Name: Produktion und Isolierung der Axone von Sinneszellen für Biochemische Analyse mit Porous Filter (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-08T23:45:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Erfahren Sie die Isolierung reiner Axone von embryonalen dorsalen Wurzelganglien für biochemische Analysen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung axonaler Physiologie und neurodegenerativer Signalwege.

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Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse MOP62827 von den Canadian Institutes of Health Research unterstützt.

HINWEIS: Die folgenden Verfahren sind in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council von Animal Care genehmigt. Alle Anstrengungen gemacht werden, um Schmerzen und Leiden der Tiere während der Verfahren zu minimieren. 1. Beschichtung der Filter HINWEIS: Wenn Kultur Filtereinsätze in Vertiefungen der Multiwellplatten gelegt werden zwei Kammern definiert: die obere Kammer ist der Bereich oberhalb des Einsatzes und die untere Kammer ist der unterhalb des Einsatzes Fig. 1A.ab. Explantate werden im oberen Fach, wo sie an der Oberseite des Filters befestigen ausgesät; viele Axone wachsen durch den Filter erstrecken, und an der Unterseite des Filters, in dem Bodenfach Fig. 1A.c. Die Standard-Arbeitsvolumen (dh zum Auftragen von Beschichtungslösung, Waschanlagen, Kulturmedien, etc) sind 2 ml für das Bodenfach und 1 ml für die obere Fach und gehen, um im Protokoll als &quot;bezeichnet werden, Standard-Bände &quot;. Hinzufügen Lösungen, beginnend mit der unteren Kammer, indem die Spitze der Pipette in den Spalt zwischen dem Einsatz und der Seite der Vertiefung. Auch neigen die Einlage an einer Seite unter Verzicht auf die Lösung von Blasen auf der Unterseite des Filters eingeschlossen werden. <ol><li> Starten Sie die Beschichtung der Filter am Tag vor der Beschichtung. Unter der sterilen Gewebekultur Haube, legen 24 mm Filtereinsätze in einer 6-Well-Aufnahmeplatte. Einsätze inkubieren mit Poly-D-Lysin in Wasser (1 mg / ml) für 1 h bei RT unter Verwendung von Standardvolumen: 2 ml in der unteren Kammer und 1 ml in der Spitze. </li><li> Saugen Poly-D-Lysin und einmal mit Wasser spülen. Saugen Sie Wasser, schließen Sie den Deckel, und die Platten in der Haube O / N. trocknen Während der Aspiration von Flüssigkeiten, stellen Sie sicher, einen Rest von Flüssigkeit, die direkt unter dem Filter aufgefangen wird zu entfernen. </li><li> Am nächsten Morgen, verdünnte Laminin in Wasser (10 g / ml), mischen und warm bei 37 ° C Einsätze Inkubation mit Laminin 1 Stunde in cell bei 37 ° C, unter Verwendung von Standardmengen. </li><li> Saugen Laminin und fügen Kollagen in Wasser (0,1 mg / ml) und Inkubation für 1 h bei RT. In diesem Fall verwenden 2 ml für das Bodenfach und 2 ml für den oberen Teil. </li><li> Saugen Kollagen und einmal mit sterilem Wasser waschen. Die Filter sind nun bereit, Kulturmedien und DRG Explantate erhalten, wie in Schritt 3 beschrieben. </li></ol> 2. Dissecting Embryonale Spinalganglion (DRG) Explantate <ol><li> Betäuben eine 13-Tage-schwangeren weiblichen Maus durch eine IP-Injektion von Avertin (250 mg / kg). Warten Sie 10-15 Minuten und überprüfen Sie die fehlende Hornhaut-und Pedal Rückzug Reflexe. Sobald Reflexe fehlen, führen Genickbruch. </li><li> Desinfizieren Sie alle chirurgischen Instrumenten und weiblichen Unterleib mit 70% Ethanol. Instrumente erlauben zu trocknen. Halten Sie die Haut am Bauch und schnitt durch die Haut-und Muskelschichten der Bauchhöhle aus. </li><li> Entfernen des Uterus durch Ablösen von der Zervix und Eierstöcke. In einer Sterile Haube, entfernen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter mit einer Schere und sammeln sie in einer Petrischale mit eiskaltem L15 Medien gefüllt. Halten Sie auf dem Eis. HINWEIS: Siehe vorherige technische Berichte für weitere Informationen darüber, wie man Embryonen von 13 Tagen der Trächtigkeit 17,18 zu erhalten. </li><li> Unter dem Mikroskop zu legen, den Embryo auf einer Seite und mit kleinen Feder Schere, um den Kopf zu entfernen. Einen Einschnitt entlang den Seiten, um die Brust, Bauch, Gliedmaßen und Schwanz zu verwerfen. Halten Sie den Rücken mit der Wirbelsäule, lag Bauchseite nach oben und entfernen Sie alle inneren Organe. </li><li> Mit kleinen Feder Schere, setzen die gesamte Rückenmark, indem die Wirbelsäule aus ihrer Bauchseite entlang der Mittellinie. Halten Sie die Karkasse unten mit einer Pinzette (# 3) und mit einem zweiten Paar, um das Rückenmark von seiner rostralen Bereich zu halten. </li><li> Langsam und ziehen Sie das Kabel von den Wirbelhöhle und kneifen Sie DRGs aus dem Rückenmark mit ultra-dünnen Pinzette (# 5). Gruppe die DRGs auf gesammelt werdender Boden der Schale. </li><li> Sammeln gruppiert DRGs durch Absaugen mit einer 200 ul Pipettenspitze, die abgeschnitten wurde, um seine Öffnung zu vergrößern. Legen Sie die DRGs in einem Rohr und lassen auf Eis, bis die DRG-Kollektion ist fertig. HINWEIS: Weiß / transparent Tipps werden bevorzugt, weil DRGs nicht den Mauern dieser Spitze haften bleiben (im Vergleich zu Standard-gelben Spitzen). Flushing Spitzen mit Medien vor dem Gebrauch verhindert ferner, dass DRGs vom Kleben an seinen Wänden. </li></ol> 3. Saat und Pflege von Wurzel-Knotenrücken Explantate auf Filter <ol><li> Fügen komplette DRG Medien bei 37 ° C zu den beschichteten Einsätze mit Standard-Bände. Ergänzen Sie die Bodenfach-Medien mit 15 ng / ml NGF, während NGF frei halten die obere Fach. HINWEIS: Obwohl NGF effizient diffundiert durch den Filter und seine Konzentration im Gleichgewicht innerhalb weniger Stunden haben wir beobachtet, dass die Anwendung von NGF auf die Bodenfach direkt vor der Aussaat axonalen Rendite der b deutlich erhöhtottom Oberfläche des Filters. </li><li> Übertragen Sie die DRGs aus der Tube auf die Filter mit einem 1000 ul Pipette mit einer Spitze getrimmt, um ihre Öffnung zu vergrößern. </li><li> Zeichnen Medien in der Spitze 2-3x vor der Erhebung der DRGs. Dies verhindert ein Festkleben an der Innenseite der Spitze. Das gleiche Spitze kann für alle Vertiefungen wieder verwendet werden. Die Verwendung von ungefärbten Tipps (gegenüber Standard-blauen Spitzen) reduziert DRG Festhalten an der Oberfläche der Spitze. </li><li> So übertragen DRGs, stellen Sie die Pipette in 800 ul. Saugen Sie ca. 200 ul Medium von der Oberseite des Filters, dann auf die DRG-haltigen Rohr gehen und Pipette eine kleine Menge auf und ab - auf DRGs, die auf den Boden versenkt haben resuspendieren. Saugen Sie das ganze Volumen und Pipetten DRGs Eintauchen der Spitze in der Mitte des Einsatzes. </li><li> Sobald alle Einsätze geladen werden, schließen Sie den Deckel und Platte schwenken Sie die Platte 10x, leichte Schläge auf die Motorhaube Bank zwischen jedem Wirbel. Diese Bewegungen erhöhen axonalen Ausbeute, indem DRG Explantate Waschbecken undbefestigen des Filters. Dies hilft auch, verteilen Explantate gleichmäßig, so dass Axone aus verschiedenen Explantaten nicht überlappen. HINWEIS: Die in den vorherigen Schritten beschrieben Explantation Impfvorgangs signifikant die Gesamtrate der Explantation Bindung an das Substrat (bis 75%) erhöht. Am wichtigsten ist, die Pipettiervorgang leicht verhindert Explantaten aus schwimmend auf der Oberfläche des Mediums statt sinken auf den Boden des Einsatzes. </li><li> Für biochemische Analysen, Samen DRGs von einem Embryo (ca. 30) pro Filter. Für morphologische Analysen, verwenden Sie entweder die Hälfte oder ein Drittel der DRGs von einem Embryo (10-15). Diese Entscheidung muss vor der Erhebung der DRGs in Rohre hergestellt werden, so dass alle DRGs eines Rohres in einem einzigen Well ausgesät (ob es 30, 15 oder 10 DRGs). </li><li> Pflegen Kulturen in einer Zellbrutschrank bei 37 ° C, verändernden Medien alle 2-3 Tage. Um Medien zu ändern, saugen Sie den oberen Fach ersten, von der Bodenfach gefolgt. In frischem Medium in Standardvolumens, beginnend mit dem Bodenfach. HINWEIS: Um Zellen / Axone Austrocknen zu verhindern, Medien in mehr als 3 Einsätze ändern sich nicht zur gleichen Zeit. DRGs auf Filter in Gegenwart von NGF gezüchtet wird Axone zu verlängern, die bis zu 2 mm nach 2 Tagen in Kultur. </li></ol> 4. Trophic Factor Entzugsbehandlung NGF Rückzug induziert axonale Degeneration mit axonalen Fragmentierung (durch Phasenkontrast-und β-III-Tubulin bestimmt IF), die zuerst erscheint rund 12 Stunden nach der Entnahme. Komplette Fragmentierung wird von 36 h erreicht. Wie lange die Degeneration läßt gehen für muss durch den Anwender gemäß der Versuchsanordnung gewählt werden. <ol><li> Nach der 2-Tages-axonalen Verlängerungsphase, ändern Sie Medien von oben und unten Fächer für Medien, die NGF fehlt und enthält Anti-NGF-Antikörper (1 ug / ml), um alle verbleibenden (oder endogen produziert) NGF maskieren. </li><li> Zurück Platten zu Zelle Inkubator (37 ° C), damitNGF-Entzug induzierte Degeneration für die gewünschte Zeitdauer fort. </li><li> Gehen Sie zur Proteinextraktion (Schritt 6) zur Prüfung durch Western-Blot-oder die Filter direkt untersuchen von IF (Schritt 7). </li></ol> 5. Axonal Trennung zu Waller-Degeneration herbei Dieses Verfahren lässt die Axone auf der Unterseite des losgelöst von ihrer Zellkörperfilter, aber ansonsten unversehrt. Danach diese Axone schnell einzuleiten Waller-Degeneration. Axonal Fragmentierung (durch Phasenkontrast-oder β-III-Tubulin belegt IF) zuerst erscheint nach 3 h nach Durchtrennung; um 9 h, sind Axone völlig zersplittert und werden von dem Filter gelöst. Wie lange die Degeneration läßt gehen für muss durch den Anwender gemäß der Versuchsanordnung gewählt werden. <ol><li> Kratzen Sie die Oberseite des Filters enthält gewachsen DRG Explantate, mit einem Zellschaber. Achten Sie darauf, die vollständige Entfernung von Top-Material, indem Sie Schaber in X-, Y-und KreisRichtungen. </li><li> Entsorgen Sie die Medien aus dem oberen Fach mit den schwimmenden Explantate, die aus dem Filter gekratzt worden sind, und ersetzen mit 1 ml vorgewärmten, komplett DRG Medien mit NGF (10 ng / ml). </li><li> Das Rückplatte Inkubator (37 º C) Zell Waller-Degeneration für die Zeitdauer von dem Endbenutzer ausgewählt ablaufen zu lassen. </li><li> Gehen Sie zur Proteinextraktion (Schritt 6) zur Prüfung durch Western-Blot-oder die Filter direkt untersuchen von IF (Schritt 7). </li></ol> 6. Proteinextraktion von Axonal Proben <ol><li> Füllen Röhrchen (1,5 ml) mit 75 ul Laemmli-Probenpuffer. Halten Röhrchen auf Eis, während der Ernte Axone aus der gesamten Reihe von Filtern. </li><li> Waschen Sie den Filter mit DRG Explantate in PBS und kratzen die Oberseite des Filters. Entfernen Sie den Einsatz aus der Platte, reinigen Sie die Oberseite des Filters mit einem Baumwoll-Spitze-Applikator und saugen Sie keine zusätzliche PBS aus den Ober-und Unterseite. </li><li> Ort eingeben Kopfauf der Werkbank und schneiden Sie den Filter aus dem Einsatz mit einem scharfen Skalpell. Halten Sie den Filter mit einer Pinzette, unten nach oben. Einen Schnitt von dem Umfang zu der Mitte des Filters mit einer Schere. </li><li> Platzieren Sie den Filter auf der Oberseite der Sammelröhrchen und mit einer Pinzette, drücken Sie die Mitte des Filters in den Schlauch. Während dies zu tun, sollte ein Trichter bilden. Drücken Sie die trichterförmige Filter mit dem Boden des Rohres, so daß er in Laemmli-Probenpuffer eingetaucht. </li><li> Komplette Proteinextraktion durch Kochen der Rohre für 4 min. Entfernen Sie den Filter mit einer Pinzette auf der Oberseite nach unten in die Oberseite der Röhre legen und die Durchführung einer kurzen Spin (2.000 g für 15 sec). Die getrockneten Filter entsorgen. </li><li> Beheben 10 ul der axonalen Proteinpräparat in einer SDS-PAGE, gefolgt von Western-Blot der Proteine ​​von Interesse zu detektieren. HINWEIS: Als Referenz eine axonale Herstellung von 20 Explantaten für 2 Tage gezüchtet und in 100 ul RIPA-Lysepuffer eine Proteinkonzentration von 4-6 habenug / ul. </li></ol> 7. Immunfluoreszenz-Untersuchung der Axone auf Filter Die folgenden Schritte beschreiben die allgemeinen Manipulationen durchführen, wenn der Färbung auf Filtereinsätze, durch den Nachweis von β-III-Tubulin veranschaulicht. Fixiermittel, Inkubationszeiten, Konzentrationen und andere Angaben sollten für andere Antigen-Antikörperpaare optimiert werden. <ol><li> Nutzen bisher verwendeten 6-well-Platten, gründlich gereinigt, für die folgenden Waschschritte und die Inkubationen der Einsätze. </li><li> Kurz waschen Einsätze in PBS. Beheben sie in frisch hergestelltem 4% Paraformaldehyd in PBS für 10 min bei RT auf Schüttler. </li><li> Nach der Fixierung, kratzen und reinigen Sie die Oberseite des Einsatzes, um die Axone, die ausschließlich auf der Bodenfläche des Filter wuchs zu sammeln. Fahren Sie mit dem Standard-Inkubationen für IF. </li><li> Einsätze inkubieren in Blockierlösung (TBS, 0,05% Tween 20, 5% Magermilch), unter Verwendung von Standardmengen, für 1 h bei RT unter leichtem Schütteln. </li><li> Übereinsätze zur primären Antikörper in Blockierungspuffer (anti-β-III-Tubulin, 1:5000) unter Verwendung von Standardvolumen verdünnt. Inkubieren O / N (~ 18 h) bei 4 ° C unter leichtem Schütteln. </li><li> Zweimal in PBS (2 × 10 min bei RT) Waschen des ersten Antikörpers. </li><li> Über fügt Fluoreszenz-konjugierten Sekundärantikörper in Blockierungspuffer (Ziege-Anti-Maus, 1:2000) unter Verwendung von Standardvolumen verdünnt. Inkubieren bedeckt von Licht für 2 Stunden bei RT unter leichtem Schütteln. </li><li> In PBS (3 x 10 min bei RT) Waschen Sie den sekundären Antikörper 3x. </li><li> Nach IF abgeschlossen ist, nehmen Einsatz aus, abgießen PBS aus dem letzten Waschen und reinigen Sie die Oberseite des Filters mit einem Baumwoll-Spitze-Applikator. Saugen Sie keine Flüssigkeit aus den Ober-und Unterseite. </li><li> Ort eingeben Upside-Down auf der Bank, und schneiden Sie den Filter aus dem Einsatz mit einem scharfen Skalpell. </li><li> Halten Sie den Filter mit einer Pinzette, von unten nach oben, und legen Sie auf Mikroskopie Rutsche. Overlay mit einem Deckglas und Leuchtstoffröhren-kompatiblen mounting Medien. Lassen Sie trocknen in Kühlraum, von Licht bedeckt. Untersuchen und Bilder zu erfassen mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops. HINWEIS: Wenn bei 4 ° C gelagert und vor Licht geschützt sind, können diese Präparate Wochen mit minimalem Verlust an Fluoreszenz gehalten werden. </li><li> OPTIONAL: Alternativ, wenn Sie auf Filter, die aus dem Einsatz entfernt wurden, durchgeführt werden. Um das zu tun, kratzen und reinigen Sie die Oberseite der Filter direkt nach der Fixierung. <ol><li> Nehmen Sie Filter aus den Einsätzen mit einem scharfen Skalpell und Ort Axone Filter-up auf dem Boden einer sechs-Well-Platte. </li><li> Danach durchführen Inkubationen für IF wie in 7,4-7,8 und 7.11 angegeben. Der Vorteil dieser Alternative ist, dass es speichert Reagenzien, da beispielsweise die Inkubation Volumina bis 500 ul (im Vergleich zu den 3 ml verwendet, wenn Filter direkt an den Einsätzen angefärbt, wie in 7,1-7,11 dargestellt) gehen. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wichtige Parameter, die bei der Anpassung dieser Technik nehmen sind die neuronalen Population, die untersucht werden sollen, ist das Substrat, Porengröße des Filters und Fläche. Alle diese Parameter beeinflussen die Spezifität, die Qualität und Quantität der Neuriten Zubereitung erhalten, und müssen durch den Anwender betrachtet werden. In den in diesem Protokoll angegebenen Beispiele die Verwendung von DRG-Neuronen hat den Vorteil, der sich nur Axone, wodurch ein reines (spezifischen) axonalen Zubereitung. <p clas...

Die axonalen Kompartiment von Neuronen zeigt ein hohes Maß an funktionaler Unabhängigkeit von der somato-dendritischen Fach. In Projektionsneuronen, enthalten die meisten Axone der neuronalen Protein 1,2. Das Studium der Physiologie und Pathophysiologie von Axonen hat Schwung in den Neurowissenschaften gewonnen, weil neuere Studien haben gezeigt, dass die frühe axonalen Dysfunktion scheint ein gemeinsames Merkmal der neurodegenerativen Erkrankungen und neuropsychiatrischen Störungen 3 sein. Es scheint wahrscheinlich, dass ein besseres Verständnis der axonalen-exklusive Mechanismen unter normalen und pathologischen Bedingungen wird Licht auf die frühen Ereignisse, die Dysfunktion fahren zu vergießen. Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie Kultureinsätze verwenden, die mit einem porösen Membran (Filter), um große Mengen von reinem axonalen Material, das geeignet ist für die biochemische und immunzytochemische Analysen zu erhalten. Der Einsatz von Filtereinsätze zu studieren axonalen Biologie wurde zuerst von Steward umgesetzt undKollegen 4 und weiter durch Twiss und Kollegen fünf seiner derzeitigen Konfiguration entwickelt. Die Technik ist jetzt in der aktuellen Nutzung durch Gruppen studieren verschiedene Aspekte der axonalen Dendriten und Biologie, mit leichten Modifikationen in jedem Fall für die Population von Neuronen untersucht zubringen, die durchgeführten Behandlungen und die Art der biochemischen Analysen 6-9. Das vorliegende Protokoll hat nicht die Absicht, alle Alternativen für eine solche Vielzahl von Anwendungen unterzubringen, sondern eine einfache Methode, die für die meisten Anwendungen geeignet ist. Insbesondere die hier beschriebenen Protokoll verwendet eine Dreifach-Beschichtung, die axonalen Ausbeute für biochemische Analysen maximiert und ist bestens geeignet, um in der Literatur beschrieben axonalen Degeneration-anderen Beschichtungen studieren produziert weniger Axone, zurückziehen und schneller degenerieren, wenn sie von Nahrungsfaktoren 9 beraubt. Bei diesem Verfahren bleiben die neuronale Zellkörper oberhalb der Filter wh isoliertile Axone verlaufen durch die Poren und wachsen entlang der Bodenoberfläche. Reine Axone (ohne Glia und neuronale Zellkörper Verunreinigungen), die auf der unteren Oberfläche des Filter wachsen kann für biochemische Analysen gesammelt werden oder kann in situ fixiert und durch immunzytochemische Methoden 9 untersucht werden. Das Verfahren beruht auf der Verwendung von embryonalen sensorischen Neuronen der dorsalen Wurzelganglien (DRG). Embryonale DRGs sind weit verbreitet, um Biologie zu studieren, weil axonalen Neuriten aus diesen Zellen eine schnelle und robuste Wachstum in vitro, wenn sie in den Nervenwachstumsfaktor (NGF) gehalten, und weil sie schnell unterziehen Degeneration, wenn dieses Faktors beraubt. Auch DRG-Neuronen fehlt Dendriten, so dass alle mit dieser Methode gesammelt Neuriten sind rein Axone. Filtereinsätze stellen im Vergleich zu anderen Ansätzen verwendet, um Axone zu studieren einen großen Vorteil. Untersuchungen sich auf die Verwendung der Mikroskopie zu unterscheiden Prozesse in der Zelle Soma von den in a vorkommendenXON-Fluß einen begrenzten biochemische Information. Als weiteres Beispiel teilten Kultursysteme (zB Campenot Kammern 10 oder 11 Mikrofluidvorrichtungen) sind nützlich zur Bildgebung Ansätze und für eine unterschiedliche Behandlung von Zellkompartimenten, bieten aber nur geringe Mengen des axonalen Material, was die Verwendung dieser Techniken für biochemische Analysen, die erfordern, relativ große Probenmengen. Weitere, ihre Verwendung erfordert eine umfassende Ausbildung sowie spezielle Geräte, und sie zeitaufwendig sind. Ein weiterer Ansatz oft verwendet, um Axone aus Explantaten isolieren ist es, eine Explantation Zentrum (mit neuronalen Zellkörpern), bevor axonalen Probensammlung manuell entfernen. Dies kann zwar große Mengen von Axon-angereicherten Präparationen erzeugen können Axone in dieser Zubereitung in Glia umhüllt und schnell nacheinander Entfernen Körper 20 Explantat von 6 Vertiefungen (als Beispiel eines minimalen Experiment) ist zeitaufwendig und an der Grenze des Machbaren. Im Gegensatz dazu ist die hier vorgestellte Methode liefert reichlich und rein axonalen Vorbereitungen, die dann von nahezu jedem biochemischen Technik, die häufig verwendet wird, um ganze-Zelllysaten analysieren, wie Western-Blot, Immunpräzipitation 6, Northern Blot-5-Massenspektrometrie 6, RNA-Reinigung analysiert werden können 7,12,13, unter anderem. Darüber hinaus kann das Protokoll verwendet werden, um (IF)-Techniken Immunfluoreszenz, wie es möglich ist, Axone wachsen in der unteren Seite des Filters weiter zu untersuchen, indem sie IF fixieren. Dieser Ansatz erleichtert die Analyse der axonalen spezifische Prozesse, da es keine Zellkörper in der letzten Vorbereitung. Dies ist ein bedeutender Vorteil, da eine hohe Immunfluoreszenzsignal vom Zellkörper oft untergräbt Prüfung und Analyse von einem schwächeren Signal von dünnen Strukturen wie Axone stammen. Zwei Anwendungen der Methode zur Kultur axonalen Degeneration ar studierene beschrieben; ein Modell der Entwicklungs Beschneiden und Modell Verletzungs-induzierte Degeneration (gemeinhin als Waller-Degeneration bezeichnet). Die Modellierung der Entwicklungs Beschneiden basiert auf der Tatsache, daß sensorische Neuronen in vivo für limitierende Mengen an Ziel-abgeleitete NGF und diejenigen weil es nicht genug neurotrophen Unterstützung degenerierten 14 empfangen Wettbewerb basiert. Dieses Phänomen kann in embryonalen DRG-Kulturen durch Abziehen von NGF aus den Kulturmedien, die, wie es in vivo auslöst axonale Degeneration, gefolgt von Zellkörper Zerstörung nachgeahmt werden. Waller-Degeneration zu modellieren, wird die obere Seite des Filters mit den Zellkörpern abgeschabt. Die Axone, die auf der Unterseite des Filters werden physikalisch von den Zellkörpern getrennt und danach die schnelle und stereotype degenerativen Prozess wie Waller-Degeneration 15 bekannt ist, nach A. Waller genannt, der als erster das Phänomen berichtet, im Jahr 1850 16 ziehen gewachsen.

<table><tbody><tr><td>CD-1 Maus, E13 zeitgesteuerte Schwangerschaft</td><td>Charles River</td><td></td><td>Zeitschwangerschaften im Haus können durchgeführt werden, indem Mäuse verpaart und auf Vaginalpfropfen überprüft werden (Tag E0)</td></tr><tr><td>Falkenzellkultur-Einsätze</td><td>Corning</td><td>353102</td><td>1 &micro; M Porengröße, passend für 6-Well-Aufnahmeplatte</td></tr><tr><td>Falcon Zellkultur-Begleitplatten</td><td>Corning</td><td>353502</td><td>Aufnahmeplatten für Einsätze</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>Wird bei 1 mg/ml in Wasser verwendet. Kann einmal wiederverwendet werden.</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Verwendet bei 10 & Mikro; g/ml in Wasser. Nehmen Sie den 100-fachen Bestand von -80 &deg; C und Tauwetter O/N bei 4 &°; C&nbsp;</td></tr><tr><td>PureCol Rinderkollagenlösung</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' L-15 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11415-064</td><td>Kann ersetzt werden durch DMEM</td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 serumfreies Supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluor-2&prime;-Desoxyuridin (FDU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>NGF (2.5S, beta-Untereinheit)</td><td>Cedarlane</td><td>CLMCNET-001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NGF-Antikörper</td><td>Inhouse</td><td></td> hergestellt <td>Wie beschrieben in: Acheson, A. et al. Nachweis der aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktor-ähnlichen Aktivität in Fibroblasten und Schwann-Zellen: Hemmung durch Antikörper gegen NGF. Neuron. <stark>7</stark>, 265-75, (1991).</td></tr><tr><td>Alomone Labs</td><td>AN-240</td><td>Kommerzielle Option</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tubulin-Antikörper</td><td>Millipore</td><td>MAB5564</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Maus-Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">DRG-Kulturmedium</td></tr><tr><td colspan="4">Neurobasal Medium 2% B27 Neurobasal Supplement 2 mM L-Glutamin 1% Penicillin-Streptomysin 10 & Mikro; M FDU 15 ng/ml NGF (nur unteres Fach)</td></tr><tr><td colspan="4">1x Laemmli Probenpuffer<</td></tr><tr>td colspan="4">2% SDS 50 mM DTT 60 mM Tris (pH 6,8) 5% Glycerin 0,01% (w/v) Bromphenolblau</td></tr></tbody></table>

produktion und isolierung der axone von sinneszellen für biochemische analyse mit porous filter

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Neuronale Axone nutzen spezifische Mechanismen, um die Ausdehnung zu vermitteln, die Integrität zu erhalten und Degeneration zu induzieren. Ein angemessenes Gleichgewicht dieser Ereignisse ist erforderlich, um funktionelle neuronale Schaltkreise zu formen. Das hier beschriebene Protokoll erklärt, wie Zellkultureinsätze mit einer porösen Membran (Filter) verwendet werden, um große Mengen reiner axonaler Präparate zu erhalten, die für die Untersuchung durch konventionelle biochemische oder immunzytochemische Techniken geeignet sind. Die Funktionalität dieser Filtereinsätze wird mit Modellen des Entwicklungsschnitts und der Wallerschen Degeneration anhand von Explantaten des embryonalen Spinalganglion demonstriert. Die axonale Integrität und Funktion ist bei einer Vielzahl von neurodegenerativen Pathologien beeinträchtigt. In der Tat ist jetzt klar, dass die axonale Dysfunktion bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungen viel früher im Krankheitsverlauf auftritt als der neuronale Somaverlust, was darauf hindeutet, dass axonale Prozesse bei diesen Erkrankungen hauptsächlich anvisiert werden. Durch die Gewinnung reiner axonaler Proben für die Analyse mit molekularen und biochemischen Techniken hat diese Technik das Potenzial, neues Licht auf die Mechanismen zu werfen, die die Physiologie und Pathophysiologie von Axonen regulieren. Dies wiederum wird sich auf unser Verständnis der Prozesse auswirken, die degenerative Erkrankungen des Nervensystems antreiben.

Dorsalwurzelganglion Explantate von E13.5 Maus wachsen weitgehend auf Filter nacheinander beschichtet mit Poly-D-Lysin, Laminin und Kollagen (1B, links), von bis zu 2 mm innerhalb von 2 Tagen in Kultur. Dieses Substrat Kombination ergibt besonders üppige Wachstum; andere Kombinationen ergeben Axone, die wesentlich kürzer sind (Abbildung 1B, rechts). Darüber hinaus DRGs auf Filtern beibehalten erweitern mehr und mehr als Axone DRGs auf Kunststoff 1C gewachsen. <p cla...

Dieser Artikel beschreibt ein neuronales Kultursystem, das verwendet werden kann, um große Mengen reiner axonaler Proben für biochemische und immunzytochemische Analysen zu erhalten. Diese Technik wird ein besseres Verständnis der normalen axonalen Physiologie und der Signalwege ermöglichen, die zur Neurodegeneration führen.

Produktion und Isolierung der Axone von Sinneszellen für Biochemische Analyse mit Porous Filter

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, reine axonale Präparate zu erhalten, die für die Untersuchung durch konventionelle, biochemische oder immunzytochemische Techniken geeignet sind. Dies wird erreicht, indem zunächst embryonale Spinalganglienzellen auf Kultureinsätzen kultiviert werden, die einen porösen Membranfilter tragen, während die DRG-Neuronen Axone verlängern. Einige der Axone wachsen durch Poren im Filter und erstrecken sich auf seiner unteren Oberfläche, während die Zellkörper auf der oberen Oberfläche isoliert bleiben. Nach den gewünschten experimentellen Manipulationen wird die axonale Präparation erhalten, indem die Zellen auf der Oberseite der Filter physikalisch entfernt werden, während die Axone, die auf der Unterseite gewachsen sind, erhalten bleiben.Letztendlich können die isolierten Axone für biochemische Analysen liegen oder für immunchemische Untersuchungen fixiert werden, indem reine axonale Proben hergestellt werden, die für die Analyse mit herkömmlichen biochemischen Techniken geeignet sind. Dieses Verfahren hat sich als sehr nützlich erwiesen, um die Physiologie und Pathophysiologie von Axonen zu untersuchen. Wie Sie sehen werden, ist die Technik relativ einfach zu implementieren und kann an bestimmte experimentelle Umgebungen angepasst werden.Wir werden seine Verwendung bei der Untersuchung von axonalen Degenerationsmechanismen am Tag vor der Plattierung demonstrieren. Beginnen Sie damit, die Filter unter einer sterilen Gewebekulturhaube zu beschichten. Erster Platz, 24-Millimeter-Filtereinsätze in einer Sechs-Well-Aufnahmeplatte.Geben Sie dann zwei Milliliter von einem Milligramm pro Milliliter, Poly de Lycin in Wasser in das untere Fach und einen Milliliter in das obere Fach und inkubieren Sie die Einsätze eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Ihr nächstes Aspirat, das Poly de Lycine, wobei darauf geachtet wird, die Flüssigkeitsreste zu entfernen, die direkt unter dem Filter eingeschlossen sind. Spülen Sie dann nach dem Ansaugen des Wassers einmal mit Wasser ab, schließen Sie den Deckel und lassen Sie die Platten über Nacht in der Haube trocknen.Am nächsten Morgen eine Laminat-Wasser-Lösung bei 37 Grad Celsius mischen und erwärmen. Inkubieren Sie die Inserts in der Lamininlösung eine Stunde lang in einem Zellinkubator bei 37 Grad Celsius unter Verwendung von Standardvolumina. Nach dem Aspirieren.Das Laminin fügt 0,1 Milligramm pro Milliliter hinzu, Kollagen in Wasser und inkubiert eine Stunde lang bei Raumtemperatur, aspiriert dann das Kollagen und wäscht es einmal mit sterilem Wasser. Die Filter sind nun bereit für die Aufnahme von Nährmedien und DRG-Explan, nachdem ein E 13-Mausembryo wie im Textprotokoll beschrieben präpariert und geköpft wurde. Legen Sie den Embryo auf die Seite in eine mit L 15-Medien gefüllte Petrischale, während Sie ihn durch ein Präpariermikroskop betrachten, und machen Sie einen Schnitt an den Seiten, um die Brust, den Bauch, die Gliedmaßen und den Schwanz zu entfernen.Legen Sie den Rücken mit der Bauchseite der Wirbelsäule nach oben und entfernen Sie alle viszeralen Organe mit einer kleinen Federschere. Legen Sie das gesamte Rückenmark frei, indem Sie die Wirbelsäule von ihrer ventralen Seite entlang der Mittellinie durchtrennen. Halten Sie den Kadaver mit einer Zange Nummer drei fest und halten Sie das Rückenmark mit einem zweiten Paar an seiner rostralsten Seite fest.Ziehen Sie nun die Nabelschnur langsam und sanft von der Wirbelhöhle weg. Wenn die DRGs freiliegen, verwenden Sie eine ultradünne Pinzette Nummer fünf, um sie vom Rückenmark abzuklemmen. Legen Sie die abgelösten DRGs mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze, die zur Vergrößerung abgeschnitten wurde, auf den Boden der Schale.Seine Eröffnung. Aspiriere die gesammelten DRGs und lege sie in eine Röhre auf Eis. Ergänzen Sie das Medium des unteren Fachs mit 15 Nanogramm pro Milliliter NGF, während das obere Fach NGF frei bleibt.Geben Sie anschließend vollständige DRG-Medien bei 37 Grad Celsius zu den beschichteten Einsätzen unter Verwendung von Standardvolumina. Verwenden Sie dann eine 1000-Mikroliter-Pipette mit einer Spitzenblende, um die Öffnung zu vergrößern. Stellen Sie die Pipette auf 800 Mikroliter ein.Übertragen Sie dann etwa 200 Mikroliter Medium von der Oberseite des Filters in die DRG-enthaltende Röhrchenpipette, ein kleines Volumen nach oben und unten, um die auf den Boden gesunkenen D-RRGs wiederzubeleben. Nach der Resuspendierung aspirieren Sie das gesamte Volumen, übertragen Sie nun die DRGs in den Filter, indem Sie die Pipettenspitze in der Mitte des Einsatzes eintauchen und die DRGs ausstoßen. Halten Sie die Kulturen in einem Zellinkubator bei 37 Grad Celsius.Wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage, um das Medium zu wechseln. Saugen Sie zuerst das obere Fach an, dann das untere. Geben Sie frisches Medium in Standardvolumina hinzu, beginnend mit dem unteren Kompartiment, um die Auswirkungen des trophischen Faktorentzugs auf Axone zu untersuchen.Warten Sie zwei Tage, um die axonale Ausdehnung zu ermöglichen. Entfernen Sie anschließend das Medium aus dem oberen und unteren Fach. Dann werden verbleibende oder endogen produzierte Medien sequestriert, und GF fügt Medien hinzu, denen NGF fehlt und die Anti-NGF-Antikörper enthalten.Bringen Sie die Platten wieder bei 37 Grad Celsius in den Zellinkubator zurück, damit die durch den NGF-Entzug induzierte Degeneration für die gewünschte Zeit zur Untersuchung während der Arianerdegeneration fortgesetzt werden kann. Verwenden Sie Filter, die DRG explan enthalten, der zwei Tage lang in NGF gepflegt wird. Verwenden Sie einen Zellschaber, um DRGs von der Oberseite des Filters abzukratzen.Sorgen Sie für die vollständige Entfernung der neuronalen Zellkörper, indem Sie den Schaber in x- und y-Richtung und in Kreisen hin und her bewegen. Bestätigen Sie den Erfolg des Schabens, indem Sie überprüfen, ob keine X Pflanzen am Filter haften. Als nächstes verwerfen Sie das Medium mit den schwimmenden Explantaten aus dem oberen Fach und fügen Sie einen Milliliter vorwärmtes vollständiges DRG-Medium mit 10 Nanogramm pro Milliliter und gf hinzu.Dann wird die Platte wieder bei 37 Grad Celsius in den Zellinkubator gestellt, damit die Waller'sche Degeneration für die gewünschte Zeit ablaufen kann, um Protein aus den axonalen Proben zu extrahieren. Füllen Sie zunächst 1,5-Milliliter-Sammelröhrchen mit 75 Mikrolitern Lammblatt-Probenpuffer und legen Sie die Röhrchen auf Eis. Waschen Sie den Filter mit dem DRG-Explan in PBS und kratzen Sie die Oberseite des Filters wie zuvor ab.Nachdem Sie den Einsatz von der Platte entfernt haben, verwenden Sie einen Wattestäbchenapplikator, um die Oberseite des Filters zu reinigen. Saugen Sie dann überschüssiges PBS von der Ober- und Unterseite an. Legen Sie dann den Einsatz kopfüber auf eine Bank und schneiden Sie mit einem scharfen Skalpell den Filter aus dem Einsatz.Halten Sie dann den Filter mit einer Pinzette fest. Von unten nach oben. Machen Sie mit einer Schere einen Schnitt vom Umfang bis zur Mitte des Filters.Legen Sie nun den Filter auf das Auffangrohr und drücken Sie mit einer Pinzette die Mitte des Filters nach unten. Dabei bildet sich ein Trichter, der den trichterförmigen Filter auf den Boden des Röhrchens drückt, so dass er in den Laly-Probenpuffer eingetaucht wird. Schließen Sie nun die Proteinextraktion ab, indem Sie die Röhrchen abdecken und vier Minuten lang in kochendes Wasser legen.Entfernen Sie den Filter mit einer Pinzette und setzen Sie ihn kopfüber in den oberen Teil des Röhrchens ein und zentrifugieren Sie ihn kurz. Wenn Sie fertig sind, entsorgen Sie die getrockneten Filter für die Immunfluoreszenz. Waschen Sie die Einsätze in PBS in Sechs-Well-Platten.Fixieren Sie dann die Einsätze in frisch aufbereitetem 4%Paraformaldehyd in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Shaker nach der Fixierung, kratzen und reinigen Sie die Oberseite der Einsätze, um sicherzustellen, dass nur Axone fleckig werden, die ausschließlich auf der Unterseite des Filters gewachsen sind. Führen Sie dann die Standard-Immunfluoreszenz durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Sobald alle Immunfluoreszenz-Inkubationen abgeschlossen sind.Gießen Sie das PBS von der letzten Wäsche ab. Reinigen Sie die Oberseite des Filters mit einem Wattestäbchenapplikator und saugen Sie die restliche Flüssigkeit von der Ober- und Unterseite ab. Legen Sie den Einsatz verkehrt herum auf die Bank und schneiden Sie mit einem scharfen Skalpell den Filter aus dem Einsatz.Halten Sie dann den Filter mit der Pinzette nach oben. Legen Sie es auf einen Objektträger. Legen Sie mit fluoreszierenden Eindeckmedien einen Deckglas über den Filter und lassen Sie den Filter im Dunkeln bei vier Grad Celsius flach trocknen.Zum Schluss wird die Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht und aufgenommen. Die sequentielle Beschichtung von Filtern mit Polylysin, Laminin und Kollagen führt dazu, dass Pflanzen im Vergleich zu solchen, die mit Polylysin allein oder Polylysin und Kollagen unter demselben Substrat angebaut werden, mehr und längere Axone bilden. Bedingungen der Beschichtung.DRG Explan, das auf Filtern gepflegt wird, zeigt ein deutlich stärkeres axonales Wachstum als X-Pflanzen, die auf Kunststoff angebaut werden. Das axonale Präparat, das nach dem Schaben der Oberseite des Filters erhalten wird, ist frei von Zellkernen, was zeigt, dass Zellkörper von der Unterseite des gezeigten Filters ausgeschlossen sind. Hier sind Beispiele von Axonen, die von etwa 17 Explan stammen, die sich durch die Filterporen erstreckten, um auf der Unterseite eines 24-Millimeter-Filters zu wachsen.Immun-Blots von Lysaten, die von Filteroberseiten im Vergleich zu Filterböden gesammelt wurden, zeigen, dass Histon H drei, ein nukleärer Marker, auf die Filteroberseiten beschränkt ist. Der Gesamtproteingehalt wurde über die verschiedenen Proben hinweg normalisiert. Die NGF-Deprivationsexperimente sind in diesen Bildern bei unterschiedlichen Vergrößerungen von axonalen Präparaten aus Explan demonstriert, die in NGF gehalten oder 12 oder 36 Stunden lang von NGF entzogen wurden.Die Studien zur arianischen axonalen Degeneration der Wand sind in diesen Bildern von axonalen Präparaten aus intakten Explantaten oder drei bis 7,5 Stunden nach der Durchtrennung gezeigt, wie in anderen Modellen der Wallerschen Degeneration. Fünf Millimolare NAD plus schützt vor transsektionsinduzierter Degeneration Einmal gemeistert. Diese Technik ist robust und einfach zu reproduzieren.Es ermöglicht die Erzeugung großer Mengen zuverlässiger axonaler Präparate Seit der Erstbeschreibung durch twist und Kollegen im Jahr 2001. Variationen dieser Technik wurden verwendet, um viele Aspekte der Axon- und Dendritenphysiologie zu erforschen. Beziehen Sie sich auf die Zitate im Textprotokoll, um weitere Anwendungen dieser Technik zu entdecken.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

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Axoplasma Isolation von Rat Ischiasnerv

Eine Methode, um translationsaktiven, intakte Synaptoneurosomen (SNS) von der Maus Hirnrinde vorbereiten beschrieben. Das Verfahren nutzt eine diskontinuierliche Percoll-Saccharose-Dichtegradienten Dies ermöglicht die schnelle Erstellung von aktiven SNS.

Vorbereitung der Synaptoneurosomen von Maus Cortex mit einem diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Dichtegradienten

Dieses Video zeigt die Isolierung und Kultivierung von Schwann-Zellen aus den Spinalwurzeln der Maus. Isolierte Zellen werden dann in speziellen Medien kultiviert. Schwann-Zellen werden über differentiellen Verdau und Adhärenz isoliert. Anschließend werden sie zur Befestigung und Proliferation auf mit extrazellulärer Matrix beschichtete Deckgläser übertragen.

Isolierung von Schwann-Zellen aus spinalen Wurzeln der Maus

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Isolation von sensorischen Neuronen von<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Für Patch-Clamp-Recordings von Glutamaterge Currents

Afferente sensorische Neuronen signalisieren sensorische Informationen von der Peripherie an das zentrale Nervensystem. Die Identifizierung spezifischer afferenter Neuronen hilft beim Verständnis ihrer Physiologie. Wir beschreiben eine Methode der retrograden Markierung, um afferente Neuronen zu identifizieren, und untersuchen die spannungsgesteuerten Ionenkanäle in diesen Neuronen mit Hilfe der Patch-Clamp-Elektrophysiologie und Immunzytochemie.

Identifikation von spezifischen sensorischen Neuronenpopulationen für das Studium der Ausgedrückt Ionenkanäle

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die hydraulische Extrusion des Rückenmarks sowie die Identifizierung und Isolierung spezifischer Spinsalwurzelganglien (DRGs) im selben Nagetier. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden zur Isolierung des Rückenmarks ist diese Methode deutlich schneller und reduziert das Risiko von Gewebeschäden.

Hydraulische Extrusion des Rückenmarks und Isolierung von Dorsalwurzelganglien in Nagetiere

Hier präsentieren wir eine Methode zur Reinigung von Fibroblasten und Schwannzellen von sensorischen und motorischen Nerven in vitro.

Reinigung von Fibroblasten und Schwannzellen von sensorischen und motorischen Nerven in Vitro

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Aussaat und Färbung neuronaler Mitochondrien in mikrofluidischen Kammern. Der fluidische Druckgradient in diesen Kammern ermöglicht die selektive Behandlung von Mitochondrien in Axonen, um ihre Eigenschaften als Reaktion auf pharmakologische Herausforderungen zu analysieren, ohne das Zellkörperkompartiment zu beeinträchtigen.

Mikrofluidik-unterstützte selektive Depolarisation axonaler Mitochondrien

Dieses Protokoll beschreibt ein mikrofluidisches System, das die neuronale Stoffwechseldynamik nach axonaler Verletzung modelliert und Bildgebung, Multi-Omics-Analysen und mechanistische Studien des intrinsischen metabolischen Umbaus ermöglicht.

Mikrofluidischer Chip für axonale Verletzungsmodelle, Aufbau und Ermöglichung von Multi-Omics-Analysen

Das neuronale Membranproteasom (NMP) wurde kürzlich in einer Untergruppe somatosensorischer Neuronen als Schlüsselregulator der Berührungs-, Schmerz- und Juckreizwahrnehmung identifiziert. In diesem Artikel wird ein robuster Arbeitsablauf für die Analyse der zelltypspezifischen NMP-Expression und -Funktion unter Verwendung von Zellsortierung, Transkriptom-Profiling und kulturbasierten Immunfluoreszenzanalysen vorgestellt.

Zellsubtyp-spezifische Analyse von neuronalen Membranproteasomen in somatosensorischen Neuronen

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Isolierung und Quantifizierung axonaler mRNAs mittels poröser Membraninserts und RTddPCR

Erfahren Sie die Isolierung reiner Axone von embryonalen dorsalen Wurzelganglien für biochemische Analysen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung axonaler Physiologie und neurodegenerativer Signalwege.

Produktion und Isolierung der Axone von Sinneszellen für Biochemische Analyse mit Porous Filter

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