Name: 3D-Tracking-Orbital in einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop: einen Antrag bei der Verfolgung von intrazellulären Vesikeln (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Lernen Sie die 3D-Orbital-Tracking-Methode zur Verfolgung schneller Lysosomen in lebenden Zellen mit einem modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop. Diese Technik ermöglicht die Erfassung von Organellendynamik und Vesikeltransport.

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Dieses Projekt wurde durch die Zuschüsse NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 und P50-GM076516 unterstützt.

1. Probenvorbereitung <ol><li> Aufrechterhaltung CHOK1-Zellen in Gewebekulturflaschen mit DMEM mit 10% fötalem Rinderserum und 100 IU / ml Penicillin 50 ug / ml Streptomycin ergänzt. Die Zellen in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C aufweist. </li><li> Ernte und dann die Platte CHOK1 Zellen auf einem 14 mm Durchmesser Mikro gut mit einer Oberfläche Dicke von 0,16 mm. Samenzellen für eine optimale Dichte für die Bildgebung, etwa 60-70% Konfluenz. </li><li> Zellen bei 37 ° C über Nacht inkubieren, 5% CO 2. In HBSS (Hank Kochsalzlösung), waschen die Zellen dreimal, und Inkubation Zellen in einer Lösung, die 50 nM Lysotracker DND26 grün und 150 nm von Tubulin-Tracker grün. Zellen Inkubation für 1 h bei 37 ° C aufweist. Optionaler Schritt: Vor der Inkubation, führen Sie eine zusätzliche Fleck mit einem mitochondrialen Matrix Färbung Farbstoff (25 nM). </li><li> Waschen Sie die Zellen dreimal in HBSS um ungebundenen Farbstoff zu entfernen. Fügen Sie frisches DMEM Wachstumsmedium vor der IMAGing die Zellen. </li></ol> 2. Mikroskop Konfigurationen Das Mikroskop für die in der Video-Protokoll beschrieben Partikelverfolgung auf dem Rahmen eines im Handel erhältlichen Umkehrmikroskop (4) zusammengebaut. Allerdings kommerziellen Module für 3D-Orbitalpartikelverfolgung sind jetzt verfügbar. <ol><li> Verwenden Sie ein Coherent Chameleon Ultra II-Ti: Sa Femtosekunden-Laseranregungslichtquelle, mit einer abstimmbaren Ausgangswellenlängenbereich zwischen 690 nm-1040 nm auf. </li><li> Sicherzustellen, dass der Laserstrahl in der hinteren Öffnung des Mikroskops unter Verwendung von IR-beschichtete Spiegel ausgerichtet ist. Der Laserstrahl wird mittels eines rotierenden Halbwellenplatte, gefolgt von einem linearen Polarisator Calcit gedämpft. Dämpfen den Strahl, so dass die mittlere Leistung an der Probe zwischen 0,5 und 2 mW. HINWEIS: Der Laserstrahl wird durch ein Paar von Galvanometer-Stellspiegeln, die Motorsteuerung der Position und der Trajektorie des fokussierten Strahls in der Probenebene reflektierte ermöglichen. In einetypische Konfiguration der kollimierte Laserstrahl-Austritts der Galvanometerspiegel expandiert (10x), die durch einen Strahlexpander, bevor sie in die Rückseite des Mikroskopobjektiv nach Reflexion am Kurzpass dichroitischer Spiegel. </li><li> Sammeln Sie das Fluoreszenzlicht aus der Probe, indem eine hohe numerische Apertur Wasser Objektiv (60x, NA 1.2) in den Strahlengang. Wähle ein Fluoreszenzfilterwürfel gemäß den gewünschten Emissionswellenlängen in einer oder beiden Kanalkonfiguration. Beschäftigen Emissionsbandpassfilter weiter wählen den Spektralbereich der emittierten Fluoreszenz. </li><li> Legen Sie die Probe auf einen motorisierten Tisch, und stellen Sie die Feinbewegung des Mikroskopobjektivs mit Hilfe einer objektiven Piezo-Controller. </li><li> Lenken das Licht von der Filterwürfel in Photovervielfacherröhren, wo das Signal diskriminiert und in ein digitales I / O-Datenerfassungskarte gesendet. HINWEIS: Computer erzeugten Wellenformen sind das analoge Ausgangssignal des I / O-Karte und provided den Scanner Steuerelektronik. Die Photonenzählung Eingabe von den Photomultipliern und das Ausgangssignal an den Scanner gemessen und über die I / O-Karte durch das Labor für Fluoreszenzdynamik SimFCS Software gesteuert. </li></ol> 3. Imaging <ol><li> Positionieren Sie die Zellen, die auf der Bühne und konzentrieren sich mit Durchlichtbeleuchtung. </li><li> Wechseln Sie zu Raster-Scan-Bildgebung, um die Zellen, die den Farbstoff aufgenommen haben zu identifizieren und die zugrunde liegenden Mikrotubuli zu visualisieren. Identifizieren Sie die erste Bereich, in dem Vesikel Bewegung vorhanden ist. </li><li> Sobald eine isolierte Vesikel identifiziert wird, legen Sie die folgenden Parameter für die Orbitalverfolgung: <ol><li> Wählen des Radius der Umlaufbahn, um die Größe der Kreisabtastung entsprechend der Größe der Teilchen verfolgt definieren. Für einen Punkt Emitter, stellen Sie den Radius der Umlaufbahn gleich der Taille des Point Spread Function (PSF) der Anregungsstrahl, um die Empfindlichkeit und Reaktion zu maximieren. </li><li> Stellen Sie die axialeAbstand zu dem Abstand zwischen den beiden Bahnen, die ausgeführt werden, um die Partikelposition in der axialen Richtung zu lokalisieren definieren. Stellen Sie den axialen Abstand zu 1,5-3 mal der PSF Taille. </li><li> Definieren Sie die Verweildauer je nach der Helligkeit des Teilchens, die Zeit auf jedem Punkt der Umlaufbahn, die auch die Foto-Bleichrate bestimmen verbrachte eingestellt. Verwenden Sie eine Verweildauer zwischen 10-100 us. </li><li> Die Anzahl der Punkte in jeder Umlaufbahn auf 64 oder 128 in den Orbit Perioden in der Größenordnung von 4-32 ms ergeben und bieten eine hohe zeitliche Auflösung für die Bestimmung der Partikelposition. </li></ol></li><li> Ändern des Gleichstromoffsetsignals an den Spiegel, um den Strahl auf den Teilchen durch die grafische Benutzerschnittstelle über eine Cursor-Auswahl in dem gerasterten Bild Zentrum geschickt. </li><li> Beginnen Tracking durch Umschalten des Mikroskop-Modus von Rasterbildern wird Orbital Scannen. </li><li> Aktivieren Sie die Feedback-und Datenerfassung. </li></ol> 4. Trajectcher Analyse <ol><li> Verwenden Sie die Software, um die an jedem Punkt entlang der Bahn und zu jedem Zeitpunkt in der Form einer &quot;Intensität Teppich &#39;gesammelt Fluoreszenz anzuzeigen. Die entlang der Teppich gesammelt Intensität Informationen über die Wechselwirkung des Teilchens mit anderen hellen Objekten. Die Software verwenden, um sowohl das Bahninformationen (über die Zeit der x, y-Scanner und der z -piezo dh die Verschiebung DC) als auch die Fluoreszenzintensität in Form von Zeitreihen von der Fotovervielfacherröhre über die Zeit gesammelt wurden. </li><li> Nutzen Sie die Zeit und die Reihendarstellung &#39;Intensität Teppich&#39; Informationen, die nur eine Region von Interesse in der Flugbahn zu wählen. </li><li> Verwenden Sie die Software, um eine 2D-Projektion des ausgewählten Teil der Partikelflugbahn an. Wählen Sie die entsprechenden Kontrollen Farbcode die Flugbahn nach der Partikelfluoreszenzintensität. </li><li> Wählen Sie die Option, um die p angezeigtArtikel Bahn in 3D, und Farbcode es nach der Fluoreszenzintensität. Drehen Sie die Flugbahn in 3D über die Steuerelemente, um die Funktionen des Lysosom Bewegung entlang der Mikrotubuli zu visualisieren. </li></ol>

<ol><li>So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+photon+excitation+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Two photon excitation fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).</li>
<li>Dupont, A., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+three+dimensional+single+particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoscale three dimensional single particle tracking.</a> Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).</li>
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<li>Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+directed+molecular+motion+in+the+nuclear+pore+complex+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Trotz der enormen Fortschritte der Fluoreszenzmikroskopie-Techniken und Instrumente in den letzten Jahren erreichen Bahnen der fluoreszierenden Teilchen in drei Dimensionen mit einer hohen zeitlichen Auflösung ist eine Herausforderung im Bereich geblieben. Wenn hohe zeitliche Auflösung wurde Tracking Teilchen in zwei Dimensionen erreicht, die Erweiterung zu der axialen Richtung führt typischerweise zu einer drastischen Reduktion der Frequenzgang des Systems 10. In diesem Video-Pro...

Zahlreiche Ansätze sind bisher entwickelt worden, um fluoreszierende Partikel in drei Dimensionen unter Verwendung eines Mikroskops zu verfolgen. Die meisten Ansätze beruhen auf der Verwendung von schnellen Kameras ideal geeignet, um in zwei Dimensionen, die typischerweise mit individuellen Änderungen der Emissionsoptik des Mikroskops kombiniert Verfolgung in axialer Richtung zu erreichen verfolgen. Laser-Scanning-Mikroskop (entweder konfokale oder zwei Photonen) üblicherweise eine Leuchtstoffpartikel durch Ausführen einer zeitlichen Abfolge von Z-Stapeln zu verfolgen, wobei dieses Verfahren typischerweise zeitaufwendig und liefert angemessene zeitliche Auflösung (10 Hz), wenn das Teilchen verfolgt wird in der Mitte eines kleinen Rasterabbildungsbereich durch eine aktive Rückkopplungsmechanismus 2 gehalten. Die Idee der Verriegelungs, um die Partikel der Boden der Orbitalverfolgungsverfahren. Anstelle von einer Rasterabtastung einer Kreisbahn um den fluoreszierenden Teilchen durchgeführt. Die Intensität der Fluoreszenz entlangdie Umlaufbahn genau lokalisiert die Partikelposition 4. Die lokalisierte Position des Partikels kann dann verwendet werden, um die Mikroskopscanner und Wieder Zentrum der Umlaufbahn von der Partikelposition zu betätigen. Die Galvanometer-Scannern des Mikroskops durch eine analoge Spannung angetrieben. Die Wechselstromkomponente dieser Spannung ermöglicht die Durchführung einer Umlaufbahn mit dem fokussierten Laserstrahl, dh einer Sinus und einer zur X und Y Scanspiegel angewendet wird es Durchführen einer kreisförmigen Umlaufbahn Kosinuswelle. Der Gleichstrom-Offset des Signals erleichtert das Ändern der Position der Bahn entfernt. Sobald eine Umlaufdauer bestimmt wird und die Wellenform des Wechselspannungssignals konfiguriert ist, muss das Rückführsystem, um nur die DC-Komponente des Signals zu aktualisieren. Eine Software in der Lage, die von den Detektoren gesammelten Fluoreszenzsignal ausgelesen wird benötigt, um die Scanner und den Detektoren zu steuern, um die Position des Teilchens zu berechnen und zu aktualisieren, die DC ausgesetzt. Für eine erfolgreiche Rückmeldung Abbilden einer sorgfältigen Auswahl der Bahndaten (Größe und Timing) erforderlich ist, und diese Parameter auf der Basis der Eigenschaften der Leuchtstoffpartikel, die es notwendig, zu verfolgen ist, eingestellt werden. Die physikalischen und mathematischen Grundlagen der Technik wurden in der Vergangenheit 4,5 für 2D-und 3D-Anwendungen beschrieben. In diesem Protokoll beschreiben wir kurz die wesentlichen Hardware-Komponenten der Einrichtung, und genauer die Wahl der Parameter und die Probenvorbereitung für einen typischen Versuch erlaubt uns folgende Verschiebung eines Lysosom mit hoher zeitlicher Auflösung in einer lebenden Zelle erforderlich.

<table><tbody><tr><td>Lysotracker DND 26</td><td>Life Technologies</td><td>L-7526</td><td></td></tr><tr><td>Tubuline Tracker Green</td><td>Life Technologies</td><td>T34075</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker RED</td><td>Life Technologies</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>Coherent Chamelon- ultra II TI</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glan Taylor Calcit Polarizer</td><td>Melles Griot</td><td>03PTA001</td><td></td></tr><tr><td>Galvanometer-Motorspiegel</td><td>Cambridge Technologies</td><td>M 6350</td><td></td></tr><tr><td>Dichroitischer Spiegel</td><td>Chroma Technologies</td><td>700 DCSPXR</td><td></td></tr><tr><td>Motorischer Tisch</td><td>ASI</td><td>MS2000</td><td></td></tr><tr><td>Piezo&nbsp;</td><td>PI</td><td>P721-LLQ</td><td></td></tr><tr><td>Photomultiplier-Röhre</td><td>Hamamatsu</td><td>H7422P-40</td><td></td></tr><tr><td>Datenerfassungskarte</td><td>IO tech</td><td>PCI 1128-4000</td><td></td></tr><tr><td>Bildgebungssoftware</td><td>LFD</td><td>Global für Bilder-SimFCS</td><td></td></tr></tbody></table>

3d-tracking-orbital in einer modifizierten zwei-photonen-mikroskop: einen antrag bei der verfolgung von intrazellulären vesikeln

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Das Ziel dieses Video-Protokoll ist zu diskutieren, wie mit einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop 1 durchzuführen und zu analysieren, eine dreidimensionale Fluoreszenzorbitalpartikelverfolgung Experiment. Wie zu herkömmlichen Ansätzen (Rasterabtastung oder Weitfeld basierend auf einem Stapel von Frames) gegenüberliegt, kann die 3D-Tracking-Orbital zu lokalisieren und zu verfolgen mit hoher räumlicher (10 nm Genauigkeit) und zeitliche Auflösung (50 Hz Frequenzgang) die 3D-Verschiebung ein bewegtes fluoreszierende Partikel auf Längenskalen von Hunderten von Mikrometern 2. Das Verfahren basiert auf einem Algorithmus, der die Rückkopplungs Hardware eines Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop, um eine Kreisbahn um das Objekt auszuführen steuert basierend verfolgt werden: Der Rückkopplungsmechanismus wird das fluoreszierende Objekt in der Mitte durch die Steuerung der Verschiebung zu halten der Abtaststrahl 3-5. Um die Vorteile dieser Technik zu demonstrieren, folgten wir einem sich schnell bewegenden Organelle, das Lysosom, in aliving Zelle 6,7. Zellen wurden nach Standardprotokollen überzogen, und unter Verwendung eines im Handel Lysosom Farbstoff. Wir besprechen kurz die Hardware-Konfiguration und im Detail die Steuer-Software, um eine 3D-Orbital Tracking-Experiment in lebenden Zellen durchzuführen. Diskutieren wir im Detail die um die Rastermikroskop zu steuern und zu ermöglichen, die Bewegung des Strahls in einer geschlossenen Bahn um die Teilchen erforderlichen Parameter. Wir schließen, durch den Nachweis, wie diese Methode effektiv verwendet, um die schnelle Bewegung eines markierten Lysosom an Mikrotubuli in 3D in einer lebenden Zelle zu verfolgen. Lysosomen mit Geschwindigkeiten im Bereich von 0,4-0,5 um / s bewegen, in der Regel Anzeige einer gerichteten Bewegung entlang der Mikrotubuli-Netzwerk 8.

Nach diesem Protokoll schnelle 3D-Einzelpartikelverfolgung kann in lebenden Zellen mit einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop, um die Verschiebung des Fluoreszenz-markierten Lysosomen verfolgen durchgeführt werden. Die durchgeführte Experiment besteht aus einer isolierten Verfolgung Lysosom bewegenden im Inneren der Zelle nach dem Endosom Reifungsprozess 9. Die Lysosomen wurden mit einem fluoreszierenden grünen Farbstoff angefärbt und bei 930 nm zu nutzen 2-Photonen-Anregung angeregt wird. Unsere Daten z...

In diesem Videoprotokoll verfolgen wir - mit hoher Geschwindigkeit und in drei Dimensionen - fluoreszenzmarkierte Lysosomen in lebenden Zellen, mit der orbitalen Tracking-Methode in einem modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop.

3D-Tracking-Orbital in einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop: einen Antrag bei der Verfolgung von intrazellulären Vesikeln

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu veranschaulichen, wie sich schnell bewegende Organellen wie Lysosomen, die sich in 3D innerhalb einer lebenden Zelle bewegen, verfolgt werden können. Dies wird erreicht, indem zunächst die Lysosomen und die Mikrotubuli mit speziellen handelsüblichen Farbstoffen in kultivierten lebenden Zellen gefärbt werden. Der zweite Schritt besteht darin, ein Laser-Scanning-Mikroskop zu verwenden und die Orbital-Tracking-Methode anzuwenden, um die Bewegung des Lysosoms mit hoher Geschwindigkeit zu verfolgen, die Größe der Umlaufbahn und andere Parameter, wie z. B. den Frequenzgang des Systems, werden dann ausgewählt, um Tracking-Experimente durchzuführen.Letztendlich zeigen die Ergebnisse, dass es möglich ist, sich schnell bewegende Lysosomen dreidimensional zu verfolgen und Wechselwirkungen mit anderen fluoreszenzgefärbten Organellen zu detektieren, die während der Nachführung entlang der Laserumlaufbahn angetroffen werden. Der Hauptvorteil der 3D-Tracking-Methode gegenüber anderen bestehenden Methoden, die zum Beispiel auf Astigmats basieren, besteht darin, dass die 3D-Tracking-Methode es uns ermöglicht, einen sehr großen Bereich der Demenz z

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Biotechnik

Dieses Video zeigt, wie neuronale Vesikel mit spezifischen fluoreszierenden Proteinen markiert werden, um ihre Bewegung zu visualisieren. Zuerst wird ein Plasmid, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert, mit einem Transfektionsmittel inkubiert und dann in eine Kultur von Neuronen eingeführt. Anschließend werden Bilder der Neuronen aufgenommen und analysiert, um die Bewegung der Vesikel zu verfolgen.

Visualisierung von Vesikelmotilitäten in Neuronen mittels Fluoreszenzbildgebung

Vierdimensionalen (4D)-Bildgebung verwendet werden, um das Verhalten und die Interaktionen zwischen den zwei Arten von Endosomen in lebenden Wirbeltier-Nervenenden zu studieren. Bewegung dieser kleinen Strukturen in drei Dimensionen gekennzeichnet, wodurch Bestätigung von Veranstaltungen wie Endosomen Fusion und Exozytose.

Visualisierung der Endosomen Dynamics in lebenden Nerven Klemmen mit Vier-dimensionale Fluoreszenz-Imaging

Die Untersuchung des Membranhandels ist entscheidend für das Verständnis der neuronalen Funktionen. Hier stellen wir eine Methode zur Quantifizierung der Vesikelmotilität in Neuronen vor. Dies ist eine bequeme Methode, die an die Quantifizierung des Membranhandels im Nervensystem angepasst werden kann.

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

Dieser Protokolldetails, den Bau und Betrieb eines Echtzeit-3D Einzelkorn Tracking-Mikroskops in der Lage Tracking nanoskalige fluoreszierende Sonden bei hohen diffusiven Geschwindigkeiten und geringen Photon Zählraten.

Ein Protokoll für Echtzeit-3D Einzelkorn-Tracking

Hier zeigen wir wie Einzelmolekül Foto aktiviert Lokalisierung Mikroskopie auf dem motorischen Nerv-Terminal von einem live Drosophila Melanogaster erfolgen kann Dritte instar Larve.

In Vivo Einzelmolekül-Tracking bei Drosophila präsynaptischen motorischen Nerv Terminal

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4D-Mikroskopie der Hefe

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Single-Molecule Tracking-Mikroskopie - Ein Werkzeug zur Bestimmung der diffusiven Zustände von zytosolischen Molekülen

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Im frühen Drosophila-Embryo sind viele Organellen beweglich. Im Prinzip können sie über spezifische fluoreszierende Sonden lebend abgebildet werden, aber die Eierschale verhindert eine direkte Anwendung auf den Embryo. Dieses Protokoll beschreibt, wie solche Sonden durch Mikroinjektion eingeführt und dann die Bewegung der Massenorganelle über die Teilchenbild-Velocimetrie analysiert werden.

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Verfolgung einzelner Proteine in Lipid-Doppelschichten mittels Fluoreszenzmikroskopie

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3D-Tracking-Orbital in einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop: einen Antrag bei der Verfolgung von intrazellulären Vesikeln (Video) | JoVE Journal

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