Wohnung Berg-Imaging von Mäusehaut und ihre Anwendung auf die Analyse von Mustern und die Haarfollikel Sinnes Axon Morphologie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Hautstrukturen wie Haarfollikel und Nervenenden vollständig und ohne physikalisches Schneiden der Probe sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst Haut von verschiedenen Körperregionen, einschließlich der Rückenseite der Hinterpfote und des Schwanzes, gesammelt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Hautproben zu glätten und zu reinigen.

Anschließend werden Hautproben einer geeigneten Fixierung unterzogen. Der letzte Schritt besteht darin, Immunfärbungen oder Histochemie an den Hautproben durchzuführen. Abschließend erfolgt die Bildgebung mittels eines Stereomikroskops oder konfokalen Mikroskops, um die Geometrie verschiedener Hautstrukturen sichtbar zu machen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Herstellung von epidermalen Hormonpräparaten besteht darin, dass sie auf die Haut an beliebiger Stelle des Körpers angewendet werden kann und nicht die Trennung der Epidermis von der Dermis erfordert. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen bei der Untersuchung der Zellpolarität in der Fußsohle zu beantworten. Da die zweidimensionale Geometrie der Haut und die ungewöhnliche Anordnung der Haarfollikel das Hautsystem ideal für die Erforschung dieses Prozesses machen, kann diese Methode nicht nur Erkenntnisse zur Pflanzenzellpolarität liefern, sondern auch zur Untersuchung anderer Aspekte der Hautentwicklung eingesetzt werden, beispielsweise zur Definition von Somatosensorik-Neuronentypen basierend auf der direkten Visualisierung einzelner Aktionen an oberflächlichen Morphologien.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Hautentnahme aus bestimmten Regionen wie den Pfoten und dem Schwanz schwer zu erlernen ist; ein perfektes Glätten unter Vermeidung von Falten und Überdehnung ist wichtig. In dieser Demonstration wird die dorsale Haut von drei durch Isofluran euthanasierten Mäusen entnommen. Unter Verwendung von Klingen wird ein horizontaler Schnitt von der Schwanzwurzel entlang jeder Flanke angelegt, wobei die dorsale Seite der Basis jedes Gliedes passiert und lateral bis zu den Ohren verläuft, und an der Nase endet.

Die Haut vorsichtig von dem darunterliegenden Gewebe ablösen, wobei man von posterior nach anterior vorgeht, indem man die Haut zwischen behandschuhten Fingern hält, sodass sie nicht mit der Pinzette eingeklemmt wird. Beim Abziehen der Haut im Bereich der Ohren zuerst die Ohren mit einer Schere abschneiden und besonders langsam vorgehen, da die Haut an dieser Stelle reißen kann. Ab diesem Punkt die Haut so ausrichten, dass die Innenseite nach oben zeigt.

Fixieren Sie die Haut mit etwa 20 Insektennadeln gleichmäßig am S-Guard am Rand. Dehnen Sie die Haut nicht übermäßig. Bedecken Sie die Haut mit 10 bis 20 Milliliter PBS unter Verwendung von winklig gebogenen oder gekrümmten Pinzetten.

Entfernen Sie die mit der Haut verbundenen Fett- und Bindegewebsanteile. Richten Sie das spitze Ende der Pinzette horizontal aus, um das Risiko zu minimieren, dass die Pinzette die Haut durchdringt. Drücken Sie eingeschlossene Luftblasen unter der Haut vorsichtig heraus, indem Sie einen mit Watte besetzten Applikator über die Hautoberfläche rollen.

Der nächste Schritt besteht darin, die Hautprobe zu fixieren. Falls die Haut für die Melanin-Bildgebung oder die alkalische Phosphatase-Histochemie verwendet wird, geben Sie 20 Milliliter pro 10 Zentimeter große Schale frisch zubereitete 4 % PFA-PBS oder 10 % gepufferten Formalin zu. Falls die Haut für die Immunfärbung oder die Visualisierung eines transgenen Keratins, KRT17-GFP, verwendet wird, geben Sie 20 Milliliter pro 10 Zentimeter große Schale frisch zubereitete 2 % PFA-PBS hinzu und rotieren Sie die Probe sanft über Nacht im Kühlschrank. Am folgenden Tag waschen Sie die Probe mehr als 10 Minuten lang in PBS.

Das Verfahren der alkalischen Phosphatase-Histochemie wird in diesem Video nicht demonstriert. Für die Melanin-Bildgebung dehydrieren Sie die Haut durch eine abgestufte Ethanolreihe, wobei jeder Schritt einen Tag dauert und eine sanfte horizontale Rotation bei Raumtemperatur erfolgt. Drei Tage später entfernen Sie das restliche Bindegewebe von der dehydrierten Haut, wobei die Haut in 100 % Ethanol gegeben wird.

Entfernen Sie die Insektennadeln und überführen Sie die Hautprobe in eine Glaspetrischale mit einem Durchmesser von 10 Zentimetern. Für den Erfolg dieses Verfahrens muss die Hautprobe als intaktes Stück entnommen und vollständig geglättet werden. Legen Sie zwei Objektträger auf die Haut, um sie zu glätten und ein Aufrollen zu verhindern.

Fügen Sie 20 Milliliter Benzoylbenzoat und Benzoylalkohol oder BBBA hinzu, wodurch das Gewebe innerhalb der nächsten Stunden schnell verfestigt wird. Heben Sie die Deckgläser für einige Sekunden von der Haut ab, damit das BBBA über die Haut fließen kann. Fußhaut zur Analyse der Haarfollikel-Anordnung wird typischerweise von postnatalen Tag eins bis postnatalen Tag acht von Tieren entnommen. Nach der Tötung schneiden Sie die Füße oberhalb des Sprunggelenks ab und führen einen einzigen geraden Schnitt entlang der ventralen Fläche durch die Fußsohlen hindurch.

Lösen Sie die Haut vorsichtig von dem darunterliegenden Gewebe, wobei Sie in Richtung von proximal nach distal vorgehen. Durchtrennen Sie die Zehen, um die Haut zu lösen, und heften Sie die Haut mit der Innenseite nach oben gerichtet auf einen Untergrund. Am Fuß ist nur wenig Bindegewebe vorhanden.

Haut-transgen. Die KRT17-GFP-Haut ist nun bereit für die Bildgebung zur Melanin-Darstellung. Fixieren und verarbeiten Sie die Haut wie zuvor für die dorsale Haut gezeigt. Nach der Euthanasie des P21-Tieres entfernen Sie die Haare durch Abreiben mit Haarentfernungsmittel.

Tragen Sie das Gel mit einem behandschuhten Finger und Daumen auf die Hautoberfläche auf und warten Sie 10 Minuten. Waschen Sie die Hautoberfläche mit Leitungswasser ab. Anschließend dissezieren und fixieren Sie die Fußhaut wie zuvor gezeigt an eine S-Halterung.

Fixieren Sie mit 1 % PFA in PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur und waschen Sie anschließend in PBS. Um die Schwanzhaut vorzubereiten, führen Sie einen kreisförmigen Schnitt um die Basis des Schwanzes herum und anschließend einen Längsschnitt entlang der ventralen Seite des Schwanzes über dessen gesamte Länge durch. Lösen Sie die Schwanzhaut ab, beginnend an der Spitze, indem Sie die Schwanzspitze oder das Bindegewebe mit einer Pinzette festhalten und die Haut mit einer zweiten Pinzette greifen.

Nadeln Sie die Schwanzhaut auf die SIL-Abdeckung, um die Melaninverteilung und die Haarfollikelorientierung zu analysieren. Fixieren und verarbeiten Sie die Haut wie für die dorsale Haut gezeigt, um die Talgdrüsen vor der Fixierung zu untersuchen. Schneiden Sie die Schwanzhaut in eine Reihe von Segmenten mit einer Länge von etwa 0,5 bis einem Zentimeter und inkubieren Sie die Hautstücke über Nacht bei 37 °C in PBS mit fünf Millimolar EDTA.

Um die Adhäsion zwischen Dermis und Epidermis am folgenden Tag zu schwächen, die Epidermis vorsichtig von der Dermis ablösen. Die Epidermis mit der Oberfläche nach oben auf eine S-Halterung aufspannen und eine Stunde bei Raumtemperatur in 4 % PFA-PBS fixieren. Anschließend die Epidermis mit PBS waschen und wie im Protokolltext beschrieben mit Oil Red O färben.

Ein Stereomikroskop wird verwendet, um Hautproben von dorsalen Fuß- oder Schwanzbereichen abzubilden, die in BBBA unter einer Glasplatte abgeflacht und weiterhin in der Glaswanne liegen. Diese Vorgehensweise minimiert die Kontamination des Mikroskops mit BBBA. Beleuchten Sie die Wanne von unten, um räumliche Schwankungen der Lichtintensität im Beobachtungsfeld zu minimieren.

Heben Sie die Glaswanne auf eine Höhe von etwa 10 Zentimetern über die Standardarbeitsfläche des Auflichtmikroskops an und legen Sie eine diffusierende Kunststoff- oder Glasplatte über die Lichtquelle. Nach Abschluss der Bildaufnahme kehren Sie die Haut in 100 % Ethanol für die Langzeitlagerung bei minus 20 Grad Celsius zurück. Um die alkalische Phosphatase-gefärbte Haut für die Bildaufnahme vorzubereiten, legen Sie sie zwischen zwei Glasplatten des Typs, der für kleine Proteingele verwendet wird.

Unter Vorsicht, um Luftblasen zwischen den Platten und der Haut zu vermeiden. Vorsichtig überschüssiges BBBA mit einem Papiertuch abwickeln. Dieses Sandwich aus Platte, Haut und Platte auf einen Mikroskoptrichter legen.

Verwenden Sie Hellfeld- oder DIC-Beleuchtung mit einem 10×-Objektiv und Z-Schritten von zwei oder fünf Mikrometern. Nutzen Sie einen motorisierten XY-Tisch, um eine Montage von XY-Bildern aufzunehmen, die zusammengefügt werden, um einen einzigen dreidimensionalen Graustufen-Datensatz zu erzeugen. Führen Sie eine halbautomatische Verfolgung der Axonbäume mit einer beliebigen Softwarelösung durch.

Die Hellfeld-Bildgebung von Haut-Präparaten kann verwendet werden, um einen einzelnen kutanen sensorischen Arbor darzustellen, der hier mit seinem nachgezeichneten Bild gezeigt ist. Die Hellfeld-Bildgebung ermöglicht zudem die Visualisierung von Haarfollikelmustern basierend auf der Melaninpigmentierung. Diese Bilder zeigen die P1-Haut von Wildtyp- und Frizzled-sechs-Knockout-Mäusen sowie die P7-Haut von Frizzled-sechs-Knockout-Mäusen.

Mithilfe der Lichtmikroskopie-Aufnahmen von Haut-Präparaten in flacher Anordnung kann die Geometrie der Talgdrüsen und -anhänge bestimmt werden. Bei der mit Oil Red O angefärbten Haut erscheinen die Talgdrüsen bei einem Frizzled-sechs-Knockout-Mausmodell im Vergleich zu einer wildtypischen dorsalen Fußhaut unorganisiert. Die Haut wurde von wildtypischen Mäusen und von Frizzled-sechs-Knockout-Mäusen gewonnen, die ein GFP-markiertes Keratin KRT17-GFP exprimieren, und mit Oil Red O gefärbt.

Red O zeigte, dass die Knockout-Haut eine Haarwirbel in ihrem Zentrum aufweist. Die konfokale Bildgebung von Hautpräparaten kann auch die Geometrie der Haarfollikel definieren, die mit KRT 17 GFP und Anti-GFP-Immunfärbung sowie Erictor pili sichtbar gemacht wurden. Augenmuskeln, die mit Anti-Smooth-Muskel-Aktin-Immunfärbung sichtbar gemacht wurden.

Merkel-Zell-Cluster werden mit Anti-Cytokeratin Acht oder durch Aufnahme des AM 1 43 Farbstoffs sichtbar gemacht, und sein zentraler Haarfollikel wird mit KRT 17 GFP sichtbar gemacht. Anstatt nach anterior geöffnet zu sein, bildet der Frizzled-sechs-Knockout-Merkel-Zell-Cluster einen geschlossenen Kreis. Sobald die Technik beherrscht ist, kann eine Präparation in etwa 30 Minuten durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird, und verschiedene Präparationen können innerhalb weniger Tage bis zu einer Woche angefertigt werden. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Haut aus verschiedenen Körperregionen entnimmt und wie man sie präpariert, um verschiedene Hautstrukturen im Hämatoxylin-Eosin-Format sichtbar zu machen. Bilder von Hautstrukturen in voller Dicke und mit hoher Auflösung können mithilfe herkömmlicher Hellfeldmikroskopie und konfokaler Mikroskopie aufgenommen werden.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd und BBBA äußerst gefährlich sein kann. Die Einatmung von Dämpfen sollte minimiert werden, indem diese Lösungen in geschlossenen Behältern aufbewahrt werden, und Hautkontakt ist zu vermeiden. Lassen Sie BBBA nicht mit Kunststoff in Berührung kommen.