Nanogold Markierung der Hefe Endosomale System für Ultrastrukturanalysen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, auf ultrastruktureller Ebene die endosomalen Kompartimente der Hefe Saccharomyces cerevisiae sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem Hefe Sphera plast präpariert wird, die anschließend positiv geladene Nanogoldpartikel endozytotisch aufnimmt. In einem zweiten Schritt wird die Probe fixiert und geschnitten, um ultradünne Kryoschnitte der Zellen zu erhalten.

Anschließend werden die Kryoschnitte der Silberverstärkungsreaktion unterzogen. Um die Endozytose positiv geladener Nanogoldpartikel zu vergrößern und sichtbar zu machen, werden Ergebnisse erhalten, die die Morphologie der verschiedenen endosomalen Kompartimente von Hefe auf der Grundlage der spezifischen Markierung dieses Verfahrens zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber unseren bestehenden Methoden, wie der Immungoldmarkierung von Schnitten, besteht darin, dass sie nicht auf Antikörper angewiesen ist, die häufig bei der Elektronenmikroskopiepräparation nicht funktionieren.

Obwohl diese Methode Einblicke in das lysosomale System der Hefe sarchi ESIS vei ermöglicht, kann sie auch auf andere eukaryotische Modelle wie andere Hefen und Säugerzellen angewendet werden. Die Hefe, aus der die Sphäroplasten hergestellt werden sollen, wird zunächst über Nacht bei 30 Grad Celsius in 10 Milliliter des entsprechenden Mediums inkubiert, das gemäß dem Versuchsdesign für den folgenden Tag ausgewählt wurde. Nach der Messung der optischen Dichte der Kultur bei 600 Nanometern werden die Zellen im gleichen Kulturmedium auf eine OD 600 von 0,2 bis 0,4 verdünnt.

Züchten Sie die Zellen in die exponentielle Wachstumsphase, bis ein OD 600 von eins bis zwei erreicht ist; übertragen Sie 10 D 600 -Äquivalente der Zellen in ein 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 2100 G. Nach der Zentrifugation verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren das Zellpellet in fünf Milliliter 100 Millimolar Pipes und 10 Millimolar Dihi drei bei Hall; inkubieren Sie zehn Minuten bei 30 Grad Celsius. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.

Nach dem Verwerfen des Überstandes Resus die Zellen in fünf Milliliter Medium, das ein Mol Sorbitol und fünf Milligramm lytisches Enzym enthält, resuspendieren. Die Mischung bei 30 Grad Celsius unter leichtem Schütteln 30 Minuten lang inkubieren. Die Zellsuspension bei 300 ×g fünf Minuten lang zentrifugieren, um einen Pellet-Bruchteil zu gewinnen, der den Sphero-Plats entspricht.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Sphäroplasten in 960 µL eiskaltem Medium, das einmolares Sorbitol enthält. Überführen Sie die Mischung in ein eiskaltes 2-mL-Mikrozentrifugenröhrchen. Um mit dem Verfahren zur Aufnahme von Nanogold zu beginnen, pipettieren Sie vorsichtig die Sphäroplasten mit vier positiv geladenen Nanogoldpartikeln.

Resuspendierung in 40 Mikrolitern Wasser. Das Endergebnisvolumen der Mischung muss ein Milliliter betragen. Die erhaltene Zellsuspension 15 Minuten auf Eis stellen.

Bringen Sie die Suspension auf Raumtemperatur und inkubieren Sie sie für die erforderliche Zeit, um die Internalisierung von Nano-Gold durch Endozytose zu ermöglichen. Sobald die gewünschte Aufnahme von Nano-Gold abgeschlossen ist, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie ein Milliliter fixierende Lösung mit doppelter Konzentration, die ein Mol Sorbitol enthält, der Zellsuspension hinzufügen. Bewahren Sie das Gefäß 30 Minuten bei Raumtemperatur auf.

Drehen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen während der 30 Minuten mehrmals vorsichtig per Hand um, um den PHE-Plast und die Suspension aufrechtzuerhalten. Zentrifugieren Sie anschließend zweimal mit 1700 G für 25 Sekunden, entfernen Sie den Überstand und geben Sie ein Milliliter frisches Fixativ normaler Konzentration mit einem Mol Sorbitol hinzu. Inkubieren Sie zwei Stunden bei Raumtemperatur auf einem langsam rotierenden Röhrchenwender. Danach werden die Zellen weiterverarbeitet und kryoseziiert, wie im Textprotokoll beschrieben. Vor Beginn dieses Verfahrens nehmen Sie das Silberverstärkungskit aus dem Gefrierschrank und lassen es in einem 37 Grad Celsius warmen Inkubator auftauen. Stellen Sie das aufgetaute Kit in einen 24 Grad Celsius warmen Inkubator auf dem Laborpult, der zuvor im Dunkelraum platziert wurde, und bewahren Sie es dort bis zur Verwendung auf.

Stellen Sie eine Heizplatte in einen dunklen Raum und erwärmen Sie sie auf eine Endtemperatur von 24 Grad Celsius. Bedecken Sie die Oberseite der Heizplatte mit einer Laborauflage, wobei die schützende glänzende Seite nach oben zeigt, und befestigen Sie sie mit Klebeband. Legen Sie Parafilm auf die Oberflächenschutzschicht und markieren Sie die Ränder mit einem schwarzen Stift, um die Visualisierung im Dunkeln zu ermöglichen.

Befestigen Sie ein Thermometer mit Klebeband an der Oberseite des Oberflächenschutzes. Um die Temperatur der Heizplatte zu überwachen, stellen Sie die Temperatur schrittweise ein. Wenn die Temperatur nicht 24 Grad Celsius beträgt, stellen Sie ein 50-Milliliter-Gefäß mit doppelt destilliertem Wasser darauf.

Im Inkubator eine kleine Petrischale mit doppelt destilliertem Wasser, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde, füllen. Zwei Nickelgitter mit den Kryoschnitten mit der Probenoberfläche nach unten für 30 Minuten ins Wasser legen. Nach 30 Minuten eine zweite Petrischale mit vorgewärmtem, doppelt destilliertem Wasser füllen und dieselben beiden Nickelgitter weitere 30 Minuten ins Wasser legen.

Spülen Sie die Objektträger erneut, indem Sie sie mit der Probenoberfläche nach unten über mehrere Tropfen doppelt destilliertem Wasser bei 24 Grad Celsius führen, die auf dem Parfum liegen, das auf der Heizplatte befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass neun weitere Tropfen doppelt destilliertes Wasser auf dem Parfum für die Spülung nach der Silberverstärkungsreaktion bereitstehen. Ab diesem Zeitpunkt müssen im Dunkelraum alle Lichter ausgeschaltet und das rote Licht eingeschaltet werden.

Jedoch bleibt das Licht ausschließlich aus Gründen der Filmaufnahme eingeschaltet. Nehmen Sie in dieser Demonstration die Lösungen A und B des Silberverstärkungskits aus dem 24 Grad Celsius warmen Inkubator und geben Sie jeweils sechs Tropfen der Lösung A sowie sechs Tropfen der Lösung B in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Mischen Sie die Lösung gründlich mit einer Glas-Pasteur-Pipette, wobei die Bildung von Blasen vermieden werden sollte. Vortexen Sie die Lösung.

Geben Sie die Lösungen A und B kurz zurück in den 24 °C-Inkubator und nehmen Sie die Lösung C heraus. Fügen Sie sechs Tropfen der Lösung C zur AB-Mischung hinzu. Mischen Sie erneut mit einer Pasteurpipette, gefolgt von Vortexen, und vermeiden Sie die Bildung von Blasen.

Verwenden Sie diese endgültige Mischung sofort. Geben Sie mit einem Paar sauberer, antimagnetischer Pinzette Tropfen auf das Paraform. Legen Sie die Gitter auf die Mischung.

Dies ist die Silberverstärkungsreaktion. Lassen Sie die Objektträger je nach gewünschter Verstärkung für das Experiment sechs bis 15 Minuten stehen. Entfernen Sie die Objektträger aus der Mischung und führen Sie sie schnell nacheinander durch sechs Tropfen doppelt destilliertes Wasser, die auf Perfil bei 24 Grad Celsius für die letzten drei Waschungen platziert sind.

Lassen Sie die Gitter für sieben Minuten pro Tropfen Wasser stehen. Wenn ein echtes Experiment durchgeführt wird, schalten Sie das Licht wieder ein, sobald die Wäsche abgeschlossen ist. Anschließend werden die Ergebnisse entweder durch ImmunoGold-Markierung oder Membranfärbung für eine EM-Untersuchung sichtbar gemacht.

Unterschiedliche Arten von endosomalen Kompartimenten in Hefe können mit silberverstärktem Nanogold markiert und mittels Elektronenmikroskopie sichtbar gemacht werden. Eine fünfminütige Inkubation mit Nanogold markiert die Plasmamembran und frühe endosomale Kompartimente, wie einzelne Vesikel, die möglicherweise endozytotische Vesikel sind, sowie röhrenförmige Strukturen, die sehr wahrscheinlich frühe Endosomen darstellen. Eine 30-minütige Inkubation mit Nanogold führt zur Markierung von späten Endosomen oder multivesikulären Körpern.

Die Auflösungsleistung der Kombination eines immunen Elektronenmikroskopieverfahrens mit diesem nano-goldbasierten Silberverstärkungsprotokoll zeigt sich in der Erhaltung und Qualität der Morphologie der dargestellten Organellen, insbesondere der inneren Vesikel der multivesikulären Körperchen. Vor der Anwendung der Silberverstärkungsmethode ist es notwendig, einen Vorversuch durchzuführen, um die optimalen Inkubationszeiten hinsichtlich Größe und Gleichförmigkeit dieser Silberpartikel zu bestimmen. Nach diesem Verfahren.

Andere Methoden wie die Immunfärbung können durchgeführt werden, um Fragen zur Lokalisation eines bestimmten Proteins in einer spezifischen Unterstruktur des Marinakompartiments zu beantworten.