Name: Bestellen Einzelzellen und Einzel Embryos in 3D Confinement: Ein neues Gerät für High Content Screening (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von PDMS-Mikrohöhlenarrays zur Anordnung einzelner Zellen in 3D-Umgebungen für verbesserte Hochdurchsatz-Screenings in der Zellbiologie.

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Wir erkennen an L. Brino (IGBMC High Content Screening-Anlage, Illkirch, Frankreich) für die Bereitstellung von uns mit dem Anti-Giantin Antikörper, M. Labouesse Lab. für C. elegans (IGBMC) und B. Séraphin Lab. für Bäckerhefe (IGBMC), E. Paluch und A. Hyman für fluoreszierende HeLa-Zellen (MPI-CBG, Dresden), J. Moseley (Dartmouth Medical School) und JQ Wu (Ohio State University) für Spalthefezellen; A. Hoël und F. Evenou für experimentelle Hilfe, C. Rick (IBMC, Straßburg, Frankreich) für technische Hilfe und JC Jeannot (Femto-st, Frankreich) für die Hilfe in Mikrofabrikations. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem CNRS, der Universität Straßburg unterstützt wurde, Conectus, La Fondation pour la Recherche Médicale und die ci-FRC von Straßburg.

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</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Replica Formen wurde verwendet, um die &quot;eggcups &#39;herzustellen. Der Herstellungsprozess muss nicht ein sauberes Zimmer; es ist leicht und einfach, auch wenn einige der Praxis erforderlich sein kann. Insbesondere die PDMS-Stempel Loslassen ist der wichtigste Schritt, um einen großen Bereich von hoher Qualität &quot;eggcups &#39;zu erzeugen. Aus diesem Grund hat besondere Sorgfalt in diesem Schritt genommen werden. Wenn dieser Schritt wiederholt fehlschlägt, sollten Sie die Plasma-Reiniger Parameter an die Silanis...

Strom in vitro zellbasierten Assays , sind zweidimensionale (2D). Diese Konfiguration ist nicht natürlich für Säugerzellen und ist daher nicht physiologisch relevant 1; Zellen zeigen eine Vielfalt von Formen, Größen und heterogenen Phänotypen. Sie stellen zusätzliche ernsthafte Einschränkungen bei dem Screening-Anwendungen angewandt, wie beispielsweise eine ungeordnete Verteilung innerhalb der Ebene und extreme Phenotypen von Zellorganellen (Stressfasern, insbesondere). Dies ist besonders wichtig in klinischen Studien für Drogentests, bei denen eine hohe Budgets jedes Jahr ausgegeben. Die meisten dieser Medikamente versagen jedoch, wenn die Tiermodelle angewandt wegen der künstlichen 2D-Kulturbedingungen in frühen Phasen der Wirkstoffscreening. Zusätzlich kann durch diesen Ansatz verwenden, bestimmte Zellorganellen nicht richtig dargestellt werden kann, wie beispielsweise die zytokinetischen Actomyosin Ring während Mitose und allgemein Strukturen, die in der Ebene senkrecht zur Ebene des Beobachtungs entwickeln sich. Etwasneue 2D - Assays wurden zu überwinden , um die oben erwähnten Nachteile und wichtige Erkenntnisse über Zytoskelettorganisation wurden 2,3 beobachtet vorgeschlagen. Allerdings sind diese Tests noch vorhanden eine ernsthafte Einschränkung: zeigen Zellen , die einen sehr Ausbreitung Phänotyp im Gegensatz zu dem, was in vivo beobachtet wird, wo Zellen , die eine 3D - Architektur präsentieren. Diese Artefakte mit dem Kulturverfahren verbunden sind, können auslösen nichtphysiologischen Eigenschaften wie verbesserte Stressfasern 1,4,5. Dreidimensionale Zellkultur - Assays bieten mehrere Vorteile im Vergleich zu den 2D - Umgebungen 6,7. Sie sind physiologisch relevanter, und die Ergebnisse sind daher sinnvoll. Als Beispiel zeigen in Hydrogelen eingebetteten Zellen 3D-ähnliche Strukturen , aber ihre Morphologien unterscheiden sich von einer Zelle in eine andere 8,9. Jedoch ihre Morphologien unterscheiden sich von einer Zelle zur anderen, die Screening-Anwendungen erschwert. Eine alternative Strategie ist Single einzubettenZellen in mikrostrukturierten Hohlräumen 10,11. Zell Position, Form, Polarität und interne Zellorganisation kann dann normalisiert werden. Neben der Bereitstellung von 3D-like Architektur an Zellen, Mikrokavitäten ermöglicht auch für High-Content - Screening - Studien 10,12-14; Einzelzellen können in Microarrays und Zellorganellen und ihre Entwicklungen bestellt werden können parallel beobachtet werden. Diese Regelmäßigkeit liefert gute Statistiken mit geringen Anzahl von Zellen und eine bessere zeitliche / räumliche Auflösungen. Nützliche Verbindungen sind leichter zuverlässig zu identifizieren. In dieser Studie zeigen wir die Herstellung und Anwendung einer neuen 3D-like Kultursystem einzelne Zellen für die High-Content-Screening - Anwendungen 10,12,13. Die Vorrichtung besteht aus einer Anordnung von elastomerem Mikrokavitäten (10 5 Hohlräumen / cm 2), geprägt &#39;eggcups&#39; (EC). Abmessungen und das Gesamtvolumen der EG in dieser Arbeit sind mit dem typischen Volumen einzelner NIH3T3 und HeLa-Zellen optimiertwährend der Zellteilung. Morphologie der Hohlräume - zylindrisch - richtig zu orientieren Zellform zur Sichtbarmachung von aktiven Prozessen ausgewählt wird. Replica Form wird Muster eine Anordnung von EC auf einen dünnen Polydimethylsiloxan (PDMS) Schicht auf einem Glas geklebt verwendet 15,16 Deckglas. Die Zellen werden in der EC durch Zentrifugation eingeführt. Wir berichten hier über die Beobachtung und Normalisierung der Zellorganellen (Aktin-Stressfasern, Golgi-Apparat und Kern) in 3D (EG) im Vergleich zu den gleichen Zellen auf 2D (flach) Oberflächen. Wir berichten auch die Beobachtung der aktiven dynamische Prozesse wie die Schließung des zytokinetischen Aktomyosin Ring während Mitose 17. Schließlich zeigen wir Ergebnisse dieser Methodik auf anderen Systemen mit starren Wänden, wie Bäckerhefe, Spalthefe und C. elegans Embryonen , die die Anwendbarkeit unserer Methodik auf eine breite Palette von Modellsystemen bestätigt. Wir präsentieren neben eine vollständige und genaue protokoll, um die &#39;eggcups&#39; für 3D-Mikro herzustellen und anzuwenden. Unser Ansatz ist einfach und nicht ein sauberes Zimmer benötigen. Wir gehen davon aus, dass diese neue Methode besonders interessant für Wirkstoff-Screening werden Assays und personalisierte Medizin, in der Ersatz von Petrischalen. Schließlich wird unsere Vorrichtung zur Untersuchung der Verteilung von Zellen Reaktionen auf externe Stimuli, beispielsweise bei Krebs 18 oder in der Grundlagenforschung 19 nützlich sein.

<table><tbody><tr><td>ddH20 (ultrarein)</td><td>Millipore-Verwenden</td><td></td> <td>Sie immer frisches Wasser.</td></tr><tr><td>Parafilm (Kunststofffolie)</td><td>Bemis</td><td>PM-999</td><td>Kleben Sie Parafilm mit einigen Wassertropfen auf den Labortisch und sorgen Sie für eine perfekte Ebenheit der Oberfläche.</td></tr><tr><td>Fotomaske</td><td>Selba</td><td>-</td><td><a href="http://www.selba.ch/" name="BEREICH! D4">http://www.selba.ch</a></td></tr><tr><td>Siliziumwafer</td><td>Siltronix</td><td>-</td><td><a href="http://www.siltronix.com/">http://www.siltronix.com/</a></td></tr><tr><td>SU-8 Fotolack</td><td></td><td>MicroChem 2000 Serie</td><td><a href="http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm">http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm&nbsp; </a></td></tr><tr><td>Arbeiten in einem Abzug ist erforderlich; weitere Informationen finden Sie im Datenblatt des Herstellers.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Entwickler</td><td>MicroChem</td><td>-</td><td><a href="http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm">http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm&nbsp; </a></td></tr><tr><td>Arbeiten in einem Abzug ist erforderlich; weitere Informationen finden Sie</td><td></td><td></td><td></td>im Datenblatt des Herstellers</tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19030</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&amp; region=CA">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&amp; region=CA</a></td></tr><tr><td>Verfügbar von mehreren Unternehmen.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote (silikonisierendes Reagenz )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML<</td><td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&amp; region=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&amp; region=FR&nbsp; </a></td></tr><tr><td>schädlich, das Arbeiten in einem Abzug ist erforderlich; weitere Informationen finden Sie im Datenblatt des Herstellers.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlortrimethylsilan (TMCS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>386529-100ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr&region=FR&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">TMCS erzeugt akute Inhalations- und Hauttoxizität und ist leicht entzündlich (mit Zündrückschlag, der über beträchtliche Entfernungen auftreten kann), daher sollte es in einem Abzug fern von Zündquellen verwendet werden</td></tr><tr><td>Nitrilhandschuhe</td><td>Kleenguard</td><td>57372</td><td><a href="http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m">http://www.kcprofessional. com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m</a></td></tr><tr><td>Erhältlich von mehreren Herstellern.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasdeckgläser #0</td><td>Knittel Glas</td><td>KN00010022593</td><td><a href="http://www.knittelglass.com/index_e.htm">http://www.knittelglass.com/index_e.htm</a></td></tr><tr><td>Sehr zerbrechlich. Vorsichtig manipulieren.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scharfe Pinzette</td><td>SPI</td><td>0WSSS-XD</td><td>http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7</td></tr><tr><td>50 ml Tube</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp</td></tr><tr><td>Erhältlich von mehreren Herstellern.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184 Bausatz</td><td><a href="http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx? R=131DE">http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx? R=131EN&nbsp; </a></td></tr><tr><td>Die Packung enthält sowohl PDMS-Base als auch Härtungsmittel. Ähnliche Elastomere sind von mehreren Unternehmen erhältlich.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objektträger aus Mikroskopglas</td><td>Dutscher</td><td>100001</td><td><a href="http://www.dutscher.com/frontoffice/search">http://www.dutscher.com/frontoffice/search</a></td></tr><tr><td>Erhältlich von mehreren Firmen.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium mit hohem Glukosegehalt</td><td>Fisher Scientific</td><td>41965-039<</td><td>a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search? LBCID=12301479& keyWord=41965-039& store=Wissenschaftlich& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search? LBCID=12301479& keyWord=41965-039& store=Wissenschaftlich& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>Serum für Rinderkälber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8056-500ML</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&amp; region=CA">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&amp; region=CA</a></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsin-EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>25200-072<</td><td>a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&amp; store=Wissenschaftlich& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&amp; store=Wissenschaftlich& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td><a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&amp; store=Wissenschaftlich& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&amp; store=Wissenschaftlich& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>PBS liegt bei 10x und sollte mit ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-15 Medium</td> auf 1x verdünnt werden <td>Fisher Scientific</td><td>21083-027<</td><td>a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&amp; store=Wissenschaftlich& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&amp; store=Wissenschaftlich& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD</a></td></tr><tr><td>Medium für Atmosphären ohne CO2 Steuerung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-5MG</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; term=F1141-5MG& lang=de& region=CA& Fokus=Produkt& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; term=F1141-5MG& lang=de& region=CA& Fokus=Produkt& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax</a></td></tr><tr><td>Penicillin & Streptomycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140-122<</td><td>a href="http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&amp; store=Wissenschaftlich& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=CHEM">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&amp; store=Wissenschaftlich& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=CHEM</a></td></tr><tr><td>Petrischale P35</td><td>Greiner</td><td>627102</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com/">http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/</a></td></tr><tr><td>Petrischale P60</td><td>Greiner</td><td>628163</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com/">http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/</a></td></tr><tr><td>Petrischale P94</td><td>Greiner</td><td>633179</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com/">http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/</a></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 3 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&amp; region=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&amp; region=FR&nbsp; </a></td></tr><tr><td>Besonders schädlich für die Augen, Arbeit im Abzug erforderlich; weitere Informationen finden Sie im Datenblatt des Herstellers.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton 0.5 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443-100ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; Begriff=93443-100ML& lang=de& region=CA& Fokus=Produkt& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; Begriff=93443-100ML& lang=de& region=CA& Fokus=Produkt& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax</a></td></tr><tr><td>Phallodin-Grün Fluoreszierendes Alexa Fluor 488</td><td>InVitrogen</td><td>A12379</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379? CID=Suche-a12379">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379? CID=Suche-a12379&nbsp; </a></td></tr><tr><td>Pulver in 1,5 ml Methanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>auflösen Alexa Fluor 647</td><td>InVitrogen</td><td>A21245</td><td>1:200 Verdünnung in PBS 1x</td></tr><tr><td>Kaninchen polyklonales Anti-Giantin</td><td>Abcam</td><td>ab24586</td><td>1:500 Verdünnung in PBS 1x</td></tr><tr><td><a href="http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html">http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html&nbsp; </a></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen-Anti-Anillin</td><td>Mit freundlicher Genehmigung von M. Glotzer, veröffentlicht in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin ist ein Gerüstprotein, das RhoA, Aktin und Myosin während der Zytokinese verbindet. Aktuelle Biologie 18, 30&ndash; 6 (2008).</td><td></td><td>1:500 Verdünnung in PBS 1x</td></tr><tr><td>Anti-Phosphotyrosin</td><td>Transduktion Lab</td><td>610000</td><td>http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000</td></tr><tr><td>Cy3 Ziegen Anti-Kaninchen&nbsp;</td><td>Jackson Immunforschung</td><td>111-166-047</td><td><a href="http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp">http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp&nbsp; </a></td></tr><tr><td>1:1.000 Verdünnung in PBS 1x</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417&nbsp;</td><td><ein href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&amp; region=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&amp; region=FR&nbsp; </a></td></tr><tr><td>1 mg/ml für 1 min</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; Begriff=G2025& lang=de& region=CA& Fokus=Produkt& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; Begriff=G2025& lang=de& region=CA& Fokus=Produkt& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax</a></td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410-500ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; term=M8410-500ML& lang=de& region=CA& Fokus=Produkt& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&amp; term=M8410-500ML& lang=de& region=CA& Fokus=Produkt& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partimax</a>HeLa-Zellen</td></tr> <tr><td></td><td></td><td>-</td> <td>Säugetierzellen sind von vielen Unternehmen erhältlich. Siehe auch Tabelle 1</td></tr><tr><td>NIH3T3-Zellen</td><td>ATCC-Säugetierzellen</td><td></td> <td>sind von vielen Unternehmen erhältlich. Siehe auch Tabelle 1</td></tr><tr><td>Spalthefe&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>Für Details zu den Stämmen wenden Sie sich bitte an den entsprechenden Autor. Siehe auch Table 1</td></tr><tr><td>C. elegans Würmer</td><td>-</td><td>-</td><td>Für Details wenden Sie sich bitte an den entsprechenden Autor.&nbsp; Siehe auch Tabelle 1</td></tr><tr><td>YES (Agar) + 5 enthaltene Nahrungsergänzungsmittel</td><td>MP Biomedicals</td><td>4101-732<</td><td>a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&amp; s=Suche">http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&amp; s=Suche&nbsp; </a></td></tr><tr><td>Zur Zubereitung: Befolgen Sie die Anweisungen auf der Verpackung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>JA (Medien) + 5 enthaltene Nahrungsergänzungsmittel</td><td>MP Biomedicals</td><td>4101-522</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&amp; s=Suche">http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&amp; s=Suche&nbsp; </a></td></tr><tr><td>Zur Vorbereitung: Befolgen Sie die Anweisungen auf der Verpackung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMM (Media)</td><td>MP Biomedicals</td><td>4110-012<</td><td>a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&amp; s=Suche">http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&amp; s=Suche&nbsp; </a></td></tr><tr><td>Zur Vorbereitung: Befolgen Sie die Anweisungen auf der Verpackung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter sterilisiert EMM (Medien) - Nur für die Bildgebung</td><td>MP Biomedicals</td><td>4110-012</td><td>Zur Vorbereitung: Befolgen Sie die Anweisungen auf der Verpackung. Filter sterilisieren die Medien mit einem 0,22 & Mikro; m Filter statt Autoklavieren. Dies verleiht dem Medium Transparenz und reduziert die Autofluoreszenz.</td></tr><tr><td>Ergänzungen (für EMM)</td><td>MP Biomedicals</td><td>4104-012</td><td><a href="http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&amp; s=Suche">http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&amp; s=Suche</a></td></tr><tr><td>&nbsp;( Geben Sie 225 mg/l in das EMM-Medium, bevor Sie es autoklavieren oder filtrieren)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stericup und Steritop Vaccum-betriebene Sterilfilter</td><td>Millipore</td><td>-</td><td><a href="http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&amp; Tab1=2& tab2=1#tab2=1:tab1=2">http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&amp; Tab1=2& tab2=1#tab2=1:tab1=2</a></td></tr></tbody></table>

bestellen einzelzellen und einzel embryos in 3d confinement: ein neues gerät für high content screening

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biologische Zellen sind in der Regel auf ebenen (2D) Oberflächen beobachtet. Dieser Zustand ist nicht physiologisch, und Phänotypen und Formen sind sehr variabel. Screening auf Basis von Zellen in solchen Umgebungen haben daher gravierende Einschränkungen: Zellorganellen zeigen extreme Phänotypen, Zelle Morphologien und Größen sind heterogene und / oder spezifische Zellorganellen nicht richtig sichtbar gemacht werden kann. Darüber hinaus werden in vivo Zellen in einer 3D - Umgebung angeordnet ist ; In dieser Situation zeigen Zellen unterschiedliche Phänotypen vor allem wegen ihrer Wechselwirkung mit der umgebenden extrazellulären Matrix des Gewebes. Um Reihenfolge der einzelnen Zellen in einem physiologisch relevanten 3D - Umgebung für zellbasierte Assays zu standardisieren und zu erzeugen, berichten wir hier die Mikrofertigung und Anwendungen einer Vorrichtung zur In - vitro - 3D - Zellkultur. Diese Vorrichtung besteht aus einer 2D - Anordnung von Mikrokavitäten (typischerweise 10 5 Kavitäten / cm 2), die jeweils mit einzelnen Zellen oder Embryonen gefüllt. Zell position, Form, Polarität und interne Zellorganisation dann normalisiert werden eine 3D-Architektur zeigt. Wir verwendeten Replik Formens Muster eine Reihe von Mikrokavitäten, &#39;eggcups&#39;, auf eine dünne Polydimethylsiloxan (PDMS) Schicht auf einem Deckglas geklebt. Hohlräume wurden mit Fibronectin bedeckt Haftung zu erleichtern. Zellen wurden durch Zentrifugation eingesetzt. Füllprozentsatz wurde für jedes System optimiert, um 80% ermöglicht werden. Die Zellen und Embryonen Lebensfähigkeit wurde bestätigt. Wir wendeten diese Methode zur Visualisierung von Zellorganellen wie Nukleus und Golgi-Apparat, und aktive Verfahren, wie das Schließen des Rings während zytokinetischen Zellmitose zu studieren. Dieses Gerät erlaubt die Identifizierung von neuen Features, wie zB periodische Ansammlungen und Inhomogenitäten von Myosin und Aktin während der zytokinetischen Ringschluss und verdichtet Phänotypen für Golgi und Kern-Ausrichtung. Wir gekennzeichnet , das Verfahren für Säugetierzellen, Spalthefe, Bäckerhefe, C. elegans with spezifische Anpassung in jedem Fall. Schließlich machen die Eigenschaften dieses Gerät interessant besonders für Arzneimittel-Screening-Assays und personalisierte Medizin.

Die 'eggcups' (EG) sind eine neue hohen Gehalt-Screening-Methode, die die Visualisierung von orientierten Zellen und Embryonen in einer 3D-Umgebung ermöglicht. Darüber hinaus werden einige zelluläre Prozesse, die in Standard - 2D (flach) Kulturen zu beobachten schwierig sind, können durch diese neue Methode zu beobachten. 1a zeigt eine Zusammenfassung des Verfahrens für die EG - Mikrofabrikations (siehe auch Abschnitt 1 in der oben beschriebenen Protokoll ). Das Verfahren ist einfach, schnell, effizient...

Wir berichten über eine Vorrichtung und ein neues Verfahren Zellen und Embryonen zu untersuchen. Einzelne Zellen werden in Mikroresonator-Arrays genau bestellt. Ihre 3D Haft ist ein Schritt in Richtung 3D-Umgebungen unter physiologischen Bedingungen auf und lässt zu Organell Orientierung. Durch die Steuerung der Zellform, minimiert diese Setup-Variabilität in Standardtests berichtet.

Bestellen Einzelzellen und Einzel Embryos in 3D Confinement: Ein neues Gerät für High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Morphologie und Dynamik von zellulären Organellen auf einer Reihe von Mikrokavitäten zu beobachten, die die 3D-Umgebung unter physiologischen Bedingungen nachahmen. Bei Zellen mit starren Wänden, wie z. B. Spalthefe, können Hohlräume zelluläre Strukturen organisieren und ausrichten. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Array von PDMS-Säulen von einem Master hergestellt wird, um ein Array von PDMS-Mikrokavitäten, die als Eierbecher bezeichnet werden, durch Nachbildungen zu erhalten.In einem zweiten Schritt werden die Eierbecher mit Proteinen der extrazellulären Matrix funktionalisiert und in ein Röhrchen mit einem zylindrischen, maßgefertigten Kunststoffstück eingeführt, das die Mikrokavitätenprobe stützt und das Einbringen einzelner Säugetierzellen in jeden der Mikrokavitäten ermöglicht. Als nächstes werden die mit Zellen gefüllten Eierbecher entnommen und mit dem Wirkstoff oder der Verbindung von Interesse inkubiert, um den Phänotyp und die dynamischen Prozesse von Zellen in einem 3D-Einschluss zu untersuchen. Es werden Ergebnisse erzielt, die Unterschiede im Zellphänotyp und neue dynamische Strukturen zeigen, die im V

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung einzelner Zellen aus Zebrafischembryonen, zur Anreicherung von Zellen von Interesse, zum Einfangen von Zebrafischzellen in mikrofluidisch basierten Einzelzell-Multiplexsystemen und zur Bewertung der Genexpression von einzelnen Zellen.

Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung und Kultivierung einzelner Zellen mit einer mikrofluidischen Plattform, die ein neues Mikrotiter-Designkonzept verwendet, um eine hocheffiziente Einzelzellisolierung und eine langfristige klonale Kultur zu ermöglichen.

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryonen und Larven ist eine entscheidende, aber anspruchsvolle Technik in vielen Modellen der Zebrafisch. Hier präsentieren wir Ihnen eine Reihe von Microscale Tools zur Unterstützung bei der Stabilisierung und Ausrichtung der Zebrafisch für Mikroinjektion und Imaging.

Mikrostrukturierter Apparate für optimierte Mikroinjektion und Imaging von Zebrafischlarven

Wir präsentieren Ihnen ein Verfahren zur Steuerung der erste Zellform der Cluster in einer 3D extrazelluläre Matrix, eine wiederholbare Musterbildung zu erhalten. Eine kubische Gerät mit zwei verschiedenen Hydrogele wird eingesetzt, um Multi-direktionalen Imaging für Gewebebildung Muster zu erreichen.

Erste 3D Cluster Zellkontrolle in einem Hybrid Gel Cube Gerät für wiederholbare Muster Formationen

Wir beschreiben eine Methode, um Geräte für die 3D-Kultur zu konstruieren und mit Zellen und multikellulären Organoiden zu experimentieren. Dieses Gerät ermöglicht die Analyse von zellulären Reaktionen auf lösliche Signale in 3D-Mikroumgebungen mit definierten Chemoattractged-Steigungen. Organoide sind besser als einzelne Zellen, wenn es um die Erkennung schwacher lauter Eingänge geht.

3D-Analyse von multizellulären Reaktionen auf tschoattraktive Verläufe

In diesem Protokoll wird erläutert, wie bakterielle Proben für die dreidimensionale Bildgebung vorbereitet und montiert werden und wie die dreidimensionale Form von E. coli aus diesen Bildern rekonstruiert wird.

Dreidimensionale Bildgebung von Bakterienzellen für genaue zelluläre Darstellungen und präzise Proteinlokalisierung

Diese Arbeit beschreibt ein semi-high-throughput-Protokoll, das eine gleichzeitige 3D-Zeitraffer-Bildgebung der Embryogenese in 80–100 C. elegans Embryonen in einem einzigen Nachtlauf ermöglicht. Darüber hinaus sind Bildverarbeitungs- und Visualisierungstools enthalten, um die Datenanalyse zu optimieren. Die Kombination dieser Methoden mit kundenspezifischen Reporterstämmen ermöglicht eine detaillierte Überwachung der Embryogenese.

Ein Instrument zur Analyse der C. elegans Embryonal development

Die gesamte 3D-Struktur und der zelluläre Gehalt von Organoiden sowie ihre phänotypische Ähnlichkeit mit dem ursprünglichen Gewebe können mit dem hier beschriebenen einzelligen 3D-Bildgebungsprotokoll erfasst werden. Dieses Protokoll kann auf eine breite Palette von Organoiden mit unterschiedlichem Ursprung, Größe und Form angewendet werden.

Single-Cell Resolution Dreidimensionale Bildgebung intakter Organoide

Hier wird ein Protokoll zur Mikroinjektion und gleichzeitigen Abbildung mehrerer Drosophila-Embryonen während der embryonalen Entwicklung mit einem plattenbasierten, hochinhaltigen Imager vorgestellt.

Drosophila Embryo Vorbereitung und Mikroinjektion für die Live-Zellmikroskopie mit einem automatisierten High Content Analyzer durchgeführt

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von drei verschiedenen Arten von Sphäroiden in einer Weise, die sie für ein groß angelegtes High-Content-Screening und -Analyse geeignet macht. Darüber hinaus werden Beispiele vorgestellt, die zeigen, wie sie auf Sphäroid- und Einzelzellebene analysiert werden können.

Eine robuste Methode für die großtechnische Produktion von Sphäroiden für High-Content-Screening- und Analyseanwendungen

Erfahren Sie die Herstellung von PDMS-Mikrohöhlenarrays zur Anordnung einzelner Zellen in 3D-Umgebungen für verbesserte Hochdurchsatz-Screenings in der Zellbiologie.

Bestellen Einzelzellen und Einzel Embryos in 3D Confinement: Ein neues Gerät für High Content Screening

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