Immundetektion von Außenmembranproteinen mittels Durchflusszytometrie von isolierten Mitochondrien

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Proteine von Interesse auf der ER-Mitochondrienmembran mit einem Antikörper Ihrer Wahl zu immunmarkieren und gleichzeitig mit der mitochondrialen Funktion zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zuerst das interessierende Gewebe wie das Gehirn, das Rückenmark oder die Leber von einer Ratte gesammelt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Mitochondrien aus dem Gewebe, in diesem Fall dem Rückenmark, zu isolieren.

Das Rückenmark wird mit einem Tanz homogenisiert. Homogenisator und andere Organellen und Zelltagestrümmer werden durch eine Reihe von Zentrifugationsschritten entfernt, bis ein roher mitochondrialer Gaumen erreicht ist. Myelin, eine Hauptverunreinigung des Zentralnervengewebes, wird durch Mischen von Mitochondrien mit einer Lösung aus 12%iger Opti-Vorbereitung und erneuter Zentrifusion entfernt. Als nächstes werden die isolierten Mitochondrien mit einem primären Antikörper der Wahl markiert, gefolgt von einem sekundären Antikörper, der an ein Fluor konjugiert ist.

Der letzte Schritt besteht darin, Fluoreszenzfarbstoffe hinzuzufügen, um die mitochondriale Identität bzw. funktionelle Parameter zu bestätigen. Letztendlich wird die Durchflusszytometrie verwendet, um die relative Häufigkeit von mitochondrialen Altomembranen in der normalen Physiologie oder Krankheit zu zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Mikroskopie besteht darin, dass sie einen hohen Durchsatz und eine schnelle Quantifizierung von Tausenden von einzelnen Mitochondrien ermöglicht.

Die in dieser Studie verwendeten Tiere wurden in strikter Übereinstimmung mit einem Protokoll behandelt, das vom institutionellen Ausschuss für den Schutz von Tieren C-R-C-H-U-M genehmigt wurde und den nationalen Standards entspricht, die vom Canadian Council on Animal Care Air festgelegt wurden. Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie ein ganzes intaktes Rückenmark, das von einer Ratte entnommen wurde, in einen Fünf-Milliliter-Glashomogenisator, der fünf Volumina Homogenisierungspuffer enthält. Stellen Sie den Glashomogenisator auf Eis und homogenisieren Sie das Gewebe von Hand, bis keine größeren Gewebestücke mehr übrig sind, was etwa acht Hübe erfordert.

Übertragen Sie das Homogenat auf zwei oder drei Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es bei 1.300 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Als nächstes pipettieren Sie den S-Überstand in ein Fünf-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen. Geben Sie 750 Mikroliter Homogenisierungspuffer in das Pellet und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig. Zentrifugieren Sie dann die Suspension und resuspendieren Sie das Pellet

Um kleine Ablagerungen zu entfernen, ziehen Sie zwei weitere Male alle Überstände in dasselbe Fünf-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen und setzen Sie die Röhrchen dann in einen Ultrazentrifugenrotor ein. Ausgestattet mit schwingenden Eimern zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 17.000 G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, bewahren Sie den Überstand für die weitere Verarbeitung auf, wenn die zytosolische Fraktion von Interesse ist.

Als nächstes wird das Pellet, das die rohe mitochondriale Fraktion in vier Millilitern Homogenisierungspuffer ist, der 50 millimolare Kaliumchlorid-Zentrifuge enthält, erneut suspendiert. Das resuspendierte Pellet bei 17.000 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius in einem schwingenden Schaufelrotor, dann das Supinat verwerfen und das Pellet in einem neuen Fünf-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen bei genau 800 Mikrolitern des resuspendierten Pellets vorsichtig in 800 Mikrolitern Homogenisierungspuffer resuspendieren. Pipettieren Sie anschließend 200 Mikroliter Jod Dal auf die 800 Mikroliter des resuspendierten Pellets, um eine Endkonzentration von 12 % Jod Dal zu erreichen.

Mischen Sie den Inhalt des Röhrchens vorsichtig, aber gründlich mit einer P 1000-Pipette und zentrifugieren Sie dann 15 Minuten lang bei 17.000 Mal G bei vier Grad Celsius in einem schwingenden Eimerrotor, saugen Sie die Myelinschicht am oberen Rand des Röhrchens ab und entsorgen Sie das Supinat vorsichtig, da die Palette locker sein kann. Bei der Wiederbelebung wird das Pellet in vier Millilitern Homogenisierungspuffer suspendiert. Zentrifugieren Sie dann Ihren Gewinn bei 17.000 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius in einem schwingenden Schaufelrotor.

Entsorgen Sie das Supinat und die Wiederbelebung. Das Pellet wird in vier Millilitern Homogenisierungspuffer suspendiert. Wiederholen Sie dann die Zentrifugation erneut und entfernen Sie das Rückenlagemittel reus.

Biegen Sie das fertige Pellet in 100 bis 200 Mikroliter Homogenisierungspuffer und geben Sie es in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Bestimmen Sie die Proteinmenge in jeder Probe mit einem Standard-Proteinquantifizierungsassay wie Bionic Acid Assay oder BCA. Wenn Sie die Proben für die Quantifizierung vorbereiten, verdünnen Sie die Proben und die Standardkurve in 2 % Natriumsulfat, um eine angemessene Solubilisierung der Mitochondrien zu gewährleisten.

Für jede zu testende Färbemischung pipettieren Sie 25 Mikrogramm der isolierten Mitochondrien in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentriröhrchen. Stellen Sie sicher, dass Sie in jedes Experiment eine ungefärbte Probe sowie eine geeignete Isotypkontrolle für jeden getesteten Antikörper einbeziehen: Zentrifugen Sie jede Probe bei 17.000 mal G für zwei Minuten bei vier Grad Celsius in einer Tisch-Mikrozentrifuge. Entfernen Sie dann das Supinat und resuspendieren Sie die isolierten Mitochondrien in 50 Mikrolitern Mitochondrienpuffer

Ergänzt mit 10 % fettsäurefreiem BSA inkubieren Sie die Lösung 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius und fügen Sie dann 20 Mikrogramm des Primärantikörpers pro Milliliter Lösung hinzu. Inkubieren Sie die isolierten Mitochondrien mit dem primären Antikörper 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius, um den ungebundenen Antikörper auszuwaschen, zentrifugieren Sie jede Probe und entsorgen Sie die Narant in Rückenlage. Als nächstes resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 200 Mikrolitern Mitochondrienpuffer und wiederholen dann den Zentrifugationsschritt, verwerfen Sie die Rückenlage und resuspendieren Sie das Pellet in 50 Mikrolitern Mitochondrienpuffer

Fügen Sie 0,5 Mikrogramm des Sekundärantikörpers pro Milliliter Probe hinzu. Anschließend werden die Proben 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius lichtgeschützt inkubiert. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie jede Probe und verwerfen Sie das Supinat, das den ungebundenen Sekundärantikörper enthält. Reese.

Suspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern Mitochondrienpuffer und zentrifugieren Sie die Probe. Wieder. Entfernen Sie dann das Supinat und Reese. Suspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern Mitochondrienpuffer, um sicherzustellen, dass es sich bei den beobachteten Ereignissen tatsächlich um Mitochondrien handelt.

Färben Sie die Probe 15 Minuten lang im Dunkeln mit einem mitochondrienspezifischen Fluoreszenzfarbstoff wie z. B. MIT tracker green von in Vitrogen. Wenn keine weitere Färbung erforderlich ist, um andere funktionelle Parameter zu untersuchen, dann überführen Sie die markierte Probe in ein Röhrchen, das für die Beladung in ein Durchflusszytometer geeignet ist. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf und gehen Sie zur Entnahme zu einem Durchflusszytometer, um zu überprüfen, ob die isolierten Mitochondrien ein intaktes Transmembranpotenzial aufweisen. Färben Sie die Mitochondrien mit 100 nanomolaren Tetraethylstäbchen-Domine-Methylester für 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln als Kontrolle für die Färbung mit Tetraethylstäbchen-Domine.

Methylester färbt die isolierten Mitochondrien mit 100 nanomolaren Tetraethylstäbchen-dominanten Methylestern in Gegenwart von 100 mikromolaren Carbonylcyanid m Chlorphenol HydroOne. Diese Chemikalie ist eine mitochondriale Entkopplung und wird die Mitochondrien depolarisieren, um zu überprüfen, ob die isolierten Mitochondrien Superoxid produzieren, färben Sie die Mitochondrien mit einem geeigneten Superoxid-Indikator, wie z. B. Mitosen Socken rot von in Vitrogen für 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln als Kontrolle für die mitochondriale Superoxidproduktion. Bleiben Sie in den isolierten Mitochondrien mit Farbstoff in Gegenwart von 10 mikromolaren Antimycinen.

Ein Antimycin A ist ein Inhibitor des dritten Komplexes der Atmungskette und wird die mitochondriale Superoxidproduktion erhöhen, bevor die Akquisition beginnt. Richten Sie das Gerät wie im beigefügten Textprotokoll beschrieben ein. Mischen Sie dann die Proben, indem Sie vorsichtig auf das Röhrchen klopfen, aber nicht vortexen.

Beginnen Sie mit dem Sammeln der Anfangsereignisse bei niedrigem Druck während des Anschnitts. Stellen Sie sicher, dass Sie die Gesamtbevölkerung eingrenzen. Passen Sie anschließend die Spannungen der Histogramme entsprechend an.

Der Peak der ungefärbten Probe entspricht in der Regel der zweiten Dekade. Sobald die Gates eingerichtet sind und die Proben verarbeitet werden, schalten Sie den Druck auf Hochdurchflusszytometrie um. Die Analyse der Rückenmarkspräparate ergab, dass 94% der Ereignisse positiv für den mitochondrienspezifischen Farbstoff waren.

In diesem Experiment wurden 30% der positiven Ereignisse in den Mitochondrien mit einem Antikörper markiert, der spezifisch für die MIT-Fusion zwei ist, ein Protein, das an der Fusion der äußeren Membran der Mitochondrien beteiligt ist. Die Analyse des mitochondrialen Transmembranpotentials mittels Tetraethyl-Panminmethylester ergab, dass 95% der isolierten Mitochondrien ein intaktes Transmembranpotential aufweisen. Diese Färbung erwies sich als spezifisch, da eine signifikante Abnahme der Färbung beobachtet wurde, wenn sie in Gegenwart eines mitochondrialen unco-funktionellen Mitochondrien durchgeführt wurde, um eine basale Menge an SUP-Oxid zu produzieren, gemessen mit einem membrandurchlässigen Farbstoff.

Das wird zur fluoreszierenden P-Reaktion mit SUP-Oxid. Die Behandlung der Mitochondrien mit Antimycin führt zu einer Steigerung der Superoxidproduktion um ca. 10%, sobald sie gemeistert ist. Diese Technik kann in sechs bis sieben Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.