Name: Eine neue Methode zur Lokalisierung Reporter fluoreszierende Kügelchen In der Nähe der Zellkulturoberfläche für Traction Force Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 30 s
Description: Erfahren Sie eine neue Methode zur Herstellung von Polyacrylamid-Gelen mit fluoreszierenden Mikrosphären nahe der Oberfläche für Traction Force Microscopy. Diese Technik ermöglicht präzise Messungen zellulärer Kräfte.

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Die Autoren möchten die interdisziplinäre Innovation Initiative Program der Universität von Illinois bestätigen, gewähren 12035. SK wurde UIUC von National Science Foundation (NSF) Zuschuss finanziert 0.965.918 IGERT: Ausbildung der nächsten Generation von Forschern in Zelluläre und Molekulare Mechanik und Bio-Nanotechnologie.

Herstellung und Funktionalisierung von PA-Gelen unterschiedlicher Steifigkeiten mit fluoreszierenden Mikrosphären in der Nähe der Zellkulturoberfläche eingebettet. 1. Funktionalisierung der Top Glasplättchen <ol><li> Saubere Glasdeckgläschen (# 1.0, 12 mm Durchm.) Mit Wasser und Seife, gefolgt von Ethanol zu Fremd Staub zu entfernen. </li><li> Ort Glasplättchen auf einer geriebenen Oberfläche (dh Pipettenspitzenhalter), so dass sie sich nicht berühren, um eine einfache Interaktion mit den Deck erleichtern. </li><li> Beschichten der gesamten Oberfläche der Deckgläser mit Poly-D-Lysin (0,1 mg / ml) für 1 h (1A). </li><li> Während dieser Zeit führen eine 1: 10.000-Verdünnung der kolloidalen Lösung von 0,1 um Durchmesser, rot fluoreszierenden Mikrokügelchen mit deionisiertem (DI) Wasser, um eine Partikeldichte von ungefähr 1 Mikrokügelchen pro 20 um 2 auf der Gel-Oberfläche zu erhalten. Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse von verschiedenen Verdünnungen. Diese dilution modifiziert werden, um die Notwendigkeit spezieller Experimente gerecht werden. </li><li> Legen Sie die verdünnte Lösung in einem Ultraschall-Wasserbad für 30 min. </li><li> Nach 1 Stunde, mit einer Pinzette vorsichtig anheben jedes Deckglas und mit Luft trocknen. Bringen Sie die trockenen Deckgläser an den Gitteroberfläche. </li><li> Entfernen Sie die verdünnte Kolloidlösung aus dem Ultraschallbad und Pipette 150 ul auf jedes Deckglas. Lassen Sie für 10 Minuten (Abbildung 1B). </li><li> Mit einer Pinzette vorsichtig anheben jedes Deckglas und mit Luft trocknen. Rückkehr des trockenen Deckgläser an den geriebenen Oberfläche und dunkel lagern, bis sie verwendet. </li></ol> 2. Vorbereitung PA Gel direkt auf dem Glasbodenpetrischalen <ol><li> Vorheiz Heizplatte auf 100 ° C. </li><li> Legen Sie die gewünschte Anzahl der Glasboden-Petrischalen (35 mm-Schale mit 14 mm Mikro gut, # 1.0) auf einer ebenen Fläche in einem Laborabzug. </li><li> Decken Sie die Glas Teil jeder Petrischale Mikro gut mit 97% 3-aminopropyl-trimethoxysliane (3-APTES) für 7 min für die chemische Aktivierung. Vorsicht geboten, um ein unbeabsichtigtes Heraustropfen von 3-APTES auf die Oberfläche des Kunststoffs in der Petrischale zu vermeiden, um den Abbau des Polystyrols zu verhindern. </li><li> Nach 7 min, füllen Sie die Petrischale mit DI-Wasser und in den Abfallbehälter zu entsorgen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.4 3x für jedes Gericht, und dann schütteln Sie die Petrischale, um zusätzliche Wasser zu entfernen. Legen Sie die Petrischalen auf der heißen Platte, bis das Glasteil trocken ist. </li><li> Entfernen Sie die Petrischalen von der heißen Platte und zu einer ebenen Fläche in einem Laborabzug. </li><li> In einer chemischen Abzugshaube, machen eine Lösung von 0,5% Glutaraldehyd und decken das Glasteil jeder Petrischale gut mit der Lösung für 30 min. Vorsicht geboten, um ein unbeabsichtigtes Heraustropfen von Glutaraldehyd auf die Oberfläche des Kunststoffs in der Petrischale zu vermeiden, um den Abbau des Kunststoffs zu vermeiden. </li><li> Nach 30 min, füllen Sie die Petrischale mit DI-Wasser und entsorgen in den Abfallbehälter zu spülen und entfernen Sie die glutaraldehyde. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.4 3x für jedes Gericht, und dann schütteln Sie die Petrischale, um zusätzliche Wasser zu entfernen. Legen Sie die Petrischalen auf der heißen Platte, bis das Glasteil trocken ist. </li><li> Vor dem Vermischen der Komponenten des PA-Gel-Lösung, bewegen Sie die funktionalisierte Glasträger in die chemischen Abzugshaube, so dass sie leicht zugänglich sind, so dass für die schnelle sandwich des Gels mit dem Glasbodenpetrischalen nach dem Mischen der Gel-Lösung. </li><li> In ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen, mischen 40% Bisacrylamid, 2% Acrylamid und Acrylsäure unmittelbar nacheinander in den in Tabelle 1 aufgeführten Konzentrationen (von 10 veröffentlichten Protokoll angepasst), um die gewünschte Matrix Elastizität zu erzielen. </li><li> Mit 100 mM HEPES, 10% Ammoniumpersulfat und TEMED in den in Tabelle 1 aufgeführten Mengen, die gewünschte Elastizität, um den Matrix-Gel-Lösung zu vervollständigen. </li><li> Unmittelbar pipettiert 15 ul Gel-Lösung auf die Mitte des Glasteilsder Petrischalen. </li><li> Sofort abholen eine funktionalisierten Deckglas mit einer Pinzette. <ol><li> Flip das Deckglas über, so dass die fluoreszierende Kügelchen sind auf der Seite Kontakt mit Gel-Lösung. </li><li> Lag das Deckglas vorsichtig auf die Oberseite des jetzt Flüssigkeit PA-Gel, so dass die funktionalisierte Seite ist in Kontakt mit dem Gel (Abbildung 1C). Hinweis: Die besten Ergebnisse wird eine zweite Person für die Rolle der Zugabe des Deckglases, um die Möglichkeit der teilweisen Polymerisation zu vermeiden, während Pipettieren Flüssigkeit PA-Gel-Lösung auf mehrere Petrischalen empfohlen. </li></ol></li><li> Flip alle Petrischalen über mit der Vermeidung von Schwerkraft Auswirkungen auf fluoreszierende Nanopartikel Polymerisation in unteren Ebenen der PA-Gel unterstützen. </li><li> Warten Sie mindestens 35 Minuten, oder bis der Stammlösung von PA-Gel hat sichtlich in seiner Zentrifugenröhrchen polymerisiert. </li><li> Drehen Sie die Petrischalen wieder um und füllen sie mit PBS, um mit dem Entfernen der Deckglas zu unterstützen. </li><li> Kontakt mit dem Glasteil der Petrischale und der Außenlinie des Deckglas sorgfältig zu machen, mit einer Pinzette, um den Umfang des Deckglases zu kratzen. Führen mehrere Zyklen, bis das Deckglas verdrängt wird. Entfernen Sie das Deckglas und entsorgen in einem richtigen Abfallbehälter für spitze Gegenstände. </li><li> Nach Entfernen aller Deckgläser, werden fluoreszierende Kügelchen auf das Gel (Abbildung 1D) übertragen haben. Decken Sie die PA-Gelen vollständig mit PBS, legen Sie die Petrischale Deckel auf jedes Gericht, und bei 4 ° C. </li></ol> 3. Funktionalisierung PA-Gel mit Fibronektin <ol><li> Bereiten Sie die folgenden vorgemischte Lösungen wie in einem festgelegten Protokoll 11 beschrieben: Weichen-Lösung (137 mM NaCl, 5% (v / v) Glycerin) und 2x Konjugation Puffer (0,2 M 2 (N -morpholino) ethansulfonsäure (MES), 10 % (v / v) Glycerol, pH 4.5). </li><li> Verwenden Sie eine Vakuumpumpe in einem biologischen Haube, alle PBS aus den Glasboden-Gerichte, die die PA-Gelen zu entfernen. </li><li> Pipettete einweichen Lösung auf jedes Gel, so dass das Gel vollständig untergetaucht. Inkubieren bei Raumtemperatur für mindestens 1 Stunde. </li><li> Warm 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimid-Hydrochlorid (EDC) und N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) auf Raumtemperatur. </li><li> Mischen 10x Lösungen von EDC (150 mm, 19 mg / ml in DI-Wasser) und NHS (250 mm, 29 mg / ml in DI-Wasser). </li><li> 1 Teil 10x EDC, 1 Teil 10x NHS, 3 Teile DI-Wasser und 5 Teile 2x Konjugationspuffer. </li><li> Verwenden Sie eine Vakuumpumpe in einem biologischen Haube, um die Eintauchlösung zu entfernen. Sicherstellen, dass alle Flüssigkeit aus dem Gel Oberfläche entfernt. </li><li> Fügen Sie genug NHS / EDC-Lösung, um das Gel Oberfläche bedecken und füllen Sie den Glasboden und der Petrischale (150-250 ul). Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten im Dunkeln. </li><li> Tau-Fibronektin bei Raumtemperatur. Einmal aufgetaut, mischen sterile DI-Wasser, ein 50 ug / ml Fibronektin-Lösung zu erstellen. </li><li> Verwenden Sie eine Vakuumpumpe in einem biologischen Kapuze, die NHS / EDC Lösungen entfernention. Sicherstellen, dass alle Flüssigkeit aus dem Gel Oberfläche entfernt. </li><li> Jeweils 150 ul Fibronectin-Lösung zu jeder Gel. Inkubieren bei Raumtemperatur für 35 min, um für die Befestigung von Fibronektin ermöglichen. </li><li> Nach 35 min, fügen PBS zu jeder Petrischale und bei 4 ° C bis zu 2 Wochen. </li></ol> 4. Traction Force-Experimente <ol><li> Wärmezelle Medien, PBS und Trypsin zu 37 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Spülen Gele 5x mit sterilem PBS, Absaugen des PBS zwischen Spülungen, und lassen Sie in der Haube bedeckt. </li><li> 1 ml Trypsin pro 25 cm 2-Kolben mit Zellen. Nachdem die Zellen aus Kolben angehoben, verdünnt das Trypsin mit Zellmedium und zählen Sie die Zellen. Basierend auf Gel-Oberfläche, bestimmt die Anzahl der Zellen pro Gel für eine endgültige Zellaussaatdichte von 3.000 Zellen / cm 2 erforderlich. Verdünnen oder zu konzentrieren Suspension, so daß 150 ul der Zellmediengemisch enthält diese Anzahl von Zellen. Aliquoten 150 ul Zell suspensIons auf jedem Gel. </li><li> Platzieren Sie die Petrischalen, die Zellen in einem Inkubator für 30 min. Dann vorsichtig die Petrischalen und füllen den Rest der Petrischale mit den Medien (ca. 2 ml), so dass die Oberfläche der Schale vollständig eingetaucht ist. </li><li> Legen Sie die Petrischalen wieder in den Inkubator, bis der Bildaufnahme. </li><li> Bereiten Sie das Mikroskop und Datenerfassungssystem für die Bildgebung: Legen Sie die 40x Wasserimmersionsobjektiv, legen Sie die Differentialinterferenzkontrast (DIC) Prisma, wählen Sie die mCherry oder gleichwertige fluoreszierend Filter, und schalten Sie die Klimakammer. </li><li> Wenn für die Bildgebung vorbereitet, entfernen Sie eine Petrischale aus dem Inkubator und legen Sie sie sanft auf den Mikroskoptisch. Entfernen Sie die Petrischale Deckel für DIC-Bildgebung. </li><li> Suchen Sie eine einzelne Zelle und erfassen ein einzelnes Standbild von der Zelle an der DIC. </li><li> Ohne den Mikroskoptisch, schalten Sie den Aufnahmemodus zur Fluoreszenz. Konzentrieren Sie sich auf die fluoreszierenden Mikrosphären und record ein Bild der Mikrokügelchen. </li><li> Zellmedien vorsichtig aus der Petrischale mit einer Pipette und fügen Sie 0,05% Trypsin-EDTA. </li><li> Bild die Mikrosphären unter der Zelle, nachdem die Zellen abgelöst. </li><li> Verwendung Particle Image Velocimetry (PIV)-Analyse in ImageJ 12, um den Verschiebungsfeld aufgrund zellulärer Kräfte zu berechnen. </li></ol>

<ol><li>Pelham, R. J., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> PNAS. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophys. J. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li>
<li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophys. J. 79 (1), 144-152 (2000).</li>
<li>Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Complaint+Matrices+for+Quantifying+Cellular+Contraction%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction.</a> JoVE. , http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=2173 (2010).</li>
<li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyacrylamide+Hydrogels+for+Cell+Mechanics%3A+Steps+Toward+Optimization+and+Alternative+Uses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Polyacrylamide Hydrogels for Cell Mechanics: Steps Toward Optimization and Alternative Uses.</a> Methods in Cell Biol. 83, 29-46 (2007).</li>
<li>Marinkovic, A., Mih, J. D., Park, J. -A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+throughput+traction+microscopy+reveals+pivotal+role+for+matrix+stiffness+in+fibroblast+contractility+and+TGF-%CE%B2+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Improved throughput traction microscopy reveals pivotal role for matrix stiffness in fibroblast contractility and TGF-β responsiveness.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 303 (3), 169-180 (2012).</li>
<li>Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E. X., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+deeply+cells+feel%3A+methods+for+thin+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.%3A+Condens.+Matter%22%5BJournal%5D)">How deeply cells feel: methods for thin gels.</a> J. Phys.: Condens. Matter. 22 (2010), 194116-194126 (2010).</li>
<li>Polio, S. R., Rothenberg, K. E., Stamenovic,, Smith, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+micropatterning+and+image+processing+approach+to+simplify+measurement+of+cellular+traction+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces.</a> Acta Biomaterialia. 8, 82-88 (2012).</li>
<li>Wang, Y. L., Pelham, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+flexible%2C+porous+polyacrylamide+substrate+for+mechanical+studies+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells.</a> Methods in Enzymol. 298, 489-496 (1998).</li>
<li>Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTse%2C+JR+%22Current+Protocols+in+Cell+Biol%22">Current Protocols in Cell Biol</a>. , Chapter 10, Unit 1 16(2010).</li>
<li>Poellmann, M. J., Wagoner Johnson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+Patterning+Polyacrylamide+Substrates+Functionalized+with+N-Hydroxysuccinimide%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Mol.+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Characterizing and Patterning Polyacrylamide Substrates Functionalized with N-Hydroxysuccinimide.</a> Cell and Mol. Bioengineering. 6 (3), 299-309 (2013).</li>
<li>Tseng, Q., Duchemin-Pelletier, E., Deshiere, A., Balland, M., Guillou, H., Filhol, O., Théry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell%E2%80%93cell+junction+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning.</a> PNAS. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li>
<li>Trappmann, B., Gautrot, J. E., Connelly, J. T., Strange, D. G. T., Li, Y., Oyen, M. L., Cohen Stuart, M. A., Boehm, H., Li, B., Vogel, V., Spatz, J. P., Watt, F. M., Huck, W. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular-matrix+tethering+regulates+stem-cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate.</a> Nature Materials. 11, 642-649 (2012).</li>
<li>Wong, J. Y., Leach, J. B., Brown, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balance+of+chemistry%2C+topography%2C+and+mechanics+at+the+cell-biomaterial+interface%3A+Issues+and+challenges+for+assessing+the+role+of+substrate+mechanics+on+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Surface+Science%22%5BJournal%5D)">Balance of chemistry, topography, and mechanics at the cell-biomaterial interface: Issues and challenges for assessing the role of substrate mechanics on cell response.</a> Surface Science. 570 (1-2), 119-133 (2004).</li>
<li>Mih, J. D., Sharif, A. S., Marinković, A., Symer, M. M., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multiwell+Platform+for+Studying+Stiffness-Dependent+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Multiwell Platform for Studying Stiffness-Dependent Cell Biology.</a> PLoS ONE. 6 (5), e19929(2011).</li>
<li>Butler, J. P., Tolić-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+fields%2C+moments%2C+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 282, 595-605 (2001).</li>
<li>Tolić-Nørrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+traction+response+in+human+airway+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 283, 1254-1266 (2002).</li>
<li>Atanackovic, T., Guran, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAtanackovic%2C+T+%22Theory+of+Elasticity+for+Scientists+and+Engineers%22">Theory of Elasticity for Scientists and Engineers</a>. , Maple-Vail Book Manufacturing Group. York, PA. (2000).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Bei Verwendung dieser Technik ist es wichtig, dass der Wulst Lösung wird auf geeignete Weise verdünnt, und die Perlen werden auf der Basis gewünschten Durchmesser gewählt, PA Gelsubstrat Steifigkeit und der Größenskala der Phänomene, die in der gewünschten Experiment untersucht wird. Vorsicht ist bei der Verdünnung der Lösung vor der Wulst Funktionalisierung oberen Glasplättchen genommen werden. Der Abstand zwischen den Wülsten auf der Gel-Oberfläche kann durch Veränderung der Verdünnungsfak...

Die mechanische Interaktion einer lebenden Zelle mit seinem lokalen Umfeld hat gemeinhin mit PA-Gele untersucht. Diese Substrate basieren auf einem einfachen, gut charakterisierten Protokoll von Dembo Wang 1997 1. Einer der Hauptvorteile dieser Substrate aufgebaut ist, dass ihre Steifigkeit kann durch Änderung der Konzentration bestimmter Bestandteile des Gel-Lösung eingestellt werden. Dies bietet eine Plattform, um Zellen wünschenswert &#39;Interaktion mit Umgebungen von unterschiedlichen Steifigkeiten zu studieren. Bei PA-Gele werden mit der extrazellulären Matrix (ECM) Proteinen beschichtet, Zellen haften an ihnen, Krafterzeugung. Als Ergebnis der Zellkraft, verformt sich das Gel als ein elastischer Körper. Diese Verformung ist abhängig von der Größe des durch die Zellen und die elastischen Eigenschaften des Gels aufgebrachte Kraft. Verschiedene Studien haben PA-Gele eingesetzt, um zelluläre Traktionskräfte zu untersuchen. In einer Variation des PA-Gel Herstellung werden fluoreszierende Mikrosphären (Beads) eingebettet tberall das Gel auf Zell Zugkräfte auf Gelen unterschiedlicher Steifigkeiten 2 zu quantifizieren. Nach Zellkraftanwendung, verdrängen die Perlen von ihrer ursprünglichen Lage nach Gel Deformation. Das Feld Verformung der einzelnen Wulst Verschiebungen gemessen. Diese Verformung Feld wird mit Elastizitätstheorie und die elastischen Eigenschaften des Gels, um die Zugkräfte berechnen genutzt. Diese Messungen geben Aufschluss darüber, wie Zellen mechanisch zu erfassen und die Interaktion mit den lokalen Mikroumgebung 3. In vielen weit verbreiteten PA-Gel Herstellungsprotokolle werden die Perlen in der gesamten PA-Gel im flüssigen, nicht polymerisierten Zustand vermischt. Ein vollständig polymerisiert PA-Gel enthält fluoreszierende Kügelchen in seinem Volumen. Bei der Berechnung von Zelltraktionskräfte, sind Perlen die meisten in der Nähe der Gel-Oberfläche (Zell-Substrat-Schnittstelle) überwacht. Die Verschiebungen dieser Kügelchen werden als auf der Zellkulturoberfläche zur Vereinfachung der Kraft auftreten BERECHNUNGn. Die tatsächliche Position der Wülste innerhalb der Tiefe des Gels wird nicht berücksichtigt. Jedoch in einem elastischen Medium (wie PA-Gel), eine Wulst näher zu einem Kraftangriffspunkt bewegt sich mehr als ein Wulst, die weiter von dem Punkt entfernt ist. Somit Behandeln der Verschiebung eines Punktes (am Wulst Position) entfernt von der Oberfläche, wie die an der Oberfläche führt zu einer Unterschätzung der zellulären Zugkräfte. Der Fehlergrad ist abhängig vom Abstand der Schweißraupe an der Oberfläche. Der Fehler kann nicht ohne die Kenntnis der Lage der Wulst geschätzt werden. Der Bedarf für ein einfaches Verfahren, um die Kügelchen in der Nähe des Zellkulturoberfläche beschränkt ist durch einige Techniken angegangen. Eine Möglichkeit ist es, die Dichte der Kügelchen während des gesamten Gels zu erhöhen, so dass es eine ausreichende Zahl der Raupen in der oberen Brennebene, um die Bewegung sehr nahe an der Oberfläche zu messen. Ein weiteres Verfahren beinhaltet den Aufbau eines konfokalen Abbildungskammer zur lebenden Zellen, so daß das Licht vonnur die Perlen in der obersten Bildebene gesammelt 4. Eine andere Methode besteht darin überlagern eine extrem dünne Schicht der PA-Gel mit Perlen auf eine bereits polymerisierte Gel ohne Perlen 5. Ein Nachteil jedes dieser Techniken ist, dass die genaue Lage der Kügelchen in dem Gel nicht bekannt ist. Dies bringt Fehler in die Berechnung der Verschiebungsfeld der Perlen und damit die Berechnung der Zellkräfte. Ein weiteres Verfahren beinhaltet die Konjugation von Kügelchen auf die Oberfläche eines bereits polymerisiert PA-Gel mit Sulfo-SANPAH 6. Diese Technik gewährleistet die Kügelchen sind in der Tat nur auf der Oberseite des PA-Gel, aber das Ausmaß, in dem sie in der Tiefe des Gels eingebettet sind, ist unbekannt. Dies könnte möglicherweise eine lokale Topographie für die Zellen, die das Zellverhalten verändern könnte, als vor der Arbeit hat vorgeschlagen, dass Zellen können mehrere Mikrometer Kraft weg 7 zu spüren. Kürzlich wurde eine Technik zum Mustern PA-Gelen mit 1 um Durchmesser fluorescent Fibronektin Punktmarkierungen in einem Array regularisiert wurde 8 etabliert. In diesem Fall wird die Tiefe der Fluoreszenzmarker bekannt, und ist im wesentlichen Null, da die Fibronektin Muster indirekt auf die Gel-Oberfläche gedruckt. Allerdings ist dieses Verfahren nicht eine kontinuierliche Umgebung, in der Zellen zu befestigen, wie das ECM-Protein ist mit 1 um Durchmesser Dots begrenzt. Ein Verfahren zum Tracker Perlen vollständige Integration in PA-Gelen und beschränken sie auf einem bekannten Ort ganz in der Nähe der Oberfläche muss noch erarbeitet werden. Hier entwickeln wir eine Technik, um ein um bis um Durchmesser fluoreszierende Kügelchen zu einer Brennebene in der Nähe des Zellkulturfläche innerhalb PA-Gel zu beschränken. Ein Gel wird typischerweise durch Anordnen unpolymerisierten flüssigen Gel-Lösung zwischen zwei Glasplatten gehärtet. Eine der Platten wird funktionalisiert, so dass das Gel haftet stark zu. Die andere ist nicht funktionalisierten und nach der Gel härtet entfernt. Wir ändern dieses abnehmbare Glas sun-Schnittstelle durch Beschichten mit einer Schicht von Perlen. Auf, zwischen denen die flüssige Gel zwischen der funktionalisierten und dem Wulst beschichtete Glasoberfläche, die Perlen Transfer auf das Gel, während es der Aushärtung. Dies begrenzt die Entfernung der Perlen &quot;Integration in das Gel in 1,6 um der Oberfläche. Glasbodenpetrischalen werden als Haftgrund, auf dem das Gel ausgehärtet wird verwendet. Um einen flachen oberen Gel-Oberfläche während der Polymerisation zu bilden, ist eine kreisförmige Deckglas zu Sandwich verwendet das Gel mit dem Glasbodenpetrischale. Gel vor der Herstellung wird die obere Deckglas mit Poly-D-Lysin (PDL) beschichtet, wodurch eine positive Oberflächenladung. Die PDL wird mit Druckluft ausgeblasen, und eine Lösung von Perlen in Wasser auf die Deckgläser aufgebracht. Wir nutzen carboxylierten fluoreszierenden Mikrokügelchen, die eine negative Ladung tragen, und interagieren mit der positiv geladenen Oberfläche erstellt durch Behandlung mit PDL. Nach dem Ausblasen des Wulstes Lösung aus dem Deckglas mit Druckluft, eine einzelne Schicht ausPerlen bleibt elektrostatisch auf die Trockendeckglas verbunden. Der PDL-Beschichtung beeinträchtigt nicht die Haftung des Glases an der Geloberfläche, da die Glas-Objektträger nicht beschädigt und der PA-Gel vollständig intakt entfernt. Die Glasbodenpetrischalen werden adhärenten durch Behandlung mit 97% 3-aminopropyl-trimethoxysliane und 0,5% Glutaraldehyd gemacht. PA-Gelen gewünschten Steifigkeiten werden durch Mischen von geeigneten Konzentrationen von Bisacrylamid und Acrylamid über ein Standard-Verfahren 9 erstellt. Ein Tropfen des Gels Lösung wird auf die Glasbodenpetrischale pipettiert. Das Deckglas, das die Kügelchen nach Sandwich verwendet das Gel mit der Petrischale. Wenn das Gel ausgehärtet ist, wird die obere Deckglas so dass die Kügelchen in der PA-Gel innerhalb 1,6 um von der Oberfläche entfernt eingebettet.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenzien</stark></td></tr><tr><td>97% 3-Aminopropyl-trimethoxyslian (APTES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>70% Glutaraldehyd</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>111-30-8</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES-Pufferlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrylamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>2% Bisacrylamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1533</td><td></td></tr><tr><td>0,1 & Mikro; m Fluoreszierende Mikrosphären (mCherry)</td><td>Invitrogen</td><td>F8801</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin, Human, 1 mg</td><td>BD Biosciences</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Bio-RAD</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylendiamin (TEMED)</td><td>Bio-RAD</td><td>161-0801</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimidhydrochlorid (EDC)&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-Hydroxysulfosuccinimid (NHS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Trypsin-EDTA (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Acrylsäure&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>147230</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>35 mm Glasbodenschale mit 14 mm Micro-Well #1 Deckglas</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D35-14-1-N</td><td></td></tr><tr><td>Glasabdeckgläser, 12 mm Ø </td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>Artikel-Nr.: 26023</td><td></td></tr></tbody></table>

eine neue methode zur lokalisierung reporter fluoreszierende kügelchen in der nähe der zellkulturoberfläche für traction force microscopy

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA Gele sind seit langem als Plattform, um die Zell Zugkräfte aufgrund der Herstellung und der Möglichkeit, sowohl ihre elastischen Eigenschaften zu erleichtern Studie verwendet worden. Wenn das Substrat mit einem extrazellulären Matrixprotein beschichtet ist, Zellen haften an dem Gel und gelten Kräfte, wodurch das Gel zu verformen. Die Verformung ist abhängig von der Zell Traktion und die elastischen Eigenschaften des Gels. Wenn der Verformungsbereich der Oberfläche bekannt ist, kann unter Verwendung von Oberflächentraktionselastizitätstheorie berechnet werden. Gel Verformung wird üblicherweise durch die Einbettung von fluoreszierenden Marker Perlen gleichmäßig in das Gel gemessen. Die Sonden zu verdrängen, wie das Gel verformt. Die Sonden in der Nähe der Oberfläche des Gels nachgeführt. Die von diesen Sonden berichtet Verschiebungen werden als Oberflächenverschiebungen berücksichtigt. Deren Tiefe von der Oberfläche, werden ignoriert. Diese Annahme stellt Fehler in Zugkraft Auswertungen. Für die präzise Messung von Zellkräften, ist es entscheidend für die Lage der Kugeln bekannt sein. Wir haben uns entwickelteine Technik, einfache Chemie verwendet, um fluoreszierende Markierungsperlen, 0,1 und 1 um Durchmesser zu beschränken, in PA-Gelen, innerhalb 1,6 um von der Oberfläche. Wir Mantel eine Deck mit Poly-D-Lysin (PDL) und fluoreszierenden Beads. PA-Gel-Lösung wird dann zwischen dem Deckglas und einem haftenden Oberfläche angeordnet ist. Die fluoreszierende Kügelchen Transfer zum Gel-Lösung während der Aushärtung. Nach der Polymerisation enthält das PA-Gel fluoreszierende Kügelchen in ein Flugzeug in der Nähe der Gel-Oberfläche.

Konfokale Bildgebung wurde verwendet, um festzustellen, dass die Perlen waren in der Tat unter der Gel-Oberfläche und ihre genaue Position innerhalb des Gels Tiefe zu quantifizieren. Fluoreszierende Kügelchen mit einer anderen Wellenlänge als die im Inneren des Gels ließ man auf der Oberfläche absetzen, und der Abstand zwischen den eingebetteten fluoreszierenden Nanopartikeln und die auf der Oberfläche wurde unter Verwendung eines Schwerpunkts Identifikationsalgorithmus. Die Lage des Wulstes auf der Gel-Oberfläche dient...

Traditionelle Techniken zur Herstellung Polyacrylamid (PA)-Gelen, die fluoreszierenden Sonden beinhalten, zwischen denen ein Gel zwischen einem haftenden Oberfläche und einem Glasträger. Hier zeigen wir, dass die Beschichtung diese Folie mit Poly-D-Lysin (PDL) und fluoreszierende Sonden lokalisiert die Sonden innerhalb von 1,6 um von der Geloberfläche.

Eine neue Methode zur Lokalisierung Reporter fluoreszierende Kügelchen In der Nähe der Zellkulturoberfläche für Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Herstellung von Polyacrylamid- oder PA-Gelen für die Zellkultur, bei denen fluoreszierende Mikrosphären sehr nahe an der Geloberfläche eingebettet sind. Dies wird erreicht, indem Glasdeckgläser zunächst mit Poly-D-Lysin funktionalisiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Deckgläser mit einer Lösung zu beschichten, die fluoreszierende Mikrokügelchen enthält.Als nächstes werden PA-Gele formuliert, indem eine geeignete Konzentration von Bis, Acrylamid und Acrylamid gemischt und zwischen einer darunter liegenden Oberfläche und der funktionalisierten Seite der Glasabdeckfolien eingeklemmt wird. Der letzte Schritt besteht darin, das Gel mit einem extrazellulären Matrixprotein und Kulturzellen auf der Geloberfläche zu funktionalisieren. Letztendlich wird die Zugkraftmikroskopie eingesetzt, um mechanische Kräfte zu messen, die von Zellen als Folge der zellinduzierten Substratverformung ausgeübt werden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der traditionellen PHL-Herstellung, besteht darin, dass sie fluoreszierende Mikrosphären an einer bekannten Stelle innerhalb der Geltiefe lokalisiert, was eine

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Dieses Video beschreibt den Zugkraftmikroskopie-Assay. Der Assay bestimmt die zelluläre Traktion von menschlichen Dickdarmkrebszellen auf der extrazellulären Matrix, die auf einem weichen, elastischen Hydrogel mit eingebetteten fluoreszierenden Kügelchen vorhanden ist. Die resultierende Verschiebung der fluoreszierenden Kügelchen wird mit einer entsprechenden Software gemessen.

Traktionszytometrie-Assay: Eine Methode zur Quantifizierung der Zugkraft, die von Krebszellen auf die EZM ausgeübt wird

Dieses Video zeigt die Verwendung von Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie, um die Wechselwirkung zwischen Zelloberflächenproteinen bei Zell-Zell-Kontakten zu detektieren. Durch die Expression des interessierenden Transmembran-Adhäsionsrezeptors, der mit einem fluoreszierenden Protein markiert ist, und durch Mischen von zwei verschiedenen Zellpopulationen, die zwei spektral getrennte Fluoreszenzmarkierungen besitzen, wird die Trans-Interaktion zwischen den Rezeptoren zweier benachbarter Zellen...

Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie zur Untersuchung der Proteininteraktion an Zellkontakten

Dieses Protokoll beschreibt einen Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie basierende Ansatz zur Untersuchung von Interaktionen zwischen den Proteinen, die Vermittlung von Zell-Zell-Interaktionen, d.h. Proteine in der Zelle Verzweigungen direkt in lebenden Zellen lokalisiert. Wir bieten detaillierte Richtlinien auf Kalibrierung, Datenerfassung und -Analyse, einschließlich Korrekturen möglich Artefakt Quellen.

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

Eine erweiterte Mikroskop, die es ermöglichen schnelle und hochauflösende werden Bildgebung des isolierten Plasmamembran sowohl die umliegenden intrazelluläre Volumen präsentiert. Die Integration von spinning-Disk und Gesamtbetrag interne Reflexion Fluoreszenzmikroskopie in einer Aufspannung ermöglicht live-imaging-Experimente bei hohen Erfassungsraten bis zu 3,5 s pro Bildstapel.

Visualisierung von Adhäsion Bildung in den Zellen durch erweiterte Spinning-Disk-Total Internal Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie

Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die Implementierung der Multiphotonenlithographie zur Herstellung dreidimensionaler Arrays von fluoreszierenden Fiduzialen, die in poly(ethylengglykol)-basierte Hydrogele eingebettet sind und als referenzfreie Traktionskraftmikroskopie verwendet werden können. Plattformen. Anhand dieser Anleitungen wird die Messung der 3D-Materialdehnung und die Berechnung der zellulären Traktionen vereinfacht, um Messungen der Traktionskraft mit hohem Durchsatz zu...

Herstellung und Implementierung einer referenzfreien Traktionskraftmikroskopie-Plattform

Kollektive Zellmigration in Entwicklung, Wundheilung und Krebsmetastasierung wird oft von den Gradienten von Wachstumsfaktoren oder Signalmolekülen geleitet. Hier wird ein experimentelles System beschrieben, das Traktionsmikroskopie mit einem mikrofluidischen System kombiniert und demonstriert, wie die Mechanik der kollektiven Migration unter biochemischen Gradienten quantifiziert werden kann.

Traktionsmikroskopie integriert mit Mikrofluidik für chemotaktische kollektive Migration

Hier stellen wir ein Protokoll zur Durchführung von Traktionskraftmikroskopieexperimenten an B-Zellen vor. Wir beschreiben die Herstellung von weichen Polyacrylamidgelen und deren Funktionalisierung sowie die Datenerfassung am Mikroskop und eine Zusammenfassung der Datenanalyse.

Traktionskraftmikroskopie zur Untersuchung der B-Lymphozytenaktivierung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die intrazellulären mechanischen Eigenschaften isolierter embryonaler Zebrafischzellen im dreidimensionalen Einschluss mit direkter Kraftmessung durch eine optische Falle zu untersuchen.

Direkte Kraftmessungen der subzellulären Mechanik im Einschluss mit optischen Pinzetten

Dieses Protokoll stellt die experimentellen Verfahren zur Durchführung des Adhäsions-Footprint-Assays vor, um die Adhäsionsereignisse während der schnellen Zellrollenadhäsion abzubilden.

Abbildung der molekularen Adhäsion im Zellrollen durch Adhäsion Footprint Assay

Nah-UV-Lithographie und Zugkraftmikroskopie werden kombiniert, um zelluläre Kräfte auf mikrostrukturierte Hydrogele zu messen. Die gezielte lichtinduzierte Freisetzung einzelner Zellen ermöglicht eine hohe Anzahl von Messungen an derselben Probe.

Kontrolle der Zelladhäsion mit Hydrogel-Patterning-Techniken für Anwendungen in der Zugkraftmikroskopie

Um voranzukommen, müssen Wachstumskegel Zugkräfte gegen die äußere Umgebung ausüben. Die Erzeugung von Zugkräften ist abhängig von der Aktindynamik und der Kupplungskupplung. Die vorliegende Studie beschreibt Methoden zur Analyse der Aktindynamik, der Kupplungskupplung und der Zugkräfte für den Wachstumskegelvorschub.

Analysen von Aktindynamik, Kupplungskupplung und Zugkraft für den Wachstumskegelvorschub

Erfahren Sie eine neue Methode zur Herstellung von Polyacrylamid-Gelen mit fluoreszierenden Mikrosphären nahe der Oberfläche für Traction Force Microscopy. Diese Technik ermöglicht präzise Messungen zellulärer Kräfte.

Eine neue Methode zur Lokalisierung Reporter fluoreszierende Kügelchen In der Nähe der Zellkulturoberfläche für Traction Force Microscopy (Video) | JoVE Journal

Eine neue Methode zur Lokalisierung Reporter fluoreszierende Kügelchen In der Nähe der Zellkulturoberfläche für Traction Force Microscopy

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