Wohnung Berg-Imaging von Mäusehaut und ihre Anwendung auf die Analyse von Mustern und die Haarfollikel Sinnes Axon Morphologie

Säugetier-Haut enthält eine Vielfalt von Strukturen - wie Haarfollikel und Nervenenden - das charakteristische Muster der räumlichen Organisation zu zeigen. Die Analyse der Haut als flache Halterung nutzt die Vorteile der 2-dimensionalen Geometrie dieses Gewebe voller Dicke hochauflösende Bilder der Strukturen der Haut zu produzieren.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Hautstrukturen wie Haarfollikel und Nervenenden in ihrer Gesamtheit sichtbar zu machen, ohne die Probe physisch zu schneiden. Dies wird erreicht, indem zunächst Haut aus verschiedenen Körperregionen gesammelt wird, einschließlich des Rückens, der Hinterpfote und des Schwanzes. Der zweite Schritt besteht darin, die Hautproben zu glätten und zu reinigen.

Die nächsten Hautproben werden einer geeigneten Fixierung unterzogen. Der letzte Schritt besteht darin, die Hautproben mit Immunos zu färben oder eine Histochemie durchzuführen. Letztendlich wird die Bildgebung mit einem Präparier- oder Konfokalmikroskop verwendet, um die Geometrie verschiedener Hautstrukturen sichtbar zu machen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der epidermalen Hormonpräparation besteht darin, dass sie an jeder Stelle des Körpers auf die Haut aufgetragen werden kann und keine Trennung der Epidermis von der Dermis erfordert. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen bei der Untersuchung der Polarität von Plantarzellen zu beantworten. Da die zweidimensionale Geometrie der Haut und die seltsame Anordnung der Haarfollikel die Haut zum idealen System machen, um diesen Prozess zu untersuchen, kann diese Methode nicht nur Einblicke in die Polarität von Pflanzenzellen geben, sondern auch zur Untersuchung anderer Aspekte der Hautentwicklung angewendet werden, wie z.B. die Definition somatosensorischer Neuronentypen basierend auf der direkten Visualisierung individueller Einwirkungen auf die oberen Morphologien.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Hauttrennung an einigen Regionen wie den Füßen und dem Schwanz schwer zu erlernen ist, es wichtig ist, sie perfekt zu glätten und Falten und Überdehnungen zu vermeiden. In dieser Demonstration wird die Rückenhaut von P drei Mäusen entnommen, die mit Isof-Fluor euthanasiert wurden. Bei der Inhalation wird mit den Klingen ein horizontaler Schnitt von der Basis des Schwanzes entlang jeder Flanke gemacht, der an der dorsalen Seite der Basis jedes Gliedes verläuft, lateral zu den Ohren verläuft und an der Nase endet.

Ziehen Sie die Haut vorsichtig vom darunter liegenden Gewebe ab, indem Sie die Haut zwischen den behandschuhten Fingern halten, damit sie nicht von einer Pinzette eingeklemmt wird. Wenn Sie die Haut zuerst auf Höhe der Ohren schälen, schneiden Sie die Ohren mit einer Schere ab und gehen Sie besonders langsam vor, da die Haut an dieser Stelle einreißen kann. Richten Sie die Haut von diesem Punkt an mit der Innenseite nach oben aus.

Stecken Sie die Haut mit etwa 20 Insektenstecknadeln, die gleichmäßig um die Peripherie verteilt sind, an den S Guard. Überdehnen Sie die Haut nicht. Bedecken Sie die Haut mit 10 bis 20 Millilitern PBS mit einer abgewinkelten oder gebogenen Pinzette.

Zerlegen Sie das mit der Haut verbundene Fett und Bindegewebe. Richten Sie das spitze Ende der Pinzette horizontal aus, um das Risiko zu minimieren, dass die Pinzette in die Haut eindringt. Extrudieren Sie alle Luftblasen, die unter der Haut eingeschlossen wurden, indem Sie einen Applikator mit Baumwollspitze vorsichtig über die Hautoberfläche rollen.

Der nächste Schritt besteht darin, die Pin-Skin zu fixieren. Wenn die Haut für die Melanin-Bildgebung oder die Histochemie der alkalischen Phosphatase verwendet werden soll, fügen Sie 20 Milliliter pro 10 Zentimeter Zigarrenplatte mit frisch zubereitetem 4%P-F-A-P-B-S oder 10%gepuffertem Formin hinzu. Wenn die Haut für die Immunfärbung oder die Visualisierung eines transgenen Keratins verwendet werden soll, KRT 17 GFP 20 Milliliter pro 10 Zentimeter hinzufügen sogar Platte mit frisch zubereiteten 2%P-F-A-P-B-S am nächsten Tag sanft über Nacht in einem kalten Raum rotieren, länger als 10 Minuten in PBS waschen.

Das Verfahren zur Histochemie der alkalischen Phosphatase wird in diesem Video nicht demonstriert. Für die Melanin-Bildgebung dehydrieren Sie die Haut einen Tag lang für jeden Schritt durch eine abgestufte Ethanolserie mit sanfter horizontaler Drehung bei Raumtemperatur. Drei Tage später entfernen Sie Bindegewebsreste von der dehydrierten Hauthaut, wobei die Haut in 100%igem Ethanol enthalten ist.

Entfernen Sie die Insektenstifte und geben Sie die Haut in eine Glasschale mit einem Durchmesser von 10 Zentimetern. Für den Erfolg dieses Verfahrens muss die Hautprobe als intaktes Stück entnommen und perfekt abgeflacht werden. Legen Sie zwei Glasobjektträger auf die Haut, um sie zu glätten und zu verhindern, dass sie sich kräuselt.

Fügen Sie 20 Milliliter Benzoylbenzoat und Benzoylalkohol oder BBBA hinzu, die das Gewebe in den nächsten Stunden schnell aushärten. Hebe die Objektträger für ein paar Sekunden von der Haut, damit der BBBA über die Haut gleiten kann. Die Fußhaut für die Analyse der Haarfollikelmusterung wird bei Tieren typischerweise von P eins bis P acht präpariert. Nach der Euthanasie schneiden Sie die Füße oberhalb des Sprunggelenks ab und machen Sie einen einzigen geraden Schnitt entlang der Bauchfläche durch die Fußsohlen

Ziehen Sie die Haut vorsichtig vom darunter liegenden Gewebe ab, indem Sie in proximaler bis distaler Richtung vorgehen. Schneide die Finger ab, um die Haut zu lösen, und stecke die Haut mit der Innenseite nach oben an die Sarde. Es gibt nur minimales Bindegewebe am Fuß.

Haut transgen. Die KRT 17 GFP-Haut ist jetzt bereit für die Bildgebung von Melaninen. Fixieren und bearbeiten Sie die Haut wie zuvor für die Rückenhaut gezeigt Nach der Euthanasie des P 21-Tieres entfernen Sie die Haare durch Reiben mit Haarentferner.

Mit einem behandschuhten Finger und Daumen auf die Hautoberfläche auftragen und 10 Minuten warten. Waschen Sie die Hautoberfläche mit Leitungswasser. Präparieren Sie anschließend die Fußhaut und stecken Sie sie an den S-Schutz, wie zuvor gezeigt.

Mit 1%P-F-A-P-B-S 30 Minuten bei Raumtemperatur fixieren und dann in PBS waschen. Um die Schwanzhaut vorzubereiten, machen Sie einen kreisförmigen Schnitt um die Basis des Schwanzes und dann einen Längsschlitz, der über die gesamte Länge des Schwanzes entlang seiner Bauchfläche verläuft. Ziehen Sie die Schwanzhaut von der Spitze aus ab, indem Sie die Spitze des Steißbeins und/oder des Bindegewebes mit einer Pinzette und die Haut mit einer zweiten Pinzette fest greifen.

Stecken Sie die Schwanzhaut an den SIL-Schutz, um die Melaninverteilung und die Ausrichtung der Haarfollikel zu analysieren. Fixieren und bearbeiten Sie die Haut, wie es für die Rückenhaut zur Analyse der Talgdrüsen vor der Fixation gezeigt wird. Schneiden Sie die Haut der Schwänze in eine Reihe von Segmenten von etwa 0,5 bis einem Zentimeter Länge und inkubieren Sie die Hautstücke über Nacht bei 37 Grad Celsius in PBS fünf Millimolar EDTA.

Um die Adhäsion der Dermis Epidermis am nächsten Tag zu schwächen, schälen Sie die Epidermis vorsichtig von der Dermis. Stecken Sie die Epidermisschnittstelle bis zum S-Schutz und fixieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur in 4%P-F-A-P-B-S. Anschließend die Epidermis mit PBS waschen und mit Öl rot O färben, wie im Protokolltext beschrieben.

Ein Präpariermikroskop wird verwendet, um die Haut des hinteren Fußes oder des Schwanzes abzubilden, die in BBBA getaucht, unter dem Objektträger abgeflacht und noch in der Glasschale liegt. Dieser Ansatz minimiert die BBBA-Kontamination des Mikroskops. Beleuchten Sie die Schüssel von unten, um räumliche Schwankungen der Lichtintensität über das gesamte Sichtfeld zu minimieren.

Heben Sie die Glasschale auf eine Höhe von etwa 10 Zentimetern über die Standardarbeitsfläche des Präpariermikroskops an und legen Sie eine streuende Kunststoff- oder Glasplatte über die Lichtquelle. Wenn die Bildgebung abgeschlossen ist, setzen Sie die Haut wieder auf 100 % Ethanol für die Langzeitlagerung bei minus 20 Grad Celsius. Um mit alkalischer Phosphatase gefärbte Haut für die Bildgebung vorzubereiten, legen Sie sie zwischen zwei Glasplatten, wie sie für kleine Proteingele verwendet werden.

Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen zwischen den Platten und der Haut entstehen. Überschüssiges BBBA vorsichtig mit einem Papiertuch abwischen. Legen Sie dieses Sandwich aus Plattenhautplatte auf einen Mikroskoptisch.

Verwenden Sie eine Hellfeld- oder DIC-Beleuchtung mit einem 10-fach-Objektiv und zwei Mikrometer- oder fünf Mikrometer-Z-Schritten. Verwenden Sie einen mechanisierten XY-Tisch, um eine Montage von XY-Bildern zu erfassen, die zu einem einzigen dreidimensionalen Graustufen-Dataset zusammengefügt werden. Führen Sie eine halbautomatische Verfolgung von Axondornen mit einer Vielzahl von Softwarepaketen durch.

Die Hellfeld-Bildgebung von flachen Halterungen der Haut kann verwendet werden, um eine einzelne hier gezeigte Hautwelle mit ihrem nachgezeichneten Bild abzubilden. Die Hellfeld-Bildgebung ermöglicht auch die Visualisierung von Haarfollikelmustern auf der Grundlage der Melaninpigmentierung. Diese Bilder zeigen P eine Haut von Wildtyp- und gekräuselten sechs Knockout-Mäusen und P sieben Haut von gekräuselten sechs Knockout-Mäusen.

Die lichtmikroskopische Bildgebung von flachen Halterungen der Haut kann verwendet werden, um die Geometrie von Talgdrüsen und -schwänzen zu bestimmen. Die mit Öl dargestellte Haut der Talgdrüsen von O ist bei einer gekräuselten Maus mit sechs Knockouts im Vergleich zu einem Wildtyp-Rückenfuß unorganisiert. Die Haut von sechs Knockout-Mäusen, die ein GFP-markiertes Keratin KRT 17 GFP trugen, wurde entnommen und mit Öl befleckt.

Red O enthüllte, dass die Knockout-Haut einen Haarwirbel in der Mitte hat. Die konfokale Bildgebung von flachen Hauthalterungen kann auch die Geometrie von Haarfollikeln bestimmen, die mit KRT 17 GFP und Anti-GFP-Immunfärbung und Erector-Pille sichtbar gemacht werden. Augenmuskeln sichtbar gemacht mit Anti-Smoo-Muskel-Aktin-Immunfärbung.

Merkel-Zell-Cluster werden mit Anti-Cytokeratin-Acht oder mit am 1 43 Farbstoffaufnahme visualisiert und ihr zentraler Haarfollikel wird mit KRT 17 GFP visualisiert. Anstatt nach vorne hin offen zu sein, bildet der Frizzled Six Knockout-Merkel-Zell-Cluster einen geschlossenen Kreis. Einmal gemeistert, kann eine Dissektion in etwa 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird, und verschiedene Stände können innerhalb weniger Tage bis zu einer Woche durchgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Haut aus verschiedenen Körperregionen sammelt und wie man sie aufhält, um verschiedene Hautstrukturen im Hormonformat zu visualisieren. Bilder von Hautstrukturen in voller Dicke und hoher Auflösung können mit der Standard-Hochlichtmikroskopie und der konfokalen Mikroskopie aufgenommen werden.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd und BBBA äußerst gefährlich sein kann. Das Einatmen von Dämpfen sollte minimiert werden, indem diese Lösungen in abgedeckten Behältern aufbewahrt und Hautkontakte vermieden werden. Lassen Sie BBBA nicht mit Kunststoff in Berührung kommen.