Einem mikrofluidischen Biochip-basierte Elektrochemische für Markierungsfreie DNA-Hybridisierungsanalyse

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Auswirkungen von DNA-Hybridisierungsereignissen auf Impedanzspektren mit Hilfe eines mikrofluidischen elektrochemischen Geräts zu beobachten. Zu diesem Zweck wird ein elektrochemischer Chip hergestellt, der ein Array von Elektrodensensoren ermöglicht, und ein mikrofluidischer PDMS-Chip wird hergestellt. Um die Einführung von Mikrovolumenproben zu erleichtern, werden die beiden Chips miteinander verbunden und mit einzelsträngigen DNA-Sonden funktionalisiert.

Die einzelsträngige Ziel-DNA wird dann bei der DNA-Hybridisierung hinzugefügt, die stärkere Abstoßungskraft zwischen der negativ geladenen doppelsträngigen DNA und den negativ geladenen Cyanid-Ferris-Cyanid-Molekülen führt zu einem höheren Ladungstransferwiderstand. Letztendlich können DNA-Hybridisierungsereignisse durch Messung der Änderungen der elektrochemischen Impedanzspektren nachgewiesen werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der Verwendung eines Plattenlesegeräts oder J-Shift-Assays, besteht darin, dass die Geräte die gleiche Technik mit geringem Probenvolumen und zu einem Bruchteil der Kosten durchführen können, ohne die Empfindlichkeit oder Spezifität zu beeinträchtigen.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Krebsforschung, der Grippeerkennung und der Gentechnik zu beantworten, indem sie ein schnelles spezifisches DNA-Sequenz-Screening und die Untersuchung der binären Kinetik einzelsträngiger DNA-Sequenzen ermöglicht. Da diese schnelle Hochdurchsatz-DNA-Hybridisierungsanalysemethode mit geringem Probenvolumen und ohne komplizierte Probenvorbereitungsschritte durchgeführt werden kann, erstrecken sich die Auswirkungen dieser Technik auf unsere Diagnose von genetischen Störungen, verschiedenen Formen von Krebs oder Krankheiten mit spezifischen DNA-Markern wie Influenza. Im Allgemeinen werden Personen, die mit der Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Entwicklung von Mikrogeräten die Kontrolle, die Verarbeitungsparameter und einen iterativen Ansatz zur Lösung von Problemen wie Lösungsleckagen erfordert.

Nach dem Zusammenbau des Geräts: Um Goldelektroden auf den elektrochemischen Chip zu strukturieren, halten Sie einen blanken, vier Zoll großen Siliziumwafer mit einer Pinzette fest und spülen Sie mit einer Waschflasche die Oberfläche beider Seiten des Wafers mit Aceton, Methanol und dann Isopropanol ab. Dieser Vorgang wird im Folgenden als A-MI-Reinigung unter einem Strahl von deionisiertem Wasser bezeichnet. Spülen Sie das Isopropanol vom Wafer ab und verwenden Sie dann eine Stickstoffpistole, um den Wafer zu trocknen.

Laden Sie den Wafer in eine plasmagestützte chemische Gasphasenabscheidung oder P-E-C-V-D-Anlage. Geben Sie die Parameter ein, um eine ein Mikrometer dicke Siliziumdioxid-Ationsschicht zu erhalten, und starten Sie den automatisierten Prozess. Als nächstes wird mit einem DC-Sputterwerkzeug eine Schicht aus Chrom mit einer Dicke von 200 Angström auf den Wafer und dann eine Schicht aus Gold mit einer Dicke von 2000 Ström abgeschieden. Laden Sie den Wafer auf einen Spinner, bestäuben Sie die Oberfläche mit einer Stickstoffpistole und tragen Sie mit einer Pasterpipette Spin PR One Positive Photo Resist Spin auf, um einen gleichmäßigen Film von etwa 1,6 Mikrometern Dicke zu erzeugen.

Anschließend die Waffel eine Minute bei 100 Grad Celsius auf einer heißen Platte vorbacken. Laden Sie den Wafer mit dem Fotolack in die Masken-Aligner-Ausrüstung. Initiieren Sie dann eine Belichtung von 190 Millijoule pro Quadratzentimeter bei 405 Nanometern, bei der der Masken-Aligner den Verschluss öffnet und den Fotolack durch eine Maske mit den vorgesehenen Merkmalen dem Licht aussetzt.

Nach der Belichtung wird der Wafer in eine Glasschale mit 3 5 2 Entwicklern getaucht und 30 Sekunden lang unter leichtem Schütteln inkubiert. Spülen Sie dann den Wafer unter einem Strahl Di Wasser ab und trocknen Sie ihn wie zuvor mit der Stickstoffpistole. Tauchen Sie dann den Wafer in eine Glasschale mit Goldätzlösung und inkubieren Sie ihn 1,5 Minuten lang unter leichtem Schütteln.

Übertragen Sie dann den Wafer in eine Glasschale mit dem erwähnten Chrom und inkubieren Sie ihn unter leichtem Schütteln, bis die Chromflecken auf dem Wafer verschwunden sind. Dies sollte etwa 30 Sekunden dauern. Spülen Sie den Wafer mit Wasser ab und trocknen Sie ihn mit der Stickstoffpistole, wobei Sie den Wafer mit einer Pinzette halten.

Entfernen Sie den Fotolack mit dem MI-Reinigungsverfahren. Dann mit DI-Wasser abspülen und mit der Stickstoffpistole trocknen, wobei zwei Schichten Handschuhe zu tragen sind. Tauchen Sie die Waffel eine Minute lang in eine Teflonschale mit Piranha-sauberer Lösung.

Dann den Wafer mit Wasser abspülen und mit einer Stickstoffpistole trocknen. Laden Sie neben dem Strukturieren der Platinelektroden den Wafer auf einen Spinner. Stauben Sie die Oberfläche mit einer Stickstoffpistole ab und geben Sie mit einer Pasterpipette PR zwei positive Fotolacke auf die Oberflächendrehung, um einen gleichmäßigen Film von etwa 1,4 Mikrometern Dicke zu erzeugen.

Lege den Wafer auf eine heiße Platte bei 100 Grad Celsius und backe ihn eine Minute lang vor. Nach dem Vorbacken belichten Sie den Wafer bei 30 Millijoule pro Zentimeter im Quadrat 405 Nanometer durch eine Fotomaske. Dann den Wafer auf eine heiße Platte bei 125 Grad Celsius legen und 45 Sekunden backen.

Entfernen Sie die Maske von der Maske, dem Aligner und dem Flood. Belichten Sie den Wafer mit 1000 Millijoule pro Quadratzentimeter bei einer Wellenlänge von 405 Nanometern ohne Fotomaske. Nach der Belichtung entwickeln Sie den Wafer, indem Sie ihn in eine Glasschale mit einer Z 400 K-Entwicklerlösung im Verhältnis sechs zu eins tauchen.

Zwei Minuten lang unter leichtem Schütteln inkubieren. Dann den Wafer mit Wasser abspülen und mit einer Stickstoffpistole trocknen. Mit einem E-Beam-Verdampfungssystem wird eine 400 Angström dicke Schicht Titan abgeschieden, gefolgt von einer 1600 Angström dicken Schicht Platin auf dem Wafer.

Legen Sie die Waffel in eine mit Aceton gefüllte Glasschale und stellen Sie die Schale für fünf Minuten in ein Ultraschallbad, um das Foto abzuheben. Widerstehen Sie dann, den Wafer mit einer Pinzette zu halten. Spülen Sie mit einer Waschflasche beide Oberflächen des Wafers mit Aceton und anschließend mit Isopropanol ab.

Spülen Sie den Wafer mit Wasser ab und trocknen Sie ihn mit der Stickstoffpistole. Um die Form für die Assay-Kanäle vorzubereiten, spülen Sie einen rohen 4-Zoll-Siliziumwafer in Testqualität mit dem MI-Reinigungsverfahren ab. Spülen Sie wie zuvor das Isopropanol mit Wasser vom Wafer ab und trocknen Sie es anschließend mit einer Stickstoffpistole.

Laden Sie den Wafer auf einen Spinner, bestäuben Sie die Oberfläche des Wafers mit einer Stickstoffpistole und geben Sie mit einer Pasti-Pipette PR drei negative Fotolacke auf die Oberfläche, um einen gleichmäßigen Film von etwa 100 Mikrometern Dicke zu erzeugen. Lege die Waffel auf eine heiße Platte, um sie in einem zweistufigen Backverfahren vorzubacken. Erhöhen Sie zunächst die Temperatur von Raumtemperatur auf 65 Grad Celsius bei 300 Grad Celsius pro Stunde.

Dann 10 Minuten bei 65 Grad Celsius halten. Hochfahren auf 95 Grad Celsius bei 300 Grad Celsius pro Stunde und dann 30 Minuten lang halten. Belichten Sie den Wafer mit 2.500 Millijoule pro Quadratzentimeter bei einer Wellenlänge von 405 Nanometern durch eine Fotomaske.

Legen Sie dann den Wafer auf eine heiße Platte und backen Sie den Wafer nach, indem Sie ihn von Raumtemperatur auf 95 Grad Celsius bei 300 Grad Celsius pro Stunde hochfahren. 10 Minuten bei 95 Grad Celsius halten. Tauchen Sie den Wafer in eine Glasschale, die Propylenglykol, Monomethyletheracetat oder P-G-M-E-A-Entwickler enthält, und lassen Sie ihn 10 Minuten lang entstehen.

Spülen Sie den Wafer mit Isopropanol ab und trocknen Sie ihn mit einer Stickstoffpistole, um Assay-Kanäle herzustellen, um mit Aluminiumfolie ein Gehäuse um den Formwafer zu finden, und gießen Sie das nicht ausgehärtete Polydimethylsuboxan oder PDMS langsam über die Form. Backen Sie die Form mit dem PDMS in einem Kastenofen in einem zweistufigen Backverfahren, bei dem die Temperatur innerhalb von fünf Minuten von Raumtemperatur auf 80 Grad Celsius ansteigt und 17 Minuten lang bei 80 Grad Celsius bleibt. Nachdem die Form abgekühlt ist, ziehen Sie das PDMS von der Form ab und legen Sie es auf Aluminiumfolie.

Schneiden Sie die Assay-Chips mit einem chirurgischen Messer und definieren Sie Löcher mit einem Biopsie-Stanzwerkzeug, wie hier gezeigt. Richten Sie die PDMS-Assay-Kanäle manuell mit den Arbeitselektroden auf dem elektrochemischen Chip aus. PDMS haftet gut auf dem elektrochemischen Chip, dichtet die Kanäle ab und verhindert Leckagen.

Verbinden Sie den flexiblen Schlauch mit einem Kunststoffwinkel oder einem geraden Verbinder mit einem kurzen flexiblen Schlauch als Adapter, um die vertikalen Mikrokanäle zu funktionalisieren. Schließen Sie eine Spritze mit der einzelsträngigen DNA-Sonde an den Schlauch an und legen Sie sie in eine Spritzenpumpe. Befestigen Sie die Stecker an jedem der gesamten gestanzten Eingänge im Gerät.

Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens besteht darin, die Lösung in die Mikrokanäle fließen zu lassen, ohne Blasen zu erzeugen. Um den Erfolg sicherzustellen, lassen Sie die Lösung sehr langsam fließen Um eine homogene Füllung des Kanals zu erreichen, initiieren Sie die Pumpe mit einer Durchflussrate von 200 Mikrolitern pro Stunde, um jeden der drei separaten Mikrokanäle langsam mit einer anderen einzelsträngigen DNA-Sonden-Inkubationslösung zu füllen. Tauschen Sie nach einer Stunde Inkubation den Spritzenschlauch und den Konnektor aus, um die Mikrokanäle mit PBS zu spülen. Tauschen Sie dann die Spritzenschläuche und Konnektoren aus, um den Mikrokanal mit einer Lösung zu füllen, die aus einem Millimolar mit sechs Mer CAPTO, einem H-Ethanol MCH in 10 Millimolar PBS, 100 Millimolar Natriumchlorid und 1,395 Millimolar TCEP besteht und eine Stunde lang inkubiert.

Spülen Sie dann wie zuvor mit einer Pinzette mit PBS ab. Heben Sie das um 90 Grad gedrehte PDMS in eine horizontale Ausrichtung ab und platzieren Sie es nach unten. Dadurch werden separate Reihen von Reaktionskammern freigelegt, wobei jede Reihe eine einzigartige Gegen- und Referenzelektrode für die DNA-Hybridisierungsanalyse enthält.

Tauschen Sie die Spritzenschläuche und Konnektoren aus, um die Mikrokanäle mit einer Kontrollmesslösung aus konzentriertem Forex-Natriumcitrat SSC-Puffer zu füllen, inkubieren Sie 20 Minuten nach der Inkubation und tauschen Sie die Spritze aus, um die Mikrokanäle mit fünf Millimolar Ferris Cyanid fünf Millimolar Pharao Cyanid in PBS-Lösung zu füllen. Um dann die Hintergrundimpedanzwerte des elektrochemischen Systems für verschiedene Frequenzen mittels elektrochemischer Impedanzspektroskopie oder EIS aufzuzeichnen, verbinden Sie einen Potentialstat mit dem Arbeitszähler und Referenzelektroden mit Sondenspitzen. Geben Sie die Parameter der EIS-Messung in die Computersoftware ein und starten Sie dann die Messung.

Wiederholen Sie diese Messung für jede Arbeitselektrode in den Mikrokanälen, um die DNA-Hybridisierung für jeden nicht-komplementären und komplementären einzelsträngigen DNA-Zielaustausch zu messen. Der Spritzenschlauch und der Anschluss. Füllen Sie die Mikrokanäle mit einem vierfach konzentrierten SSC-Puffer, der ein Mikromolar der einzelsträngigen Ziel-DNA enthält, und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang.

Nehmen Sie Messungen vor, indem Sie die EIS-Messung mit einer Software auf dem Computer für jede einzelsträngige DNA-Ziellösung starten, um die elektrochemische Aktivität des zyklischen Biochipp-Volumens zu validieren. Telemetriemessungen wurden in den Mikrokanälen durchgeführt, die mit einem elektroaktiven Redox-Couple Cyanidcyanid gefüllt sind. Die ähnliche Form, die Peakhöhen und der Peakabstand für alle Elektroden zeigen eine hohe Reproduzierbarkeit, um die Fähigkeit der Biochips zu demonstrieren, DNA-Hybridisierungsereignisse zu erkennen.

Elektrochemische Impedanzvariationen wurden für Hybridisierungsereignisse zwischen drei einzelsträngigen DNA-Sonden und ihren komplementären und nicht-komplementären einzelsträngigen DNA-Zielen gemessen. Höhere Änderungen des Ladungstransferwiderstands wurden beobachtet, wenn komplementäres einzelsträngiges DNA-Ziel eingeführt und mit der Sonde hybridisiert wurde, verglichen mit der Einführung von nicht-komplementären einzelsträngigen DNA-Zielen, um die Empfindlichkeit des Biosensors zu demonstrieren. Unterschiedliche Konzentrationen von komplementären einzelsträngigen DNA-Zielen wurden in die Messsonde eingeführt, hier ist ein Nyquist-Diagramm elektrochemischer Impedanzspektroskopie-Messungen nach der Einführung steigender einzelsträngiger Ziel-DNA-Konzentrationen, die durch den Pfeil in der Grafik angezeigt werden. Erhöhte Impedanzwerte wurden bei niedrigen Frequenzen von etwa 15 Hertz für höhere zielorientierte, einzelsträngige DNA-Konzentrationen aufgrund der stärkeren Abstoßungskräfte zwischen der doppelsträngigen DNA und den Ferriscyanid-Ferriscyanid-Molekülen beobachtet.

Insgesamt zeigt der BIOCHIP die Fähigkeit, das Vorhandensein von DNA-Hybridisierungsereignissen schnell zu erkennen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein mikrofluidisches elektrochemisches Gerät entwickelt und herstellt und es zur Erkennung von DNA-Hybridisierungsereignissen verwendet. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, verschiedene BIOS-Parameter wie das Signal-zu-Schwestern-Verhältnis, Stabilität und Empfindlichkeit nach diesem Verfahren zu optimieren.

Andere Methoden, wie z.B. die Einführung von einzelsträngigen DNA-Targets mit leicht unterschiedlichen Sequenzen von Nukleinsäuren, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie DNA-Mutationskombination und Konkurrenz zu beantworten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Prozesslösungen für die Mikrofabrikation äußerst gefährlich sein kann, und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer ein Schutz der Augen und Hände des Körpers erforderlich ist.