Name: 3D-Tracking-Orbital in einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop: einen Antrag bei der Verfolgung von intrazellulären Vesikeln (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Lernen Sie die 3D-Orbital-Tracking-Methode zur Verfolgung schneller Lysosomen in lebenden Zellen mit einem modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop. Diese Technik ermöglicht die Erfassung von Organellendynamik und Vesikeltransport.

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Dieses Projekt wurde durch die Zuschüsse NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 und P50-GM076516 unterstützt.

1. Probenvorbereitung <ol><li> Aufrechterhaltung CHOK1-Zellen in Gewebekulturflaschen mit DMEM mit 10% fötalem Rinderserum und 100 IU / ml Penicillin 50 ug / ml Streptomycin ergänzt. Die Zellen in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C aufweist. </li><li> Ernte und dann die Platte CHOK1 Zellen auf einem 14 mm Durchmesser Mikro gut mit einer Oberfläche Dicke von 0,16 mm. Samenzellen für eine optimale Dichte für die Bildgebung, etwa 60-70% Konfluenz. </li><li> Zellen bei 37 ° C über Nacht inkubieren, 5% CO 2. In HBSS (Hank Kochsalzlösung), waschen die Zellen dreimal, und Inkubation Zellen in einer Lösung, die 50 nM Lysotracker DND26 grün und 150 nm von Tubulin-Tracker grün. Zellen Inkubation für 1 h bei 37 ° C aufweist. Optionaler Schritt: Vor der Inkubation, führen Sie eine zusätzliche Fleck mit einem mitochondrialen Matrix Färbung Farbstoff (25 nM). </li><li> Waschen Sie die Zellen dreimal in HBSS um ungebundenen Farbstoff zu entfernen. Fügen Sie frisches DMEM Wachstumsmedium vor der IMAGing die Zellen. </li></ol> 2. Mikroskop Konfigurationen Das Mikroskop für die in der Video-Protokoll beschrieben Partikelverfolgung auf dem Rahmen eines im Handel erhältlichen Umkehrmikroskop (4) zusammengebaut. Allerdings kommerziellen Module für 3D-Orbitalpartikelverfolgung sind jetzt verfügbar. <ol><li> Verwenden Sie ein Coherent Chameleon Ultra II-Ti: Sa Femtosekunden-Laseranregungslichtquelle, mit einer abstimmbaren Ausgangswellenlängenbereich zwischen 690 nm-1040 nm auf. </li><li> Sicherzustellen, dass der Laserstrahl in der hinteren Öffnung des Mikroskops unter Verwendung von IR-beschichtete Spiegel ausgerichtet ist. Der Laserstrahl wird mittels eines rotierenden Halbwellenplatte, gefolgt von einem linearen Polarisator Calcit gedämpft. Dämpfen den Strahl, so dass die mittlere Leistung an der Probe zwischen 0,5 und 2 mW. HINWEIS: Der Laserstrahl wird durch ein Paar von Galvanometer-Stellspiegeln, die Motorsteuerung der Position und der Trajektorie des fokussierten Strahls in der Probenebene reflektierte ermöglichen. In einetypische Konfiguration der kollimierte Laserstrahl-Austritts der Galvanometerspiegel expandiert (10x), die durch einen Strahlexpander, bevor sie in die Rückseite des Mikroskopobjektiv nach Reflexion am Kurzpass dichroitischer Spiegel. </li><li> Sammeln Sie das Fluoreszenzlicht aus der Probe, indem eine hohe numerische Apertur Wasser Objektiv (60x, NA 1.2) in den Strahlengang. Wähle ein Fluoreszenzfilterwürfel gemäß den gewünschten Emissionswellenlängen in einer oder beiden Kanalkonfiguration. Beschäftigen Emissionsbandpassfilter weiter wählen den Spektralbereich der emittierten Fluoreszenz. </li><li> Legen Sie die Probe auf einen motorisierten Tisch, und stellen Sie die Feinbewegung des Mikroskopobjektivs mit Hilfe einer objektiven Piezo-Controller. </li><li> Lenken das Licht von der Filterwürfel in Photovervielfacherröhren, wo das Signal diskriminiert und in ein digitales I / O-Datenerfassungskarte gesendet. HINWEIS: Computer erzeugten Wellenformen sind das analoge Ausgangssignal des I / O-Karte und provided den Scanner Steuerelektronik. Die Photonenzählung Eingabe von den Photomultipliern und das Ausgangssignal an den Scanner gemessen und über die I / O-Karte durch das Labor für Fluoreszenzdynamik SimFCS Software gesteuert. </li></ol> 3. Imaging <ol><li> Positionieren Sie die Zellen, die auf der Bühne und konzentrieren sich mit Durchlichtbeleuchtung. </li><li> Wechseln Sie zu Raster-Scan-Bildgebung, um die Zellen, die den Farbstoff aufgenommen haben zu identifizieren und die zugrunde liegenden Mikrotubuli zu visualisieren. Identifizieren Sie die erste Bereich, in dem Vesikel Bewegung vorhanden ist. </li><li> Sobald eine isolierte Vesikel identifiziert wird, legen Sie die folgenden Parameter für die Orbitalverfolgung: <ol><li> Wählen des Radius der Umlaufbahn, um die Größe der Kreisabtastung entsprechend der Größe der Teilchen verfolgt definieren. Für einen Punkt Emitter, stellen Sie den Radius der Umlaufbahn gleich der Taille des Point Spread Function (PSF) der Anregungsstrahl, um die Empfindlichkeit und Reaktion zu maximieren. </li><li> Stellen Sie die axialeAbstand zu dem Abstand zwischen den beiden Bahnen, die ausgeführt werden, um die Partikelposition in der axialen Richtung zu lokalisieren definieren. Stellen Sie den axialen Abstand zu 1,5-3 mal der PSF Taille. </li><li> Definieren Sie die Verweildauer je nach der Helligkeit des Teilchens, die Zeit auf jedem Punkt der Umlaufbahn, die auch die Foto-Bleichrate bestimmen verbrachte eingestellt. Verwenden Sie eine Verweildauer zwischen 10-100 us. </li><li> Die Anzahl der Punkte in jeder Umlaufbahn auf 64 oder 128 in den Orbit Perioden in der Größenordnung von 4-32 ms ergeben und bieten eine hohe zeitliche Auflösung für die Bestimmung der Partikelposition. </li></ol></li><li> Ändern des Gleichstromoffsetsignals an den Spiegel, um den Strahl auf den Teilchen durch die grafische Benutzerschnittstelle über eine Cursor-Auswahl in dem gerasterten Bild Zentrum geschickt. </li><li> Beginnen Tracking durch Umschalten des Mikroskop-Modus von Rasterbildern wird Orbital Scannen. </li><li> Aktivieren Sie die Feedback-und Datenerfassung. </li></ol> 4. Trajectcher Analyse <ol><li> Verwenden Sie die Software, um die an jedem Punkt entlang der Bahn und zu jedem Zeitpunkt in der Form einer &quot;Intensität Teppich &#39;gesammelt Fluoreszenz anzuzeigen. Die entlang der Teppich gesammelt Intensität Informationen über die Wechselwirkung des Teilchens mit anderen hellen Objekten. Die Software verwenden, um sowohl das Bahninformationen (über die Zeit der x, y-Scanner und der z -piezo dh die Verschiebung DC) als auch die Fluoreszenzintensität in Form von Zeitreihen von der Fotovervielfacherröhre über die Zeit gesammelt wurden. </li><li> Nutzen Sie die Zeit und die Reihendarstellung &#39;Intensität Teppich&#39; Informationen, die nur eine Region von Interesse in der Flugbahn zu wählen. </li><li> Verwenden Sie die Software, um eine 2D-Projektion des ausgewählten Teil der Partikelflugbahn an. Wählen Sie die entsprechenden Kontrollen Farbcode die Flugbahn nach der Partikelfluoreszenzintensität. </li><li> Wählen Sie die Option, um die p angezeigtArtikel Bahn in 3D, und Farbcode es nach der Fluoreszenzintensität. Drehen Sie die Flugbahn in 3D über die Steuerelemente, um die Funktionen des Lysosom Bewegung entlang der Mikrotubuli zu visualisieren. </li></ol>

<ol><li>So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+photon+excitation+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Two photon excitation fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).</li>
<li>Dupont, A., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+three+dimensional+single+particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoscale three dimensional single particle tracking.</a> Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).</li>
<li>Estrada, L. C., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+nanometer+images+of+biological+fibers+by+directed+motion+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles.</a> Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).</li>
<li>Kis-Petikova, K., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurement+by+circular+scanning+of+the+excitation+beam+in+the+two+photon+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope.</a> Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).</li>
<li>Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3+D+particle+tracking+in+a+two+photon+microscope+application+to+the+study+of+molecular+dynamics+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells.</a> Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).</li>
<li>Lund, F. W., Wustner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+single+particle+tracking+and+temporal+image+correlation+spectroscopy+for+quantitative+analysis+of+endosome+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility.</a> Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).</li>
<li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+of+Neurodegenerative+Pathology+via+Neuron+to+Neuron+Transmission+of+beta+Amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).</li>
<li>Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+live+cell+and+superresolution+microscopy+reveals+cargo+transport+dynamics+at+microtubule+intersections%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).</li>
<li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Endosome maturation.</a> Embo Journal. 30, 3481-3500 (2011).</li>
<li>Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+particle+tracking+on+the+two+photon+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Multiphoton+Microscopy+in+the+Biomedical+Sciences%22%5BJournal%5D)">3D particle tracking on the two photon microscope.</a> Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).</li>
<li>Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+response+to+near-infrared+femtosecond+laser+pulses+in+two+photon+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes.</a> Optics Letters. 22, 135-136 (1997).</li>
<li>Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+motors+at+the+intersection+of+trafficking+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport.</a> Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).</li>
<li>Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+directed+molecular+motion+in+the+nuclear+pore+complex+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Trotz der enormen Fortschritte der Fluoreszenzmikroskopie-Techniken und Instrumente in den letzten Jahren erreichen Bahnen der fluoreszierenden Teilchen in drei Dimensionen mit einer hohen zeitlichen Auflösung ist eine Herausforderung im Bereich geblieben. Wenn hohe zeitliche Auflösung wurde Tracking Teilchen in zwei Dimensionen erreicht, die Erweiterung zu der axialen Richtung führt typischerweise zu einer drastischen Reduktion der Frequenzgang des Systems 10. In diesem Video-Pro...

Zahlreiche Ansätze sind bisher entwickelt worden, um fluoreszierende Partikel in drei Dimensionen unter Verwendung eines Mikroskops zu verfolgen. Die meisten Ansätze beruhen auf der Verwendung von schnellen Kameras ideal geeignet, um in zwei Dimensionen, die typischerweise mit individuellen Änderungen der Emissionsoptik des Mikroskops kombiniert Verfolgung in axialer Richtung zu erreichen verfolgen. Laser-Scanning-Mikroskop (entweder konfokale oder zwei Photonen) üblicherweise eine Leuchtstoffpartikel durch Ausführen einer zeitlichen Abfolge von Z-Stapeln zu verfolgen, wobei dieses Verfahren typischerweise zeitaufwendig und liefert angemessene zeitliche Auflösung (10 Hz), wenn das Teilchen verfolgt wird in der Mitte eines kleinen Rasterabbildungsbereich durch eine aktive Rückkopplungsmechanismus 2 gehalten. Die Idee der Verriegelungs, um die Partikel der Boden der Orbitalverfolgungsverfahren. Anstelle von einer Rasterabtastung einer Kreisbahn um den fluoreszierenden Teilchen durchgeführt. Die Intensität der Fluoreszenz entlangdie Umlaufbahn genau lokalisiert die Partikelposition 4. Die lokalisierte Position des Partikels kann dann verwendet werden, um die Mikroskopscanner und Wieder Zentrum der Umlaufbahn von der Partikelposition zu betätigen. Die Galvanometer-Scannern des Mikroskops durch eine analoge Spannung angetrieben. Die Wechselstromkomponente dieser Spannung ermöglicht die Durchführung einer Umlaufbahn mit dem fokussierten Laserstrahl, dh einer Sinus und einer zur X und Y Scanspiegel angewendet wird es Durchführen einer kreisförmigen Umlaufbahn Kosinuswelle. Der Gleichstrom-Offset des Signals erleichtert das Ändern der Position der Bahn entfernt. Sobald eine Umlaufdauer bestimmt wird und die Wellenform des Wechselspannungssignals konfiguriert ist, muss das Rückführsystem, um nur die DC-Komponente des Signals zu aktualisieren. Eine Software in der Lage, die von den Detektoren gesammelten Fluoreszenzsignal ausgelesen wird benötigt, um die Scanner und den Detektoren zu steuern, um die Position des Teilchens zu berechnen und zu aktualisieren, die DC ausgesetzt. Für eine erfolgreiche Rückmeldung Abbilden einer sorgfältigen Auswahl der Bahndaten (Größe und Timing) erforderlich ist, und diese Parameter auf der Basis der Eigenschaften der Leuchtstoffpartikel, die es notwendig, zu verfolgen ist, eingestellt werden. Die physikalischen und mathematischen Grundlagen der Technik wurden in der Vergangenheit 4,5 für 2D-und 3D-Anwendungen beschrieben. In diesem Protokoll beschreiben wir kurz die wesentlichen Hardware-Komponenten der Einrichtung, und genauer die Wahl der Parameter und die Probenvorbereitung für einen typischen Versuch erlaubt uns folgende Verschiebung eines Lysosom mit hoher zeitlicher Auflösung in einer lebenden Zelle erforderlich.

<table><tbody><tr><td>Lysotracker DND 26</td><td>Life Technologies</td><td>L-7526</td><td></td></tr><tr><td>Tubuline Tracker Green</td><td>Life Technologies</td><td>T34075</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker RED</td><td>Life Technologies</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>Coherent Chamelon- ultra II TI</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glan Taylor Calcit Polarizer</td><td>Melles Griot</td><td>03PTA001</td><td></td></tr><tr><td>Galvanometer-Motorspiegel</td><td>Cambridge Technologies</td><td>M 6350</td><td></td></tr><tr><td>Dichroitischer Spiegel</td><td>Chroma Technologies</td><td>700 DCSPXR</td><td></td></tr><tr><td>Motorischer Tisch</td><td>ASI</td><td>MS2000</td><td></td></tr><tr><td>Piezo&nbsp;</td><td>PI</td><td>P721-LLQ</td><td></td></tr><tr><td>Photomultiplier-Röhre</td><td>Hamamatsu</td><td>H7422P-40</td><td></td></tr><tr><td>Datenerfassungskarte</td><td>IO tech</td><td>PCI 1128-4000</td><td></td></tr><tr><td>Bildgebungssoftware</td><td>LFD</td><td>Global für Bilder-SimFCS</td><td></td></tr></tbody></table>

3d-tracking-orbital in einer modifizierten zwei-photonen-mikroskop: einen antrag bei der verfolgung von intrazellulären vesikeln

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Das Ziel dieses Video-Protokoll ist zu diskutieren, wie mit einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop 1 durchzuführen und zu analysieren, eine dreidimensionale Fluoreszenzorbitalpartikelverfolgung Experiment. Wie zu herkömmlichen Ansätzen (Rasterabtastung oder Weitfeld basierend auf einem Stapel von Frames) gegenüberliegt, kann die 3D-Tracking-Orbital zu lokalisieren und zu verfolgen mit hoher räumlicher (10 nm Genauigkeit) und zeitliche Auflösung (50 Hz Frequenzgang) die 3D-Verschiebung ein bewegtes fluoreszierende Partikel auf Längenskalen von Hunderten von Mikrometern 2. Das Verfahren basiert auf einem Algorithmus, der die Rückkopplungs Hardware eines Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop, um eine Kreisbahn um das Objekt auszuführen steuert basierend verfolgt werden: Der Rückkopplungsmechanismus wird das fluoreszierende Objekt in der Mitte durch die Steuerung der Verschiebung zu halten der Abtaststrahl 3-5. Um die Vorteile dieser Technik zu demonstrieren, folgten wir einem sich schnell bewegenden Organelle, das Lysosom, in aliving Zelle 6,7. Zellen wurden nach Standardprotokollen überzogen, und unter Verwendung eines im Handel Lysosom Farbstoff. Wir besprechen kurz die Hardware-Konfiguration und im Detail die Steuer-Software, um eine 3D-Orbital Tracking-Experiment in lebenden Zellen durchzuführen. Diskutieren wir im Detail die um die Rastermikroskop zu steuern und zu ermöglichen, die Bewegung des Strahls in einer geschlossenen Bahn um die Teilchen erforderlichen Parameter. Wir schließen, durch den Nachweis, wie diese Methode effektiv verwendet, um die schnelle Bewegung eines markierten Lysosom an Mikrotubuli in 3D in einer lebenden Zelle zu verfolgen. Lysosomen mit Geschwindigkeiten im Bereich von 0,4-0,5 um / s bewegen, in der Regel Anzeige einer gerichteten Bewegung entlang der Mikrotubuli-Netzwerk 8.

Nach diesem Protokoll schnelle 3D-Einzelpartikelverfolgung kann in lebenden Zellen mit einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop, um die Verschiebung des Fluoreszenz-markierten Lysosomen verfolgen durchgeführt werden. Die durchgeführte Experiment besteht aus einer isolierten Verfolgung Lysosom bewegenden im Inneren der Zelle nach dem Endosom Reifungsprozess 9. Die Lysosomen wurden mit einem fluoreszierenden grünen Farbstoff angefärbt und bei 930 nm zu nutzen 2-Photonen-Anregung angeregt wird. Unsere Daten z...

In diesem Videoprotokoll verfolgen wir - mit hoher Geschwindigkeit und in drei Dimensionen - fluoreszenzmarkierte Lysosomen in lebenden Zellen, mit der orbitalen Tracking-Methode in einem modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop.

3D-Tracking-Orbital in einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop: einen Antrag bei der Verfolgung von intrazellulären Vesikeln

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu veranschaulichen, wie sich schnell bewegende Organellen wie Lysosomen, die sich in 3D innerhalb einer lebenden Zelle bewegen, verfolgt werden können. Dies wird erreicht, indem zunächst die Lysosomen und die Mikrotubuli mit speziellen handelsüblichen Farbstoffen in kultivierten lebenden Zellen gefärbt werden. Der zweite Schritt besteht darin, ein Laser-Scanning-Mikroskop zu verwenden und die Orbital-Tracking-Methode anzuwenden, um die Bewegung des Lysosoms mit hoher Geschwindigkeit zu verfolgen, die Größe der Umlaufbahn und andere Parameter, wie z. B. den Frequenzgang des Systems, werden dann ausgewählt, um Tracking-Experimente durchzuführen.Letztendlich zeigen die Ergebnisse, dass es möglich ist, sich schnell bewegende Lysosomen dreidimensional zu verfolgen und Wechselwirkungen mit anderen fluoreszenzgefärbten Organellen zu detektieren, die während der Nachführung entlang der Laserumlaufbahn angetroffen werden. Der Hauptvorteil der 3D-Tracking-Methode gegenüber anderen bestehenden Methoden, die zum Beispiel auf Astigmats basieren, besteht darin, dass die 3D-Tracking-Methode es uns ermöglicht, einen sehr großen Bereich der Demenz zu verfolgen. Diese Methode kann helfen, eine Schlüsselfrage im vesikulären Transportfeld zu stellen, z. B. wie sich Vesikel entlang von Mikroröhrchen bewegen.Diese Methode kann jedoch verwendet werden, um die endosomale Dynamik zu untersuchen. Es kann auch an anderen Systemen eingesetzt werden, bei denen es möglich ist, isolierte Partikel fluoreszierend zu markieren, wie z. B. Go-Nanopartikel-Membranrezeptoren, aggregierte nukleare Portkomplexe oder genetische Loci. Erhaltene Ovarialzellen des chinesischen Hamsters oder CH K one-Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Nach der Ernte der Zellen legen Sie sie auf einen Durchmesser von 14 Millimetern.Mikrovertiefung mit einer Oberflächendicke von 0,16 Millimetern Seed-Zellen für eine optimale Dichte für die Bildgebung von etwa 60 bis 70 %Co Fluency Inkubieren Sie Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius 5 %CO2 am nächsten Tag, waschen Sie die Zellen dreimal in Hanks gepufferter Kochsalzlösung oder H-B-S-S-H-B-S-S wird verwendet, um abgestorbene Zellen oder Ablagerungen von der Kulturplatte zu entfernen und die Zellen für den Färbeschritt vorzubereiten. Dann inkubieren Sie die Zellen in einer HBSS-Lösung, die eine Endkonzentration von 50 anomolaren Lyo-Trackern und 150 anomolaren Tubulin-Trackern grün enthält, eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius nach der Inkubation. Waschen Sie die Zellen dreimal in HBSS, um ungebundene Farbstoffe zu entfernen.Fügen Sie frisches DMEM-Wachstumsmedium hinzu, bevor Sie die Zellen abbilden. Das im Videoprotokoll beschriebene Mikroskop für die Teilchenverfolgung ist auf dem Rahmen eines kommerziell erhältlichen inversen Mikroskops aufgebaut. Es wird eine kohärente Chamäleon-Ultra-Zwei-Titan-Saphir-Femtosekunden-Laseranregungslichtquelle mit einem einstellbaren Ausgangswellenlängenbereich zwischen 690 Nanometern und 1040 Nanometern verwendet.Stellen Sie sicher, dass der Laserstrahl in der hinteren Öffnung des Mikroskops ausgerichtet ist. Unter Verwendung von infrarotbeschichteten Spiegeln wird der Laserstrahl mit einer rotierenden Halbwellenplatte, die vor einem Calcitpolarisator platziert ist, abgeschwächt und der Strahl so abgeschwächt, dass die durchschnittliche Leistung an der Probe zwischen 0,5 und zwei Milliwatt liegt. Sammeln Sie das Fluoreszenzlicht aus der Probe, indem Sie ein Wasserobjektiv mit hoher numerischer Apertur in den Strahlengang einsetzen.Legen Sie dann die Probe auf einen motorisierten Tisch und stellen Sie die Feinbewegung des Mikroskopobjektivs ein. Mit einem objektiven Pizo-Controller. Wählen Sie einen Fluoreszenzfilterwürfel entsprechend den gewünschten Emissionswellenlängen in ein- oder zweikanaliger Konfiguration.Verwenden Sie Filter mit Emissionsbanddurchgang. Um den Spektralbereich der emittierten Fluoreszenz weiter auszuwählen, lenken Sie das Licht aus dem Filterwürfel in Photovervielfachungsröhren, wo das Signal verstärkt und diskriminiert und an eine Datenerfassungskarte mit digitalem Eingang gesendet wird, um die Zellen abzubilden, sie auf dem Tisch zu positionieren und mit Durchlichtbeleuchtung zu fokussieren. Wechseln Sie zur Raster-Scan-Bildgebung, um die Zellen zu identifizieren, die den Farbstoff eingebaut haben, und um die darunter liegenden Mikrotubuli zu visualisieren und den anfänglichen Bereich zu identifizieren, in dem Vesikelbewegungen vorhanden sind.Sobald ein isoliertes Vesikel identifiziert ist, stellen Sie die Parameter für die orbitale Verfolgung ein. Wählen Sie zunächst den Radius des Orbits aus, um die Größe des kreisförmigen Scans entsprechend der Größe des zu verfolgenden Partikels zu definieren. Legen Sie für einen Punktemitter den Radius der Umlaufbahn auf die Taille der Punktspreizfunktion oder PSF des Anregungsstrahls fest.Um die Empfindlichkeit und Reaktion zu maximieren. Legen Sie den axialen Abstand fest, um den Abstand zwischen den beiden Orbits zu definieren, der durchgeführt wird, um die Partikelposition entlang der axialen Richtung zu lokalisieren. Stellen Sie den Achsabstand auf das 1,5- bis Dreifache des PSF-Abfalls ein.Definieren Sie die Verweilzeit entsprechend der Helligkeit des Partikels, um die Zeit festzulegen, die an jedem Punkt der Umlaufbahn verbracht wird, wodurch auch die Photobleichrate bestimmt wird. Verwenden Sie eine Verweilzeit zwischen 10 und 100 Mikrosekunden. Legen Sie die Anzahl der Punkte in jedem Umlauf auf 64 oder 128 fest, um Umlaufperioden in der Größenordnung von vier bis 32 Millisekunden zu erhalten und eine hohe zeitliche Auflösung für die Bestimmung der Teilchenposition bereitzustellen.Ändern Sie das an die Spiegel gesendete DC-Offset-Signal, um den Strahl über die grafische Benutzeroberfläche über eine Cursorauswahl im Rasterscanbild auf das Partikel zu zentrieren. Beginnen Sie mit der Verfolgung, indem Sie den Mikroskopmodus von Raster-Imaging auf Orbital-Scanning umschalten. Aktivieren Sie das Feedback und die Datenerfassung für die Trajektorienanalyse.Verwenden Sie die Software, um die an jedem Punkt entlang der Umlaufbahn und zu jedem Zeitpunkt gesammelte Fluoreszenz in Form eines Intensitätsteppichs anzuzeigen. Die entlang des Teppichs gesammelte Intensität gibt Aufschluss über die Wechselwirkung des Teilchens mit anderen hellen Objekten. Zeigen Sie sowohl die Trajektorieninformationen als auch die Fluoreszenzintensität an, die von der Photomultiplierröhre im Laufe der Zeit in Form von Zeitreihen gesammelt wurde.Verwenden Sie die Zeitreihendarstellung und die Informationen zum Intensitätsteppich, um nur einen interessanten Bereich in der Trajektorie auszuwählen. Zeigen Sie dann eine 2D-Projektion des ausgewählten Teils der Partikeltrajektorie an. Wählen Sie die entsprechenden Steuerelemente aus, um die Flugbahn entsprechend der Fluoreszenzintensität der Partikel farblich zu codieren.Wählen Sie die Option aus, um die Partikelbahn in 3D anzuzeigen und entsprechend der Fluoreszenzintensität farblich zu kennzeichnen. Drehen Sie die Flugbahn in 3D mit den Steuerelementen, um die Merkmale der Bewegung des Lysosoms entlang des Mikrotubuli zu visualisieren. Mit Hilfe einer fluoreszierenden grünen Farbstofffärbung der Lysosomen und der Mikrotubuli ist es möglich, die Hochgeschwindigkeitsbewegung der Vesikel entlang der Mikrotubuli mit einem Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop abzubilden.Die Rasterscan-Bildgebung verfügt jedoch nicht über die zeitliche Auflösung, die erforderlich ist, um die Bewegung der schnelleren Endosomen genau zu verfolgen, wenn die Orbitalverfolgung verwendet wird. Stattdessen zeigen die Daten, dass es möglich ist, x-, y- und z-Verschiebungstrajektorien mit einer zeitlichen Auflösung von 32 Millisekunden zu erhalten. In diesen Verschiebungs-Zeit-Trajektorien zeigt die Teppichanalyse die Intensität an, die entlang jeder Umlaufbahn aufgezeichnet wurde.Im Laufe der Zeit liefert die Intensitätsbahn Informationen über die fluoreszierende Umgebung des Teilchens. Der geschachtelte Bereich entspricht dem Teil der Flugbahn zwischen zwei Sprüngen. Helle Flecken außerhalb des geschachtelten Bereichs entsprechen den Wechselwirkungen des Teilchens mit anderen hellen Objekten und sind mit Sprüngen in der Flugbahn verbunden, wenn die Umlaufbahnen auf die hellste Fluoreszenzquelle neu zentriert werden.Während des Trackings kann die integrierte Intensität der emittierten Fluoreszenz aufgezeichnet werden. Die rekonstruierte 3D-Trajektorie zeigt eine gerichtete Bewegung, wie sie von einem Vesikel erwartet werden kann, das sich auf dem Mikrotubuli-Netzwerk bewegt. Darüber hinaus ist es möglich, die 3D-Trajektorie mit einem RAs oder Scanbild der umgebenden Region zu korrelieren.Dies bestätigt die Bewegung des Partikels entlang der Richtung eines Mikrotubuli-Bündels. Einmal gemeistert, kann diese Technik in wenigen Stunden durchgeführt werden, wenn sie beim Versuch richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, dass Sie bei der Verwendung von photonischen Zitaten, wie in diesem Protokoll dargestellt, Laserleistungsstufen verwenden sollten, die für Ihre Probe nicht schädlich sind, wie in diesem Protokoll dargestellt, sollten Leistungsstufen etwa zwei Millivolt nach den Objektiven beibehalten werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein sehr gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Experiment mit der 3D-Orbitalverfolgungsmethode einrichten, die es ermöglicht, Objekte mit einem sehr großen Z-Bereich zu verfolgen.

3d-orbital-tracking-modified-two-photon-microscope-an-application-to

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Video zeigt, wie neuronale Vesikel mit spezifischen fluoreszierenden Proteinen markiert werden, um ihre Bewegung zu visualisieren. Zuerst wird ein Plasmid, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert, mit einem Transfektionsmittel inkubiert und dann in eine Kultur von Neuronen eingeführt. Anschließend werden Bilder der Neuronen aufgenommen und analysiert, um die Bewegung der Vesikel zu verfolgen.

Visualisierung von Vesikelmotilitäten in Neuronen mittels Fluoreszenzbildgebung

Vierdimensionalen (4D)-Bildgebung verwendet werden, um das Verhalten und die Interaktionen zwischen den zwei Arten von Endosomen in lebenden Wirbeltier-Nervenenden zu studieren. Bewegung dieser kleinen Strukturen in drei Dimensionen gekennzeichnet, wodurch Bestätigung von Veranstaltungen wie Endosomen Fusion und Exozytose.

Visualisierung der Endosomen Dynamics in lebenden Nerven Klemmen mit Vier-dimensionale Fluoreszenz-Imaging

Die Untersuchung des Membranhandels ist entscheidend für das Verständnis der neuronalen Funktionen. Hier stellen wir eine Methode zur Quantifizierung der Vesikelmotilität in Neuronen vor. Dies ist eine bequeme Methode, die an die Quantifizierung des Membranhandels im Nervensystem angepasst werden kann.

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

Dieser Protokolldetails, den Bau und Betrieb eines Echtzeit-3D Einzelkorn Tracking-Mikroskops in der Lage Tracking nanoskalige fluoreszierende Sonden bei hohen diffusiven Geschwindigkeiten und geringen Photon Zählraten.

Ein Protokoll für Echtzeit-3D Einzelkorn-Tracking

Hier zeigen wir wie Einzelmolekül Foto aktiviert Lokalisierung Mikroskopie auf dem motorischen Nerv-Terminal von einem live Drosophila Melanogaster erfolgen kann Dritte instar Larve.

In Vivo Einzelmolekül-Tracking bei Drosophila präsynaptischen motorischen Nerv Terminal

Dieses Protokoll beschreibt die Analyse von fluoreszierend markierten intrazellulären Kompartimenten in angehender Hefe mittels mehrfarbiger 4D-Konfokalmikroskopie (Zeitraffer-3D). Die bildgebenden Parameter werden ausgewählt, um geeignete Signale zu erfassen und gleichzeitig Photoschäden zu begrenzen. Benutzerdefinierte ImageJ-Plugins ermöglichen es, beschriftete Strukturen nachzuverfolgen und quantitativ zu analysieren.

4D-Mikroskopie der Hefe

Die 3D-Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie wird verwendet, um die räumlichen Positionen und Bewegungsbahnen fluoreszierend markierter Proteine in lebenden Bakterienzellen zu untersuchen. Das hier beschriebene experimentelle und Datenanalyseprotokoll bestimmt das vorherrschende diffusive Verhalten von zytosolischen Proteinen auf der Grundlage gepoolter Einzelmolekülbahnen.

Single-Molecule Tracking-Mikroskopie - Ein Werkzeug zur Bestimmung der diffusiven Zustände von zytosolischen Molekülen

Die iMSD-Analyse (Imaging-derived mean square displacement) wird auf Makropinosomen angewendet, um ihre intrinsische zeitentwickelnde Natur in Bezug auf strukturelle und dynamische Eigenschaften hervorzuheben. Macropinosomen werden dann mit insulinsekretorischen Granulaten (ISGs) als Referenz für subzelluläre Strukturen mit zeitinvarianten durchschnittlichen strukturellen/dynamischen Eigenschaften verglichen.

Untersuchung struktureller und dynamischer Eigenschaften des Handels subzellulärer Nanostrukturen durch raumzeitliche Fluktuationsspektroskopie

Im frühen Drosophila-Embryo sind viele Organellen beweglich. Im Prinzip können sie über spezifische fluoreszierende Sonden lebend abgebildet werden, aber die Eierschale verhindert eine direkte Anwendung auf den Embryo. Dieses Protokoll beschreibt, wie solche Sonden durch Mikroinjektion eingeführt und dann die Bewegung der Massenorganelle über die Teilchenbild-Velocimetrie analysiert werden.

Visualisierung des zytoskelettabhängigen Handels von lipidhaltigen Organellen in Drosophila-Embryonen

Dieser Artikel bietet eine detaillierte Beschreibung, wie Proben für die Tracking von Einzelproteinen in festgestützten Lipiddoppelschichten erstellt werden können. Es erklärt außerdem ein einfaches Fluoreszenzmikroskop mit Einzelmolekülempfindlichkeit und hoher Bildrate. Abschließend skizzieren wir das Verfahren zur Extraktion von Einzelprotein-Trajektorien.

Verfolgung einzelner Proteine in Lipid-Doppelschichten mittels Fluoreszenzmikroskopie

Lernen Sie die 3D-Orbital-Tracking-Methode zur Verfolgung schneller Lysosomen in lebenden Zellen mit einem modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop. Diese Technik ermöglicht die Erfassung von Organellendynamik und Vesikeltransport.

3D-Tracking-Orbital in einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop: einen Antrag bei der Verfolgung von intrazellulären Vesikeln (Video) | JoVE Journal

3D-Tracking-Orbital in einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop: einen Antrag bei der Verfolgung von intrazellulären Vesikeln

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