Name: Die Kombination von Magnet Sortierung der Mutterzellen und Fluktuation Tests zu Genominstabilität Während mitotischen Zellalterung in Analysieren Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Erfahren Sie, wie Magnet-Sortierung und Fluktuationstests genutzt werden, um Genominstabilität während der mitotischen Zellalterung in Saccharomyces cerevisiae zu analysieren. Diese Methode erlaubt präzise Vergleiche vorhergesagter und beobachteter Mutationsfrequenzen.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch Gewährung R00AG031911 aus dem National Institute on Aging der National Institutes of Health unterstützt zu PHM Der Inhalt dieses Artikels gibt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health.

1. Herstellung der Medien und Lösungen <ol><li> Wachsen Zellen unter Verwendung von Hefeextrakt-Pepton-Glukose (YPD) reichen Medium für die Standard-Protokoll. Bereiten Sie eine 2% Bacto-Pepton, 1% Hefeextrakt, 2% Glucose-Lösung für YPD-Medium und mit 2% Bacto-Agar für Festmedium 19. Autoklaven sterilisieren. Verwenden Sie ein alternatives Medium, falls erforderlich, um eine bestimmte Wachstumsbedingung oder mutierte Hefestamm testen. </li><li> Machen festen Kunst komplette Medium ohne Arginin mit 60 mg / L Canavanin (SC-arg + Canavanin), die für Canavanin resistenten Mutanten zu wählen. Bereiten Sie eine Lösung, die 0,67% Bacto-Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren, 2% Glucose, 0,2% komplette Ergänzung Mischung ohne Arginin (Dropout-mix), und 2% Bacto-Agar 19 ist. Autoklaven und cool vor der Zugabe Canavanin von einer 20 mg / ml Stammlösung (steril filtriert, bei 4 ° C gelagert) 19. <ol><li> Machen festen Kunst komplette Medium mit 5-Fluororotsäure (5-FOA). Bereiten 500ml einer Lösung, die 1,34% Bacto-Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren, 4% Glucose, 0,4% abgeschlossen Ergänzungsgemisches und 0,2% 5-FOA und Filter-sterilisiert 19. Autoklaven 500 ml einer 4% Bacto-Agar-Lösung, cool kurz, und dann mit dem 500 ml steril filtriert Nährlösung mischen. Verwenden Sie geeignete alternative Medien für andere Mutationsassays. </li></ol></li><li> Für Biotin-Markierung, stellen 500 ml 1x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)-Lösung enthält 137 mM Natriumchlorid, 2,7 mM Kaliumchlorid, 10.14 mM Dinatriumhydrogenphosphat und 1,77 mM Kaliumhydrogenphosphat, pH 8. Lagerung bei 4 ° C und halten Sie auf Eis während des Gebrauchs. </li><li> Machen Sie eine frische 5 mM Biotin Lager in sterilen, hochreinem Wasser. </li><li> Zu löschen Biotin-Markierung, stellen 500 ml 1x PBS, 100 mM Glycin. Lagerung bei 4 ° C und während der Verwendung auf Eis zu halten. </li><li> Abhängig von der Anzahl von Zellen verwendet und die Dauer des Experiments, stellen 1-2 L des Wulst-Markierungspuffer, enthaltend 1 × PBS, 2 mM EDTA, 0,5% Bovine Serumalbumin. Filter sterilisieren und de-Gaspuffer. Lagerung bei 4 ° C und während der Verwendung auf Eis zu halten. </li><li> Bereiten Sie eine 0,4% Trypanblau-Lösung in 1x PBS, Filter zu sterilisieren, und lagern bei RT für den Einsatz in der Lebensfähigkeit der Zellen-Messungen. </li><li> Aliquot kleinen Volumina (~ 100 ul) einer Weizenkeim-Agglutinin (WGA) fluoreszierendes Konjugat bei -20 ° C in Folie (oder opak) Mikrozentrifugenröhrchen für die Verwendung bei der Bestimmung Zellalter zu speichern. </li></ol> 2. Bestimmung der Mutationsrate und Frequenz <ol><li> Stellen Sie eine Baseline-Mutationsrate pro Zelle Generation mit Fluktuation Tests für Zellen unter Standardkulturbedingungen gewachsen. Wachsen sieben bis elf replizieren 1 ml Kulturen von einer Anfangsdichte von 1.000-5.000 Zellen / ml bis zur frühen stationären Phase (~ 10 8 Zellen / ml). <ol><li> Für jede Wiederholung Kultur, verdünnte Zellen 1: 2.000 und verteilt 1-4 ul auf nicht-selektiven Medium (YPD) an Kolonie-bildenden-Einheiten / ml zu bestimmen. Pellet restlichen Zellen bei ~ 2.400 xg für 1 min in einer Mikro und resuspendieren in 100 ul Wasser auf selektiven Medium zu verbreiten, um Mutanten zu identifizieren. Inkubation erfolgt für drei Tage bei 30 ° C vor dem Zählen der Kolonien (einzustellen Inkubationszeit bezogen auf die Wachstumsrate von Zellen erforderlich). </li><li> Bestimmung der Anzahl von unabhängigen Mutationen (m), die basierend auf der Anzahl der Mutantenkolonien (r) auf selektivem Medium erhalten werden, in dem Prozess aufgetreten. Verwenden Sie die Lea-Coulson Median Schätzer m durch Einsetzen der Median der Anzahl der Mutantenkolonien für r in der Formel unter 9 zu finden. Dann Ersatzwerte für m, bis die linke Seite der Gleichung ist praktisch Null. <img alt="Gleichung 1" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51850/51850eq1.jpg"></li><li> Um zu bestimmen, Mutationsrate, berechnen wir zuerst die durchschnittliche Anzahl an lebensfähigen Zellen auf einem selektiven Medium verteilt, indem die durchschnittliche Koloniebildungseinheiten / ml der Replika-Kulturen und das Volumender Kultur in ml Ausbreitung auf Selektivmedium. Teilen Sie die m-Wert aus Schritt 2.1.2 dieses durchschnittliche Anzahl der lebensfähigen Zellen, die Mutationsrate pro Zelle Generation zu erhalten. </li></ol></li><li> Individuell berechnen die Anzahl der lebensfähigen Zellen auf Selektivmedium für jede Wiederholung Kultur in einer Studie aus, wie in Schritt 2.1.3 beschrieben. Teilen die Anzahl der Mutantenkolonien (r) durch die Anzahl der lebensfähigen Zellen auf einem selektiven Medium verteilt, um die Mutationshäufigkeit zu erhalten, für eine Kultur erhalten. Verwenden Sie von den Replika-Kulturen in Schritt 2.1 als Basis Mutationsfrequenz der Durchschnitt oder Median der einzelnen Mutationshäufigkeiten. </li><li> Machen Frequenzmessungen vor und nach der Markierung mit Biotin-Zellen (Schritte 3.2 und 3.4), um zu bestimmen, ob die Markierungsschritt führt zu einer Änderung der Häufigkeit von Mutationen, die müssen berücksichtigt werden, wenn die Prüfung auf altersspezifische Veränderungen Mutation Akkumulation werden. </li></ol> 3. Biotin Labeling <ol><li> Streak S. cerevisiae aus einem Glycerin-Stamm bei -80 ° C auf YPD-Medium und Inkubation bei 30 ° C für 1-3 Tage. </li><li> Mit einer sterilen Pipettenspitze, Transferzellen aus dem Streifen Platte auf 1 ml (oder mehr) von Wasser unter Berücksichtigung, dass 1-1,5 cm dick gewachsen eines Teils der Streifen geben etwa 10 8 Zellen. Festzustellen, genaue Zelldichte mit einer Zählkammer. </li><li> Etikett 10 8 Zellen pro Stamm (oder Behandlungsbedingungen) pro Sammelpunkt, an dem Mutationsfrequenz ermittelt werden, bzw. eine Populationsgröße ausreicht, um mindestens 5-10 Mutantenkolonien pro Abtastung auf selektivem Medium zu erhalten (bezogen auf Mutationsfrequenz von Schritt 2.2). Eine zusätzliche 10 8 Zellen für die Baseline-Messungen pro Stamm / Zustand. </li><li> Biotin-Markierung nach Standardverfahren vom Hersteller, außer mit einem 5 mm Biotinreagens Lager und während der Inkubation sanft schaukeln. Spin für 5 min bei 4 ° C bei 3.000 xg für alle Zentrifugationsschritte, seit Spinnen bei Temperaturen von mehr als 4 ° C kann zu einem erhöhten Zellverlust führen. Nach dem letzten Waschschritt auszusetzen Zellen bis zu einer Konzentration von 10 8 markierten Zellen / ml in Wasser. </li><li> Überprüfen Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung von Trypanblau-Färbung. Verdünnen 10 ul der Zellen mit 23 ul Wasser und 67 ul von 0,4% Trypanblau in 1x PBS. Inkubation für mindestens 40 min bei RT erzielte Live (ungefärbten) und toten (gebeizt) Zellen mit einer Zählkammer. </li><li> Messen Sie die Ausgangswerte für die Genominstabilität, Zell Alter und anderen relevanten Eigenschaften (siehe Abschnitte 5, 6 und 7). </li><li> Übertragen Biotin-markierten Zellen zu 20 ml YPD-Medium pro 10 8 Zellen in einen Erlenmeyerkolben (etwa 5 x 10 6 Zellen / ml). Kultur wachsen (s) 16-18 h bei 20 ° C bis zu einer Dichte von etwa 10 8 Zellen / ml (vier vor fünf Zellgenerationen), aber nicht zulassen, Zellen die stationäre Phase erreichen. Verwenden Sie einen kürzeren Inkubationszeit für Wachstum bei 30 ° C. Halten Biotin-markierten cEllen bei 4 ° C für mehrere Stunden vor der Zugabe zum Medium, falls erforderlich, um die Zeit der Wachstumsperiode und Sammlung zu optimieren. </li></ol> 4. Bead Kennzeichnung und magnetische Sortierung <ol><li> Nach der Wachstumsphase Ein Aliquot der Kultur die Zelldichte zu bestimmen, mit einer Zählkammer. Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 4 ° C bei 3000 x g. Überstand abgießen. </li><li> Waschen Sie die Zellen durch Vortexen zu Pellet in 30 ml Wulst-Markierungspuffer suspendieren, dann Zentrifugieren und Abgießen Überstand, wie in Abschnitt 4.1. Waschen wiederholen. </li><li> Voll Zellen in 50 ul Wulst-Markierungspuffer pro 10 8 Zellen insgesamt durch Wirbeln. Add 2 ul magnetische Perlen pro 10 8 Zellen insgesamt und Wirbel kurz zu mischen. Inkubieren auf Eis für 10 min, Invertierung regelmäßig zu mischen (aus einer Online-Protokoll auf veränderte <a href="http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf">http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf &lt;</a>/ A&gt;). </li><li> Mit 30 ml Kügelchen-Markierungspuffer waschen Zellen dreimal. </li><li> 0,5 ml Wulst-Markierungspuffer pro 10 8 Zellen insgesamt und kurz Wirbel Pellets auf mittlere Einstellung nur, bis die Zellen werden suspendiert. Gießen durch ein 40 um Zellsieb in ein 50 ml-Röhrchen, um alle verbleibenden Zellklumpen zu entfernen. Bei Bedarf lassen Zellen auf Eis für 1-2 Stunden vor dem Laden auf die Säule. </li><li> Folgen Sie der vom Hersteller empfohlenen Protokoll für die magnetischen Spalten zu binden, zu waschen und zu eluieren die magnetischen Kügelchen markiert Mutterzellen. Für eine erhöhte Rückgewinnung von markierten Zellen, verwenden Sie mindestens eine Spalte pro 2 x 10 9 Zellen insgesamt. <ol><li> Entfernen Sie alle Blasen, die beim Laden von Spalten, wie sie Fluss blockieren auftreten. Entfernen und ersetzen Sie die Spalte auf der Trennlinie zwischen wäscht, um Zellen aus immer zwischen den Perlen (von einem Online-Protokoll geändert am eingeschlossen werden <a href="http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf">http://www.sysbio.org/dataresources/user</a>manual031113.pdf). </li><li> Speichern Durchfluß von Bindung und Waschschritte zu jungen Zellen von den Mutterzellen produziert analysieren, falls gewünscht. Konzentrat-Zellen, wie in Schritt 4.7 beschrieben. </li><li> Verwenden Sie Multi-Spalten-Separatoren für die Verarbeitung mehrerer Proben auf einmal. Eluat in mehreren Spalten der gleichen Probe in der gleichen Sammelröhrchen zu reduzieren und die Bearbeitungszeit zu verringern Verlust von Zellen. </li></ol></li><li> Konzentriert eluiert Mutterzellen durch Zentrifugieren bei 3000 × g für 5 min bei 4 ° C ist. Saugen Sie alle, aber 1 ml pro 10 8 Original-Biotin-markierte Zellen zu puffern. Wirbel kurz, um Zellen in Restpuffer auszusetzen. </li><li> Einen aliquoten von Zellen und färben mit Trypanblau, um die Zelldichte und die Lebensfähigkeit der Zellen mit einer Zählkammer bestimmen (siehe Schritt 3.5). Berechnen der Gesamtzahl der Zellen gewonnen. <ol><li> Wenn die Anzahl der Zellen wesentlich höher ist als erwartet, passieren die Probe durch Elution einer anderen Spalte zu versuchen, verunreinigende jungen Zellen.Wenn die Anzahl der Zellen ist wesentlich geringer als erwartet, übergeben Sie die gespeicherte Fluss durch Probe durch eine andere Spalte, um zu versuchen, um die Ausbeute Mutterzellen zu verbessern. </li></ol></li><li> Verwenden Zellen für weitere Analysen, wie in den Abschnitten 5 und 6. Alternativ beschrieben, die Zellen in YPD-Brühe wieder wachsen, um ihre replikativen Alter (Schritt 3.7) zu erhöhen, und folgen Sie durch Wulst Kennzeichnung und Sortierung (Schritte 4.1-4.8.1), ohne die müssen die Biotin-Markierung zu wiederholen. </li></ol> 5. Bestimmung der Replikative Alter <ol><li> Spin-Zellen für 2 min bei 5.000 × g bei RT für alle Schritte in diesem Abschnitt. Setz 25 ul gewonnenen Zellen (~ 10 8 Zellen / ml) in ein 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen und wasche zweimal mit 1 ml 1 × PBS. Überstand absaugen. <ol><li> Tauwetter ein Aliquot der WGA-Konjugat, Vortex mischen und Spin kurz auf Proteinaggregate zu beseitigen. Aussetzen Zellen in 180 ul 1x PBS und 20 ul WGA einem fluoreszierenden Molekül konjugiert Sprossnarben auf der Oberfläche des Etikett-tenE-Zellen. Decken Sie die 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit Folie und Inkubation unter leichtem Schütteln bei 30 ° C für 30 min. </li><li> Dreimal mit 1 ml 1X PBS waschen. </li></ol></li><li> Für Fluoreszenz-Mikroskopie, Etiketten Rutschen und montieren pro Standard-Protokoll mit einem Anti-Fade-Agent. Folien in der Dunkelheit (bis zu ein paar Tagen) vollständig aushärten, bevor Dichtungsdeckglas, um die Zellbewegung während der Bildgebung zu vermeiden. Graf Knospe Narben auf mindestens 50 Zellen pro Probe, um eine repräsentative Messung der Zellalter zu erhalten. Speicher Folien für bis zu 1 Monat für die Anzeige Knospe Narben, wenn nötig. <ol><li> Alternativ bestimmt die Intensität des Fluoreszenzsignals von der WGA-Konjugat durch Ausführen der Durchflusszytometrie auf die Zellen in 1 ml 1 × PBS nach Schritt 5.1.2 suspendiert. Verwenden Sie ein 405 nm Anregungslaser und 530/30 nm Emissionsfilter mit einem 505 nm Langpassfilter für WGA-Alexa 488. Fügen Sie eine ungefärbte Kontrolle für jede Sammelstelle. </li></ol></li><li> Graph Knospe Narben auf junge Zellen und gealterten Zellen mikroskopisch auf die gezähltey-Achse gegen die normalisierten geometrischen Mittelwert (Bunt geometrischen Mittelwert / ungefärbten geometrischen Mittelwert) der WGA-Fluoreszenz-Konjugat aus der gleichen Zellpopulationen auf der x-Achse. Erhalten die Gleichung einer linearen Trendlinie für diese Beziehung. Für nachfolgende Experimente, ersetzen die normalisierten geometrischen Mittels der WGA-Konjugat Fluoreszenzintensität einer Zellpopulation für x in der Gleichung zu lösen und für y die durchschnittliche Zell Alter einer Probe zu bestimmen. </li></ol> 6. Mutationsfrequenz <ol><li> Verbreitung sortiert Mutterzellen in Puffer von Schritt 4.7 auf YPD-Medium und selektive Medium resuspendiert, wie in Schritt 2.1.1 beschrieben. Verwenden Sie 1 ml resuspendiert Mutterzellen zur selektiven Medium und Spin-Zellen bei 5.000 g für 1 min. HINWEIS: Verbreiten Sie größere Mengen verdünnten Zellen auf YPD-Medium, wie Zellen zu erhöhen, um in Alter für immer mehr nicht-lebensfähige und seneszenten Zellen in älteren Bevölkerungsgruppen auszugleichen. <ol><li> Inkubieren YPD-Medium und selektive Medium-Platten ausSchritt 6.1 bei 30 ° C für 3 und 4 Tagen. Erhöhen Inkubationszeit bis zu einer Woche für sehr alte Zellen oder langsam wachsende Sorten. Berechnen Mutationsfrequenz wie in Schritt 2.2 beschrieben. </li></ol></li></ol> 7. Berechnung vorhergesagte Mutationsfrequenz für eine gegebene Replikative Alter <ol><li> Berechnung der durchschnittlichen Erhöhung der replikativen Alter der Biotin-markierten Zellen über den Verlauf des Experiments durch Subtrahieren des Durchschnittsalters der ersten Zellpopulation von dem Durchschnittsalter der sortierten Mutterzellen für die jeweilige Sorte. Verwenden Sie die Zelle Alter in Schritt 5.2 berechnet oder Schritt 5.2.2. </li><li> Multiplizieren die Mutationsrate in Schritt 2.1.3 durch die Zunahme der durchschnittlichen Zellalter in Schritt 7.1 berechnet erhalten. Fügen diesen Wert auf die Basislinie Mutationsfrequenz für das in Schritt 2.2 berechnet die vorhergesagte Mutationsfrequenz für Zellen des betreffenden replikativen Alter zu bestimmen Anfangspopulation. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll verbindet mehrere Methoden, um Ressourcen zu ermöglichen und Ansätze in den Saccharomyces cerevisiae Modellsystem zur Verfügung, um während der mitotischen Zellalterung effizient auf das Studium der Genominstabilität angewendet werden. Eine große Vielzahl von Assays auf unterschiedliche Formen der Genominstabilität durch phänotypische Selektion quantifizieren kann mit Magnetsortierung kombiniert werden, um mögliche altersspezifische Veränderungen Anreicherung bestimmter Formen von Mutationen oder Chromosomenveränderungen untersucht werden. Während des gesamten Genoms Sequenzierung Ansätze könnten mehr Informationen über die Gesamt Arten von Änderungen in einem Genom mit dem Alter auftreten, zu schaffen, sind die Fähigkeit, phänotypischen Selektionssysteme verwenden, um Mutationsrate Messungen zu erhalten und zu isolieren, bevorzugt bestimmte Arten von genetischen Veränderungen wichtige Vorteile für das Studium mechanistische Aspekte des Alterns bezogene Genominstabilität. Straffung der Bestimmung der Zell Alter und das Potenzial parallelen Messungen von physiologi zu machencal Veränderungen durch Durchflusszytometrie effiziente Mittel, um Genominstabilität mit anderen zellulären Veränderungen in bestimmten Altersklassen korrelieren. Festlegung der möglichen altersabhängigen Veränderungen in der Akkumulation von Mutationen Raten erfordert: 1) vorsichtig Bestimmung bei jungen Zellpopulationen, 2) eine genaue Bestimmung der Zellalter, und 3) die Fähigkeit, zuverlässig zu bereichern ausreichend große Populationen von Mutterzellen reproduzierbar messen Genominstabilität im Alter. Dieser Ansatz ermöglicht die Hefe Modellsystem, um die Definition zu Grunde liegenden Mechanismen für altersabhängige Veränderungen der Zinssätze und / oder Frequenzen der Genominstabilität in mitotisch aktiven Zellen verantwortlich beitragen. Weiterhin können genetische und Umweltfaktoren schnell für Beiträge zu altersabhängigen Genominstabilität zu beurteilen. Letztlich könnten diese Charakterisierungen, die Entwicklung von Modellen, die für die Art und Weise, in der Mutationen während der replikativen Alterung akkumulieren Konto führen. Dieses Verfahren hängt von der Fähigkeit, Mutationen oder andere Arten von Genominstabilität durch das Auftreten von Selektionsphänotypen erfassen Raten solcher Ereignisse zu messen. Allerdings kann Kreativität in Assay-Design erlauben viele Aspekte der Genominstabilität untersucht werden. Zum Beispiel kann das URA3 und CAN1 Gene an verschiedenen Genomorte platziert werden, um jegliche Einflüsse der genomischen Position auf die Testergebnisse. Reversion von spezifischen nicht-funktionalen Gen-Allele zu funktionellen Gen-Allele könnte insbesondere Mutationsprozesse zu testen. Auch Einführung mehrerer inaktiver Allele eines Gens oder eines Gens mit flankierenden Wiederholungssequenzen verwendet werden, um Rekombinationsereignisse durch Wiederherstellung oder Verlust der Genfunktion zu untersuchen bzw. werden. Fluktuation Tests sind die Standard-Ansatz zur Bestimmung Raten der verschiedenen Genominstabilität Ereignisse 9. Das Protokoll wird mit Hilfe der gut angenommen und relativ einfach Lea-Coulson Median-Schätzer zu bestimmen muta geschriebentionsrate es zugänglicher zu verschiedenen Forscher zu machen, auch wenn die MSS-Maximum-Likelihood-Schätzer Methode gilt als der beste Ansatz für die Bestimmung Mutationsraten 9. Die MSS-Maximum-Likelihood-Schätzer zuvor detailliert 9 überprüft, und kann als ein alternatives Verfahren verwendet werden, erfordert jedoch komplexere Berechnungen. Alternativ wurde die kostenlose Software, Mutationsraten mit dieser Methode berechnen worden verfügbaren 22 gemacht. Reproduzierbare Maßnahmen der Mutationsraten erfordert Aufmerksamkeit auf einige Aspekte der Versuchsplanung, einschließlich der Verwendung von genügend Parallel Kulturen, Impfen Kulturen niedrig genug Anfangszelldichten, die Populationsgröße steigt um 10.000-fach oder mehr, und die Auswahl geeigneter Kulturvolumina, so dass der gesamte Population von Zellen kann auf selektiven Medium verbreitet werden. Für den letzteren Punkt kann eine zuvor beschriebene Formel verwendet, um die Mutationsrate einzustellen, basierend auf dem Anteil der Kultur Teste werdend 9. Veränderung der Wachstumsrate der Kulturen kann die Bestimmung eines reproduzierbaren Mutationsrate und eine modifizierte Median-basierte Schätzer, die mehr reproduzierbare Ergebnisse in solchen Situationen wurde kürzlich beschrieben 23 ergeben kann erschweren. Die Fähigkeit zur genauen Messung der Zellalter ist ein weiterer Faktor, der wichtig für die Feststellung, ob Genominstabilität Frequenzen in alten Zellen von den Werten erwartet werden aufgrund der Ereignisrate in jungen Zellen. Wir haben gefunden, WGA-Färbung bevorzugt, weiße Färbung Calcofluor zu sein, sowohl in Bezug auf Hintergrund und Flexibilität, da WGA ist konjugiert mit verschiedenen fluoreszierenden Molekülen. Diese Flexibilität kann mehr Möglichkeiten zur gleichzeitigen Messung von anderen Zelleigenschaften mit fluoreszierenden Reagenzien bereitzustellen. Erste Arbeiten, um eine Beziehung zwischen der Signalintensität für die WGA-Färbung und der entsprechenden Zahl der Knospe Narben auf Zellen herstellen kann dann zu einem mehr führenschnelle Bestimmung von Zellalter durch Durchflusszytometrie. Dieser Ansatz ermöglicht auch die Verwendung von größeren Populationsgrößen, als es in der Regel durch Mikroskopie für eine verbesserte Reproduzierbarkeit der Messungen untersucht werden. Während alle Altersbestimmungen konnte durch mikroskopische Untersuchung der Zellen gemacht werden, fühlen wir, dass die Durchflusszytometrie Ansatz erleichtert das schnelle Screening von Faktoren, die altersabhängigen Genominstabilität beeinflussen. Neben der Messung der Zellalter zuverlässig ist zu überlegen, auf die Anzahl der Zellteilungen Mutter Zellen werden mit jeder Runde wächst und Sortieren von Zellen unterziehen sollen. Verwendung einer geringeren Anfangspopulationsgröße oder eine größere Kulturvolumen könnte es Zellen, mehr Zellteilungen vor Erreichen der gewünschten Zelldichte zu unterziehen. Zum Beispiel haben andere Forscher nur zwei Runden der Sortierung sehr alte Hefe-Zellen 16, die den offensichtlichen Vorteil des Erhaltens alten Zellen mit weniger Experime hat zu erhaltenNTAL Schritten. Bei der Prüfung, ob die Kulturvolumen zu erhöhen, um damit die Zellen mehr Zellteilungen vor der Sortierung abgeschlossen haben, denken Sie daran, die Grenze für die Gesamtzahl der Zellen, die in einer einzelnen Spalte bearbeitet werden können. Verwendung einer größeren Kulturvolumen kann die Verwendung von mehreren Spalten erfordern, um eine Zellpopulation zu sortieren. Auch, wenn Zellen durchlaufen weniger Runden der Zellteilung zwischen Arten / Sammlung Punkte, dann gibt es mehr Möglichkeiten, um Abweichungen von erwarteten Mutation Frequenzen an bestimmten Zeitpunkten während Lebensdauer zu beobachten. Zum Beispiel, Probenahme nur bei frühen und späten Zeitpunkten während Lebensdauer kann Daten, die einen stetigen Anstieg der Mutationsfrequenz, aber Abtastung mit zusätzlichen Zwischenzeiten während Lebensdauer kann schnell und dann zeigen, dass die Hochebenen Mutationsfrequenz erhöht produzieren. Da dieses Protokoll isoliert alte Mutterzellen, gibt es eine Möglichkeit, um eine direkte Messung der Veränderungen im Mutationsraten mit dem Alter zu erhalten. Fluktuation Tests könnten be unter Verwendung von Mutterzellen unterschiedlichen Alters, um zu bestimmen, ob die Mutationsrate wird von der mit jungen Zellen erhalten Satz abweichen. Während die Kulturen für diese Fluktuation Tests wird eine Mischung aus alten und jungen Zellen werden, wie sie wachsen, könnten etwaige Abweichungen von Raten erhalten, beginnend mit jungen Zellen auf die Verwendung einer älteren Ausgangspopulation zurückzuführen. Die Fähigkeit, reproduzierbar erhalten eine ausreichend große Population von Zellen alte Mutter, genau zu messen Genominstabilität ist entscheidend für den Erfolg dieses Ansatzes. Während das Protokoll beschreibt die Verwendung einer bestimmten magnetischen Sortiersystem für diesen Zweck, haben andere Gruppen Hefe Mutterzellen mit alternativen Systemen 14,18 (siehe Tabelle der Materialien) sortiert. Solche alternativen Systeme sollte auch mit dieser Methode zu arbeiten, auch wenn einige Optimierung der Protokolle der Hersteller erforderlich werden könnte. Unabhängig von der konkreten System verwendet werden, die Populationsgröße erfordernd unterscheidet sich in Abhängigkeit von der Frequenz von der Art der Mutation oder Genom Umlagerung zur Untersuchung ausgewählt. Zumindest muß es genügend Mutterzellen mit mindestens einem mutierten Kolonie pro Population zu erhalten, um eine Mutationsfrequenz zu berechnen. In der Praxis können die Ergebnisse ziemlich variabel sein, wenn nur null bis fünf Mutantenkolonien aus der Populationsgröße und auch eine geringe Zunahme der Populationsgröße erwartet, so dass fünf bis zehn Mutantenkolonien zu erwarten sind, kann erheblich die Reproduzierbarkeit zu verbessern. Biotin-Markierung, wenn eine Ausgangspopulation, die Rückgewinnungseffizienz für jede Art muss berücksichtigt werden, um zu identifizieren die entsprechende Bevölkerungsgröße notwendig, Mutationsfrequenz in alten Mutterzellen zu messen. Mit 90% Erstattung der Mutterzellen nach jeder Art würden nur 59% der ursprünglichen Bevölkerung nach fünf Runden des Wachstums und der Sortierung wiederhergestellt werden. Diese sinkt auf ~ 33% Wiederherstellung der ursprünglichen Bevölkerung nach fünf Runden des Wachstums und Sortier, wenn nur 80% der markierten Zellen Mutter erholenbei jeder Art ed. Messung und Maximierung der Wiederherstellung ist von entscheidender Bedeutung bei der Messung niedriger Frequenz Veranstaltungen, seit zwei bis dreifache Abnahme der Populationsgröße könnte leicht zu unzuverlässigen Zahlen von mutierten Kolonien pro Bevölkerung führen. Es gibt zahlreiche Möglichkeiten für die Erweiterung oder Änderung auf dieses Protokoll, um ein breiteres Verständnis der Genominstabilität während der mitotischen Zellalterung zu erhalten. Einfache Beispiele sind die Analyse, wie Veränderungen in der Gen-Funktionen, Medienwechsel, oder andere Umweltzustand ändert nichts an der Anhäufung von Mutationen mit dem Alter. Mutationsraten für junge Zellen mit veränderten Gen-Funktion oder in der entsprechenden Bedingung wäre gemessen und verwendet, um zu bestimmen, ob Mutationen ansammeln anders als durch die Frequenzwerte vorhergesagt und anders als in der Kontrollzellpopulationen werden. Zellpopulationen in verschiedenen Punkten während replikative Alterung könnte, spezifische Belastungen, wie reaktive Sauerstoffspezies oder DNA-schädigende Mittel ausgesetzt werden. Einvorübergehend und mild Exposition gegenüber oxidativem Stress im Wesentlichen nicht die Fähigkeit zur Zellsortierung (3) durchführen zu verändern, aber härteren Beanspruchungen kann die Wiederherstellung von Zellen zu erschweren. Vorversuche notwendig wäre, um zu überprüfen, dass Mutterzellen noch effizienter nach spezifischen Belastungen zurückgewonnen werden. Zusätzlich könnte die zelluläre Eigenschaften der isolierten Mutterzellen im Detail analysiert werden, einschließlich der Stufen von reaktiven Sauerstoffspezies, mitochondriale und Vakuolenmorphologie und andere physiologische Eigenschaften, die mit der Alterung 3 zugeordnet sind. Außerdem könnten die Mutterzellen eine Ausgangspopulation für eine weitere Behandlung oder Manipulation. Da Mutter und Tochterzellen physikalisch während des Verfahrens abgetrennt, werden die Tochterzellen auch noch für die Analyse verfügbar. Beispielsweise ändert in physiologischen Eigenschaften der Tochterzellen oder der asymmetrischen Vererbung von Makromolekülen zwischen Hefe beschädigt Mutter und Tochterzellen <sbis&gt; 24 könnte der Zeitpunkt, wann interessante Veränderungen in Mutationsfrequenzen / Raten verglichen werden. Mutation Frequenzen für Tochter Zellpopulationen könnten auch in Ordnung erhalten werden, um zu versuchen zu modellieren, ob es asymmetrischen Vererbung von Mutationen während der replikativen Alterung. Zusammenfassend kombiniert Anreicherung von Mutterzellen durch magnetische Zellsortierung mit Schwankung Tests können die Vorteile der S. cerevisiae Modellsystem, um effizient zu untersuchen Mechanismen zur Akkumulation von genetischen Veränderungen während der mitotischen Zellalterung verantwortlich angewendet werden.

Mikroorganismen wie der Hefe Saccharomyces cerevisiae, sind hervorragende Modelle zur Untersuchung der Mutationsraten, aber diese Modelle nicht voll ausgenutzt worden, um die Akkumulation von Mutationen im mitotischen Alterung von Zellen zu untersuchen. Mutation Akkumulation im Zellkerngenom wurde die Hypothese aufgestellt, um die Alterung von was zu fortschreitenden Verlust (oder Variation) Genfunktionen 1 beitragen. Die Fähigkeit, ein mikrobielles System, um die Mechanismen und Folgen der Mutation Akkumulation während der Alterung kann die Identifizierung von genetischen und Umweltfaktoren diesen Prozess zu beeinflussen, da der einfache genetische Systeme und die einfache Quantifizierung von seltenen phänotypischen Veränderungen in Mikroorganismen stark beschleunigen studieren. DNA-Reparaturfaktoren und DNA-Schadensantwort-Proteine ​​werden auch über verschiedene Arten 2 konserviert und Grund Ähnlichkeiten in Organismen Alterung sind für Organismen so vielfältig wie S. identifiziert cerevisiae eind Säugetiere 3, was es wahrscheinlich macht, dass die Ergebnisse aus Studien in Hefe erhalten wird relevant für Alterung in vielen Organismen sein. Studien des Alterns in S. cerevisiae nutzen zwei Alterungsmodelle, die chronologische Alterung oder replikative Alterung von Zellen zu messen. Chronologischer Alterung wird durch den progressiven Verlust der Lebensfähigkeit der Hefe-Zellpopulationen, die in einer nicht-teilenden Zustand (stationäre Phase) sind durch Nährstoffverarmung 3 gekennzeichnet. Die chronologische Alterung Modell wurde verwendet, um zu zeigen, dass Mutationen akkumulieren mit zunehmendem Alter 4, da große Zellpopulationen sind leicht in diesem Modell erhalten, um phänotypische Auswahl für mutierten Zellen durchzuführen. In diesem Fall erscheint Mutation Akkumulation von wachstumsSignalWege und oxidativer Stress 5 beeinflußt werden, und jeder dieser Faktoren für das Verständnis Alterung in vielzelligen Eukaryoten 3. Die replikative Alterung Modell nutzt die asymmetrische divisiauf zwischen S. cerevisiae Mutter und Tochter Zellen für die Untersuchung von Hautalterung, die mit aufeinanderfolgenden Zellgenerationen 3 auftritt. Hefe replikative Alterung wurde oft durch Mikromanipulation von kleinen Populationen von Mutter und Tochter Zellen, oder in jüngerer Zeit durch Videomikroskopie von kleinen Populationen von Hefezellen in mikrofluidischen Bauteilen 6,7 gemessen worden. Begrenzte Populationsgrößen machen diese Ansätze wenig geeignet für die Untersuchung von Mutation Akkumulation während der mitotischen Alterung, es sei denn gesamten Genoms Information wird aus einzelnen Zellen erhalten oder sehr hohe Frequenz genetischen Veränderungen werden gemessen 8. Gesamtgenom-Sequenzierung von Einzelzellen bietet erhebliche Datenmengen für die Untersuchung Mutation Akkumulation, aber phänotypische Selektion Systeme haben den wichtigen Vorteil, dass sie ein Mittel zur Messung Mutationsraten zu Grunde liegenden Mechanismen zu studieren Mutation Akkumulation. Studien zur Mutationshäufigkeiten und Preise durch phänotypische Auswahl in haploi prüfend Hefestämme während replikative Alterung noch nicht berichtet worden. Mutationsraten werden häufig mit Tests Fluktuation 9 gemessen. Mutationshäufigkeit Werte spiegeln die Gesamtzahl der Zellen, die eine Mutation in einem Gen-Sequenz in einer Population. Dies umfasst Zellen, in denen unabhängige Mutationen auftreten und alle Nachkommen dieser Zellen, die einfach erben bereits vorhandenen Mutationen. Im Gegensatz dazu Mutationsraten durch Fluktuation Tests gemessen entsprechen der Anzahl der unabhängigen Mutationen, die neu mit jeder Zelle Generation auftreten. Diese Prüfungen umfassen typischerweise viele Impfen Replika-Kulturen bei niedriger Zelldichte, um die Wahrscheinlichkeit des Hinzufügens von Zellen mit vorbestehenden Mutation in einer Zielsequenz, Züchten der Kulturen in der Nähe der Sättigung, und Identifizieren mutanten Zellen durch Wachstum auf Selektivmedium zu reduzieren. Die Anzahl der mutierten Zellen in den Wiederholungspopulationen identifiziert werden dann in einer von mehreren mathematischen Modelle verwendet, um die Anzahl von i zu schätzenndependent Mutationen, die während des Wachstums 9 entstand. Vergleichen der Anzahl von unabhängigen Mutationen auf die durchschnittliche Bevölkerungszahl stellt ein Maß für die Mutationsrate. In S. cerevisiae Mutationshäufigkeiten und Preise werden häufig gemessen mit den URA3 und CAN1 Gene, da loss-of-function Mutationen in diesen Genen produzieren Selektionsphänotypen. Verlust des URA3-Funktion macht Zellen resistent gegen 5-Fluororotsäure (5-FOA), da das Protein codiert URA3 konvertiert 5-FOA in einem toxischen Molekül 10. Verlust der Funktion der Zellen ermöglicht CAN1 beständig Canavanin, einer toxischen Arginin Analog zu werden, da das Protein durch CAN1 codiert transportiert Arginin und Canavanin in Zellen 11. Beide genetische und physikalische Sortierung Strategien wurden erfolgreich eingesetzt, um größere Populationen von S. erhalten cerevisiae Mutterzellen, Untersuchungen der replikativen Altern erleichtern. Genetische Strategien umfassen clevere Ansätze, die gegen die Tochter des Zellüberlebens in einer Population aus. Die Mutter Anreicherungsprogramm (MEP) beinhaltet Beta-Estradiol Induktion von Cre-Rekombinase-Expression nur in Tochterzellen, was zu Tochter-spezifischen Störung der zwei Gene, welche entwickelt wurden, um loxP 12 enthalten. MEP-Stämme können in der Regel in Abwesenheit des Induktors kultiviert werden, sondern nur die Mutterzellen teilen sich weiter nach Induktion, während Tochterzellen in M-Phase in der Regel während der ersten Progression durch den Zellzyklus 12 zu verhaften. Während dieses System nicht verwendet worden, um allgemein zu studieren Mutation Akkumulation während der Alterung wurde verwendet, um den Verlust der Heterozygotie, eine relativ häufige Form von Genominstabilität in diploiden Hefestämme sowie biochemische Veränderungen Alterung Mutterzellen 13,14 studieren. Ebenso beinhaltet die Tochter-Ableiter System Tochter-spezifische Expression des S. cereviSIAE URA3 Gen 15. Tochter-Ableiter Stämme wachsen in der Regel bis 5-FOA wird zum Medium gegeben, an welcher Stelle Tochterzellen exprimieren URA3 sterben wird, während Mutter Zellen weiter wachsen 15. Diese sind nützlich, Systeme für Mutterzellen zu bereichern, aber sie sind auf die Wartung der Gen-Funktionen, die das Auswahlsystem bilden abhängen. Zufallsmutationen in einer oder mehreren Komponenten des Selektionssystems kann in Tochterzellen, die die Auswahl entweichen und sich vermehren exponentiell führen. Bei der Entwicklung der MEP-Stämme, wurden entsprechende Populationsgrößen bestimmt das Aussehen der Mutante Tochterzellen, die die Auswahl 12 entweichen könnten. Doch diese Grenze in Bevölkerungsgröße beeinträchtigt die Erkennung von seltenen Formen der Genom-Instabilität während der replikativen Alterung. Diese Beschränkung auf die Bevölkerungsgröße konnte teilweise durch die Verwendung diploiden Hefestämme mit zwei Kopien von jedem Gen, die zur Auswahlsystem, da die meisten überwunden werdenMutationen wahrscheinlich rezessiv 12 sein. Verwendung von diploiden Stämme beschränkt jedoch die Arten von Mutationsereignisse, die im Vergleich zu denen, die sich leicht in haploiden Hefezellen detektiert werden kann leicht nachgewiesen werden kann. Physikalische Sortierung Strategien umfassen Isolierung von Mutterzellen mit einem markierten Zelloberfläche von unmarkierten Tochterzellen für große Populationen von Mutterzellen zu bereichern. Die Beobachtung, dass die Zelloberflächenproteine ​​(Zellwandproteine) von S. cerevisiae Tochterzellen sind neu bei angeh wurde genutzt, um Zellen zu markieren, ohne Mutter Kennzeichnung der Tochterzellen, die sie produzieren 16 synthetisiert. Zum Beispiel kann eine anfängliche Population von Hefezellen, die auf ihrer Oberfläche mit Biotin markiert gezüchtet werden und dann von ihrer Tochterzellen mit Anti-Biotin-Mikrokugeln und 16 magnetische Sortierung, da die Tochterzellen nach der Anfangspopulation erzeugt nicht Biotin enthalten auf ihrer Oberfläche isoliert . Serien Wachstum undSortierung ermöglicht schrittweise älteren Bevölkerung von Mutterzellen zu erhalten und analysiert werden. Dieses Verfahren wurde erfolgreich eingesetzt, um Veränderungen in der Zellphysiologie und Genexpression während replikative Alterung Hefe 13,14,17,18 untersuchen. Die aktuelle Methode passt sich diese Biotin-Markierung und magnetische Sortiertechnik für Mutterzellen mit dem Ziel der Messung der Anreicherung potenziell seltene Mutationen oder andere Formen der Genom-Instabilität durch phänotypische Auswahl untersucht zu bereichern. Serien Wachstum und physikalische Sortierung die eine Analyse der Mutation Akkumulation in zunehmend älteren Mutterzellen, als auch in ihrer Tochter Zellpopulationen. Bestimmung des Mutationsraten pro Generation ermöglicht eine vorhergesagte Mutationsfrequenz für Mutterzellen, die eine bestimmte Anzahl von Zellteilungen durchlaufen haben, berechnet werden. Seit vorhergesagt Frequenzwerte auf den erwarteten Anstieg durch zusätzliche Runden der Zellteilung, erhebliche Abweichungen in den beobachteten Mutati basierendauf Frequenzen im Vergleich zu den vorhergesagten Werten belegen altersspezifische Veränderungen in der Rate der Akkumulation von Mutationen. Über dieses Protokoll können Fluoreszenzfärbung von Narben, die Knospe zu Websites von Zellteilungen auf Mutter-Zellen mit der Durchflusszytometrie gekoppelt entsprechen verwendet werden, um schnell festzustellen, die Altersverteilung der Bevölkerung sortierte und unsortierte werden. Zusätzliche fluoreszierende Reagenzien, wie sie zum Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies verwendet werden, können auch in diesem Protokoll verwendet werden. Insgesamt ist dieses Protokoll ermöglicht eine effiziente Analyse der altersabhängigen Veränderungen in der Genominstabilität mit dem Potenzial für Korrelation zu altersbedingten physiologischen Veränderungen Zelle in einem Modellorganismus gut geeignet für die Untersuchung der genetischen und umweltbedingten Faktoren, die alterungsbedingte Genominstabilität beeinflussen.

<table><tbody><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>21335</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>Anti-Biotin Mikrokügelchen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td>2 ml MicroBeads, konjugiert mit monoklonalen Maus Anti-Biotin Antikörpern (Isotyp: Maus IgG1)</td></tr><tr><td>MACS LS Säulen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>25 Säulen geeignet für QuadroMACS</td></tr><tr><td>Separator QuadroMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>Nur Separator</td></tr><tr><td>QuadroMACS Starterkit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-051</td><td>enthält: QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Säulen (130-042-401), MACS 15 ml Tube Rack (130-091-052), eine 2 ml Einheit MACS MicroBeads. Hinweis: Zu den alternativen Systemen gehören Dynabeads Biotin Binder und MagnaBind Magnetic Beads</td></tr><tr><td>BD Falcon Cell Strainer, 40 & micro; m</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td>40 &micro; m zur Verwendung mit BD Falcon 50 ml konischen Röhrchen. 50 pro Packung</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td>Pulver, Filterung nach dem Auflösen wichtig zur Entfernung von Partikeln</td></tr><tr><td>Weizenkeim-Agglutinin Alexa Fluor488</td><td>Life Technologies</td><td>W11261</td><td>Konjugate mit unterschiedlichen Anregungs-/Emissionsspektren könnten ebenfalls verwendet werden</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade-Reagenz</td><td>Life Technologies</td><td>P36930 10</td><td>ml, andere Antifade-Reagenzien können ebenfalls verwendet werden</td></tr></tbody></table>

die kombination von magnet sortierung der mutterzellen und fluktuation tests zu genominstabilität während mitotischen zellalterung in analysieren saccharomyces cerevisiae

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae wurde für die Prüfung Mechanismen und Folgen der Genominstabilität ein ausgezeichneter Modellsystem. Informationen aus diesem Hefemodell gewonnen hat für viele Organismen, einschließlich Menschen, da die DNA-Reparatur von DNA-Schäden und Antwortfaktoren sind in verschiedenen Spezies konserviert. Allerdings S. cerevisiae ist noch nicht verwendet worden, um voll anzugehen, ob die Rate der Akkumulation von Mutationen Veränderungen mit zunehmendem replikativen (Mitose) Alter aufgrund technischer Einschränkungen. Zum Beispiel Messungen der Hefe replikativen Lebensdauer durch Mikromanipulation in geringer Zellpopulationen, die die Detektion von seltenen Mutationen zu verhindern. Genetische Methoden, die zur Mutterzellen in der Bevölkerung durch Induktion Tod von Tochterzellen zu bereichern entwickelt worden, aber Populationsgrößen werden noch von der Häufigkeit, mit der zufälligen Mutationen, die die Selektionssysteme gefährden auftreten begrenzt. Das aktuelle Protokoll nutzt magnetische Sorting von Oberflächen-markierten Hefe Mutterzellen groß genug Populationen von Zellen alternde Mutter, um seltene Mutationen durch phänotypische Auswahl quantifizieren zu erhalten. Mutationsraten, durch Fluktuation Tests gemessen, und Mutationsfrequenzen werden zuerst für junge Zellen festgelegt und verwendet, um die Häufigkeit von Mutationen in den Mutterzellen verschiedener replikativen Alters vorherzusagen. Mutation Frequenzen werden dann für sortierte Mutterzellen bestimmt, und das Alter der Mutter Zellen mittels Durchflusszytometrie durch Färbung mit einem fluoreszierenden Reagenz, das Knospe Narben auf ihren Zelloberflächen während der Zellteilung gebildet erkennt bestimmt. Vergleich der vorausgesagten Mutationsfrequenzen auf Grundlage der Anzahl der Zellteilungen zu den Frequenzen experimentell für Mutterzellen einer bestimmten Alters replikativen beobachtet kann dann ermitteln, ob es altersbedingte Veränderungen in der Rate der Akkumulation von Mutationen. Variationen dieses Grundprotokoll die Mittel, um den Einfluss von Veränderungen der spezifischen Genfunktionen untersuchen oderspezifischen Umweltbedingungen auf die Mutation, Mechanismen Akkumulation während replikative Alterung Rechnung zugrunde liegenden Genom-Instabilität.

Mutationsraten bei jungen Saccharomyces cerevisiae Zellen durch Fluktuation Tests gemessen werden zur Mutationshäufigkeiten für Mutterzellen der verschiedenen replikativen Alter vorherzusagen. Magnetische Sortierung und Durchflusszytometrie werden dann verwendet, um tatsächliche Mutationshäufigkeiten und Alter der Mutter Zellen zu messen, um Abweichungen von der erwarteten Mutationsfrequenzen zu ermitteln.

Die Kombination von Magnet Sortierung der Mutterzellen und Fluktuation Tests zu Genominstabilität Während mitotischen Zellalterung in Analysieren Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, zu bestimmen, ob Veränderungen in den Mutationshäufigkeiten mit erhöhter Replikativität. Das Alter der Hefezellen ist einfach auf zusätzliche Zellteilungsrunden oder auf altersspezifische Veränderungen der Raten akkumulierender Mutationen zurückzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Mutationshäufigkeiten und -raten in jungen Zellen gemessen werden, indem Zellen auf selektive und nicht-selektive Medien verteilt werden, um eine vorhergesagte Mutationshäufigkeit für Zellen zunehmenden Alters aufgrund der Mutationsakkumulation mit jeder Runde der Zellteilung zu berechnen.Als nächstes wird eine Hefezellpopulation mit Biotin markiert, das in Flüssigkulturen gezüchtet wurde, und die ursprünglich markierten Zellen werden durch magnetische Sortierung zurückgewonnen, um gealterte Mutterzellen zu erhalten, die mehrere Zellteilungen durchlaufen haben. Dann werden gealterte Mutterzellen entweder nachwachsen lassen, um ihr Alter zu erhöhen, und dann wieder sortiert oder auf Po-Narben gefärbt und dann auf selektive und nicht-selektive Medien verteilt, um ihr durchschnittliches replikatives Alter und ihre Mutationshäufigkeit zu bestimmen. Es erhalten Ergebnisse, die zeigen, ob es eine altersspezifische Zunahme oder Abnahme der akkumulierenden Mutationen gibt, basierend auf einem Vergleich der experimentell beobachteten Mutationshäufigkeit mit der vorhergesagten Mutationshäufigkeit für Zellen der beobachtetes Durchschnittsalter. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet des Alterns zu beantworten, z. B. ob Veränderungen in den Raten akkumulierender genetischer Schäden zum normalen Altern beitragen oder ob die lebensdauerverändernde Wirkung verschiedener genetischer und Umweltfaktoren zum Teil auf Änderungen der Mutationsraten zurückzuführen ist.Melissa Patterson, eine Doktorandin in meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren, um eine Basismutationsrate pro Zellgeneration mit Hilfe von Fluktuationstests für Zellen zu ermitteln, die unter Standardkulturbedingungen gezüchtet wurden. Für jede Replikatkultur verdünnen Sie die Zellen um ein bis 2000 und verteilen Sie sie um ein bis vier Mikroliter auf nicht-selektives Medium, um die koloniebildenden Einheiten pro Milliliter zu bestimmen. Die verbleibenden Zellen werden eine Minute lang bei 2.400 g in einer Mikrozentrifuge pelletiert und mit 100 Mikrolitern Wasser resuspendiert, bevor sie auf selektivem Medium verteilt werden, um Mutanten zu identifizieren.Nachdem Sie die Platten drei Tage lang bei 30 Grad Celsius inkubiert haben, zählen Sie die Kolonien, bestimmen Sie die anfängliche Mutationsrate und -häufigkeit gemäß dem begleitenden Textprotokoll, um charmy CCI mit Biotin zu markieren. Beginnen Sie damit, die Kultur aus einem Glycerinstamm auf YPD-Medium zu streichen und ein bis drei Tage lang bei 30 Grad Celsius zu inkubieren. Mit einer sterilen Pipettenspitze werden die Zellen von der Platte auf mindestens einen Milliliter Wasser übertragen. Denken Sie daran, dass ein bis eineinhalb Zentimeter eines dick gewachsenen Teils des Streifens etwa 10 auf die acht Zellen bringen.Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die genaue Zelldichte für jeden Stamm oder jede Behandlungsbedingung zu bestimmen. Verwenden Sie einen fünf Millimolare Biotin-Reagenzien, um 10 bis acht Zellen pro Entnahmestelle gemäß dem Standardverfahren des Herstellers zu markieren. Führen Sie alle Zentrifugationsschritte nach der letzten Wäsche fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius durch.Verwenden Sie Wasser, um die markierten Zellen auf eine Endkonzentration von 10 bis acht Zellen pro Milliliter zu suspendieren, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu überprüfen: Verdünnen Sie 10 Mikroliter Zellen mit 23 Mikrolitern Wasser und 67 Mikrolitern 0,4 % Triamblau, inkubieren Sie die Zellen 40 Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie ein Hämozytometer verwenden, um lebende oder ungefärbte und tote oder gefärbte Zellen zu bewerten. Nach der Messung der Ausgangswerte für das Zellalter und die Mutationshäufigkeit gemäß dem Textprotokoll werden die mit Biotin markierten Zellen auf 20 Milliliter YPD-Medium übertragen. Stellen Sie sich den acht Zellen vor.Züchten Sie die Kulturen für 16 bis 18 Stunden bei 20 Grad Celsius auf etwa 10 bis acht Zellen pro Milliliter. Lassen Sie die Zellen nicht in die stationäre Phase gelangen und halten Sie die Zellen gegebenenfalls mehrere Stunden lang bei vier Grad Celsius, um das Timing der Wachstumsphase und der Entnahme zu optimieren. Nach der Bestimmung der Zelldichte und dem Pelletieren der Zellen bei vier Grad Celsius waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 30 Millilitern Bead-Markierung, Puffer und Vortexing, dann schleudern Sie die Suspension und gießen den Überstand ab.Nach einer zweiten Wäsche suspendieren wir die Zellen in 50 Mikrolitern Bead-Labeling-Puffer. Tun Sie so, als würden Sie die acht Zellen insgesamt durch Vortexen betrachten. Fügen Sie zwei Mikroliter magnetische Kügelchen hinzu, geben Sie den insgesamt acht Zellen vor und inkubieren Sie nach dem Vortexen 10 Minuten lang auf Eis und invertieren Sie sie periodisch.Verwenden Sie anschließend 30 Milliliter Bead-Labeling-Puffer, um die Zellen dreimal zu waschen. Fügen Sie dann 0,5 Milliliter Bead-Labeling-Puffer hinzu. Stellen Sie sich auf die insgesamt acht Zellen vor und wirbeln Sie das Pellet kurz auf mittlerer Stufe, bis die Zellen wieder suspendiert sind.Gießen Sie die Suspension durch ein 40-Mikron-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen, um alle verbleibenden Zellklumpen zu entfernen. Lassen Sie die Zellen bei Bedarf ein bis zwei Stunden auf Eis, bevor Sie sie auf die Säule laden. Befolgen Sie das vom Hersteller empfohlene Protokoll für die magnetischen Säulen mit bis zu zweimal 10 bis neun Zellen pro Minute.Achten Sie darauf, beim Beladen der Säulen alle luftbaren Elemente zu entfernen, und entfernen und ersetzen Sie die Säule am Separator zwischen den Wäschen, um zu verhindern, dass Zellen zwischen den Kügelchen eingeschlossen werden. Wenn Sie Mehrsäulenseparatoren für die Verarbeitung mehrerer Säulen derselben Probe verwenden, eluieren Sie sie alle in dasselbe Sammelröhrchen, um die Handhabungszeit zu verkürzen und den Verlust von Zellen zu verringern, falls gewünscht. Sparen Sie sich den Durchfluss von den Bindungs- und Waschschritten, um junge Zellen zu analysieren, die von den Mutterzellen produziert werden, nachdem die Zellen durch Zentrifugation bei 3000 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius konzentriert wurden, und aspirieren Sie alle bis auf einen Milliliter Puffer.Tun Sie so, als wären es die acht ursprünglichen Biotin-markierten Zellen. Dann kurz vortexen, um die Zellen im restlichen Puffer zu suspendieren. Verwenden Sie Triamblau, um ein Aliquot verdünnter Zellen zu färben, und verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zelldichte und Lebensfähigkeit zu bestimmen.Berechnen Sie dann die Gesamtzahl der wiederhergestellten Zellen. Wenn die Anzahl der Zellen wesentlich höher ist als erwartet, führen Sie die Elutionsprobe durch eine andere Säule, um zu versuchen, kontaminierende junge Zellen zu entfernen. Wenn die Anzahl der Zellen wesentlich geringer als erwartet ist, übergeben Sie den gespeicherten Fluss.Probieren Sie durch eine weitere Säule, um zu versuchen, die Ausbeute der Mutterzellen zu verbessern, falls gewünscht. Lassen Sie Zellen nachwachsen, um das replikative Alter zu erhöhen, und folgen Sie der Bead-Markierung und -Sortierung ohne Biotin-Markierung. Um das replikative Alter zu bestimmen, geben Sie 25 Mikroliter der zurückgewonnenen Zellen in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und verwenden Sie einen Milliliter eines XPBS, um die Zellen zweimal zu waschen, um Knospennarben auf der Oberfläche der Zellen zu markieren.Verwenden Sie 180 Mikroliter eines XPBS und 20 Mikroliter fluoreszierend konjugiertes WGA zur Resuspendierung der Zellen, decken Sie das 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit Folie ab und inkubieren Sie nach der Inkubation 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius unter leichtem Schaukeln. Verwenden Sie ein XPBS, um die Zellen dreimal zu waschen. Verwenden Sie dann für die Fluoreszenzmikroskopie ein Antifa-Reagenz, um die Zellen auf Objektträger zu montieren, um Zellbewegungen während der Bildgebung zu vermeiden.Härten Sie die Objektträger bis zu einigen Tagen im Dunkeln vollständig aus. Zählen Sie die Knospennarben von mindestens 50 Zellen pro Probe, um ein repräsentatives Maß für das Zellalter zu erhalten. Alternativ können Sie nach dem Suspendieren der Zellen in einem XPBS eine Durchflusszytometrie mit den Einstellungen durchführen, die im Textprotokolldiagramm skizziert sind. Knospennarben an jungen Zellen und Alterszellen, die durch Mikroskopie auf der Y-Achse gegen das normalisierte geometrische Mittel der WGA-konjugierten Fluoreszenz aus denselben Zellpopulationen auf der x-Achse gezählt werden.Erhält man schließlich die Gleichung einer linearen Trendlinie für diese Beziehung Zur anschließenden Substitution konjugiert das normierte geometrische Mittel von WGA die Fluoreszenzintensität einer Zellpopulation für X in der Gleichung und löst sich nach Y auf, um das durchschnittliche Zellalter einer Probe zu bestimmen. Diese Grafik zeigt, dass die Mutationsrate im Can One-Gen vor und nach der Biotin-Markierung ähnlich war. In unabhängigen jungen Hefepopulationen waren die Mutationshäufigkeiten auch in jungen Zellen vor und nach der Biotin-Markierung ähnlich, wenn sie entweder bei 20 Grad Celsius oder 30 Grad Celsius gezüchtet wurden. Die hier gezeigte Grafik zeigt, was bei der Zählung von zurückgewonnenen Zellen nach Biotinmarkierung und Sortierung von unbehandelten Zellen oder von Zellen, die nach der ersten Sortierung mit einem millimolaren Wasserstoffperoxid behandelt wurden, beobachtet werden kann.Die Anzahl der Zellen kann nach der ersten Sortierung höher erscheinen als erwartet, und bei fortgesetzter Sortierung ist ein geringer fortschreitender Zellverlust zu erwarten. Das replikative Alter wurde durch manuelles Zählen von fluoreszenzmarkierten, aber Narben auf Zellen bestimmt, wie hier gezeigt, wie in dieser Abbildung zu sehen. Das Fluoreszenz-, aber Narbensignal aus der Durchflusszytometrie wurde mit manuellen Zählungen verglichen, um eine lineare Beziehung zu erhalten, die es ermöglicht, das replikative Alter der Mutter- und Kontrollzellpopulationen durch Durchflusszytometrie zu bestimmen.Diese Diagramme zeigen Beispiele für ähnliche oder erhöhte beobachtete Mutationshäufigkeiten gealterter Mutterzellen im Vergleich zu den vorhergesagten Häufigkeiten, die aus dem Durchschnittsalter der Mutterzellen und den Mutationshäufigkeiten und -raten für junge Zellpopulationen berechnet wurden. Abhängig von der genomischen Lage der kann ein Gen Nach diesem Verfahren. Andere Methoden, wie die Färbung für reaktive Sauerstoffspezies oder die ulare Morphologie, können verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche Veränderungen in der Zellphysiologie mit altersbedingten Veränderungen in der Mutationsakkumulation verbunden sind.

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Wir beschreiben hier den Betrieb einer mikrofluidischen Vorrichtung, die eine kontinuierliche und hochauflösende mikroskopische Bildgebung einzelner knospenden Hefezellen ermöglicht während ihres kompletten replikativen und / oder chronologischer Lebensdauer.

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Die Kombination von Magnet Sortierung der Mutterzellen und Fluktuation Tests zu Genominstabilität Während mitotischen Zellalterung in Analysieren Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal

Die Kombination von Magnet Sortierung der Mutterzellen und Fluktuation Tests zu Genominstabilität Während mitotischen Zellalterung in Analysieren Saccharomyces cerevisiae

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