Bestellen Einzelzellen und Einzel Embryos in 3D Confinement: Ein neues Gerät für High Content Screening

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Morphologie und Dynamik von zellulären Organellen auf einer Reihe von Mikrokavitäten zu beobachten, die die 3D-Umgebung unter physiologischen Bedingungen nachahmen. Bei Zellen mit starren Wänden, wie z. B. Spalthefe, können Hohlräume zelluläre Strukturen organisieren und ausrichten. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Array von PDMS-Säulen von einem Master hergestellt wird, um ein Array von PDMS-Mikrokavitäten, die als Eierbecher bezeichnet werden, durch Nachbildungen zu erhalten.

In einem zweiten Schritt werden die Eierbecher mit Proteinen der extrazellulären Matrix funktionalisiert und in ein Röhrchen mit einem zylindrischen, maßgefertigten Kunststoffstück eingeführt, das die Mikrokavitätenprobe stützt und das Einbringen einzelner Säugetierzellen in jeden der Mikrokavitäten ermöglicht. Als nächstes werden die mit Zellen gefüllten Eierbecher entnommen und mit dem Wirkstoff oder der Verbindung von Interesse inkubiert, um den Phänotyp und die dynamischen Prozesse von Zellen in einem 3D-Einschluss zu untersuchen. Es werden Ergebnisse erzielt, die Unterschiede im Zellphänotyp und neue dynamische Strukturen zeigen, die im Vergleich zu Standard-2D-In-vitro-Assays auf der Grundlage der Zellorientierung beobachtet werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. Standard-2D-Zellkultur-Assays, besteht darin, dass Säugetierzellen in Eierbechern eine 3D-Umgebung ähnlich den logischen Mikroumgebungen erleben, aber in einer geordneten und standardisierten Qualität angeordnet sind. Ordnung und Orientierung sind auch bei der Spalthefe eine deutliche Verbesserung. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich des Zellskeletts und der Wirkstoffforschung zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung neuer und krebshemmender Medikamente mit High-Content-Screening.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Diagnose von multifaktoriellen Erkrankungen wie Krebs, da Wirkstoffscreening-Assays einfach mit Hilfe von Eierbechern durchgeführt und analysiert werden können, was diese Methode besonders für die personalisierte Medizin interessant macht. Diese Methode kann einen Schlüssel zu organisierten Strukturen und Dynamiken in einzelnen Säugetierzellen und Spalthefezellen liefern, und sie kann auch auf die Organisation von Studien und die Entwicklung von Embryonen wie C.elegans und ri-so-flu-a angewendet werden. Bei diesem Protokoll wird ein Array von Mikrokavitäten oder Eierbechern auf eine Polydimethylsiloxan- oder PDMS-Schicht aufgebracht, die durch Nachformen auf ein Deckglas geklebt wird.

Der erste Schritt ist die Herstellung des Masters, der nicht gezeigt wird, aber im Textprotokoll beschrieben wird. Nachdem der Master erstellt wurde, besteht der nächste Schritt darin, das PDMS-Replikat herzustellen. In einem 50-Milliliter-Röhrchen werden der Vernetzer und das Prepolymer in einem Verhältnis von 1 zu 10 Gewicht zu Gewicht oder Volumen zu Volumen gründlich gemischt, so dass insgesamt 30 Gramm entstehen.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 1.800 g Futter, um Luftblasen zu entfernen. Legen Sie das PDMS vorsichtig auf dem Master ab. Wenn Blasen auftreten, entgasen Sie die Mischung.

Legen Sie die Probe für vier Stunden bei 65 Grad Celsius in einen Ofen. Nachdem das PDMS ausgehärtet ist, schneiden Sie mit einem Skalpell vorsichtig den interessierenden Bereich von etwa einem Quadratzentimeter ab, der etwa 10 bis fünf Mikrokaries oder Eierbecher umfasst. Ziehen Sie den PDMS-Stempel vorsichtig ab.

Um den Vorgang für das Nachformen zu starten, aktivieren Sie den PDMS-Stempel durch Sauerstoffplasmabehandlung für 30 Sekunden. Bewahren Sie den aktivierten Stempel vorübergehend in einer geschlossenen Petrischale auf, um Staubablagerungen zu verhindern. Platzieren Sie den aktivierten PDMS-Stempel in einem Abzug mit der Seite mit den Strukturen nach oben oder auf dem Kopf stehend in einer Petrischale neben einem 15-Milliliter-Deckel.

Füllen Sie die Kappe mit 200 Mikrolitern Trimethylchlorsilan. Schließen Sie die Petrischale und lassen Sie den Stempel sieben Minuten lang salzen. Platzieren Sie den PDMS-Stempel mit den Strukturen nach oben auf dem Spin Coater.

Geben Sie einen kleinen Tropfen flüssiges PDMS auf die Strukturen. Schleudern Sie die Beschichtung 30 Sekunden lang bei 1500 U/min, um eine dünne Schicht PDMS auf die Strukturen aufzutragen. Legen Sie den Stempel für vier Stunden bei 65 Grad Celsius in den Ofen, um die abgeschiedene spinbeschichtete PDMS-Schicht auszuhärten.

Aktivieren Sie anschließend die dünne PDMS-Schicht, indem Sie den PDMS-Stempel kopfüber zusammen mit einem Glasdeckglas für 30 Sekunden in einen Sauerstoffplasmareiniger legen. Legen Sie den Stempel sofort in Kontakt mit dem Glasdeckglas und drücken Sie die Oberfläche des Stempels für die Verklebung vorsichtig mit einer Pinzette an. Halten Sie danach etwa 10 Sekunden lang konstanten Druck auf den Stempel.

30 Minuten später den Stempel vorsichtig aus dem Deckglas ziehen, um die Eierbecher zu befreien. Seien Sie sehr vorsichtig, um die Probe nicht zu zerbrechen. Spülen Sie die Eierbecher gründlich mit Ethanol aus und trocknen Sie sie ab.

Wenn sich PDMS-Eierbecher nicht auf dem Glasdeckglas befinden und sich während des Lösens gelöst haben, sollten Sie die Einstellungen des Plasmareinigers anpassen und das Verfahren für das Nachformen neu starten. Um die spätere Manipulation der Probe zu erleichtern, empfiehlt es sich, ein kleines Stück ausgehärtetes PDMS an den Rand des Deckglases zu kleben. Im Falle von Säugetierzellen, die in diesem Video vorgestellt werden, muss die PDMS-Oberfläche mit Adhäsionsproteinen der extrazellulären Matrix funktionalisiert werden.

Hydrophilieren Sie die Eierbecher im Sauerstoffplasmareiniger für 30 Sekunden. Danach sterilisieren Sie die Eierbecher fünf Minuten lang mit ultraviolettem Licht. Geben Sie einen kleinen Tropfen Fibronektinlösung auf die gesamte Fläche des Eierbechers und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

Schützen Sie die Probe vor dem Austrocknen. Spülen Sie die Eierbecher vorsichtig mit etwa einem Milliliter PBS mit einer Plastikpipette aus. Wiederholen Sie dies insgesamt dreimal.

Legen Sie als Nächstes ein speziell angefertigtes zylindrisches Kunststoffstück in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie 13 Milliliter Zellkulturmedium in das Röhrchen. Das Medium sollte mindestens zwei Zentimeter über das zylindrische Stück hinausragen, um ein vollständiges Eintauchen der Probe zu gewährleisten.

Halten Sie die Probe mit einer scharfen und geraden Pinzette am PDMS-Griff fest, platzieren Sie die Eierbecher vorsichtig in das Röhrchen und drücken Sie vorsichtig auf den Deckglas, bis er auf der Oberseite des Kunststoffstücks liegt und vollständig eingetaucht ist. Die Zellen, die in die Eierbecher eingeführt werden sollen, sollten auf 80 bis 100 % Konfluenz kultiviert und in fünf Millilitern Kulturmedium resuspendiert werden. Pipettieren Sie 200 Mikroliter Zellen auf die Eierbecher und lassen Sie die Zellen so zentriert wie möglich auf die Eierbecher fallen, vermeiden Sie jedoch Körperkontakt.

Dadurch wird ein Bruch und/oder eine Beschädigung der Probe vermieden. Zentrifugieren Sie das 50-Milliliter-Röhrchen bei 1.800 g für zwei Minuten. Pipettieren Sie weitere 200 Mikroliter Zellen auf die Eierbecher und zentrifugieren Sie erneut bei 1.800 g für zwei Minuten.

Wiederholen Sie den Vorgang insgesamt dreimal, um den Füllgrad zu optimieren. Überprüfen Sie nach der letzten Zentrifugation den Füllanteil von Eierbechern mit einem Mikroskop. Verwenden Sie die Pinzette, um den PDMS-Griff zu halten, nehmen Sie die Probe vorsichtig aus dem Röhrchen, ohne die Zellen in den Eierbechern zu stören, und legen Sie die Probe in eine Petrischale mit Medium.

Um die überschüssigen Zellen zu entfernen, die sich nicht in den Eierbechern befinden, spülen Sie, indem Sie dreimal neben jeder Seite des Mikrostrukturarrays vorsichtig auf und ab pipettieren. Ersetzen Sie schließlich das Medium durch frisches Medium, um nicht gebundene Zellen zu entfernen. Um fixierte zelluläre Organellen zu beobachten, legen Sie die Eierbecher mit einer fixierten Probe auf den Tisch eines inversen Epifluoreszenzmikroskops und wählen Sie das 60x Ölobjektiv.

In diesem Beispiel handelt es sich bei der Probe um NIH 3T3-Fibroblasten, bei denen der Golgi-Apparat, der Zellkern und die Aktinfasern angefärbt wurden. Fokussieren Sie vorsichtig mit hellem Feldlicht, bis sich die Eierbecher und Zellen in der Betrachtungsebene befinden. Wählen Sie den interessierenden Bereich aus, fokussieren Sie ihn und starten Sie die Bildaufnahme.

Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Eierbecher in einen Mikroskophalter legen und ihn mit einem Milliliter 10%iger FCS L15-Zellkulturmedium füllen. Montieren Sie die Halterung auf dem Tisch des Mikroskops. Um Verdunstung zu vermeiden, setzen Sie einen Glasdeckel auf den Halter.

Beobachten Sie die Zellen mit einem inversen Epifluoreszenzmikroskop, das mit einem 60-fachen Ölobjektiv ausgestattet ist. In diesem Beispiel werden HeLa-Zellen verwendet, die fluoreszenzmarkiertes Myosin und Aktin exprimieren, zwei Schlüsselmoleküle, die am zytokinetischen Ringschluss während der Mitose beteiligt sind. Wählen Sie die Region von Interesse aus und suchen Sie nach einem zytokinetischen Ring, indem Sie entweder den GFP- oder den Texas Red-Kanal verwenden.

Fokussieren Sie genau. Lassen Sie die automatische Erfassung in beiden Kanälen laufen, bis der Ring vollständig geschlossen ist. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Eierbechern zeigen, dass ihre Form und Größe sehr regelmäßig sind.

Bei Zellen mit starren Wänden, wie z. B. Spalthefe, können die Eierbecher den zytokinetischen Ring ausrichten. Bei Säugetierzellen zeigt ein Vergleich zwischen Zellen auf 3D-Eierbechern und 2D-flachen Oberflächen, dass erstere eine geordnete Anordnung mit dem homogenen kugelartigen Phänotyp bilden, während letztere eine ungeordnete und heterogene Morphologie aufweisen. Zellen auf Eierbechern zeigen auch eine Verringerung der Anzahl der Stressfasern, was durch die Anzahl der bescheidenen Auswirkungen der Behandlung mit Blebbistatin angezeigt wird.

Der Golgi-Apparat zeigt bei 2D-Kulturen typischerweise einen erweiterten Phänotyp, während er bei Eierbechern einen kompakteren Phänotyp aufweist. Dies wurde durch eine Quantifizierung der Golgi-Phänotypen bestätigt. Schließlich ist der Zellkern auf 2D-Oberflächen zufällig orientiert, während er auf Eierbechern orthogonal auf der xy-Ebene orientiert ist, sowohl in Wildtyp- als auch in Blebbistatin-behandelten Zellen.

Eine Bestimmung der Sphärizitätswerte des Zellkerns zeigt, dass die Eierbecher die normale Sphärizität des Zellkerns nicht beeinflussen. Der Unterschied zwischen Wildtyp- und Blebbistatin-behandelten Zellen auf Eierbechern deutet jedoch darauf hin, dass die Eierbecher eine reale Wirkung des Medikaments zeigen, die in 2D maskiert ist. Lebendzellstudien mit Eierbechern ermöglichen die Identifizierung neuartiger aktiver Prozesse, die in Standardkulturen nicht sichtbar sind.

Zum Beispiel wurden periodische Ansammlungen von Myosin, die sich radial bewegen, wenn sich der zytokinetische Ring während der Mitose schließt, in HeLa-Zellen beobachtet. Einmal gemeistert, können die Eierbecher in weniger als sechs Stunden aus einer Replik hergestellt werden, und das Befüllen der Zellen kann in etwa 15 Minuten erfolgen. Beim Versuch dieses Prozesses ist es wichtig, die Größe der Eierbecher für die untersuchten Zellen zu haben.

Dieses Verfahren kann weiter an High-Content-Screening-Plattformen in Pharmaunternehmen für Massenscreening-Aktivitäten und auch an personalisierte diagnostische Assays von Patienten zur Beurteilung individueller spezifischer Behandlungen angepasst werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Mikrokaries für Eierbecher herstellen und verwenden. Die Eierbecher standardisieren und ordnen eine Vielzahl ähnlicher Systeme aus, die von einzelnen Zellen ohne Wände, wie z. B. Säugetierzellen, bis hin zu Systemen mit Wänden, wie Hefe und Embryo, reichen.