3D-Tracking-Orbital in einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop: einen Antrag bei der Verfolgung von intrazellulären Vesikeln

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu veranschaulichen, wie sich schnell bewegende Organellen wie Lysosomen, die sich in 3D innerhalb einer lebenden Zelle bewegen, verfolgt werden können. Dies wird erreicht, indem zunächst die Lysosomen und die Mikrotubuli mit speziellen handelsüblichen Farbstoffen in kultivierten lebenden Zellen gefärbt werden. Der zweite Schritt besteht darin, ein Laser-Scanning-Mikroskop zu verwenden und die Orbital-Tracking-Methode anzuwenden, um die Bewegung des Lysosoms mit hoher Geschwindigkeit zu verfolgen, die Größe der Umlaufbahn und andere Parameter, wie z. B. den Frequenzgang des Systems, werden dann ausgewählt, um Tracking-Experimente durchzuführen.

Letztendlich zeigen die Ergebnisse, dass es möglich ist, sich schnell bewegende Lysosomen dreidimensional zu verfolgen und Wechselwirkungen mit anderen fluoreszenzgefärbten Organellen zu detektieren, die während der Nachführung entlang der Laserumlaufbahn angetroffen werden. Der Hauptvorteil der 3D-Tracking-Methode gegenüber anderen bestehenden Methoden, die zum Beispiel auf Astigmats basieren, besteht darin, dass die 3D-Tracking-Methode es uns ermöglicht, einen sehr großen Bereich der Demenz zu verfolgen. Diese Methode kann helfen, eine Schlüsselfrage im vesikulären Transportfeld zu stellen, z. B. wie sich Vesikel entlang von Mikroröhrchen bewegen.

Diese Methode kann jedoch verwendet werden, um die endosomale Dynamik zu untersuchen. Es kann auch an anderen Systemen eingesetzt werden, bei denen es möglich ist, isolierte Partikel fluoreszierend zu markieren, wie z. B. Go-Nanopartikel-Membranrezeptoren, aggregierte nukleare Portkomplexe oder genetische Loci. Erhaltene Ovarialzellen des chinesischen Hamsters oder CH K one-Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Nach der Ernte der Zellen legen Sie sie auf einen Durchmesser von 14 Millimetern.

Mikrovertiefung mit einer Oberflächendicke von 0,16 Millimetern Seed-Zellen für eine optimale Dichte für die Bildgebung von etwa 60 bis 70 %Co Fluency Inkubieren Sie Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius 5 %CO2 am nächsten Tag, waschen Sie die Zellen dreimal in Hanks gepufferter Kochsalzlösung oder H-B-S-S-H-B-S-S wird verwendet, um abgestorbene Zellen oder Ablagerungen von der Kulturplatte zu entfernen und die Zellen für den Färbeschritt vorzubereiten. Dann inkubieren Sie die Zellen in einer HBSS-Lösung, die eine Endkonzentration von 50 anomolaren Lyo-Trackern und 150 anomolaren Tubulin-Trackern grün enthält, eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius nach der Inkubation. Waschen Sie die Zellen dreimal in HBSS, um ungebundene Farbstoffe zu entfernen.

Fügen Sie frisches DMEM-Wachstumsmedium hinzu, bevor Sie die Zellen abbilden. Das im Videoprotokoll beschriebene Mikroskop für die Teilchenverfolgung ist auf dem Rahmen eines kommerziell erhältlichen inversen Mikroskops aufgebaut. Es wird eine kohärente Chamäleon-Ultra-Zwei-Titan-Saphir-Femtosekunden-Laseranregungslichtquelle mit einem einstellbaren Ausgangswellenlängenbereich zwischen 690 Nanometern und 1040 Nanometern verwendet.

Stellen Sie sicher, dass der Laserstrahl in der hinteren Öffnung des Mikroskops ausgerichtet ist. Unter Verwendung von infrarotbeschichteten Spiegeln wird der Laserstrahl mit einer rotierenden Halbwellenplatte, die vor einem Calcitpolarisator platziert ist, abgeschwächt und der Strahl so abgeschwächt, dass die durchschnittliche Leistung an der Probe zwischen 0,5 und zwei Milliwatt liegt. Sammeln Sie das Fluoreszenzlicht aus der Probe, indem Sie ein Wasserobjektiv mit hoher numerischer Apertur in den Strahlengang einsetzen.

Legen Sie dann die Probe auf einen motorisierten Tisch und stellen Sie die Feinbewegung des Mikroskopobjektivs ein. Mit einem objektiven Pizo-Controller. Wählen Sie einen Fluoreszenzfilterwürfel entsprechend den gewünschten Emissionswellenlängen in ein- oder zweikanaliger Konfiguration.

Verwenden Sie Filter mit Emissionsbanddurchgang. Um den Spektralbereich der emittierten Fluoreszenz weiter auszuwählen, lenken Sie das Licht aus dem Filterwürfel in Photovervielfachungsröhren, wo das Signal verstärkt und diskriminiert und an eine Datenerfassungskarte mit digitalem Eingang gesendet wird, um die Zellen abzubilden, sie auf dem Tisch zu positionieren und mit Durchlichtbeleuchtung zu fokussieren. Wechseln Sie zur Raster-Scan-Bildgebung, um die Zellen zu identifizieren, die den Farbstoff eingebaut haben, und um die darunter liegenden Mikrotubuli zu visualisieren und den anfänglichen Bereich zu identifizieren, in dem Vesikelbewegungen vorhanden sind.

Sobald ein isoliertes Vesikel identifiziert ist, stellen Sie die Parameter für die orbitale Verfolgung ein. Wählen Sie zunächst den Radius des Orbits aus, um die Größe des kreisförmigen Scans entsprechend der Größe des zu verfolgenden Partikels zu definieren. Legen Sie für einen Punktemitter den Radius der Umlaufbahn auf die Taille der Punktspreizfunktion oder PSF des Anregungsstrahls fest.

Um die Empfindlichkeit und Reaktion zu maximieren. Legen Sie den axialen Abstand fest, um den Abstand zwischen den beiden Orbits zu definieren, der durchgeführt wird, um die Partikelposition entlang der axialen Richtung zu lokalisieren. Stellen Sie den Achsabstand auf das 1,5- bis Dreifache des PSF-Abfalls ein.

Definieren Sie die Verweilzeit entsprechend der Helligkeit des Partikels, um die Zeit festzulegen, die an jedem Punkt der Umlaufbahn verbracht wird, wodurch auch die Photobleichrate bestimmt wird. Verwenden Sie eine Verweilzeit zwischen 10 und 100 Mikrosekunden. Legen Sie die Anzahl der Punkte in jedem Umlauf auf 64 oder 128 fest, um Umlaufperioden in der Größenordnung von vier bis 32 Millisekunden zu erhalten und eine hohe zeitliche Auflösung für die Bestimmung der Teilchenposition bereitzustellen.

Ändern Sie das an die Spiegel gesendete DC-Offset-Signal, um den Strahl über die grafische Benutzeroberfläche über eine Cursorauswahl im Rasterscanbild auf das Partikel zu zentrieren. Beginnen Sie mit der Verfolgung, indem Sie den Mikroskopmodus von Raster-Imaging auf Orbital-Scanning umschalten. Aktivieren Sie das Feedback und die Datenerfassung für die Trajektorienanalyse.

Verwenden Sie die Software, um die an jedem Punkt entlang der Umlaufbahn und zu jedem Zeitpunkt gesammelte Fluoreszenz in Form eines Intensitätsteppichs anzuzeigen. Die entlang des Teppichs gesammelte Intensität gibt Aufschluss über die Wechselwirkung des Teilchens mit anderen hellen Objekten. Zeigen Sie sowohl die Trajektorieninformationen als auch die Fluoreszenzintensität an, die von der Photomultiplierröhre im Laufe der Zeit in Form von Zeitreihen gesammelt wurde.

Verwenden Sie die Zeitreihendarstellung und die Informationen zum Intensitätsteppich, um nur einen interessanten Bereich in der Trajektorie auszuwählen. Zeigen Sie dann eine 2D-Projektion des ausgewählten Teils der Partikeltrajektorie an. Wählen Sie die entsprechenden Steuerelemente aus, um die Flugbahn entsprechend der Fluoreszenzintensität der Partikel farblich zu codieren.

Wählen Sie die Option aus, um die Partikelbahn in 3D anzuzeigen und entsprechend der Fluoreszenzintensität farblich zu kennzeichnen. Drehen Sie die Flugbahn in 3D mit den Steuerelementen, um die Merkmale der Bewegung des Lysosoms entlang des Mikrotubuli zu visualisieren. Mit Hilfe einer fluoreszierenden grünen Farbstofffärbung der Lysosomen und der Mikrotubuli ist es möglich, die Hochgeschwindigkeitsbewegung der Vesikel entlang der Mikrotubuli mit einem Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop abzubilden.

Die Rasterscan-Bildgebung verfügt jedoch nicht über die zeitliche Auflösung, die erforderlich ist, um die Bewegung der schnelleren Endosomen genau zu verfolgen, wenn die Orbitalverfolgung verwendet wird. Stattdessen zeigen die Daten, dass es möglich ist, x-, y- und z-Verschiebungstrajektorien mit einer zeitlichen Auflösung von 32 Millisekunden zu erhalten. In diesen Verschiebungs-Zeit-Trajektorien zeigt die Teppichanalyse die Intensität an, die entlang jeder Umlaufbahn aufgezeichnet wurde.

Im Laufe der Zeit liefert die Intensitätsbahn Informationen über die fluoreszierende Umgebung des Teilchens. Der geschachtelte Bereich entspricht dem Teil der Flugbahn zwischen zwei Sprüngen. Helle Flecken außerhalb des geschachtelten Bereichs entsprechen den Wechselwirkungen des Teilchens mit anderen hellen Objekten und sind mit Sprüngen in der Flugbahn verbunden, wenn die Umlaufbahnen auf die hellste Fluoreszenzquelle neu zentriert werden.

Während des Trackings kann die integrierte Intensität der emittierten Fluoreszenz aufgezeichnet werden. Die rekonstruierte 3D-Trajektorie zeigt eine gerichtete Bewegung, wie sie von einem Vesikel erwartet werden kann, das sich auf dem Mikrotubuli-Netzwerk bewegt. Darüber hinaus ist es möglich, die 3D-Trajektorie mit einem RAs oder Scanbild der umgebenden Region zu korrelieren.

Dies bestätigt die Bewegung des Partikels entlang der Richtung eines Mikrotubuli-Bündels. Einmal gemeistert, kann diese Technik in wenigen Stunden durchgeführt werden, wenn sie beim Versuch richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, dass Sie bei der Verwendung von photonischen Zitaten, wie in diesem Protokoll dargestellt, Laserleistungsstufen verwenden sollten, die für Ihre Probe nicht schädlich sind, wie in diesem Protokoll dargestellt, sollten Leistungsstufen etwa zwei Millivolt nach den Objektiven beibehalten werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein sehr gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Experiment mit der 3D-Orbitalverfolgungsmethode einrichten, die es ermöglicht, Objekte mit einem sehr großen Z-Bereich zu verfolgen.