Name: Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Erfahren Sie die Primärkultur dopaminerger Neuronen aus embryonalen Mäusehirnen zur Untersuchung von Parkinson-Mechanismen. Diese Methode ermöglicht die Analyse neuronaler Vulnerabilität in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Unterstützt durch Zuschüsse von CNRS und INSERM. PM bedankt sich für die Unterstützung durch die Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC bedankt sich für die Unterstützung durch die Fondation de France.

Die in dieser Arbeit verwendeten Mäuse wurden gepflegt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Rates der Europäischen Union (86/609 / EU) für den Einsatz von Labortieren behandelt. 1. Herstellung der erforderlichen Lösungen <ol><li> Stammlösungen <ol><li> 10x Poly-L-Ornithin (PLO) Lösung: wiegen 10 mg PLO Hydrobromid (Molekulargewicht = 30,000-70,000) und in 70 ml sterilem Wasser auflösen. Die Lösung wird mit 0,2 um Spritzenfilter, aliquoten, und bei -20 ° C. </li><li> 30% Glucose-Lösung: wiegen 30 g D (+) - Glucose und Auflösen in sterilem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml. Filter, aliquoten, und bei 4 ° C. </li><li> 5x Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) / Nährstoff-Mischung F-12 Ham: abwiegen 6 g DMEM / F-12 Ham Pulver und lösen sich in sterilem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml. Filter, aliquoten, und bei 4 ° C. </li><li> 7,5% Natriumbicarbonat (NaHCO 3) Solutiauf: wiegen 7,5 g NaHCO 3 und lösen sich in sterilem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml. Filter, aliquoten, und bei 4 ° C. </li><li> 1 M HEPES-Lösung: Man wiegt 23,8 g HEPES und Auflösen in sterilem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml. Filter, aliquoten, und bei 4 ° C. </li><li> 70% (v / v) Ethanol: Verdünnen mit 70 ml absolutem Ethanol mit 30 ml sterilem Wasser. </li></ol></li><li> Phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit Glucose und Antibiotika (PBS-GAB): 10 ml 30% ige Glucoselösung und 5 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung zu 500 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Inaktiviertes fötales Rinderserum (IFB) auftauen Rinderserum über Nacht bei 4 ° C inaktiviert bei 56 ° C für 30 min. Aliquot in 50 ml und bei -20 ° C. </li><li> Kulturmedium: in sterilem Wasser, Mischung nacheinander mit 40 ml 5x DMEM / F12-Ham, 1 ml 1 M HEPES, 2 ml von 200 mM L-Glutamin, 2 ml Penicillin-Streptomycin, 4 ml 30% Glucose einnd 3 ml 7,5% iger NaHCO 3 auf ein Endvolumen von 180 ml. Zu filtern und verwenden am selben Tag. </li><li> Hormon-Mix <ol><li> Planen 180 ml Kulturmedium. Man löst 200 mg des apo-Transferrin in diesem Medium. </li><li> Man wiegt 50 mg Insulin und in 2 ml 0,1 M HCl zu lösen. Fügen Sie langsam 8 ml sterilem Wasser unter Mischen sanft. Verdünne die Lösung in dem Kulturmedium. </li><li> Wiegen 19,3 mg Putrescin-dihydrochlorid und in 10 ml sterilem Wasser auflösen. Fügen Sie die 10 ml-Lösung auf das Hormon-Mix. </li><li> Bereiten Sie eine 3 mM Natriumselenit-Lösung in sterilem Wasser und 2 mM Progesteron-Lösung in absolutem Ethanol. Mit 20 ul jeder Lösung auf das Hormon-Mix. </li><li> Filtern Sie die Hormon-Mix, Aliquot in 10 ml und bei -20 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von Kulturplatten und Instrumente <ol><li> FBS Beschichtung der Kulturplatten: Der Tag vor der Dissektion, bereiten 180 ml Kulturmedium. 10 mlIFB auf 90 ml Kulturmedium. Geben Sie 300 ul / Kulturmedium / 10% IFBS in Poly-D-Lysin-Fertig 24-Well-Platten. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C aufweist. Bewahren Sie die übrigen Medien (mit und ohne IFBS) bei 4 ° C. </li><li> Sterilisieren die Instrumente und Pasteur-Pipetten. Sammeln Sie die in der Materialliste aufgeführt als Class II Laminarströmungshaube und einem CO 2-Inkubator Ausrüstung. </li></ol> 3. Präparation der Maus Mesencephalon <ol><li> Opfern eine E13.5 schwangere Maus (gemäß gültiger Richtlinien). Reinigen Sie den Bauch der Maus mit 70% Ethanol und öffnen Sie die Bauchdecke. Sammeln Sie die Gebärmutterhörner, öffnen Sie sie mit zarten Schere, sezieren jedem Embryo von der Gebärmutterhörner, und entfernen Sie das Frucht Membranen. Legen Sie die Embryonen in einer 100 mm Petrischale mit sterilem PBS-GAB und waschen Sie sie durch Übertragung in 3 aufeinanderfolgenden gleichen Bäder mit einer Pinzette. Für die Präparation, legen Sie die Embryonen von 3 in einer 60 mm sterilen Petrischale. </li><li> Move die letzten Petrischale unter dem Stereomikroskop. Enthaupten nicht die Embryonen. Verwendung Vannas Schere, die Gehirne herauszuschneiden. <ol><li> Entfernen und entsorgen den Vordergrund und Hinterhirn Regionen. Um rostralen Seite, schneiden in der Nähe des Thalamus-Region, an der Schwanzseite Schnitt an der Landenge Region, entfernen Sie den Colliculus superior. </li><li> Sobald der ventralen Mittelhirn isoliert ist, sorgfältig Hirnhäute mit ultra feinen Pinzette entfernen. Sammeln Sie die Segmente zerlegt, ohne die Hirnhäute, in einer sterilen 13-ml-Tube mit PBS-GAB gefüllt. </li></ol></li><li> Reinigen Sie das Rohr mit dem mesencephala gründlich mit 70% Ethanol und bringen sie unter der Haube. </li></ol> 4. Zelldissoziation <ol><li> Wasch mesencephala mit sterilem PBS-GAB 3x. Erlauben Gehirn Fragmente zwischen jedem Wasch absetzen und vermeiden das Gewebe zu beeinträchtigen. Nach dem letzten Wasch, entfernen Sie sorgfältig, wie viel Lösung wie möglich und Inkubation Gehirn Segmente in 3 ml Trypsin / EDTA für 15 min bei 37 ° C in eineCO 2-Inkubator. </li><li> Feuer-Politur die Pasteur-Pipetten, um das Überleben der Neuronen als das Ende eines nicht-polierten Glaspipette zu maximieren ist scharf und kann die Zellen während der Dissoziation Schritte beschädigen. Reduzieren Sie die Extremität Durchmesser (bis 0,5 mm) des Pasteur-Pipette, während Feuer-polieren. </li><li> So viel Trypsin / EDTA-Lösung entfernen Sie vorsichtig wie möglich und mit 10 ml Kulturmedium / 10% IFBS. Wasch Gehirn Segmente 3x mit Kulturmedium / 10% IFBS. </li><li> Verwendung der feuerpolierten Pasteurpipette beginnen Dissoziation mesencephala in 6 ml Kulturmedium / 10% IFBS. Man reibt 10x (Luftblasen vermeiden), lassen die Stücke zu regeln, dann sammeln das Medium in ein neues steriles 13-ml-Tube. </li><li> 6 ml Kulturmedium, wiederholen Sie den vorherigen Schritt einmal zu sammeln und das Medium mit dissoziierten Zellen in der gleichen 13-ml-Tube. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 160 g für 5 min. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in Kulturmedium, ergänzt mit10% Hormon-Mix. </li></ol> 5. Handy-Überzug <ol><li> Zählen von Zellen in Suspension in einem Malassez Zelle und die Lautstärke von mittleren bis zu einer Konzentration von 600.000 Zellen / ml. Rund 1.700.000 Zellen können aus einer Maus Hirn gewonnen werden. </li><li> Entfernen FBS-haltigen Beschichtungsmedium von 24-Well-Platten und fügen Sie in jede Vertiefung 1 ml Zellsuspension (600.000 Zellen / Well, 2-4% der TH + Zellen). </li><li> Inkubieren der Platte bei 37 ° C und 5% CO 2/95% Luft. Kein Medium Veränderung ist notwendig. Dopaminergen Neuronen sind ausgereift nach etwa 5-7 Tagen in vitro (in Übereinstimmung Ausdruck der Dopamin-Transporter). Zellen in Kultur zu halten bis zu 15 Tage ohne Mediumwechsel. </li></ol> 6. Immunfluoreszenz-Protokoll <ol><li> Reinigung der Deckgläser <ol><li> Am Tag vor der Präparation, 10 ml 1 M HCl in eine Petrischale. Lag an der Oberfläche der Flüssigkeit 12-15 Deckgläser und warten Sie 15 min. </li><li> Sinken die Abdeckungschlüpfen in die Flüssigkeit und warten Sie 15 min. </li><li> HCl zu entfernen und waschen 3x mit Wasser. </li><li> Schnell waschen Sie die Deckgläser mit reinem Ethanol einmal, dann fügen reinem Ethanol in die Schale und warten Sie 30 min. </li><li> Unter der Haube entfernen gereinigt Deckgläser aus Ethanol und fügen Sie ein Deckglas pro Vertiefung einer 12-Well-Zellkulturplatte mit sterilisierten Pinzette. </li><li> Waschdeckgläser zweimal mit sterilem Wasser (1 ml / Vertiefung). Dann waschen Sie einmal mit sterilem PBS. </li></ol></li><li> Beschichtung der Deckgläser <ol><li> PBS zu entfernen und fügen Sie 500 ul / 2x PLO (verdünnt in PBS). Inkubation für 4 Stunden bei 37 ° C im CO 2-Inkubator. </li><li> Entfernen Sie die PLO-Lösung und waschen 3x mit sterilem PBS. </li><li> PBS zu entfernen und fügen Sie 500 ul / 20% IFBS / 1 g / ml Laminin. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C im CO 2-Inkubator. </li></ol></li><li> Ausplattieren der Zellen für Immunfluoreszenz <ol><li> Entfernen Beschichtungsmedium von 12-Well-Platten. </li><li> Fügen 900,000 Zellen / Vertiefung in 2 ml Volumen und Wachstum der Zellen bei 37 ° C im Brutschrank. Zellen können in Kultur bis zu 15 Tage ohne Mediumwechsel gehalten werden. </li></ol></li><li> Immunfärbung <ol><li> Entfernen Medium von 12-Well-Platten und Waschen mit 500 ul / well DMEM vorgewärmt auf 37 ° C. </li><li> Gib 500 ul / Vertiefung DMEM vorgewärmt auf 37 ° C, dann fügen vorsichtig 160 ul / Vertiefung von 8% Paraformaldehyd (PFA, 2% Endkonzentration) und Inkubation für 10 min bei 37 ° C aufweist. </li><li> PFA entfernen und waschen 3x mit PBS / 0,1 M Glycin für 10 min. </li><li> PBS zu entfernen, fügen Sie 300 ul / PBS / 0,05% Triton X-100/20% Ziegenserum und Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Medium entfernen, werden 300 ul / Vertiefung von primärem Antikörper, verdünnt in PBS / 0,05% Triton X-100/1% Ziegenserum und Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Primäre Antikörper, die zum Nachweis von dopaminergen Neuronen und Charakterisierung der Kultur verwendet werden können, sind in der Tabelle angegebenen Materialien. Halten1 auch ohne primären Antikörper für Hintergrund der verschiedenen Sekundärantikörper zu bewerten. </li><li> Medium entfernen und waschen 3x mit PBS / 0,2% Gelatine für 10 min. </li><li> Medium entfernen, werden 300 ul / Vertiefung des sekundären Antikörpers, verdünnt in PBS / 0,05% Triton X-100/1% Ziegenserum und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln. Sekundärantikörper verwendet werden, in der Tabelle angegebenen Materialien. </li><li> Medium entfernen und waschen 3x mit PBS / 0,2% Gelatine für 10 min. </li><li> Medium entfernen und waschen 3x mit PBS. </li><li> Montieren Sie die Deckgläser auf Glasobjektträgern Zellseite nach unten in einem Tropfen Vectashield. Halten Sie die Folien bei Raumtemperatur über Nacht, um die Montage Medium trocknen lassen, dann speichern Sie sie bei 4 ° C. </li><li> Erwerben Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskop oder einem Phasenkontrast Epifluoreszenz ausgestattet. Repräsentative Bilder wurden mit einem Leica SP2 UV konfokalen Mikroskop erfasst. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+regulation+of+dopaminergic+transmission+in+the+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum.</a> Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).</li>
<li>Iversen, S. D., Iversen, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine%3A+50+years+in+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopamine: 50 years in perspective.</a> Trends Neurosci. 30, 188-193 (2007).</li>
<li>Dahlstroem, A., Fuxe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+Existence+of+Monoamine-Containing+Neurons+in+the+Central+Nervous+System+I.+Demonstration+of+Monoamines+in+the+Cell+Bodies+of+Brain+Stem+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+Scand+Suppl.+SUPPL%22%5BJournal%5D)">Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons.</a> Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).</li>
<li>Chinta, S. J., Andersen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic neurons.</a> Int J Biochem Cell Biol. 37, 942-946 (2005).</li>
<li>Bjorklund, A., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neuron+systems+in+the+brain%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopamine neuron systems in the brain: an update.</a> Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).</li>
<li>Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O'Keeffe, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain+dopaminergic+neurons%3A+a+review+of+the+molecular+circuitry+that+regulates+their+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development.</a> Dev Biol. 379, 123-138 (2013).</li>
<li>Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease.</a> Lancet. 363, 1783-1793 (2004).</li>
<li>Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mTOR+signaling+in+Parkinson%27s+disease+prevents+L-DOPA-induced+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mTOR signaling in Parkinson's disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia.</a> Sci Signal. 2, (2009).</li>
<li>Ohlin, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+is+upregulated+by+L-dopa+in+the+parkinsonian+brain%3A+implications+for+the+development+of+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia.</a> Brain. 134, 2339-2357 (2011).</li>
<li>Obeso, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missing+pieces+in+the+Parkinson%27s+disease+puzzle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Missing pieces in the Parkinson's disease puzzle.</a> Nat Med. 16, 653-661 (2010).</li>
<li>Cooper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+rescue+of+mitochondrial+deficits+in+iPSC-derived+neural+cells+from+patients+with+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease.</a> Sci Transl Med. 4, (2012).</li>
<li>Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+needs+of+dopamine+neurons+for+stimulation+in+order+to+survive%3A+implication+for+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease.</a> FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).</li>
<li>Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NURR1+in+Parkinson+disease-from+pathogenesis+to+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential.</a> Nat Rev Neurol. , (2013).</li>
<li>Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. erkerian- <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+brain+stimulation+of+the+center+median-parafascicular+complex+of+the+thalamus+has+efficient+anti-parkinsonian+action+associated+with+widespread+cellular+responses+in+the+basal+ganglia+network+in+a+rat+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson's disease.</a> J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).</li>
<li>Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mov+Disord%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Parkinson's disease.</a> Mov Disord. 28, 24-30 (2013).</li>
<li>di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+striatal+cells+on+in+vitro+maturation+of+mesencephalic+dopaminergic+neurones+grown+in+serum-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions.</a> Nature. 288, 370-373 (1980).</li>
<li>Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+heterogeneity+may+define+the+three-dimensional+shape+of+mouse+mesencephalic+dopaminergic+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones.</a> Nature. 307, 641-643 (1984).</li>
<li>Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+studies+on+the+maturation+of+mesencephalic+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons.</a> Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).</li>
<li>Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+toxicity+toward+cultured+mesencephalic+dopaminergic+neurons+is+induced+by+the+synergistic+effects+of+energetic+metabolism+impairment+and+NMDA+receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation.</a> J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).</li>
<li>Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+mesencephalic+dopaminergic+neurons+in+culture+by+low-level+stimulation+of+voltage-gated+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels.</a> J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).</li>
<li>Toulorge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotection+of+midbrain+dopamine+neurons+by+nicotine+is+gated+by+cytoplasmic+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2.</a> FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).</li>
<li>Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Iron-Binding+Protein+Lactoferrin+Protects+Vulnerable+Dopamine+Neurons+from+Degeneration+by+Preserving+Mitochondrial+Calcium+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis.</a> Mol Pharmacol. 84, (2013).</li>
<li>Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitriol+imparts+neuroprotection+in+vitro+to+midbrain+dopaminergic+neurons+by+upregulating+GDNF+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression.</a> PLoS One. 8 (e62040), (2013).</li>
<li>Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+complex+I+inhibition+is+not+required+for+dopaminergic+neuron+death+induced+by+rotenone%2C+MPP%2B%2C+or+paraquat%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).</li>
<li>Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mouse+models+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Mol+Biol+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Genetic mouse models of neurodegenerative diseases.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).</li>
<li>Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+microglial+NADPH+oxidase-derived+free+radicals+in+the+in+vitro+MPTP+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson's disease.</a> FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+Parkinson%27s+disease-related+mutant+alpha-synuclein+in+the+midbrain+dopaminergic+neurons+causes+progressive+neurodegeneration+and+degradation+of+transcription+factor+nuclear+receptor+related+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of Parkinson's disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1.</a> J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).</li>
<li>Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+dating+of+midbrain+dopamine+neurons+identifies+A9+enriched+tissue+for+transplantation+into+parkinsonian+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice.</a> Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).</li>
<li>Ramonet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+neuronal+loss%2C+reduced+neurite+complexity+and+autophagic+abnormalities+in+transgenic+mice+expressing+G2019S+mutant+LRRK2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2.</a> PLoS One. 6 (e18568), (2011).</li>
<li>Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+axon+guidance%3A+which+makes+what%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic axon guidance: which makes what.</a> Front Cell Neurosci. 6, (2012).</li>
<li>Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pitx3+is+required+for+development+of+substantia+nigra+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).</li>
<li>Ferri, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxa1+and+Foxa2+regulate+multiple+phases+of+midbrain+dopaminergic+neuron+development+in+a+dosage-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner.</a> Development. 134, 2761-2769 (2007).</li>
<li>Rayport, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+postnatal+mesolimbic+dopamine+neurons+in+culture%3A+morphology+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology.</a> J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).</li>
<li>Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+and+GABA+receptors+in+cultured+substantia+nigra+neurons%3A+correlation+of+electrophysiology+and+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry.</a> Neuroscience. 78, 759-769 (1997).</li>
<li>Nefzger, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lmx1a+allows+context-specific+isolation+of+progenitors+of+GABAergic+or+dopaminergic+neurons+during+neural+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).</li>
<li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+expression+of+Cdh2+is+essential+for+efficient+neural+differentiation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieses Protokoll stellt die Verfahren und Reagenzien notwendig, eine Primärkultur von Mittelhirnneuronen von der embryonalen Maus und der Immunfluoreszenz-Verfahren zu dopaminergen Neuronen zu erkennen vorzubereiten. Kritische Schritte des Verfahrens sind die Dissektion der Embryonen und die mechanische Dissoziation der Fragmente gesammelt Gehirn. Hochwertige Dissektionsinstrumente hilft, die Technik zu beherrschen Dissektion. DA-Neuronen bilden einen kleinen Teil des Mittelhirns. Dementsprechend sammelt den rechten Tei...

Dopamin, eine der wesentlichen Neurotransmitter im Gehirn 1,2, wird hauptsächlich von dopaminergen Mittelhirn (DA) Neuronen freigesetzt. Die Mehrheit der DA Neuronen befinden sich in der ventralen Teil des Mittelhirns 2-6. Mesostriatal, mesolimbischen und mesocorticalen Wege 2,5: schematisch, Mittelhirn-Neuronen DA kann in drei anatomisch und funktionell verschiedene Projektionssysteme aufgeteilt werden. Der Weg wird in nigrostriatale Motorik beteiligt, die mesolimbischen Bahnen spielen eine wichtige Rolle in der Verstärkung, Motivation und Lernen, während die dopaminergen Bahnen zum präfrontalen Kortex vorstehen, sind in Erkenntnis 2 beteiligt. DA-Neuronen in mehreren neurologischen Störungen menschlichen wie Schizophrenie, Aufmerksamkeitsdefizit, Hyperaktivität Erkrankung und Parkinson-Krankheit (PD) 2,4 beteiligt. PD wird durch eine progressive Degeneration der selektiven und DA Neuronen verbinden Substantia nigra gekennzeichnetpars compacta (SNC) zum Striatum. Der Verlust der nigrostriatalen DA Neuronen führt zu einer starken Verarmung Dopamin im Striatum, die verantwortlich für die motorischen Symptome der PD (Bradykinesie, Ruhetremor, und Steifigkeit) 7. Die ursprüngliche Ursache der idiopathischen PD ist nicht nachgewiesen und die aktuellen Behandlungen sind nur symptomatisch, mit dem Ziel der Wiederherstellung Dopaminspiegel im Striatum. Das verschriebene Medikament ist L-Dopa (Levodopa), das natürliche Vorläufer von Dopamin. Obwohl Verabreichung von Levodopa kompensiert den Verlust von Dopamin zu einer bestimmten Zeit auftreten Motor Komplikationen nach einer Langzeitbehandlung (Dyskinesie und / AUS-Zustände) 8,9. Forschung auf dopaminerge Neuronen und PD ist in ständiger Progression und intensive Anstrengungen unternommen werden, um Behandlungen auf Zelltransplantation, Gentherapie, oder neuroprotektive Mittel 10,11 zu entwickeln. Allerdings bleibt ein wichtiges Thema nicht geklärt: Was ist die Ursache für die extreme vulnerability von DA Neuronen? Ein Teil der Antwort kann in der Aktivität von Neuronen DA gefunden werden. Eine Reduktion der elektrischen Aktivität und der Erregbarkeit von DA-Neuronen scheint die Neigung zu degenerieren 12 zu erhöhen. Dennoch ist die Komplexität der PD Pathogenese erfordert weitere Studien, um die Mechanismen in DA Neuronen beteiligt Degeneration 13-15 identifizieren. Primärkulturen sind besonders relevant für die DA Neuron Eigenschaften 16-19 studieren und diese Neuronen auf verschiedene Belastungen für die Bewertung der neuroprotektive Mittel 20-24 herauszufordern. Ratte Kulturmodelle werden häufig verwendet, da die Präparation der Rattenembryohirn ist einfacher, verglichen mit der Maus, und höhere Mengen von Neuronen bei Ratten erhalten werden. Allerdings hat von transgenen Mausmodellen der Krankheit 25 deutlich erhöht das Interesse der Neurowissenschaftler Community für Primärkulturen von der Maus 26-29. Obwohl Kulturen prvon neugeborenen Tieren epared verwendet werden kann, ist es besser, sie von Embryonen im post-mitotischen Stadium (E13.5 für Mesencephalon-Neuronen) herzustellen, wenn Neuronen haben ihre Fähigkeit zur Differenzierung beibehalten. Das folgende Protokoll stellt isoliert Hirn-Neuronen in Primärkultur von Maus-Embryonen (E13.5), die am schwierigsten zu vorzubereiten. Insbesondere stellen wir ein Protokoll mit serumfreiem Kulturmedium für eine bessere Reproduzierbarkeit. Die beiden wichtigsten Schritte in der Kultur-Präparat (Dissektion und mechanische Dissoziation) wird vorsichtig in den zugehörigen Video detailliert werden.

<table><tbody><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Lonza</td><td>14-801F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4,5 g/L Glukose mit L-Glutamin</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsin-EDTA (1x), phenolrot</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin, 200 mM Lösung</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>25030123</tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium/Nährstoff-Gemisch F-12 Schinken</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D0547</td><td>Pulver</td></tr><tr><td>Laminin - 1 mg/ml in Tris gepuffertem NaCl</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithinhydrobromid</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Insulin aus der Bauchspeicheldrüse des Schweins</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td>I5523</td><td></td></tr><tr><td>Apo-Transferrin human</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Putrescindihydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Natriumselenit</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H4034&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G7126</td><td>Stammlösung 1 M in Wasser</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G9391</td><td>Stammlösung 2% (w/v) in Wasser</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16% in Wasser</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>RT 15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat (NaHCO3)</td><td>Merck Millipore</td><td>106329</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose, Monohydrat</td><td>Merck Millipore</td><td>4074-2</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) Titripur</td><td>Merck Millipore</td><td>109057</td><td></td></tr><tr><td>Steriles Wasser - Aqua B. Braun</td><td>Braun Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolut NORMAPUR Analysenreagenz</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Petrischalen</td><td>VWR</td><td>82050-566</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten Normalglas - Wilhem Ulbrich GdbR.</td><td>VWR</td><td>612-2297</td><td></td></tr><tr><td>Zählkammer Malassez</td><td>VWR</td><td>631-0975</td><td></td></tr><tr><td>Serum Acrodisc Spritzenvorsatzfilter mit Supor Membran, steril, GF/0,2 & Mikro; m, 37 mm</td><td>PALL Life science</td><td>4525</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schere - Gerade, scharf-scharf, 14,5 cm lang</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-14</td><td>Zum Öffnen der Bauchdecke</td></tr><tr><td>Schere - Gerade, spitz, filigran, 10 cm lang</td><td>MORIA</td><td>4877A</td><td>Zum Öffnen der Gebärmutterwand</td></tr><tr><td>Pinzette - Gebogene, übliche, gezackte Kiefer 1 mm</td><td>MORIA</td><td>2183</td><td>Zur Manipulation von</td></tr> <tr><td>EmbryonenVannas Schere - Gebogene, spitze, 7 mm Klingen</td><td>MORIA</td><td>MC50</td><td>Zum Herausnehmen des Mesencephalons</td></tr><tr><td>Ultrafeine Pinzette - Gebogen, zart, 13 cm lang</td><td>MORIA</td><td>9987</td><td>Zur Entfernung von Hirnhäuten</td></tr><tr><td>BD BioCoat Poly-D-Lysin 24-Well-Multiwell-Platten</td><td>BD Bioscience</td><td>356414</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 12-Well-Zellkulturplatte, flacher Boden mit Deckel</td><td>BD Bioscience</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Objektträger, geschliffene Kanten 90&ordm;</td><td>MENZEL-GL&Auml; SER</td><td>AG00008032E</td><td></td></tr><tr><td>Präzisions-Deckgläser Stärke Nr. 1,5H rund 18 mm & Oslash;</td><td>MARIENFELD</td><td>117580</td><td></td></tr><tr><td>Polyklonaler Kaninchen-Anti-Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 (MAP2)-Antikörper</td><td>Chemicon Millipore</td><td>AB5622</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Monoklonaler Maus-Anti-Glutamat-Decarboxylase (GAD67)-Antikörper, Klon 1G10.2</td><td>Chemicon Millipore</td><td>MAB5406</td><td>1/400</td></tr><tr><td>Monoklonaler Ratten-Anti-Dopamin-Transporter (DAT)-Antikörper, Klon DAT-Nt&nbsp;</td><td>Chemicon Millipore</td><td>MAB369</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Monoklonaler Maus Anti-5-HT Antikörper</td><td></td><td></td><td>1/8.000 - Großzügiges Geschenk von Yves Charnay (Schweiz, Yves.Charnay@hcuge.ch)</td></tr><tr><td>Ziegenserum, Neuseeland Herkunft</td><td>Life Technologies</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 405 Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) Antikörper</td><td>Life Technologies</td><td>A-31556</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus IgG (H+L) Antikörper</td><td>Life Technologies</td><td>A-11001</td><td>1/1.000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Ziege Anti-Ratte IgG (H+L) Antikörper</td><td>Life Technologies</td><td>A-11007</td><td>1/1.000</td></tr><tr><td>VECTASHIELD HardSet Eindeckmedium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Carl Zeiss Mikroskopie</td><td>Stemi-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Bunsenbrenner FIREBOY</td><td>VWR</td><td>451-0136</td><td></td></tr></tbody></table>

primärkultur von maus dopaminergen neuronen

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergen Neuronen weniger als 1% der gesamten Anzahl von Neuronen im Gehirn. Diese geringe Menge an Neuronen regelt wichtige Hirnfunktionen wie Motorsteuerung, Motivation und Arbeitsgedächtnis. Nigrostriatalen dopaminergen Neuronen selektiv degenerieren bei Parkinson-Krankheit (PD). Diese fortschreitende Verlust von Nervenzellen ist eindeutig mit den Motoren Symptome der Pathologie (Bradykinesie, Ruhetremor und Muskelstarre) assoziiert. Die wichtigsten Vertreter der dopaminergen Neuronen verantwortlich Degeneration ist noch unbekannt. Allerdings scheinen diese Neuronen extrem anfällig in unterschiedlichen Bedingungen zu sein. Primärkulturen stellen eine der wichtigsten Modelle Eigenschaften und Merkmale von dopaminergen Neuronen zu untersuchen. Diese Kulturen können auf verschiedene Stressmittel, die PD Pathologie imitieren und zu neuroprotektiven Verbindungen, um zu stoppen oder zu verlangsamen neuronale Degeneration vorgelegt werden. Die zahlreichen transgenen Mausmodellen der PD, die Gener habenergaben sich im letzten Jahrzehnt weiter erhöht das Interesse der Forscher für dopaminerge Neuronenkulturen. Hier konzentriert sich das Video-Protokoll auf den empfindlichen Dissektion der embryonalen Gehirn der Maus. Präzise Exzision der ventralen Mittelhirn ist entscheidend für die neuronalen Kulturen ausreichend reich an dopaminergen Zellen zu erhalten, um nachfolgende Studien zu ermöglichen. Dieses Protokoll kann mit embryonalen transgenen Mäusen realisiert werden und ist für die Immunfluoreszenzfärbung, quantitative PCR, second messenger Quantifizierung oder zum neuronalen Tod / Überleben Beurteilung.

Eine illustrierte Flussdiagramm der Mittelhirn-Kultur Schritte ist in Abbildung 1 dargestellt. Kurz gesagt, nach dem Sammeln von E13.5 Embryonen von einer schwangeren Schweizer Maus, Ventralmesenzephalons von der gesamten Embryo seziert. Die isolierten Gehirnfragmente werden nacheinander auf die enzymatische Verdauung und mechanische Dissoziation eingereicht. Dissoziierten Zellen werden durch Zentrifugation pelletiert, in Kulturmedium resuspendiert und in vorbeschichteten 12 oder 24-Well-Platten ausplat...

Dopaminerge Neuronen spielen eine wichtige regulatorische Rolle im Gehirn. Ihr Verlust wird mit der Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht. In diesem Video zeigen wir, wie Primärkulturen von zentralen dopaminergen Neuronen aus embryonalem Mausmesencephalon erzeugt werden können. Solche Kulturen sind nützlich, um die extreme Anfälligkeit dieser Neuronen gegenüber verschiedenen Belastungen zu untersuchen.

Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu zeigen, wie man eine Primärkultur dopaminerger Neuronen aus embryonalen Maushirnen erzeugt. Dies wird erreicht, indem zunächst Embryonen von Mäusen im Stadium E 13,5 gewonnen werden. Der zweite Schritt besteht darin, die embryonalen Maushirne zu präparieren und das Mesencephalon zu isolieren.Anschließend werden eine enzymatische und eine mechanische Dissoziation am gesammelten Mesencephalon durchgeführt. Der letzte Schritt ist das Ausplattieren der dissoziierten neuronalen Zellen. Abschließend wird mittels immunfluoreszenzchemischer Färbung die Anwesenheit dopaminerger Neuronen in der Kultur nachgewiesen.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen auf dem Gebiet neurologischer und psychiatrischer Erkrankungen wie Schizophrenie, Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung und Morbus Parkinson beantworten. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte zur Dissektion und Zell-Dissociation schwer zu erlernen sind, weil präzise Handgriffe und die anatomische Identifizierung der Struktur erforderlich sind. Die Vorführung des Verfahrens wird Florence übernommen, einer Ingenieurin aus meiner Grup

primary-culture-of-mouse-dopaminergic-neurons

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Primäre dissoziiert Mittelhirn Dopamin Zellkulturen erlauben die Untersuchung der präsynaptischen Eigenschaften des Dopamin-Neuronen. Sie können verwendet werden, um Echtzeit-Freisetzung von Dopamin Kinetik und Protein / mRNA-Spiegel von Regulatoren der Dopamin-Exozytose zu überwachen. Hier zeigen wir Ihnen, wie Sie diese Kulturen von Nagetier Neugeborenen zu generieren.

Primäre Dissoziierte Mittelhirn Dopamin Zellkulturen aus Nager Neugeborene

Dieses Protokoll beschreibt die erforderlichen Schritte zu zerlegen, zu transfizieren via Elektroporation und Kultur Maus Hippocampus und kortikalen Neuronen. Kurzfristige Kulturen können für die Untersuchung der Axon Auswuchs und Beratung verwendet werden, während die langfristigen Kulturen für ein Studium der Synaptogenese und dendritischen Dorn Analyse verwendet werden können.

Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen

Dieser Artikel beschreibt Methoden zur Ableitung von angereicherten Populationen von murinen Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) in primären Kultur, die, um zu reifen Oligodendrozyten (OLS) produzieren differenzieren. Darüber hinaus beschreibt dieser Bericht Techniken zur Herstellung murine myelinisierenden Co-Kulturen durch Impfen Maus OPCs auf einen Neuriten Bett Maus Spinalganglien Neuronen (DRGNs).

Ableitung von Enriched Oligodendrozyten Kulturen und Oligodendrozyten / Neuron myelinisierenden Co-Kulturen von Post-Natal Mausgeweben

Dieses Video beschreibt eine Methode zur Kultivierung dopaminerger Neuronen aus embryonalem Hirngewebe von Mäusen. Der Prozess umfasst die Behandlung des Mittelhirns mit einem proteolytischen Enzym, die Ablösung der Zellen und die Kultivierung auf polymerbeschichteten Deckgläsern in einem nährstoffreichen Medium mit Antibiotika für ihr Wachstum und ihre langfristige Lebensfähigkeit.

Kultivierung und Erhaltung dopaminerger Neuronen aus embryonalem Hirngewebe der Maus

Das Video zeigt den Prozess der Isolierung und Kultivierung von Dopamin-Neuronen aus dem Mittelhirn von Mausembryonen. Die isolierten ventralen Mittelhirnböden werden mit Hilfe von Enzymen dissoziiert. Die resultierenden Dopamin-Neuronen werden geerntet und in Mikroinseln in Multi-Well-Platten übertragen. Die Zellen werden mit einem Dopamin-Neuronenmedium inkubiert, um die Zellen in den Mikroinseln auf einer hohen Dichte zu halten.

Isolierung und Kultivierung von primären embryonalen Dopamin-Neuronen aus dem Mittelhirn der Maus

Dieses Video zeigt den Prozess der Quantifizierung der Alpha-Synuclein-Akkumulation in embryonalen Dopamin-Neuronen der Maus, die mit alpha-Synuclein-vorgeformten Fibrillen vorbehandelt wurden. Es werden die Schritte zur Fixierung, Färbung und Quantifizierung der Dopamin-Neuronen, die Alpha-Synuclein-Aggregate enthalten, mittels Immunfluoreszenz beschrieben.

Untersuchung der Alpha-Synuclein-Akkumulation in primären embryonalen Dopamin-Neuronen der Maus

Hier beschreiben wir eine detaillierte Protokoll für die gleichzeitige Erzeugung von neuralen Vorläuferzellkulturen, entweder als Mono-oder haftNeuroSphären, aus der Subventrikularzone und Gyrus dentatus der einzelnen erwachsenen Mäusen.

Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

Die Ursachen der Degeneration von dopaminergen Neuronen im Mittelhirn während der Parkinson-Krankheit sind nicht vollständig geklärt. Zellkultursysteme stellen ein wesentliches Werkzeug für die Untersuchung der neurophysiologischen Eigenschaften dieser Neuronen dar. Hier stellen wir ein optimiertes Protokoll vor, das für die in vitro Modellierung der Neurodegeneration verwendet werden kann.

Isolation, Kultur und langfristige Wartung von Primär mesencephalen dopaminergen Neuronen aus embryonalen Nagetier Brains

Bei der Parkinson-Krankheit (PD), Substantia Nigra (SNC) dopaminergen Neuronen degenerieren, was zu Motorstörungen. Hier berichten wir über ein Protokoll zur Kultivierung von ventralen Mittelhirns Neuronen aus einer Maus eGFP durch eine Tyrosinhydroxylase (TH) Promotorsequenz angetrieben exprimieren, Ernten einzelnen fluoreszierenden Neuronen aus den Kulturen, und die Messung ihrer Transkriptom RNA-seq verwenden.

Zuverlässige Identifikation von Wohn dopaminerge Neurone in Mittelhirns Kulturen unter Verwendung von RNA-Sequenzierung und TH-Promotor getriebene eGFP Expression

Die Durchführung von In-vitro-Experimenten, um in vivo-Bedingungen so angemessen wie möglich zu reflektieren, ist keine leichte Aufgabe. Die Verwendung von primären Zellkulturen ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis der Zellbiologie in einem ganzen Organismus. Das bereitgestellte Protokoll beschreibt, wie man erfolgreich wachsen und Kultur embryonale Maus Kleinhirn Neuronen.

Primäre Kultur der Neuronen isoliert von Embryonal Mouse Cerebellum

Hier, Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll zur Untersuchung der neuronalen Synuclein-Akkumulation in primären Maus-Dopamin-Neuronen. Phosphorylierte-Synuclein-Aggregate in Neuronen werden mit vorgebildeten ,-Synuclein-Fibrillen induziert. Die automatisierte Bildgebung von immunfluorest markierten Zellen und die unvoreingenommene Bildanalyse machen dieses robuste Protokoll für das Screening von Medikamenten mit mittlerem bis hohem Durchsatz geeignet, die die Akkumulation von Synuclein...

Studium der vorgeformten Fibril-induzierten Synuclein-Akkumulation in primären embryonalen Maus-Midbrain-Neuronen

Erfahren Sie die Primärkultur dopaminerger Neuronen aus embryonalen Mäusehirnen zur Untersuchung von Parkinson-Mechanismen. Diese Methode ermöglicht die Analyse neuronaler Vulnerabilität in vitro.

Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen

Weitere Videos entdecken