Name: Hochdurchsatz-Assay zum Phänotyp Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion und Replikation in Makrophagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-11T18:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Erfahren Sie einen Hochdurchsatz-Assay zur Untersuchung von Salmonella enterica Typhimurium in Makrophagen. Diese Methode identifiziert Gene für Invasion und Replikation in Wirtszellen.

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Dieses Projekt wurde teilweise durch einen Zuschuss für National Institutes of Health NIAID (für AJB und LGA, R01 AI076246) unterstützt. Die Salmonella-Mutante Sammlung wurde teilweise von der National Institutes of Health Zuschüsse (für MM, U01 A152237-05, R01 AI07397-01, R01 und R01 AI039557-11 AI075093-01), teilweise von der National Institutes of Health Zuschüsse (für HAP, R21 unterstützt AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Wir danken Steffen Prowollik für Replikaplattierung und Bestätigung der Mutanten in der Sammlung.

1. Murine Makrophagen RAW264.7 Zellkultur <ol><li> Wachsen niedrige Durchgang Nummer murine Makrophagen, RAW264.7 (ATCC ® Nummer, TIB-71) in einem T-75 Zellkulturflasche abgelassen Filterkappe in Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) , 0,5% NaHCO 3 und 1% nicht-essentiellen Aminosäuren 100x (NEAA) bei 37 ° C in einem 5% CO 2-Inkubator. </li><li> Sobald Zellen erreichen eine 60-80% Konfluenz in den Kolben, mit einem Zellschaber, um Zellen zu ernten, und zählen Sie die Zellen in einer Hämazytometer und berechnen die Zellkonzentration. </li><li> Die Zellen und die Zellkonzentration verdünnt in 2,5 x 10 5 / ml in frischem DMEM-Zellkulturmedium. Mehrkanalpipetten verwenden, um 200 ul DMEM-Zellkulturmedium, enthaltend 5 × 10 4 Zellen in jeder Vertiefung der 96-Well-Zellkulturplatten zu plattieren. </li><li> Platte vier Vertiefungen jeder Salmonella Stamm. Drei getrennte Platten für einen Satz gesetztvon Fresszellen Invasion Assay, und markieren Sie diese mit &quot;Verein&quot;, &quot;Invasion&quot; und &quot;Replikation&quot; auf. </li><li> Platzieren der Platten in 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C auf, damit die Makrophagen-Zellen auf den Boden der Vertiefungen anzubringen. </li></ol> 2. Herstellung von Salmonellen Wildtyp-und Mutanten <ol><li> Am selben Tag der Aufstellung des Makrophagen RAW264.7 Zellen, nehmen einzelne Kolonien von Wildtyp (WT) Salmonella enterica Serotyp Typhimurium 14028s, DinvA Mutante DphoP Mutante und die gewünschten Test-Mutantenstämme, und Kultur sie in Luria Bertani-( LB) Brühe mit Antibiotika und gegebenenfalls ergänzt. Verwenden jedes Satzes der Phagozyten Invasionsassays zu testen bis 10 Mutantenstämme (DinvA mutierten und mutierten DphoP sind Invasion und intrazelluläre Replikation defekt, beziehungsweise). </li><li> Wachsen die Bakterien für 14 Stunden bei 37 ° C mit sHAKING bei 220 rpm in LB-Medium je 5 ml in 14 ml lose verschlossen Polypropylen in einer Röhre mit rundem Boden. LB-Medium enthält geeigneten Antibiotika, in unserem Fall sind die meisten der Mutanten-Stämme resistent gegen Kanamycin, 50 ug / ml </li><li> Am nächsten Tag, Subkultur jeder der EIN-Kulturen von Salmonella-Stämmen in Klar 5 ml LB-Brühe in einem Verhältnis von 1:50 für weitere 4 h unter Schütteln bei 220 UpM. </li><li> Lesen OD 600-Werte jedes Bakterienkultur auf einem Spektrophotometer, und jede Lese sollte 0,6 bis 1,2 reichen, um Salmonellen Pathogenität Insel-1-Typ-III-Sekretionssystem (SPI-1 TTSS) Genexpression für die Invasion zu optimieren. </li><li> Verwenden der Formel von 1 OD 600 = 7,5 x 10 8 CFU / ml, um die Bakterienkonzentration zu schätzen, dann verdünnte Bakterien in einer Konzentration von 5 x 10 6 KBE / ml in frischem DMEM-Zellkulturmedium. </li></ol> 3. Invasion Assay in 96-Well-Kulturplatte <ol><li> Entfernen Sie die drei 96-Loch-cell Kulturplatten aus dem CO 2-Inkubator und waschen jeweils auch einmal mit 200 ul 1x PBS-Puffer. </li><li> Nach dem Waschen und vollständige Entfernung von PBS, 200 ul Bakterien in DMEM-Medium (siehe oben) in jedes Well. Dies führt zu 1 x 10 6 Salmonella-Zellen in jede Vertiefung und Multiplizität der Infektion (MOI) von 20: 1 beträgt. </li><li> Zentrifugieren der Platten bei 1000 × g in einem verschlossenen Träger für 10 min, dann ersetzen Platten (Zeit Null) in einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator für 30 min. Für jeden Stamm, richtet mindestens vier zwei Vertiefungen. </li><li> Nach 30 Minuten, entfernen Sie Platten aus dem Inkubator und dreimal mit 200 ul 1x PBS auf unassociated Bakterien zu entfernen. </li><li> Nach dem Waschen, speichern Sie die Platte mit &quot;Verein&quot; für die weitere Behandlung gekennzeichnet. Fügen Sie 200 ul DMEM-Medium mit 100 ug / ml Gentamicin in jede Vertiefung der mit &quot;Invasion&quot; und &quot;Replikation&quot; markiert Platten, um to töten die extrazelluläre Salmonellen. Bringen Sie die Platten bis 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator für eine zusätzliche Stunde. </li><li> Zu retten und von jedem infizierten Belastung für die Aufzeichnung von Makrophagen-Zellzahl, behandeln den Rest der Brunnen auf dem &quot;Verein&quot; Platte mit 200 ul 1x PBS mit 1% Triton X-100 für 10 min. Die Triton-Lösung Makrophagenzellen lysieren und damit verbundenen Salmonellen. </li><li> Ernte Salmonellen aus jeder Vertiefung und legen Sie sie in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Führen Sie drei 10-fach serielle Verdünnungen mit 900μl 1x PBS auf den geernteten Proben aus jeder Vertiefung wird Wirbel zwischen jeder Verdünnung durchgeführt. </li><li> Platte der dritten Verdünnung, 10 -3, entweder auf LB (WT) oder LB-Kan (Mutanten)-Platten. Beschriften Sie die Platten mit entsprechenden Salmonella Stamm Name, Verdünnungszahl, Zeitpunkt und Datum. </li><li> Nach Vortexen des dritten Verdünnungsröhrchen, verzichten 10 ul Probe auf der Oberfläche des Agars und Wiederholen funserer Zeit für insgesamt 5 Tropfen. Achten Sie darauf, den Raum der fünf 10 ul Tropfen gleichmäßig auf die Petrischale Platten 7. </li><li> Nach den Tropfen in den Agar einweichen, drehen die Platten und Inkubation über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator. </li><li> Gönnen Brunnen für die Zählung von Makrophagen mit 150 ul 1xPBS mit 0,25% Trypsin-EDTA für 10 min gespeichert. </li><li> Nach Trypsinierung, Ort Makrophagen in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen und behandeln sie mit 50 ul FBS zu Trypsin / EDTA-Lösung zu neutralisieren, färben die Zellen mit 0,4% Trypanblau und Gäste sie unter Anwendung Hämazytometer. </li><li> Wenn die eine Stunde Inkubation abgelaufen ist, entfernen Sie die &quot;Invasion&quot; und &quot;Replikation&quot; Platten aus dem CO 2-Inkubator, und waschen jedes sowie &quot;Step 3.4&quot;. </li><li> Speichern Sie die &quot;Invasion&quot; Platte für die weitere Behandlung als &quot;Schritt 3,6-3,12&quot;. </li><li> Gib 200 ul DMEM-Medium mit 10 ug / ml Gentamicindie &quot;Replikation&quot; Platte Abstand von extrazellulären Salmonellen in dem Medium zu erhalten. Bringen Sie die Platte auf 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator für eine zusätzliche 22,5 Stunden. </li><li> Am nächsten Tag nehmen Sie die &quot;Replikation&quot; Platte von 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator, und waschen jedes sowie &quot;Step 3.4&quot; und behandeln sie als &quot;Schritt 3,6-3,12&quot;. </li><li> Schließlich entfernen Sie die Agar-Platten nach der Inkubation über Nacht im 37 ° C Inkubator und Gäste die Anzahl der Bakterienkolonien. </li><li> Eine gute Verteilung Kolonie sollte zwischen 10 und 100 Kolonien, enthält jede Stelle etwa 2 bis 20 Kolonien, wäre es schwer zu punkten, wenn es mehr als 20 Kolonien auf einem Fleck. Wenn die Zählung zu niedrig oder zu hoch ist, Ausstrich der Probe mit 10-fach höhere oder niedrigere Verdünnungen nach Bedarf. </li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Berechnen Sie die KBE (Koloniebildung Einheiten pro ml) jeder Platte auf der Basis der BeschichtungVolumen und Verdünnungsfaktor. </li><li> Ermitteln Sie die Anzahl der Salmonellen pro Makrophagen durch die Makrophagen aufgenommen Zellzahl von jedem Stamm. </li><li> Berechnen Sie die geometrischen Mittel der KBE pro Makrophagen aus mindestens drei unabhängigen Experimenten für die Zellverband, Invasion oder Replikation bzw. normalisieren und weiter nach WT für den relativen Wert. </li><li> Analysieren Sie die Daten für die Assoziation, Invasion und Replikation von Student-t-test bzw. indem jeder Stamm WT, und bestimmen Sie die statistische Signifikanz von p-Wert. </li></ol>

<ol><li>Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonellae+interplay+with+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Salmonellae interplay with host cells.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).</li>
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<li>Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+and+molecular+characterization+of+Salmonella+typhimurium+infection+in+neonatal+calves%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves.</a> Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).</li>
<li>Lawhon, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+SPI-1+secreted+effectors+in+acute+bovine+response+to+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+a+systems+biology+analysis+approach%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach.</a> PLoS One. 6, e26869(2011).</li>
<li>Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Salmonella+SPI1+effector+SopB+stimulates+nitric+oxide+production+long+after+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion.</a> Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).</li>
</ol>

Wir haben nichts offenzulegen.

Die Gentamicin-Schutztest wird häufig eingesetzt, um das Eindringen und die Vermehrung von intrazellulären bakteriellen Krankheitserregern im Wirtszelle zu untersuchen, und es ist insbesondere ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung biologischer Pathogene wie Salmonellen, deren Einfall ist die Voraussetzung für die Festlegung Schritt 1 Infektion. Die Standard-Gentamicin-Schutztest bei Salmonella-Forschung wird in 24-Well-Kulturschale 5 implementiert. Obwohl die Verwendung von ...

Nontyphoidal Salmonellen sind wichtige Ursachen von Darmerkrankungen in allen Wirbeltieren. Salmonellose beim Menschen ist unter den Top bakterielle lebensmittelbedingten Erkrankungen ein. Charakterisierung der molekularen Mechanismen, die die Wechselwirkungen von Salmonella mit ihrer tierischen Wirte unterstützen wird hauptsächlich durch die Untersuchung von Salmonella enterica-Serotyp typhimurium (STM) in der Gewebekultur und Tiermodellen der Infektion erreicht. Einblicke in STM-Wirt-Interaktionen wird uns helfen, zu verstehen, wie Salmonellen überleben und wachsen in Wirtszellen. Die erste Herausforderung bei der Untersuchung dieser Wechselwirkungen ist, so viele teilnehmende Faktoren wie möglich von beiden Wirt und Pathogen zu identifizieren, aber diese Bemühungen sind weitgehend durch den erheblichen Schwierigkeiten im Umgang mit zwei unabhängigen komplexen biologischen Systemen gleichzeitig, dh, Host-und Salmonella behindert, unter physiologischen Bedingungen. Zusätzlich ist die große repertOire von Salmonella und Wirtsgene möglicherweise Faktoren in Wirt-Interaktionen beteiligt Codierung erfordern Hochdurchsatz-biologische Plattform, um diese Herausforderung zu bewältigen. Eine modifizierte, standardisierte Test mit Salmonellen Verein, Invasion und Replikation in Makrophagen, die mit Hochdurchsatzkapazität Phänotyp wurde entwickelt, um eine große Gruppe von Genen wahrscheinlich Beteiligung an Salmonellen -host Wechselwirkungen zu untersuchen. Die Gentamicin-Schutz-Assay wurde im Jahr 1973 2 entwickelt, wurde aber zunächst gründlich von Elsinghorst 1994 3,4 beschrieben. Es wurde nun ein Standard-Werkzeug für die Untersuchung viele intrazelluläre bakterielle Erreger ex vivo, einschließlich Salmonellen 5,6 geworden. Verinnerlicht Bakterien zu vermeiden, die von einigen Antibiotika, wie Gentamicin, die nicht eukaryotischen Zellen eindringen kann 3 getötet. Durch Ausnutzung dieses Phänomens, misst die Gentamicin-Schutz-Assay, das Überleben und das Wachstum von intrazellulären bacterial Krankheitserreger. Drei Ereignisse, die während der Infektion, das heißt zusammen mit eukaryotischen Zellen, Invasion und Replikation können für die intrazelluläre bakterielle Pathogene auf der Basis des Zeitintervalls zwischen der Infektion, Gentamicin-Behandlung und eine weitere Inkubation (1) ausgewertet werden. Eukaryotische Zelllinien eine physiologische Umgebung, die weniger komplex als relevanten Tiermodellen für Wirt-Pathogen-Interaktionsstudien ist. Die Gentamicin-Schutz-Assay ist eine geeignete Plattform, um STM-Wirt-Interaktionen zu studieren, aber die Standard-Assay in einer 24-Well-Kulturschale hat eine geringe Durchsatzkapazität. Computergestützte Analyse in vivo Datensätze identifiziert 149 Salmonella-Genprodukte, die voraussichtlich mit rund 300 Gast Genprodukte (unveröffentlichte Daten) zu interagieren. Die Standard-Gentamicin-Schutztest hat nicht die Fähigkeit, diese Anzahl von Mutanten effizient Phänotyp. In additIonen, die Gentamicin-Schutz-Assay kann theoretisch die Invasion auch nur eines einzigen Bakterium erkennen. Wegen dieser inhärenten Empfindlichkeit sind die Rohdaten anfällig für technische Abweichungen, wenn zu verschiedenen Zeitpunkten wiederholt. Die internen Kontrollen und die relative Darstellung der Daten nach der Normalisierung sind für sinnvolle Interpretation der Ergebnisse. Angesichts dieser Überlegungen wurde eine modifizierte, standardisierte Gentamicin Protection Assay entwickelt, um Testkapazität erhöhen und die Präzision. Das folgende Protokoll ist eine detaillierte und illustrierte, um die geänderte Gentamicin-Schutz-Assay unter Verwendung von 96-Well-Kulturschalen und die murine Makrophagen-Zelllinie RAW264.7 durchzuführen. Im Vergleich zur Standard-Protokoll in 24-Well-Kulturschalen hat die modifizierte Protokoll die folgenden Vorteile: 1) unter Verwendung von 96-Well-Kulturschalen können bis zu 10 verschiedene Mutantenstämme phänotypisiert werden einschließlich der internen positiven und negativen Kontrollen mit ausreichender statistischer Power;2) Die Varianz der Ergebnisse wird deutlich reduziert, da die Mutantenstämme sind in der gleichen Kulturschale und zur gleichen Zeit getestet; 3) Die Verwendung von Mehrkanalpipetten erhöht den Durchsatz und reduziert Ermüdungserscheinungen. Schließlich Vergleich zu 24-Well-Kulturschalen wurden Bedenken von weniger Wirtszellen pro Well in 96-Well-Kulturschale durch Protokolloptimierung und Standardisierung gerichtet. Zusammenfassend ist die modifizierte, standardisierte Test zur in-vitro-Phänotyp Salmonellen oder andere bakterielle Verein, Invasion und Replikation in Fresszellen erhöht die Präzision und erreicht Hochdurchsatzleistung bei gleichzeitiger Reduzierung Ermüdung des Bedieners.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>HyClone</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Zellkulturflasche mit belüfteter Filterkappe</td><td>Nest Biotechnology</td><td>708003</td><td></td></tr><tr><td>100x nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Zellschaber</td><td>BD Falcon</td><td>353086</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Zellkulturplatte</td><td>Corning Incorporated</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) Bouillon</td><td>MP Biomedicals</td><td>3002-075</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Polypropylen-Rundbodenröhrchen</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4 (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>10010</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin Lösung</td><td>Sigma</td><td>K0254</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin Lösung</td><td>Sigma</td><td>G1272</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr></tbody></table>

hochdurchsatz-assay zum phänotyp salmonella enterica typhimurium association, invasion und replikation in makrophagen

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella-Arten sind Zoonoseerreger und führenden Ursachen von lebensmittelbedingten Krankheiten bei Mensch und Vieh 1. Das Verständnis der Mechanismen Salmonellen -host Interaktionen zugrunde liegen, sind wichtig, um die molekularen Pathogenese der Salmonellen-Infektion aufzuklären. Die Gentamicin-Schutztest auf Salmonellen Verein, Invasion und Replikation in Fresszellen Phänotyp angepasst, damit Hochdurchsatz-Screening, um die Rollen der Deletionsmutanten von Salmonella enterica Serotyp Typhimurium in Wirt-Interaktionen mit RAW 264.7 Makrophagen Maus definieren. Unter diesem Protokoll, die Varianz bei Messungen, verglichen mit dem Standardprotokoll erheblich reduziert, da Wildtyp-und Mutantenstämmen mehrere in der gleichen Kulturschale und gleichzeitig getestet werden. Die Verwendung von Mehrkanalpipetten erhöht den Durchsatz und erhöht die Präzision. Darüber hinaus betrifft die Verwendung weniger ho bezogenenST-Zellen pro Well in 96-Well-Kulturschale angesprochen. Hier wurde das Protokoll des modifizierten in vitro-Assay mit Salmonella Invasion Fresszellen erfolgreich eingesetzt, um 38 Einzel Salmonellen Deletionsmutanten für Verein, Invasion und intrazellulären Replikationsphenotyp. Die in vitro-Phänotypen vorgestellt, von denen einige später bestätigt Phänotypen in vivo in einem Tiermodell zu haben. So wird die modifizierte, standardisierte Test mit Salmonellen Verein, Invasion und Replikation in Makrophagen, die mit Hochdurchsatzleistung konnte im weiteren Sinne verwendet, um Bakterien-Wirt-Interaktionen zu untersuchen Phänotyp.

Siehe repräsentative Ergebnisse (Figur 2), nachdem die Daten auf der Basis des modifizierten phagozytischen Zellinvasionstest aufgetragen. Die Daten sind fünf verschiedene Stämme, WT, ΔinvA, ΔphoP, mutierten A, B und Mutanten Δ InvG bekannt für die Invasion defekt zu sein, und ΔphoP bekannt für die Replikation 8 defekt zu sein, werden als positive Kontrollen verwendet werden, um die experimentelle Gültigkeit zu überprüfen . In der Tat, in der modifizierten Invasion ...

Eine Hochdurchsatz-Assay in vitro Phänotyp Salmonellen oder andere bakterielle Verein, Invasion und Replikation in Fresszellen mit hoher Durchsatzleistung entwickelt. Die Methode wurde eingesetzt, um Salmonellen Gen-Knockout-Mutanten-Stämme für ihre Verstrickungen in der Wirt-Pathogen-Interaktionen zu bewerten.

Hochdurchsatz-Assay zum Phänotyp Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion und Replikation in Makrophagen

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Gene, die für die Invasion und/oder das Überleben in Makrophagenzellen in vitro erforderlich sind, in einer Hochdurchsatzmethode zu screenen und zu bewerten und mechanistische Gene der Salmonellen-Pathogenese zu identifizieren. Dies wird durch die Zugabe von Wildtyp- oder mutierten Salmonellenstämmen zu Makrophagen-Zellkulturen erreicht. In 96 Well-Platten für 30 Minuten als In-vitro-Infektion im zweiten Schritt nach der 30-minütigen Inkubation werden Salmonellen, die sich nicht an die Makrophagenzellen anheftet haben, weggespült und frisch.Ein Medium, das eine hohe Konzentration des Antibiotikums Gentamycin enthält, wird eine Stunde lang zugegeben, wodurch alle extrazellulären Bakterien, die nicht internalisiert werden, abgetötet werden. Als nächstes wird die Makrophagen-Zellkultur erneut gewaschen und frisches Medium mit einer geringen Konzentration an Gentamycin für eine weitere 22,5-stündige Inkubation hinzugefügt, um eine bakterienfreie extrazelluläre Umgebung aufrechtzuerhalten und nur den intrazellulären Salmonellen das Überleben und die Vermehrung zu ermöglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass durch den Vergleich der mutierten Salmonellen mit dem Wildtyp-Stamm der in vitro Phänotyp der mutierten Stämme für Assoziationsinvasion und Replikation bestimmt wird, basierend auf der Messung der Koloniebildungseinheiten pro Makrophagenzelle, die durch den seriellen Verdünnungs-Plattierungsassay für jeden Zeitpunkt erhalten wurden.Der Hauptvorteil unserer Technik besteht darin, dass sie die Assoziation, Invasion und Replikation von Salmonellen und phagozytären Zellen misst und dass sie mehrere Stämme gleichzeitig messen kann, um einen höheren Durchsatz zu erzielen. Das Verfahren wird von Dr. Jing Wu, Postdoktorandin in meinem Labor, und Frau Roberta Pugh, wissenschaftliche Mitarbeiterin in meinem Labor, demonstriert. Um mit der Reihe von Makrophagenzellen roh 2 64 0,7 in einem T 75 Zellkulturkolben mit einer belüfteten Filterkappe in Delcos modifizierten Eagles Medium zu beginnen, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 0,5 % Natriumbicarbonat und 1 %100 x nicht-essentiellen Aminosäuren NEAA bei 37 Grad Celsius in einem 5%Kohlendioxid-Inkubator.Wenn die Zellen eine Konfluenz von 60 bis 80 % erreichen, ernten Sie die Zellen in DMEM mit einem Zellschaber, zählen Sie dann die Zellen in einem Hämozytometer und berechnen Sie die Zellkonzentration, verdünnen Sie die Zellsuspension auf eine Konzentration von 2,5 mal 10 bis fünf Zellen pro Milliliter frischer DMEM-Zellkultur. Mittlere Platte: 200 Mikroliter der verdünnten Zellsuspension unter Verwendung einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung einer 96-Well-Zellkulturplatte, Plattenzellen in drei separate 96-Well-Platten für einen Satz phagozytärer Zellinvasionsassays auffüllen und jede Platte mit Assoziation, Invasion und Replikation markieren. Für jeden Salmonellenstamm werden vier Vertiefungen pro Platte verwendet.Legen Sie die Platten über Nacht in einen 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius, damit sich die Makrophagenzellen noch am selben Tag am Boden der Vertiefungen anheften können. Die Makrophagen-Rohzellen mit 2, 6, 4, 0,7 Zellen werden in 96-Well-Platten plattiert. Es werden einzelne Kolonien des Wildtyps Salmonella entera Serotyp, tyria 1 0 4 2 8 delta INVA Mutante delta four P Mutante und die gewünschte Testmutantenstammkultur ausgewählt.Jeder der Salmonellenstämme gibt fünf Milliliter LB-Brühe und ergänzt die LB-Brühe für die mutierten Stämme: Mit 50 Mikrogramm pro Milliliter kann Mycin die Bakterien 14 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 220 Umdrehungen pro Minute in locker verschlossenen 14-Milliliter-Polypropylen-Rundbodenröhrchen wachsen. Nach der nächtlichen Inkubation bei 37 Grad Celsius Subkultur stämmt jeder der Salmonellen im Verhältnis eins zu 50 in fünf Milliliter der jeweiligen lb Brühe. Züchten Sie die Kulturen weitere vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 220 U/min.Lesen Sie die OD 600-Werte jeder Bakterienkultur auf einem Spektralphotometer ab. Jede Kultur sollte einen OD 600-Wert zwischen 0,6 und 1,2 haben, um die Pathogenität von Salmonellen, Insel, ein bis drei Sekretionssystem, SPI, ein Typ-3-Sekretionssystem, die Genexpression für die Invasion zu optimieren. Berechnen Sie die Bakterienkonzentration nach der Formel eins OD 600 entspricht 7,5 mal 10 bis zur achten koloniebildenden Einheit pro Milliliter.CFU verdünnt dann die Bakterien auf eine Konzentration von fünf mal 10 auf die sechs, die FU pro Milliliter und drei Milliliter frisches DMEM-Zellkulturmedium. Entnehmen Sie 3 96-Well-Zellkulturplatten mit Makrophagen aus dem Kohlendioxid-Inkubator und waschen Sie jede Vertiefung einmal mit 200 Mikrolitern eines XPBS. Nachdem die PBS-Wäsche vollständig entfernt wurde, geben Sie 200 Mikroliter Bakterien in DMEM-Medium in jede Vertiefung. Dies führt dazu, dass die Platten in einem verschlossenen Behälter bei 1000 mal G für 10 Minuten und einer Multiplizität des Infektionsmoi von 20 zu eins zentrifugiert werden.Legen Sie dann die Platten für 30 Minuten in einen 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Sobald die 30-minütige Inkubation abgeschlossen ist, nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator und waschen Sie jede Vertiefung dreimal mit 200 Mikrolitern eines XPBS, um nicht verwandte Bakterien zu entfernen. Als nächstes werden 200 Mikroliter DMEM-Medium, das 100 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin enthält, in jede Vertiefung der mit Invasion und Replikation markierten Platten gegeben, um die extrazellulären Salmonellen abzutöten.Dann stellen Sie die Platten für eine weitere Stunde in einen 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Für die Assoziationsplatte wird von jedem infizierten Stamm eine Vertiefung für die Aufzeichnung der Makrophagenzellzahl aufbewahrt und die verbleibenden Vertiefungen 10 Minuten lang mit 200 Mikrolitern eines XPBS mit 1 %tritton x 100 behandelt. Um die Zellen zu schneiden, ernten Sie die Salmonellen aus jeder Vertiefung und geben Sie sie in 1,5-Milliliter-Orph-Röhrchen Führen Sie drei zehnfache Getreideverdünnungen mit 900 Mikrolitern eines XPBS auf die geernteten Proben aus jeder Vertiefung durch und wirbeln Sie zwischen jedem Verdünnungswirbel die dritte Verdünnung von 10 bis minus drei für jedes Bakterium und geben Sie 10 Mikroliter der Probe entweder auf LB-Platten für Wildtyp- oder LB-Platten.Mit kann Mycin für die mutierten Stämme. Wiederholen Sie diesen Schritt viermal für insgesamt fünf 10-Mikroliter-Tropfen, die gleichmäßig auf den Platten verteilt sind, nachdem die Tropfen in den Agar eingedrungen sind, drehen Sie die Platten um und inkubieren Sie über Nacht. In einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator behandeln Sie die verbleibenden Vertiefungen, die für die Zählung der Makrophagen aufbewahrt wurden, 10 Minuten lang mit 150 Mikrolitern eines XPBS, das 0,25 % TRIPSIN EDTA enthält. Nach der Trypsinisierung werden die Makrophagen in 1,5 Milliliter Einorröhrchen überführt und mit 50 Mikrolitern FBS behandelt, um die Tryin-EDTA-Lösung zu neutralisieren.Entfernen Sie dann 10 Mikroliter der Zellsuspension aus einem EOR-Röhrchen in ein neues Röhrchen. Fügen Sie 10 Mikroliter 0,4 % Trianblau hinzu, um die Zellen zu färben, und zählen Sie sie in einem Hämozytometer, wenn die Invasions- und Replikationsplatten die einstündige Inkubation im Kohlendioxid-Inkubator abgeschlossen haben. Nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator und waschen Sie jede Platte dreimal gut mit 200 Mikrolitern eines XPBS.Geben Sie als nächstes 200 Mikroliter DMEM-Medium mit 10 Mikrogramm Gentamycin pro Milliliter auf die Replikationsplatte, um die Clearance von extrazellulären Salmonellen im Medium aufrechtzuerhalten. Stellen Sie die Platte dann für weitere 22,5 Stunden in einen 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Ernten und refaden Sie dann die Salmonellen von der Invasionsplatte auf Agarplatten und zählen Sie die Makrophagen aus einer Vertiefung jedes infizierten Stammes, indem Sie am nächsten Tag die für die Assoziationsplatte beschriebenen Schritte befolgen.Nehmen Sie die Replikationsplatte aus dem Inkubator und waschen Sie jede Vertiefung dreimal mit 200 Mikrolitern eines XPBS. Ernten und refaden Sie dann die Salmonellen von der Replikationsplatte auf Agarplatten und zählen Sie die Makrophagen aus einer Vertiefung jedes infizierten Stammes, indem Sie die für die Assoziationsplatte beschriebenen Schritte befolgen. Nachdem die Agarplatten über Nacht in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator inkubiert wurden, nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator und bewerten Sie die Anzahl der Bakterienkolonien pro Platte.Bei der Zählung der einzelnen Platten sollte die Verteilung der Bienenvölker zwischen 10 und 100 Völkern liegen. Wenn die Zählung zu hoch oder zu niedrig ist, dann die Probe je nach Bedarf mit zehnfach höherer oder niedrigerer Verdünnung auffrischen. Der phagozytäre Zellinvasionsassay identifiziert in geeigneter Weise den Phänotyp von Salmonellen-Deletionsmutanten, wie er für den delta-INVA-Invasionskontrollstamm, eine bekannte invasionsdefekte Mutante, und den delta-four-P-Replikationskontrollstamm gezeigt wird.Eine bekannte replikationsdefekte Mutante, Mutante A und Mutante B, sind zwei repräsentative Stämme, die unter Verwendung dieses Protokolls veränderte Phänotypen für die Replikation in Makrophagen 20 von 38 aufweisen. Salmonellenmutanten, die bisher im phagozytären Zellinvasionsassay getestet wurden, zeigen variable, aber signifikante Defekte in der Assoziationsinvasion und/oder Replikation in rohen 2, 6, 4, 0,7 Makrophagen. Dieses Protokoll wurde nur für einige statische Zellen der Nala und des Wirtseffekts getestet.Daher wird eine Modifikation und Optimierung für andere Bakterien und Wirtszellen notwendig sein.

high-throughput-assay-to-phenotype-salmonella-enterica-typhimurium

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Jung, A. L. et. al., Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolierung und Analyse ihres entzündungsfördernden Potenzials auf Makrophagen. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Vorbehandlung von Makrophagen mit Legionella pneumophila Vesikeln der äußeren Membran (OMVs), um deren Wirkung auf die bakterielle Replikation zu untersuchen. Durch die Veränderung der Immunsignalisierung des Wirts machen OMVs Makrophagen durchlässiger für Infektionen. Höhere Koloniezahlen in...

Assay der Legionella pneumophila-Replikation in Makrophagen, die mit äußeren Membranvesikeln vorbehandelt wurden

Dieses Video zeigt einen Assay zur Untersuchung der Toll-like Rezeptor (TLR)-abhängigen Aktivität der Transkriptionsfaktoren Kernfaktor-kappa-B (NF-κB) und Aktivatorprotein-1 (AP-1) in Makrophagen. Die TLRs lösen bei der Erkennung von schadensassoziierten molekularen Mustern (DAMPs) eine proinflammatorische Signalkaskade aus, die NF-κB und AP-1 aktiviert. Die manipulierten Reportermakrophagen produzieren bei Aktivierung von NF-κB und AP-1 ein sezerniertes embryonales alkalisches...

Ein Assay für die TLR-abhängige NF-&kcy;B/AP-1-Transkriptionsfaktor-Signalgebung in Makrophagen

Dieses Video zeigt einen Assay zur Quantifizierung des intrazellulären Wachstums von Parasiten in aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen (BMMs). Die Makrophagenzellen sind mit den beweglichen und nicht-beweglichen invasiven Stadien der Leishmanien, metazyklischen Promastigoten bzw. Amastigoten infiziert. Die Parasiten dringen in die Makrophagen ein, werden in einer parasitophoren Vakuole internalisiert und vermehren sich im Inneren. Das intrazelluläre Parasitenwachstum wird unter Verwendung...

Ein in vitro Assay zur Quantifizierung des intrazellulären Wachstums von Parasiten in Makrophagen

Dieses Video zeigt einen Assay zur Quantifizierung von zytosolischem und vakuolärem Salmonella typhimurium in aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen mittels differentieller Permeabilisierung. Die Makrophagen sind mit einer fluoreszierenden Protein-exprimierenden Salmonelle infiziert, die in einer spezialisierten Vakuolenstruktur namens Salmonellen-haltige Vakuole oder SCV internalisiert ist. Eine Untergruppe von Bakterien entkommt dem SCV und dringt in das Zytosol ein. Die cholesterinreiche...

Ein Assay zur Quantifizierung von zytosolischen und vakuolären Salmonellen in infizierten primären Makrophagen

Vorwärtsgenetik ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Identifizierung von Genen in intrazellulären Krankheitserregern, die für die Resistenz gegen zellautonome Immunität wichtig sind. Der derzeitige Ansatz verwendet angeborene Immunzellen, insbesondere Makrophagen, um neue Toxoplasma gondii-Gene zu identifizieren, die für die Immunevasion wichtig sind.

Zukunfts Genetics Screens Mit Makrophagen zu identifizieren<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Gene wichtig für die Resistenz gegenüber IFN-γ-abhängige Zell autonome Immunität

Wir beschreiben die Quantifizierung von zytosolischen und vakuolären Salmonella typhimurium in Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen mittels differentieller Digitonin-Permeabilisierung.

Die Quantifizierung der Cytosolic vs. Vacuolar<em&gt; Salmonellen</em&gt; In Primäre Makrophagen durch Differential Permeabilisierung

Es wurde ein Echtzeit-Assay mit hohem Durchsatz entwickelt, um gleichzeitig (1) eukaryotische zellpenetrierende antimikrobielle Wirkstoffe zu identifizieren, die auf einen intrazellulären bakteriellen Krankheitserreger abzielen, und (2) die Zytotoxizität eukaryotischer Zellen zu bewerten. Eine Variation der gleichen Technologie wurde anschließend mit digitaler Dosiertechnologie kombiniert, um einfache, hochauflösende Dosis-Wirkungs-Studien sowie zwei- und dreidimensionale Synergiestudien zu...

Hoher Durchsatz, Echtzeit, Doppel-Ausleseprüfung intrazellulärer antimikrobieller Aktivität und eukaryotischen Zelle Zytotoxizität

Neue Modelle und Assays, die den frühen Prozess der Arzneimittelentwicklung für Anti-Tuberkulose-Medikamente der nächsten Generation verbessern würden, sind sehr wünschenswert. Hier beschreiben wir einen schnellen, kostengünstigen und BSL-2-kompatiblen Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten gegen Mycobacterium tuberculosis, der leicht für das Hochdurchsatz-Screening angepasst werden kann.

Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Wir beschreiben hier eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen durch die Beschichtung der Bakterien mit Biotin und Streptavidin.

Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

Dieses Protokoll bietet Forschern eine schnelle, indirekte Methode zur Messung der TLR-abhängigen NF--B/AP-1-Transkriptionsfaktoraktivität in einer murinen Makrophagenzelllinie als Reaktion auf eine Vielzahl von polymeren Oberflächen und adsorbten Proteinschichten, die die Mikroumgebung des Biomaterials Implantate modellieren.

Ein Makrophagen-Reporter-Zell-Assay zur Untersuchung der toll-like Receptor-vermittelten NF-kB/AP-1-Signalisierung auf adsorbierten Proteinschichten auf polymeren Oberflächen

Salmonellen dringen in intestinale Epithelzellen ein und replizieren sich sowohl in Salmonellen-spezifischen Vakuolen als auch frei im Zytosol (Hyperreplikation). Hier wird ein auf Hochdurchsatz-Fluoreszenzmikroskopie basierendes Protokoll beschrieben, um die intrazellulären Phänotypen von Salmonellen durch zwei komplementäre Bildanalysen durch ImageJ zu quantifizieren, um Einzelzellauflösung und Scoring zu erreichen.

Automatisierte Analyse intrazellulärer Phänotypen von Salmonellen mit ImageJ

Erfahren Sie einen Hochdurchsatz-Assay zur Untersuchung von Salmonella enterica Typhimurium in Makrophagen. Diese Methode identifiziert Gene für Invasion und Replikation in Wirtszellen.

Hochdurchsatz-Assay zum Phänotyp Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion und Replikation in Makrophagen

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