Eine neue Methode zur Lokalisierung Reporter fluoreszierende Kügelchen In der Nähe der Zellkulturoberfläche für Traction Force Microscopy

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Herstellung von Polyacrylamid- oder PA-Gelen für die Zellkultur, bei denen fluoreszierende Mikrosphären sehr nahe an der Geloberfläche eingebettet sind. Dies wird erreicht, indem Glasdeckgläser zunächst mit Poly-D-Lysin funktionalisiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Deckgläser mit einer Lösung zu beschichten, die fluoreszierende Mikrokügelchen enthält.

Als nächstes werden PA-Gele formuliert, indem eine geeignete Konzentration von Bis, Acrylamid und Acrylamid gemischt und zwischen einer darunter liegenden Oberfläche und der funktionalisierten Seite der Glasabdeckfolien eingeklemmt wird. Der letzte Schritt besteht darin, das Gel mit einem extrazellulären Matrixprotein und Kulturzellen auf der Geloberfläche zu funktionalisieren. Letztendlich wird die Zugkraftmikroskopie eingesetzt, um mechanische Kräfte zu messen, die von Zellen als Folge der zellinduzierten Substratverformung ausgeübt werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der traditionellen PHL-Herstellung, besteht darin, dass sie fluoreszierende Mikrosphären an einer bekannten Stelle innerhalb der Geltiefe lokalisiert, was eine genauere Berechnung der zellulären Zugkräfte ermöglicht. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da bei der Funktionalisierung der Glasdeckgläser eine räumliche Aushärtung vorgenommen werden muss, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenzbits ordnungsgemäß auf den PHL-First-Platz übertragen werden. Zuvor gereinigte Glasabdeckungen gleiten auf eine gegitterte Oberfläche, so dass sie sich nicht berühren.

Um die Interaktion mit den Deckgläsern zu erleichtern, beschichten Sie die Deckgläser eine Stunde lang vollständig mit 0,1 Milligramm Poly-D-Lysin pro Milliliter. Während dieser Zeit führen Sie eine Verdünnung der Kolloidlösung von 0,1 Mikrometer Durchmesser von 1 bis 10.000 durch. Rot fluoreszierende Mikrosphären mit deionisiertem Wasser, um eine Partikeldichte von etwa einer Mikrosphäre pro 20 Quadratmikrometer auf der Geloberfläche zu erhalten.

Legen Sie die verdünnte Lösung 30 Minuten lang in ein Ultraschall-Wasserbad. Heben Sie nach einer Stunde jeden Deckzettel vorsichtig mit einer Pinzette an und föhnen Sie ihn mit Luft trocken. Legen Sie dann die trockenen Deckgläser wieder auf die geriebene Oberfläche.

Nachdem die verdünnte kolloidale Lösung aus dem Ultraschallbad genommen wurde, pipettieren Sie 150 Mikroliter der Lösung auf jedes Deckglas. Heben Sie nach 10 Minuten jeden Deckzettel vorsichtig mit einer Pinzette an und föhnen Sie ihn mit Luft trocken. Nachdem die trockenen Deckgläser wieder auf die abgestufte Oberfläche gelegt wurden, lagern Sie sie bis zur Verwendung im Dunkeln.

Legen Sie als Nächstes die gewünschte Anzahl von Petrischalen mit Glasboden auf einer ebenen Fläche in einem chemischen Abzug aus. Decken Sie den Glasteil jeder Petrischale ab. Mikrovertiefung mit 97% von drei Amino-Propyltrimethyl für sieben Minuten zur chemischen Aktivierung.

Füllen Sie nach sieben Minuten die Petrischale mit entionisiertem Wasser und entsorgen Sie die Lösung in einem Abfallbehälter. Decken Sie den Glasteil jeder Petrischale vorsichtig ab. Mit einer zuvor vorbereiteten 0,5%igen Glutaraldehydlösung 30 Minuten lang gut kochen lassen.

Füllen Sie nach 30 Minuten die Petrischale mit entionisiertem Wasser und entsorgen Sie es in einem Abfallbehälter, um die Glutaraldehydhaut zu spülen und zu entfernen. Bevor Sie die Komponenten der Polyacrylamid-Gellösung mischen, bewegen Sie die funktionalisierten Glasobjektträger so in den chemischen Abzug, dass sie leicht zugänglich sind, was ein schnelles Einbetten des Gels mit den Petrischalen mit Glasboden ermöglicht. Nach dem Mischen der Gellösung in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen sofort nacheinander 40%Bisacrylamid, 2%Acrylamid und Acrylsäure mischen.

Um die gewünschte Matrixelastizität zu erreichen, fügen Sie dann 100 millimolare HEPs, 10 % Ammonium pro Sulfat hinzu und in Mengen, die der gewünschten Matrixelastizität entsprechen. Um die Gellösung zu vervollständigen, pipettieren Sie sofort 15 Mikroliter Gellösung in die Mitte des Glasteils der Petrischale. Nachdem Sie einen funktionalisierten Glasdeckzettel mit einer Pinzette aufgenommen haben, drehen Sie ihn so um, dass die fluoreszierenden Kügelchen auf der Seite liegen und mit der Gellösung in Kontakt kommen.

Legen Sie dann den Deckslip vorsichtig auf das nun flüssige Polyacrylamid-Gel, so dass die funktionalisierte Seite mit dem Gel in Kontakt kommt. Drehen Sie anschließend alle Petrischalen um, um Schwerkrafteffekte auf fluoreszierende Nanopartikel zu vermeiden. Polymerisation in niedrigere Schichten des Polyacrylamidgels.

Drehen Sie die Petrischalen nach der Polymerisation wieder um und füllen Sie sie mit BS. Stelle vorsichtig Kontakt mit dem Glasteil der Petrischale und dem Umriss des Deckglases her, indem du mit einer Pinzette den Umfang des Deckglases abkratzst. Nach mehreren Schabezyklen. Entfernen Sie den Deckzettel und entsorgen Sie ihn in einem geeigneten Abfallbehälter für scharfe Gegenstände.

Nachdem Sie alle Deckgläser entfernt haben, setzen Sie den Deckel der Petrischale auf jede Schale und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius. Sobald die Polyacrylamid-Gele auf Raumtemperatur erwärmt sind, verwenden Sie eine Vakuumpumpe in einer biologischen Haube, um das gesamte PBS aus den Glasbodenschalen zu entfernen, die die zuvor vorbereiteten Gele enthalten. Pipette Tränken Sie die Lösung auf jedes Gel, so dass das Gel vollständig untergetaucht ist. Nach einer mindestens einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur werden 150 bis 250 Mikroliter einer zuvor hergestellten H-S-E-D-C-Lösung hinzugefügt, um die Geloberfläche zu bedecken, und die Glasbodenmulde der Petrischale füllen.

Dann inkubieren Sie die Gele bei Raumtemperatur für 30 Minuten im Dunkeln. Sobald die N-H-S-E-D-C-Lösung durch Vakuum entfernt wurde, fügen Sie jedem Gel 150 Mikroliter einer zuvor vorbereiteten Fibronektinlösung hinzu. Auch hier wird die Inkubation 35 Minuten lang bei Raumtemperatur durchgeführt, um die Bindung von Fibronektin zu ermöglichen.

Zu diesem Zeitpunkt erwärmen Sie das Zellmedium PBS und Trypsin in einem Wasserbad auf 37 Grad Celsius. Spülen Sie die Gele fünfmal mit sterilem entionisiertem Wasser aus. Lassen Sie das Wasser zwischen den Spülgängen abgesaugt, decken Sie die Gele ab und lassen Sie sie in der Haube.

Geben Sie einen Milliliter Trypsin pro 25 Quadratzentimeter in den Kolben mit den Zellen. Nachdem die Zellen aus dem Kolben gehoben wurden, verdünnen Sie das Trypsin mit Zellmedien. Zählen Sie dann die Zellen mit einem Hämozytometer basierend auf der Geloberfläche.

Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen, die pro Gel für eine endgültige Zellsitzdichte von 3000 Zellen pro Quadratzentimeter erforderlich ist, verdünnen oder konzentrieren Sie die Suspension so, dass 150 Mikroliter des Zellmediengemisches diese Anzahl von Zellen enthalten. Dann gibt Eloqua 50 Mikroliter der Zellsuspension auf jedes Gel. Nach diesem Ort werden die Petrischalen mit den Zellen für 30 Minuten in einen Inkubator gelegt.

Nachdem Sie die Petrischalen vorsichtig aus dem Inkubator genommen haben, füllen Sie den Rest der Petrischalen mit etwa zwei Millilitern Medium, so dass die Oberfläche der Schale vollständig untergetaucht ist. Stellen Sie die Petrischalen bis zur Bildaufnahme wieder in den Inkubator. Wenn Sie für die Bildgebung vorbereitet sind, stellen Sie eine der Petrischalen vorsichtig auf den Mikroskoptisch.

Nachdem Sie den Deckel der Petrischale für die DIC-Bildgebung entfernt haben, lokalisieren Sie eine einzelne Zelle und nehmen Sie ein einzelnes Standbild der Zelle in DIC auf, ohne den Mikroskoptisch zu bewegen. Schalten Sie den Bildgebungsmodus auf Fluoreszenz um. Fokussieren Sie sich auf die fluoreszierenden Mikrosphären und nehmen Sie ein Bild der Mikrosphären auf.

Nehmen Sie das Zellmedium vorsichtig mit der Pipette aus der Petrischale und fügen Sie 0,05 % Trypsin-EDTA hinzu. Fokussieren Sie auf das DIC-Bild, um das Gel zu zeigen, von dem sich die Zelle nun gelöst hat. Bilden Sie dann die Mikrosphären unter der Zelle ab, nachdem sich die Zellen abgelöst haben.

Konfokale Bildgebung wurde verwendet, um festzustellen, dass sich die Kügelchen unter der Geloberfläche befanden, und um ihre genaue Position zu quantifizieren, ließ man fluoreszierende Kügelchen einer anderen Größe und Wellenlänge als die im Inneren des Gels auf der Oberfläche absetzen. Die Position der abgesetzten Kügelchen dient als Referenz für die Oberseite des Gels, auf der die Zellen beim Adhärieren Kraft ausüben. Nach der konfokalen Bildgebung wurde der Abstand zwischen den eingebetteten fluoreszierenden Nanopartikeln und denen auf der Oberfläche berechnet.

Dieser Abstand bestimmte die genaue Tiefe der Kügelchen innerhalb des Gels. Hier sehen Sie die räumliche Verteilung der Sippe und die projizierte Ansicht auf der YZ-Ebene. Die Leiter liefert die Tiefen aller Kügelchen von der Geloberfläche.

Die durchschnittliche Tiefe von 0,1 Mikrometern beträgt 619 Nanometer, 467 Nanometer und 278 Nanometer für Polyacrylamidgele mit einer Steifigkeit von 10 bzw. 40 Kilopascal. Die entsprechenden Tiefen für Kügelchen mit einem Durchmesser von einem Mikrometer betragen minus 20 Nanometer in 40 Kilopascal-Gelen, 12 Nanometer in 10 Gelen und 1.255 Nanometer in Ein-Kilopascal-Gelen. Die Tiefe der im Gel verteilten Kügelchen wurde gemessen und mit den Tiefen verglichen.

Mit der vorgestellten Technik. Hier wird die Variabilität der Bead-Dispersion innerhalb der Tiefe eines Polyacrylamid-Gels unter Verwendung traditioneller Herstellungsmethoden gezeigt. Hier ist das Verschiebungsfeld für eine Fibroblastenzelle und die entsprechende fluoreszierende Kügelchenschicht dargestellt.

Perlen am Rand des Bildes erscheinen leicht unscharf, was ein optischer Effekt aufgrund des Wasserimmersionsobjektivs ist. Bei Zugabe von Trypsin wird die Zelle von der Oberfläche gelöst, wodurch die deformierte Polyacrylamid-Geloberfläche in ihren ursprünglichen Zustand zurückkehrt. Einmal gemeistert, kann diese PHL-Herstellungs- und Funktionalisierungstechnik in sechs Stunden durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Polyacrylamid-Gele mit fluoreszierenden Mikrosphären hergestellt werden, die an einer bekannten Stelle innerhalb der Geltiefe in der Nähe der Zellkulturoberfläche lokalisiert sind. Für eine genauere Berechnung der Zellenzugkräfte.