Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu zeigen, wie eine Primärkultur von dopaminergen Neuronen aus embryonalen Mausgehirnen erzeugt werden kann. Dies wird erreicht, indem zunächst E 13,5-Embryonen von Mäusen entnommen werden. Der zweite Schritt besteht darin, die embryonalen Mäusegehirne zu präparieren und das Mesencephalon zu isolieren.

Als nächstes werden eine enzymatische und eine mechanische Dissoziation auf das gesammelte Mesencephalon angewendet. Der letzte Schritt ist die Beschichtung von dissoziierten neuronalen Zellen. Letztendlich wird die Immunfluoreszenzfärbung verwendet, um das Vorhandensein von dopaminergen Neuronen in der Kultur nachzuweisen.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich neurologischer und psychiatrischer Erkrankungen wie Schizophrenie, Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung und Parkinson zu beantworten. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Dissektions- und Zelldissoziationsschritte schwer zu erlernen sind, da eine genaue Geste und eine anatomische Identifizierung der Struktur erforderlich sind. Nachdem Sie eine schwangere Maus mit E 13,5 geopfert haben, reinigen Sie ihren Bauch mit 70% Ethanol.

Öffnen Sie als Nächstes die Bauchwand und sammeln Sie die Gebärmutterhörner. Präparieren Sie jeden Embryo aus den Gebärmutterhörnern und entfernen Sie die Amnionmembranen. Übertragen Sie dann die Embryonen in eine 100-Millimeter-Petrischale, die steriles P-B-S-G-A-B enthält.

Waschen Sie sie, indem Sie sie in drei aufeinanderfolgende identische Bäder geben. Danach werden die Embryonen zur Sektion in eine 60 Millimeter sterile Petrischale gegeben. Stellen Sie die Petrischale unter das Stereomikroskop.

Als nächstes schneiden Sie das Gehirn mit einer Vanna-Schere heraus. Entfernen und entsorgen Sie vorsichtig die vier Hirnregionen und die Hinterhirnregionen. Machen Sie einen Schnitt in der Nähe der Thalamusregion an der rostralen Seite und einen weiteren Schnitt in der SSUS-Region an der Kotschenseite.

Entfernen Sie dann die obere Colus. Sobald das ventrale Mittelhirn isoliert ist, entfernen Sie vorsichtig die Hirnhäute Mit einer ultrafeinen Pinzette sammeln Sie die präparierten Segmente ohne die Hirnhäute in einem sterilen 13-Milliliter-Röhrchen, das mit P-B-S-G-A-B gefüllt ist. Reinigen Sie das Röhrchen mit dem Mesencephalon gründlich mit 70 % Ethanol.

Platzieren Sie es dann in diesem Schritt unter der Motorhaube. Waschen Sie das Mesencephalon dreimal mit sterilem P-B-S-G-A-B. Lassen Sie die Gehirnfragmente zwischen jedem Waschen absetzen und vermeiden Sie es, das Gewebe nach dem letzten Waschen zu stören.

Entfernen Sie vorsichtig so viel Lösung wie möglich und inkubieren Sie die Gehirnsegmente in drei Millilitern Trypsin-EDTA für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator. In der Zwischenzeit sollten Sie Ihre Pipetten mit Feuerpolitur PE polieren, um das Überleben der Neuronen zu maximieren, da das Ende einer unpolierten Glaspipette scharf ist und die Zellen während der Dissoziationsschritte leicht schädigen kann. Reduzieren Sie den Durchmesser der Extremitäten der PE-Pipette, während Sie sie feuerpolieren.

Entfernen Sie nun vorsichtig so viel Trypsin-EDTA-Lösung wie möglich. Fügen Sie dann 10 Milliliter Nährmedium hinzu, 10 % IFBS, und waschen Sie die Gehirnsegmente dreimal damit. Beginnen Sie mit der feuerpolierten PE-Pipette mit der Dissoziation von Mesencephalon in sechs Millilitern Kultur.

Mittel, 10%IFBS trier bewerten 10 Mal und versuchen Luftblasen zu vermeiden. Lassen Sie die Brocken danach absetzen. Sammeln Sie das Medium in einem neuen sterilen 13-Milliliter-Röhrchen.

Fügen Sie sechs Milliliter Kultur, Medium und Tri rate 10-mal mehr hinzu. Lassen Sie die Stücke sich absetzen und sammeln Sie das Medium mit den dissoziierten Zellen in demselben 13-Milliliter-Röhrchen. Dann zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 160 g.

Entsorgen Sie danach den Überstand und die Wiederbelebung. Suspendieren Sie die Zellen in Kulturmedium, das mit 10% Hormon ergänzt ist. Mischen Sie Zählzellen in Suspension in einer Mase-Zelle und stellen Sie das Volumen des Mediums auf eine Konzentration von 600.000 Zellen pro Milliliter ein.

Im Allgemeinen können etwa 1.700.000 Zellen aus einem Maus-Mesencephalon gewonnen werden. Entfernen Sie nun FBS-haltiges Beschichtungsmedium von einer 24-Well-Platte. Fügen Sie jeweils einen Milliliter Zellsuspension hinzu.

Nun, dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, 95 % Luft, dopaminerge Neuronen sind nach etwa fünf bis sieben Tagen in vitro reif und die Zellen können bis zu 15 Tage in Kultur gehalten werden, ohne dass das Medium ausgetauscht werden muss. Geben Sie am Tag vor der Dissektion 10 Milliliter eines molaren HCL in eine Petrischale. Legen Sie 12 bis 15 Glasabdeckfolien auf die flüssige Oberfläche und warten Sie 15 Minuten.

Drücken Sie dann die Deckfolien in die Flüssigkeit und warten Sie weitere 15 Minuten. Entfernen Sie anschließend das HCL und waschen Sie den Bezug Slips dreimal mit Wasser, gefolgt von einer schnellen Wäsche mit reinem Ethanol. Geben Sie dann reines Ethanol in das Gericht und warten Sie 30 Minuten unter der Haube.

Entfernen Sie die gereinigten Deckgläser aus Ethanol. Übertragen Sie anschließend die Deckgläser auf eine 12-Well-Zellkulturplatte. Waschen Sie die Einbezugsbezüge zweimal mit sterilem Wasser und waschen Sie sie anschließend einmal mit sterilem PBS.

Entfernen Sie dann das PBS und fügen Sie zwei XPLO mit 500 Mikrolitern pro Vertiefung hinzu, inkubieren Sie vier Stunden bei 37 Grad Celsius im Kohlendioxid-Inkubator, nach vier Stunden. Entfernen Sie die PLO-Lösung und waschen Sie sie dreimal mit sterilem PBS. Entfernen Sie danach das PBS und geben Sie 500 Mikroliter 20%iges IFBS-Laminin zu einem Mikrogramm pro Milliliter in jede Vertiefung, die über Nacht bei 30 Grad Celsius im Kohlendioxid-Inkubator inkubiert wird.

Für Immunfluoreszenz. Entfernen Sie das Beschichtungsmedium von der 12-Well-Platte. Fügen Sie zwei Milliliter Zellen mit 900.000 Zellen pro Vertiefung hinzu und züchten Sie sie im Inkubator bei 37 Grad Celsius.

Die Zellen können bis zu 15 Tage in Kultur gehalten werden, ohne dass das Medium ausgetauscht werden muss. Gezeigt. Hier sind die Phasenkontrastbilder der Kultur in verschiedenen Entwicklungsstadien. Diese Abbildung zeigt die Tyrosinhydroxylase-Färbung von dopaminergen Neuronen bei DIV: Acht D-Neuronen wurden mit Anti-TH-Antikörpern nachgewiesen.

Die Anzahl der TH-positiven Neuronen in der Mesencephalon-Kultur ist eine Funktion des Alters der Kultur. Hier sind die repräsentativen Neuronen und Astrozyten in der Kultur. Bei DIV vier wurden dopaminerge Neuronen mit Anti-DAT- oder Anti-TH-Antikörpern und den GABAergen Neuronen nachgewiesen.

Serotonerge Neuronen und Astrozyten wurden mit Anti-GAD 67-, Anti-Serotonin- bzw. Anti-GFAP-Antikörpern nachgewiesen. Die neuronalen Zellen wurden mit einem Anti-Map-2-Antikörper gefärbt. Hier ist die repräsentative Färbung mehrerer Zellpopulationen der Mesencephalon-Kultur.

Ein dopaminerges Neuron wurde durch DAT-Färbung bei DIV neun nachgewiesen und diese GABAergen Neuronen wurden durch GAD 67-Färbung bei DIV neun sichtbar gemacht. Das serotonerge Neuron wurde mit einem Anti-Serotonin-Antikörper bei DI neun gefärbt. Die Neuronen wurden nach ihrer Entwicklung in den frühen achtziger Jahren durch Karte zur Färbung identifiziert.

Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg, um die Entwicklung dopaminerger Zellen in Primärkulturen zu erforschen und kann zur Untersuchung molekularer Mechanismen eingesetzt werden, die physiologischen und pathologischen Zuständen von dopaminergen Neuronen zugrunde liegen. Das Fehlen eines Videos, das die heikle Sektion zeigt, könnte die Forscher davon abgehalten haben, dieses Mauskulturmodell zu entwickeln. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man funktionelle aus dem embryonalen Mausgehirn genau isoliert und spezielle Dissoziationsschritte durchführt, um eine schöne Primärkultur von Maus-Dopaminorgika zu erhalten.