Die Kombination von Magnet Sortierung der Mutterzellen und Fluktuation Tests zu Genominstabilität Während mitotischen Zellalterung in Analysieren Saccharomyces cerevisiae

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, zu bestimmen, ob Veränderungen in den Mutationshäufigkeiten mit erhöhter Replikativität. Das Alter der Hefezellen ist einfach auf zusätzliche Zellteilungsrunden oder auf altersspezifische Veränderungen der Raten akkumulierender Mutationen zurückzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Mutationshäufigkeiten und -raten in jungen Zellen gemessen werden, indem Zellen auf selektive und nicht-selektive Medien verteilt werden, um eine vorhergesagte Mutationshäufigkeit für Zellen zunehmenden Alters aufgrund der Mutationsakkumulation mit jeder Runde der Zellteilung zu berechnen.

Als nächstes wird eine Hefezellpopulation mit Biotin markiert, das in Flüssigkulturen gezüchtet wurde, und die ursprünglich markierten Zellen werden durch magnetische Sortierung zurückgewonnen, um gealterte Mutterzellen zu erhalten, die mehrere Zellteilungen durchlaufen haben. Dann werden gealterte Mutterzellen entweder nachwachsen lassen, um ihr Alter zu erhöhen, und dann wieder sortiert oder auf Po-Narben gefärbt und dann auf selektive und nicht-selektive Medien verteilt, um ihr durchschnittliches replikatives Alter und ihre Mutationshäufigkeit zu bestimmen. Es erhalten Ergebnisse, die zeigen, ob es eine altersspezifische Zunahme oder Abnahme der akkumulierenden Mutationen gibt, basierend auf einem Vergleich der experimentell beobachteten Mutationshäufigkeit mit der vorhergesagten Mutationshäufigkeit für Zellen der beobachtetes Durchschnittsalter. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet des Alterns zu beantworten, z. B. ob Veränderungen in den Raten akkumulierender genetischer Schäden zum normalen Altern beitragen oder ob die lebensdauerverändernde Wirkung verschiedener genetischer und Umweltfaktoren zum Teil auf Änderungen der Mutationsraten zurückzuführen ist.

Melissa Patterson, eine Doktorandin in meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren, um eine Basismutationsrate pro Zellgeneration mit Hilfe von Fluktuationstests für Zellen zu ermitteln, die unter Standardkulturbedingungen gezüchtet wurden. Für jede Replikatkultur verdünnen Sie die Zellen um ein bis 2000 und verteilen Sie sie um ein bis vier Mikroliter auf nicht-selektives Medium, um die koloniebildenden Einheiten pro Milliliter zu bestimmen. Die verbleibenden Zellen werden eine Minute lang bei 2.400 g in einer Mikrozentrifuge pelletiert und mit 100 Mikrolitern Wasser resuspendiert, bevor sie auf selektivem Medium verteilt werden, um Mutanten zu identifizieren.

Nachdem Sie die Platten drei Tage lang bei 30 Grad Celsius inkubiert haben, zählen Sie die Kolonien, bestimmen Sie die anfängliche Mutationsrate und -häufigkeit gemäß dem begleitenden Textprotokoll, um charmy CCI mit Biotin zu markieren. Beginnen Sie damit, die Kultur aus einem Glycerinstamm auf YPD-Medium zu streichen und ein bis drei Tage lang bei 30 Grad Celsius zu inkubieren. Mit einer sterilen Pipettenspitze werden die Zellen von der Platte auf mindestens einen Milliliter Wasser übertragen. Denken Sie daran, dass ein bis eineinhalb Zentimeter eines dick gewachsenen Teils des Streifens etwa 10 auf die acht Zellen bringen.

Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die genaue Zelldichte für jeden Stamm oder jede Behandlungsbedingung zu bestimmen. Verwenden Sie einen fünf Millimolare Biotin-Reagenzien, um 10 bis acht Zellen pro Entnahmestelle gemäß dem Standardverfahren des Herstellers zu markieren. Führen Sie alle Zentrifugationsschritte nach der letzten Wäsche fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius durch.

Verwenden Sie Wasser, um die markierten Zellen auf eine Endkonzentration von 10 bis acht Zellen pro Milliliter zu suspendieren, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu überprüfen: Verdünnen Sie 10 Mikroliter Zellen mit 23 Mikrolitern Wasser und 67 Mikrolitern 0,4 % Triamblau, inkubieren Sie die Zellen 40 Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie ein Hämozytometer verwenden, um lebende oder ungefärbte und tote oder gefärbte Zellen zu bewerten. Nach der Messung der Ausgangswerte für das Zellalter und die Mutationshäufigkeit gemäß dem Textprotokoll werden die mit Biotin markierten Zellen auf 20 Milliliter YPD-Medium übertragen. Stellen Sie sich den acht Zellen vor.

Züchten Sie die Kulturen für 16 bis 18 Stunden bei 20 Grad Celsius auf etwa 10 bis acht Zellen pro Milliliter. Lassen Sie die Zellen nicht in die stationäre Phase gelangen und halten Sie die Zellen gegebenenfalls mehrere Stunden lang bei vier Grad Celsius, um das Timing der Wachstumsphase und der Entnahme zu optimieren. Nach der Bestimmung der Zelldichte und dem Pelletieren der Zellen bei vier Grad Celsius waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 30 Millilitern Bead-Markierung, Puffer und Vortexing, dann schleudern Sie die Suspension und gießen den Überstand ab.

Nach einer zweiten Wäsche suspendieren wir die Zellen in 50 Mikrolitern Bead-Labeling-Puffer. Tun Sie so, als würden Sie die acht Zellen insgesamt durch Vortexen betrachten. Fügen Sie zwei Mikroliter magnetische Kügelchen hinzu, geben Sie den insgesamt acht Zellen vor und inkubieren Sie nach dem Vortexen 10 Minuten lang auf Eis und invertieren Sie sie periodisch.

Verwenden Sie anschließend 30 Milliliter Bead-Labeling-Puffer, um die Zellen dreimal zu waschen. Fügen Sie dann 0,5 Milliliter Bead-Labeling-Puffer hinzu. Stellen Sie sich auf die insgesamt acht Zellen vor und wirbeln Sie das Pellet kurz auf mittlerer Stufe, bis die Zellen wieder suspendiert sind.

Gießen Sie die Suspension durch ein 40-Mikron-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen, um alle verbleibenden Zellklumpen zu entfernen. Lassen Sie die Zellen bei Bedarf ein bis zwei Stunden auf Eis, bevor Sie sie auf die Säule laden. Befolgen Sie das vom Hersteller empfohlene Protokoll für die magnetischen Säulen mit bis zu zweimal 10 bis neun Zellen pro Minute.

Achten Sie darauf, beim Beladen der Säulen alle luftbaren Elemente zu entfernen, und entfernen und ersetzen Sie die Säule am Separator zwischen den Wäschen, um zu verhindern, dass Zellen zwischen den Kügelchen eingeschlossen werden. Wenn Sie Mehrsäulenseparatoren für die Verarbeitung mehrerer Säulen derselben Probe verwenden, eluieren Sie sie alle in dasselbe Sammelröhrchen, um die Handhabungszeit zu verkürzen und den Verlust von Zellen zu verringern, falls gewünscht. Sparen Sie sich den Durchfluss von den Bindungs- und Waschschritten, um junge Zellen zu analysieren, die von den Mutterzellen produziert werden, nachdem die Zellen durch Zentrifugation bei 3000 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius konzentriert wurden, und aspirieren Sie alle bis auf einen Milliliter Puffer.

Tun Sie so, als wären es die acht ursprünglichen Biotin-markierten Zellen. Dann kurz vortexen, um die Zellen im restlichen Puffer zu suspendieren. Verwenden Sie Triamblau, um ein Aliquot verdünnter Zellen zu färben, und verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zelldichte und Lebensfähigkeit zu bestimmen.

Berechnen Sie dann die Gesamtzahl der wiederhergestellten Zellen. Wenn die Anzahl der Zellen wesentlich höher ist als erwartet, führen Sie die Elutionsprobe durch eine andere Säule, um zu versuchen, kontaminierende junge Zellen zu entfernen. Wenn die Anzahl der Zellen wesentlich geringer als erwartet ist, übergeben Sie den gespeicherten Fluss.

Probieren Sie durch eine weitere Säule, um zu versuchen, die Ausbeute der Mutterzellen zu verbessern, falls gewünscht. Lassen Sie Zellen nachwachsen, um das replikative Alter zu erhöhen, und folgen Sie der Bead-Markierung und -Sortierung ohne Biotin-Markierung. Um das replikative Alter zu bestimmen, geben Sie 25 Mikroliter der zurückgewonnenen Zellen in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und verwenden Sie einen Milliliter eines XPBS, um die Zellen zweimal zu waschen, um Knospennarben auf der Oberfläche der Zellen zu markieren.

Verwenden Sie 180 Mikroliter eines XPBS und 20 Mikroliter fluoreszierend konjugiertes WGA zur Resuspendierung der Zellen, decken Sie das 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit Folie ab und inkubieren Sie nach der Inkubation 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius unter leichtem Schaukeln. Verwenden Sie ein XPBS, um die Zellen dreimal zu waschen. Verwenden Sie dann für die Fluoreszenzmikroskopie ein Antifa-Reagenz, um die Zellen auf Objektträger zu montieren, um Zellbewegungen während der Bildgebung zu vermeiden.

Härten Sie die Objektträger bis zu einigen Tagen im Dunkeln vollständig aus. Zählen Sie die Knospennarben von mindestens 50 Zellen pro Probe, um ein repräsentatives Maß für das Zellalter zu erhalten. Alternativ können Sie nach dem Suspendieren der Zellen in einem XPBS eine Durchflusszytometrie mit den Einstellungen durchführen, die im Textprotokolldiagramm skizziert sind. Knospennarben an jungen Zellen und Alterszellen, die durch Mikroskopie auf der Y-Achse gegen das normalisierte geometrische Mittel der WGA-konjugierten Fluoreszenz aus denselben Zellpopulationen auf der x-Achse gezählt werden.

Erhält man schließlich die Gleichung einer linearen Trendlinie für diese Beziehung Zur anschließenden Substitution konjugiert das normierte geometrische Mittel von WGA die Fluoreszenzintensität einer Zellpopulation für X in der Gleichung und löst sich nach Y auf, um das durchschnittliche Zellalter einer Probe zu bestimmen. Diese Grafik zeigt, dass die Mutationsrate im Can One-Gen vor und nach der Biotin-Markierung ähnlich war. In unabhängigen jungen Hefepopulationen waren die Mutationshäufigkeiten auch in jungen Zellen vor und nach der Biotin-Markierung ähnlich, wenn sie entweder bei 20 Grad Celsius oder 30 Grad Celsius gezüchtet wurden. Die hier gezeigte Grafik zeigt, was bei der Zählung von zurückgewonnenen Zellen nach Biotinmarkierung und Sortierung von unbehandelten Zellen oder von Zellen, die nach der ersten Sortierung mit einem millimolaren Wasserstoffperoxid behandelt wurden, beobachtet werden kann.

Die Anzahl der Zellen kann nach der ersten Sortierung höher erscheinen als erwartet, und bei fortgesetzter Sortierung ist ein geringer fortschreitender Zellverlust zu erwarten. Das replikative Alter wurde durch manuelles Zählen von fluoreszenzmarkierten, aber Narben auf Zellen bestimmt, wie hier gezeigt, wie in dieser Abbildung zu sehen. Das Fluoreszenz-, aber Narbensignal aus der Durchflusszytometrie wurde mit manuellen Zählungen verglichen, um eine lineare Beziehung zu erhalten, die es ermöglicht, das replikative Alter der Mutter- und Kontrollzellpopulationen durch Durchflusszytometrie zu bestimmen.

Diese Diagramme zeigen Beispiele für ähnliche oder erhöhte beobachtete Mutationshäufigkeiten gealterter Mutterzellen im Vergleich zu den vorhergesagten Häufigkeiten, die aus dem Durchschnittsalter der Mutterzellen und den Mutationshäufigkeiten und -raten für junge Zellpopulationen berechnet wurden. Abhängig von der genomischen Lage der kann ein Gen Nach diesem Verfahren. Andere Methoden, wie die Färbung für reaktive Sauerstoffspezies oder die ulare Morphologie, können verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche Veränderungen in der Zellphysiologie mit altersbedingten Veränderungen in der Mutationsakkumulation verbunden sind.