Kombination von Mikrostereolithographie und Elektrospinnen auf Membranen Ausgestattet mit Nischen für die Hornhautregeneration Produzieren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die räumliche 3D-Komplexität in Tissue-Engineering-Gerüsten einzuführen, indem der Einsatz von additiven Fertigungstechniken und Elektrospinnen kombiniert wird. Dies wird erreicht, indem eine nicht abbaubare Schablone aus Polyethylenglykol, D acrl oder PEG DA unter Verwendung einer schichtweisen Photohärtungstechnik namens Mikrostereolithographie hergestellt wird. Als zweiter Schritt.

Die Schablonen werden auf ein metallisches Substrat aufgebracht und durch Elektrospinnen wird eine biologisch abbaubare Membran hergestellt, die die zugrunde liegende Morphologie nachahmt. Als nächstes werden Verpackungsverfahren und die Degradation der elektrogesponnenen Membranen untersucht. Ein vorzeitiger Abbau der gelagerten Membranen wird durch die Kontrolle von Temperatur und Feuchtigkeit vermieden.

Der letzte Schritt besteht darin, die biologisch abbaubaren Membranen auf ein 3D-Modell der verwundeten Hornhaut zu legen, um ihre mögliche Verwendung als Geräte zur Hornhautregeneration zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen die Vielseitigkeit des Einsatzes von additiven Fertigungstechniken und Elektrospinnen zur Herstellung komplexer Membranen mit Mikrotaschen, die bis zu einem gewissen Grad die natürliche Stammzellnische nachahmen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Vielseitigkeit.

Da die nicht biologisch abbaubaren Formen mit einer Vielzahl von Herstellungstechniken neu hergestellt werden können, wäre diese Methode sowohl in der Herstellung als auch in der Geweberegeneration von Interesse und würde dazu beitragen, Schlüsselfragen im Zusammenhang mit dem Verhalten von Stammzellen und der Stammzellnische zu beantworten. Diese Methode zur Herstellung von mikrofabrizierten Gerüsten kann Einblicke in die Hornhautregeneration geben. Es kann auch auf andere Epithelgewebe mit Stammzellnischen wie Haut und Mundschleimhaut angewendet werden oder um andere 3D-Merkmale und Gerüste für die Entwicklung einer Vielzahl von Geweben bereitzustellen.

Sowohl der Vorsitzende Ortega als auch Thomas Patterson werden das Verfahren vorführen. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie L eins, die erste Schicht, erstellen. Dieser wird mit einem geeigneten Zeichenprogramm für einen 1,2 Zentimeter großen schwarzen Kreis zur Basis der Struktur.

Erstellen Sie als Nächstes L zwei. Die zweite Schicht zeichnet einen weiteren 1,2 Zentimeter großen schwarzen Kreis, umfasst aber sechs bis acht weiße 0,5 x 0,35 Millimeter große hufeisenförmige Strukturen. Verteilen Sie die kleinen weißen Hufeisenformen innerhalb der schwarzen Kreisstruktur.

Speichern Sie L eins und L zwei im JPEG-Format, um es für die Mikrostereolithografie einzurichten. Stellen Sie zunächst die Optik des Systems ein und reinigen Sie sie sorgfältig. Geben Sie 300 Mikroliter Polyethylenglykol di acrl oder PEG D-Mischung in eine Vertiefung einer 12-Well-Gewebekulturplatte.

Die Vertiefung sollte mit Teflon oder einem anderen Antihaftmaterial vorbeschichtet sein oder die Struktur leicht entfernen lassen. Schalten Sie nach dem Aushärten den blauen Laser ein und laden Sie L one in die Basissoftware ALP three hoch. Diese Software ist eine USP-Schnittstelle, die die Verbindung zwischen dem PC und dem digitalen Mikrospiegelgerät herstellt.

Bestrahlen Sie die erste Schicht 60 Sekunden lang. Geben Sie in die Vertiefung 250 Mikroliter mehr von dem Peg da. Laden Sie L zwei hoch und bestrahlen Sie L zwei für 60 Sekunden.

Entfernen Sie das nicht ausgehärtete Polymer und waschen Sie die Ringe über Nacht mit Isopropanol. Erstellen Sie am Tag vor dem Elektrospinnen einen statischen Elektrospinnkollektor, indem Sie die PEG DA-Ringe auf einem galvanisierten 12 Zentimeter x 20 Zentimeter großen Aluminiumblech verteilen. Befestigen Sie die Ringe mit leitfähigem Kohleband. Bereiten Sie die Polylactid-Co-Glyko- oder PLGA-Lösung vor und rühren Sie sie über Nacht um, bevor Sie sie am nächsten Tag verwenden.

Legen Sie vier Fünf-Milliliter-Spritzen mit stumpfen Nadeln mit einem Innendurchmesser von 0,8 Zentimetern auf eine Spritzenpumpe. Anstelle einer einzigen Spritze werden vier Spritzen verwendet. Um ein schnelleres Elektrospinnen zu gewährleisten, werden 2,5 Milliliter der PLGA-Lösung in jede Spritze geladen.

Für den Erfolg dieses Verfahrens ist es wichtig, die Laro-Pinin-Variablen so konstant wie möglich zu halten. Lassen Sie zwischen den Nadeln und dem Sammler einen Abstand von 15 Zentimetern. Stellen Sie eine Durchflussmenge von 30 Mikrolitern pro Minute und Spannungen im Bereich von 12 bis 15 Kilovolt für den Elektrospinn Elektrospinn für eine Stunde und 30 Minuten ein.

Wenn das Elektrospinnen abgeschlossen ist, ziehen Sie das PLGA-Elektroschwammblech vorsichtig vom Kollektor ab, der die PEG-Da-Ringe trägt. Die PEG DA-Ringe können als Schablonen für das Elektrospinnen wiederverwendet werden. Schneiden Sie die Elektrogerüste mit einem kreisförmigen Locher in Kreise mit einem Durchmesser von 22 Millimetern.

Die Ringstruktur wird in der Mitte positioniert, um die PLGA-Membranen für die Langzeitlagerung vorzubereiten. Montieren Sie jedes in einem kleinen Behälter, z. B. einer Petrischale aus Plastik, und legen Sie es in eine medizinische Tasche. Legen Sie drei Beutel Trockenmittel in den medizinischen Beutel.

Legen Sie dem Beutel eine im Handel erhältliche Feuchtigkeitsanzeigekarte mit sechs Punkten bei. Dadurch wird eine eventuelle Feuchtigkeitsansammlung während der Lagerzeit erkannt. Verwenden Sie eine Vakuumiermaschine, um den Beutel zu vakuumieren und zu versiegeln.

Anschließend werden die PLGA-Membranen an eine externe Firma geschickt, um das Gamma oder die Strahlung vor der Lagerung zu erhalten. In diesem Experiment werden limbale Auberginen von Kaninchen aus Kaninchenaugen isoliert, die von einem Bauernhof stammen, auf dem Kaninchen für den Verzehr gezüchtet werden. Desinfizieren Sie zuerst die Kaninchenaugen mit einer 3%igen antiseptischen Lösung.

Reinigen Sie anschließend die Augen, indem Sie überschüssiges Gewebe um die Hornhaut herum entfernen. Die limbale Region ist als dünner kreisförmiger Bereich zwischen der transparenten Hornhaut und der weißen Sklera zu erkennen. Trennen Sie die limbale Region vom Rest der Hornhaut.

Schneiden Sie die Limbusregion in etwa 1,5 Zentimeter lange Segmente und desinfizieren Sie die Limbussegmente eine Minute lang in einer 1,5%igen antiseptischen Lösung. Schneiden Sie nach der Desinfektion mit einer Skalpellklinge die Limbussegmente in kleine Stücke. Lagern Sie die kleinen Gewebestücke in DMEM plus glut max Medium bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid oder maximal eine Stunde vor der Verwendung.

Um diesen Vorgang zu starten, beschichten Sie die Ringmembranen mit einem Zellschaber mit 15 Mikrolitern Fibrillinkleber. Verteilen Sie das Fibrillin gleichmäßig, während Sie unter einem Präpariermikroskop arbeiten. Verwenden Sie eine 25-Gauge-Nadel, um die limbalen Explantate direkt auf den PLGA-Mikrotaschen zu platzieren.

Platzieren Sie die Ringe mit dem Gewebeexplan auf die zuvor vorbereitete entblößte Hornhaut. Mit dem Explan nach oben und bei der Grenzfläche zwischen Luft und Flüssigkeit wird der PLGA-Ring schnell benetzt und nimmt die Form des Hornhautmodells an. Bewahren Sie die Organkulturmodelle vier Wochen lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid auf, wechseln Sie das Medium alle zwei Tage.

Die Mikrostereolithographie ermöglicht die Herstellung von PEG DA-Ringen unterschiedlicher Größe und die gleichzeitige Einarbeitung von Mikromerkmalen. Die Ringe können reproduzierbar hergestellt und wiederverwendet werden und lassen sich einfach an einem Blech befestigen, das als Elektrospinnkollektor verwendet werden kann. In diesem Beispiel enthalten die Ringe Hufeisen-Mikromerkmale.

Durch Elektrospinnen werden dann PLGA-Repliken hergestellt, die Vakuumverpackung der PLGA-Membranen verbessert deren Langzeitlagerung auch bei 37 Grad Celsius unter bewusst feuchten Bedingungen erheblich. Auch die Art des verwendeten Beutels wirkt sich auf die Stabilität der Membran aus: Rasterelektronenmikroskopie und die Untersuchung der drei Diskanten zeigen keine Veränderungen der Faserintegrität oder der Feuchtigkeit der intakten Fasern. Zellauswuchs aus limbalen Implantaten oder unterstützt durch frisch hergestellte, biologisch abbaubare PLGA-Ringe und Ringe nach sechsmonatiger Lagerung bei minus 20 Grad Celsius.

Beim Platzieren der PLGA-Membranen auf 3D-Modellen verwundeter Hornhaut wurde der Zelltransfer nach vier Wochen erreicht. Die Bilder von H und e zeigen das neue mehrschichtige Epithel, das von den Zellen gebildet wird, die aus den auf den Nischen platzierten Explantaten hervorgehen. Die Negativkontrolle bestätigte, dass in Abwesenheit von zugesetzten Zellen kein neues Epithel gebildet wurde.

Im Vergleich zu einem herkömmlichen Hornhautepithel, das bei einer frischen Kaninchenhornhaut als Positivkontrolle verwendet wurde. Die Immunzytochemie zeigte, dass es sich bei den Zellen, die aus den Implantaten herauswuchsen, um Hornhautepithelzellen handelte, da sie positiv für Cytokeratin drei, einen Marker für die Hornhautdifferenzierung, waren. Da die Elektrospinnkollektoren, die die nicht biologisch abbaubaren Schablonen enthalten, wiederverwendbar sind, kann die Herstellung der Gerüste in zwei Stunden erfolgen, wenn das Protokoll optimiert ist.

Diese Technik ermöglicht es Forschern auf dem Gebiet des Tissue Engineering, eine neue Methode zur Herstellung komplexer Tissue-Engineering-Membranen zu erforschen, die Mikromerkmale enthalten, in denen das Zellverhalten untersucht werden kann. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine nicht abbaubare mikrofabrizierte Vorlage erstellen, indem Sie additive Fertigungstechniken oder ähnliche Ansätze wie die Modellierung verwenden und wie Sie Elektrospinnen verwenden, um Ihre Gerüste komplexer zu machen.