad Celsius heißen 5%CO2-Inkubator, bis sie zwischen 80 und 90% konfluent sind. Führen Sie eine Zellteilung durch, indem Sie zuerst das Medium aspirieren, dann die Zellen einmal mit PBS waschen, bevor Sie zwei Milliliter 0,05%ige Trips in EDTA hinzufügen und eine Minute lang bei Raumtemperatur inkubieren, dann lösen Sie die Zellen durch Fingerklopfen. Geben Sie dann 10 Milliliter Plat-E-Medium hinzu und geben Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen wie zuvor und resuspendieren Sie die Zellen mit 10 Millilitern Plat-E-Medium. Nächster Seed, 2 Millionen Zellen pro 10-Zentimeter-Kulturschale mit Plat-E-Medium ohne Antibiotika und die Zellen über Nacht inkubieren lassen. Am nächsten Tag 300 Mikroliter Optimum in ein 1,5 Milliliter Mikroröhrchen umfüllen.

Geben Sie 27 Mikroliter Polyethylenamin in das vorbereitete Röhrchen mit Optum. Vorsichtig mit den Fingern klopfen mischen und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie anschließend neun Mikrogramm Plasmid-DNA in Transfektionsqualität in das Röhrchen, mischen Sie es vorsichtig durch Vortexen und inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Dann die Mischung tropfenweise in die Platte E geben, bevor sie über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag aspirieren Sie das Medium, das das Transfektionsreagenz enthält, und fügen Sie 10 Milliliter frisches Plat-E-Medium hinzu, bevor Sie die Zellen in den Inkubator zurückbringen, um NIH-Drei-T-Drei-Kulturen zu etablieren. Tauen Sie die Zellen zunächst in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad schnell auf und geben Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen.

Geben Sie langsam neun Milliliter NIH drei, T drei Medium in die Zellen, zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 180 mal G und verwerfen Sie das Snat. Dann resuspendieren Sie die Zellen mit 10 Millilitern NIH drei, T drei Medium und geben Sie sie in eine 10 Zentimeter große Kulturschale. Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 Grad Celsius heißen 5%-CO2-Inkubator und halten Sie sie unter Konfluente, wenn die Häufigkeit der spontanen Umwandlung zunimmt.

Sobald eine Kultur die Co-Fluenz erreicht, sät sie einmal gezüchtet dreimal 10 bis zur fünften Nih, drei T drei Zellen pro 10 Zentimeter Schale und inkubiert über Nacht für die Infektion am nächsten Tag. Ernten Sie am nächsten Tag den retroviralen Überstand aus der Plat-E-Schale, indem Sie eine 10-Milliliter-Einwegspritze verwenden, ihn durch einen Nylonmembranfilter mit einer Porengröße von 0,45 Mikrometern filtrieren und in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführen. Geben Sie 10 Milliliter frisches Plat-E-Medium in die Zellen, bevor Sie sie in den Inkubator zurückbringen.

Aspirieren Sie dann das Medium aus der NIH-Drei-T-Drei-Zellen-Schale, die infiziert werden soll, und fügen Sie fünf Milliliter reguläres NI H drei, T drei Medium und fünf Milliliter Virus, das gefilterten Überstand enthält, hinzu. Als nächstes fügen Sie dem Gericht Polyhirn hinzu. Fügen Sie eine Konzentration von sechs Mikrogramm pro Milliliter hinzu.

Inkubieren Sie die Zellen über Nacht, bevor Sie die Infektionsschritte für eine zweite Infektionsrunde wiederholen. Ersetzen Sie nach der Infektion das Virus, enthalten Sie Medium mit normalem IH drei T drei Medium. Lassen Sie die drei T-Drei-Zellen des IH zwei bis drei Zellen lang wachsen und ersetzen Sie das Medium nach Bedarf für die Kristallviolettfärbung.

Aspirieren Sie das NIH drei T drei Medium und stellen Sie die Schalen auf Eis. Spülen Sie das Geschirr zweimal mit eiskaltem PBS. Fixieren Sie die Zellen 10 Minuten lang mit eiskaltem Methanol.

Nehmen Sie dann das Geschirr aus dem Eis und saugen Sie das Methanol an. Fügen Sie drei Milliliter 0,5%ige Kristallviolettlösung aus 25%Methanol hinzu und inkubieren Sie die Schalen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation die kristallviolette Lösung ansaugen und die Schale vorsichtig mit Milli Q Wasser ausspülen, bis sich beim Spülen keine Farbe mehr löst.

Lassen Sie das Geschirr unbedeckt über Nacht auf einer Arbeitsplatte trocknen. Sobald das Geschirr trocken ist, verwenden Sie ein Lineal, um die Brennpunkte zu messen und diejenigen zu zählen, die einen Durchmesser von mehr als fünf Millimetern haben. Die Zahl MXD drei ist ein grundlegender Helix-Schleifen-Helix-Leucin-Reißverschluss-Transkriptionsfaktor, der ein atypisches Mitglied der MAD-Familie ist und von dem berichtet wurde, dass er im Vergleich zur Negativkontrolle und der Positivkontrolle an der Karzinogenese beteiligt ist.

Die NIH drei T drei Schüsseln, bei denen MXD drei überexprimiert wurde, hatten signifikant weniger Herde. Die Daten wurden aus mehreren Experimenten gesammelt, um die Signifikanz zu bestimmen, und die gleichen Trends wurden bei diesem Assay beobachtet. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass MXD drei nach diesem Verfahren nicht als Onkogen fungiert.

Andere Methoden wie der Fokusbildungsassay mit Genkombinationen, das Wachstum der Softschneckenproliferation und die Zellzyklusanalyse können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten: Um die Rolle eines Gens von Interesse in der Onkogenese-Pathogenese zu beurteilen.