Name: Erzeugung transgener Hydra Durch Mikroinjektion Embryo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Lernen Sie die Erzeugung transgener Hydra durch Mikroinjektion von Plasmid-DNA in Embryonen. Diese Methode ermöglicht stabile transgene Linien für genetische und entwicklungsbiologische Studien.

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Diese Arbeit wurde durch ein G. Harold &amp; Leila Y. Mathers Award an HL und einer NIH (R24 GM080527) zu RESCEJ unterstützt wurde, war ein NRSA Postdoctoral Fellow (NIH F32GM9037222) und wird derzeit von einem Mentored Research Scientist Development Award von der National unterstützt Institute on Aging (K01AG04435). Wir möchten die Gutachter für hilfreiche Kommentare.

1. Herstellung von Plasmid-DNA, Nadeln und Injektions Geschirr <ol><li> Bereiten Sie die Plasmid-DNA mit einem High-Speed-Maxi oder Midi-Kit und konzentrieren die DNA auf 2,5 mg / ml mit Ethanol-Fällung. Das DNA-Pellet sollte in Nuklease-freiem deionisiertem Wasser gelöst werden. Speichern die DNA in 10-20 ul-Aliquots bei -20 ° C. (Siehe Zusatz Tabelle 1 für eine Liste der verfügbaren Vektoren) </li><li> Machen Sie eine Spritz Gericht unter Verwendung von Agarose, eine Mulde zur Aufnahme Embryonen in einem 100 x 15 mm Petrischale konstruieren. <ol><li> Legen Sie ein 75 x 50 Glasobjektträger in einen 100 x 15 mm Petrischale in einem Winkel. Pour ca. 50 ml 2% Agarose in Hydra Medium 24 in die Petrischale aufgeschmolzen. Alternativ gießen Sie die Agarose in die Schüssel erste und Schwimmer eine &quot;Mikroinjektion Fisch Mold&quot; an der Spitze. </li><li> Nach Erstarren der Agarose, entfernen Sie den Glasobjektträger oder der Form. Wenn ein Glasobjektträger verwendet wurde, schneiden Sie das überschüssige Agarose mit einem Rasiermesser blade, um eine Wand zu bilden. Gießen Hydra Medium in die Schüssel und verwenden Sie es sofort oder lagern Sie es bei 4 ° C, bis sie benötigt. Hinweis: Injektions Geschirr kann wiederverwendet werden, wenn bei 4 ° C zwischen den Verwendungen gespeichert. </li></ol></li><li> Ziehen Nadeln aus Borosilikatglas Kapillaren mit einem Faden auf der Mikropipette Puller mit den folgenden Bedingungen: Hitze 525, ziehen 75, Geschwindigkeit 100, Zeit 50. Speichern Sie die Nadeln durch Drücken sie in einem schmalen Streifen von Ton in einer Petrischale, so dass sie Hand parallel zum Boden der Schale. </li><li> Zur Herstellung der Injektionslösung, kombiniert 3 ul 2,5 mg / ml Plasmid-DNA-Lösung mit 2 ul 10% Phenolrot. Vortex die Lösung kurz und dann drehen Sie es für 10 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikro um alle Partikel, die die Nadel verstopfen könnten, zu entfernen. </li><li> Unter einem Binokular, Clip der Nadel ein paar Millimeter von der Spitze mit einer Pinzette, eine kleine Öffnung zu schaffen. Anmerkung: Es ist eine gewisse Flexibilität in der geeigneten Größe der offenening, weil der Druck in Schritt 3.3 eingestellt, um diese Variation zu berücksichtigen. </li><li> Legen Sie die Petrischale, so dass es hält die Nadel in einer vertikalen Position mit der Spitze nach unten. Laden der Nadel mit etwa 0,5 ul Injektionslösung durch Pipettieren der Flüssigkeit in das hintere Ende der Nadel. Ermöglichen Kapillarwirkung, um die Lösung in die Spitze der Nadel zu ziehen. </li></ol> 2. Herstellung von Embryonen zur Injektion <ol><li> Täglich scannen die Hydra AEP Stammkultur für Polypen, deren Eier. Sammeln Sie diese Polypen und legen Sie sie beiseite in einem separaten Kulturschale. Alle paar Stunden zu beobachten diese Polypen im Laufe des Tages, um den Fortschritt des Eierbildung zu überwachen. Wenn Eier durchbrechen die Ektoderm und sitzen auf einem Ring aus eingefahrenen ektodermalen Zellen sind sie bereit für die Injektion 25. Legen Sie diese Polypen in einer Schale mit mehreren Hydra, die Hoden für mindestens 1 Stunde vor der Injektion, um die Befruchtung zu ermöglichen. Hydra &lt;/ Em&gt; Männchen Spermien ohne besondere Manipulation freizugeben. </li><li> Wenn Frauen sind in der AEP-Kolonie mit voll gebildet Eier, die etwa 400 um im Durchmesser 25, oder 1 bis 8-Zell-Stadium Embryonen gefunden werden, sammeln diese auch zur Injektion. Sofort injizieren Embryonen, die Spaltung begonnen haben. Anmerkung: Es ist nicht möglich, die Differenz zwischen den vollständig geformten Eiern und Zygoten Einzeller sagen, so sollten diese bei Männern vor der Injektion inkubiert. </li><li> Vor der Injektion verringert sich die Eltern Gewebe oberhalb und unterhalb des Embryos unter Verwendung eines Skalpells mit einer # 15 Klinge. Lassen Sie nur den Embryo mit einem kleinen Stück von Körpersäule befestigt ist, zu verwenden, um den Embryo mit einer Pinzette ggf. zu manipulieren. Hinweis: Das Gewebe, aus dem Embryo zerlegt wird regeneriert und sollte gespeichert, um sicherzustellen, dass Frauen in der Hydra-Kolonie verbleiben. </li><li> Mit einer Pasteurpipette, bewegen Embryonen zur Einspritz Gericht, ordnet sie parallel zur Wand desAgarose Trog. </li></ol> 3. Mikroinjektion von Plasmid-DNA <ol><li> Montieren Sie die Mikroinjektor auf einem Magnetständer, die auf einer Eisenplatte sitzt. Montieren der Einspritzhalterung, die den Teil der Mikroinjektor, dass die Nadel hält, an einer Joystick-Mikromanipulator ist. Montieren Sie den Joystick Manipulator an der Eisenplatte, mit einem Magnetständer. Dieses gesamte Set-up auf der rechten Seite von einem Binokular und Positionierung des Injektionshalters, so dass er im Beobachtungsfeld sichtbar ist. </li><li> Platzieren des Einspritzform mit Embryonen unter dem Präpariermikroskop ausgerichtet, daß die vertikale Wand der Agarose Trog nach links. Legen Sie die Nadel in die Injektionshalter und senken Sie die Spitze der Nadel in die Hydra Medium in der Schale. </li><li> Drehen Sie den Knopf der Spritze im Uhrzeigersinn, bis Mineralöl die Spitze der Nadel und einem stetigen Strom von Injektionslösung füllt beobachtet Verlassen der Nadel in die Hydrein Medium. Wenn der Strom zu stark ist, senken Sie den Druck durch Drehen des Knopfes gegen den Uhrzeigersinn. Praxis dieser Schritt auf einen geeigneten Druck, der auf die Größe der Nadelöffnung (dh wie die Nadel in Schritt 1.5 abgeschnitten) hängt routinemßig erhalten. Hinweis: Wenn der Strom zu stark ist, wird der Embryo die Injektion nicht überleben. </li><li> Schauen Sie durch den Binokular, bewegen Sie den Einspritzschale, so dass der erste Embryo ist in der Mitte des Feldes. Bewegen Sie die Nadel, so dass es zu berühren, dass die Embryos. Verwenden Sie den Mikromanipulator, den Embryo mit der Nadel zu durchstechen. Anmerkung: Die senkrechte Wand der Rinne Agarose wird der Embryo ist von der Nadel beiseite gedrückt halten. </li><li> Ermöglichen die Injektionslösung in den Embryo 1 oder 2 s fließen und dann schnell die Nadel entfernen. Wenn der Embryo mehr als eine Zelle, wobei jede Zelle individuell zu injizieren. Zange verwenden, um den Embryo neu auszurichten, um die nächste Zelle mit der Spitze der Nadel auszurichten. </li><li> Nach dem ersten embryo eingespritzt wird, bewegen Sie den Spiegel so, dass die nächste Embryo ist in der Einspritzposition und wiederholen Sie den Vorgang; fortgesetzt, bis alle Embryonen injiziert wurden. </li></ol> 4. Die Züchtung von Embryonen und Brut <ol><li> Bewegen aller injizierten Embryonen in eine Schale mit einigen Hydra, die Hoden haben (dies ist zu gewährleisten, dass alle Embryonen befruchtet). Die Embryonen inkubieren in einer 18 ° C-Inkubator der Embryogenese, während sie weiter. </li><li> Sobald die Nagelhaut Stadium erreicht ist, bewegen jeden Embryo injiziert, um eine individuelle Vertiefung einer 24-Well-Platte mit Hydra Medium gefüllt ist. </li><li> Die injizierten Embryonen für 2 Wochen im Dunkeln inkubieren bei 18 ° C. </li><li> Nach der 2 Wochen Inkubationszeit, überprüfen Sie jeden Embryo injiziert unter dem Binokular. Beachten Sie alle Fälle, in denen die Nagelhaut-Stufen-Embryo aus dem kleinen Stück der elterlichen Gewebe abgelöst und das Eltern Gewebe regeneriert hat. Entfernen Sie diese regeneriert Polypen sofort, so dass es nicht miStaken für ein neues Jungtier. </li><li> Bewegen Sie den Teller des injizierten Embryonen unter einem Aquarium Licht bei RT. Überprüfen Sie die Platten jeden Tag und sammeln Jungtiere. Neue Jungtiere werden weiß, weil die typische rosa Farbe der Hydra-Polypen kommt von der Artemia sie essen. </li><li> Beachten Sie die Jungtiere unter einem Fluoreszenzmikroskop zu Transgen-Expression zu erkennen. </li></ol>

<ol><li>Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Hydra+allow+in+vivo+tracking+of+individual+stem+cells+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).</li>
<li>Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Hydra.</a> Curr Biol. 20, 964-965 (2010).</li>
<li>Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+epithelial+cell+cycling+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern of epithelial cell cycling in hydra.</a> Dev Biol. 148, 602-611 (1991).</li>
<li>Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+pathways+of+ectodermal+epithelial+cells+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra.</a> Differentiation. 35, 181-189 (1987).</li>
<li>Khalturin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+stem+cells+in+Hydra+reveal+an+early+evolutionary+origin+for+key+elements+controlling+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation.</a> Dev Biol. 309, 32-44 (2007).</li>
<li>Bosch, T., David, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+of+Hydra+magnipapillata+can+differentiate+into+somatic+cells+and+germ+line+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells.</a> Dev Biol. 121, 182-191 (1987).</li>
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<li>Juliano, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIWI+proteins+and+PIWI-interacting+RNAs+function+in+Hydra+somatic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).</li>
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<li>Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulatory+and+repressive+inputs+localize+Hydra+Wnt3+to+the+head+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).</li>
<li>Gee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-catenin+plays+a+central+role+in+setting+up+the+head+organizer+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra.</a> Dev Biol. 340, 116-124 (2010).</li>
<li>Fraune, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+an+early+branching+metazoan%2C+bacterial+colonization+of+the+embryo+is+controlled+by+maternal+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).</li>
<li>Bridge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+and+stress+responses+in+the+cnidarian+Hydra+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris.</a> PLoS One. 5, e11686(2010).</li>
<li>Boehm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+is+a+critical+regulator+of+stem+cell+maintenance+in+immortal+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).</li>
<li>Franzenburg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyD88-deficient+Hydra+reveal+an+ancient+function+of+TLR+signaling+in+sensing+bacterial+colonizers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).</li>
<li>Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+a+horizontally+transferred+gene+into+an+operon+during+cnidarian+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution.</a> PLoS One. 7, e31643(2012).</li>
<li>Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLenhoff%2C+HM+%22Hydra%3A+Research+Methods%22">Hydra: Research Methods</a>. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 4 29-34 (1983).</li>
<li>Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+development+in+Hydra+involves+selection+from+competent+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells.</a> Dev Biol. 224, 326-338 (2000).</li>
<li>Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLenhoff%2C+HM+%22Hydra%3A+Research+Methods%22">Hydra: Research Methods</a>. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 8 53-62 (1983).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen

Hydra routinemäßig reproduziert ungeschlechtlich, erfordert aber Umweltreize zu produzieren Gameten zu beginnen. Diese Stimuli werden für die meisten Arten Hydra gut definiert und kann von Stamm zu Stamm unterscheiden. Ein wesentliches Hindernis für die Herstellung von transgenen Hydra Erhalten Embryonen regelmäßig, weil es schwierig im Labor zu induzieren Hydra sexuelle geworden sein kann. Der AEP-Stamm 25 erzeugt jedoch Gameten leicht im Labor und dies ist der einzige Sta...

Hydra ist verwendet worden, um die Regeneration, Musterbildung zu studieren, und Stammzellen für etwa 250 Jahre 2 Hydra hat eine einfache Körperplan, bestehend aus drei Zelllinien. Ektodermalen Epithelzellen, endodermalen Epithelzellen und interstitiellen. Der rohrförmige Körper wird von der ektodermalen und endodermalen Epithelzellen Abstammungslinien, von denen jede eine einzelne Zellschicht ausgebildet ist. Alle epithelialen Zellen im Körper Spalte mitotischen. Wenn Epithelzellen in den Extremitäten 3 verschoben wird, der Kopf (Mund und Tentakeln) in der mündlichen Ende oder dem Fuß (basal Scheibe) an der aboralen Ende, sie in der G2-Phase des Zellzyklus zu arretieren, und ändern Sie das Schicksal der Zelle 4. Die Zellen der Zwischenlinie liegen in den Zwischenräumen zwischen den Epithelzellen. Diese Linie wird von multipotenten Stammzellen, die in der ektodermalen Epithelschicht des Körpers Spalte 5 angeordnet werden unterstützt. Die interstitielle Stammzellen führen zu drei somatische cell Typen (Nerven, Drüsenzellen, und nematocytes) und die Keimzellen 6,7. Als Mitglied des Stammes Cnidaria, die Schwestergruppe zu allen Bilateria, Hydra Licht auf grundlegende biologische Prozesse unter vielzelligen Tiere geteilt vergießen. Bis vor kurzem waren diese Bemühungen durch das Fehlen zuverlässiger Verfahren zur Störung der Gen-Funktion behindert. Doch mit der Entwicklung transgener Methodik 1, sind wir jetzt in der Lage, alle Vorteile der Hydra zu ergreifen, um ein besseres Verständnis der grundlegenden Mechanismen gemeinsam vielzelligen Tiere, wie der Stammzellfunktion, Regeneration und Strukturierung zu gewinnen. Transgene Hydra Linien werden durch Injektion von Plasmid-DNA in Embryonen, die in zufälliger Integration und chimären Ausdruck in einem wesentlichen Häufigkeit der Jungtiere führt gegründet. Eine Linie mit gleichmäßiger Expression in einem bestimmten Abstammungslinie kann durch asexuelle Vermehrung festgestellt werden. Die Fähigkeit, klonal transg propagierenENIC Hydra Linien ist ein Vorteil gegenüber der Mehrzahl von Tiermodellen, die nur durch sexuelle Reproduktion vermehrt werden können. Darüber hinaus können transgene Zellen in vivo leicht aufgrund der Transparenz des Tieres und der Abwesenheit von endogener Fluoreszenzproteine ​​8 verfolgt werden. In den sieben Jahren seit der ersten transgenen Hydra Linien wurden 1 wie Linien für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet. Expression von fluoreszierenden Proteinen in verschiedenen Zelltypen hat es möglich gemacht, um die Zellbewegung zu verfolgen, Änderungen in der Zellform zu beobachten und zu verfolgen Zellschicksale sowohl in Wildtyp-Bedingungen und nach der chemischen Störung 1,5,9-12. Darüber hinaus ermöglicht die FACS Isolierung von spezifischen Zellpopulationen, die Expression von verschiedenen fluoreszierenden Proteinen in den verschiedenen Linien. Diese Technik wurde für die Sequenzierung von Stammzell-spezifischen mRNAs und linienspezifische kleinen RNAs 13,14 eingesetzt. Während der Promotoreiner der beiden Hydra Aktin Gene wurde am häufigsten verwendet wird, eine spezifische Promo wenige Zelltyp wurden identifiziert und verwendet, um die Expression von GFP bei transgenen Hydra 9,11,15,16 fahren. In Zukunft werden Zelltyp-spezifische Promotoren für die Beobachtung und Erfassung von spezifischen Zelltyp ermöglichen. Darüber hinaus wurde eine transgene Ansatz erfolgreich verwendet, um die cis-wirkenden regulatorischen Elemente des Promotors Wnt3 17 definieren. Die Entwicklung transgener Methoden in Hydra bietet eine robuste Ansatz zum Testen der Funktion von Genen durch ektopische Expression, Überexpression und Knockdown. Transgenen Tieren vorgenommen wurden, die fluoreszenzmarkierte Proteine, um die Funktion und zelluläre Lokalisation 18-20 untersuchen auszudrücken. Zusätzlich wurde die Expression von RNA-Haarnadeln in der 3&#39;UTR des GFP-Transgens führt zu Knockdown von Zielgenen 21,22. In diesen Ansätzen GFP ist erforderlich, um zu ermittelnund verfolgen die transgene Gewebe während der Erstellung der transgenen Linie. Es ist jedoch wahrscheinlich, dass in einigen Fällen das GFP-Molekül würde mit der Funktion des markierten Proteins stören. Eine neuere Untersuchung zeigt, dass Hydra-Gene in einem Operon-Konfiguration angeordnet, das heißt, polycistronische Transkripte hergestellt, die dann durch Transspleißprodukte Führer zusätzlich getrennt und separat 23 übersetzt werden. Mit der Abgabe eines Gens, das ein Protein oder eine RNA-Haarnadel in die Position stromaufwärts von einem Operon und ein fluoreszierendes Protein-Gen in der stromabwärtigen Position kodiert, kann eine transgene Gewebe, ohne den das Protein-oder RNA-Haarnadel-kodierende Gen Schiene. Diese Methode wurde verwendet, um eine RNA-Haarnadel in einem Operon Konfiguration mit DsRed2 um zu erreichen Gen-Knockdown 14 auszudrücken.

<table><tbody><tr><td>AEP Hydra Strain</td><td></td><td></td><td>E-Mail: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu oder Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp</td></tr><tr><td>High Speed Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12662</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm Petrischalen</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>75 x 50 mm Glasmikroskop Objektträger</td><td>Sigma</td><td>CLS294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektion Fischschimmel</td><td>IBI Scientific</td><td>FM-600</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikatglas mit Filament</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-50-10</td><td>Außendurchmesser: 1,0 mm, Innendurchmesser: 0,50 mm, 10 cm Länge</td></tr><tr><td>Flammende/Braune Mikropipette Abzieher</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Phenolrot</td><td>Sigma</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>Juwelierzange, Durmont #5</td><td>Sigma</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellklinge #15</td><td>Fischer</td><td>50-822-421</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma</td><td>M8410-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektor</td><td>Narishige</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td>Magnetständer</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Eisenplatte</td><td>Narishige</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>Joystick Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr></tbody></table>

erzeugung transgener hydra durch mikroinjektion embryo

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Als Mitglied des Stammes Cnidaria, der Schwestergruppe aller Bilaterien, kann Hydra Licht auf grundlegende biologische Prozesse werfen, die mehrzellige Tiere gemeinsam haben. Hydra wird als Modell für die Untersuchung von Regeneration, Musterbildung und Stammzellen verwendet. Die Forschungsbemühungen wurden jedoch durch das Fehlen einer zuverlässigen Methode für Genstörungen zur Untersuchung der molekularen Funktion behindert. Die Entwicklung transgener Methoden hat die Erforschung der Hydra-Biologie neu belebt1. Transgene Hydra ermöglichen die Verfolgung lebender Zellen, die Sortierung zur Gewinnung reiner Zellpopulationen für die biochemische Analyse, die Manipulation der Genfunktion durch Knockdown und Überexpression sowie die Analyse der Promotorfunktion. Plasmid-DNA, die in Embryonen im Frühstadium injiziert wird, wird zu Beginn der Entwicklung zufällig in das Genom integriert. Dies führt zu Schlüpflingen, die Transgene in Gewebeflecken in einer oder mehreren der drei Linien (ektodermale Epithel, endodermale Epithel oder interstitiell) exprimieren. Die Erfolgsquote, ein Junges mit transgenem Gewebe zu erhalten, liegt zwischen 10 % und 20 %. Die asexuelle Vermehrung des transgenen Jungtiers wird verwendet, um eine einheitlich transgene Linie in einer bestimmten Linie zu etablieren. Die Erzeugung von transgenem Hydra ist überraschend einfach und robust, und hier beschreiben wir ein Protokoll, das einfach und kostengünstig implementiert werden kann.

Gründung transgenen Linien Hydra Jungtiere ernähren transgenen alle 2-3 Tage mit Artemia-Nauplien. Jungtiere manchmal nicht für ein oder zwei Tage zu essen nach dem Schlüpfen. Einige neue Jungtiere nie zu essen, und damit wird nicht überleben. Wenn das Jungtier ist entweder in der transgenen ektodermalen (Abbildung 1A) oder endodermalen Epithel, damit das Tier zu knospen und sammeln die Knospen, die den meisten transgenen Gewebe (Abbildung 1B, C).</str...

Stabil transgene Hydra werden durch Mikroinjektion von Plasmid-DNA in Embryonen hergestellt, gefolgt von zufälliger genomischer Integration und asexueller Vermehrung, um eine einheitliche Linie zu etablieren. Transgene Hydra werden verwendet, um Zellbewegungen zu verfolgen, Gene zu überexprimieren, die Promotorfunktion zu untersuchen oder die Genexpression mithilfe von RNAi zu unterbinden.

Erzeugung transgener Hydra Durch Mikroinjektion Embryo

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Plasma-DNA in Hydra-Embryonen zu injizieren, um transgene Linien herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Plasma-DNA-Lösung hergestellt und in eine Injektionsnadel geladen wird. Als nächstes wird die Plasma-DNA-Lösung in Hydra-Embryonen zwischen dem ersten und achten Zellstadium injiziert.Dann lassen wir die Hydra-Embryonen sich entwickeln und schlüpfen und es werden Jungtiere mit transgenem Gewebe selektiert. Der letzte Schritt besteht darin, eine einheitliche transgene Linie durch ungeschlechtliches Knospen des ursprünglichen transgenen Tieres herzustellen. Letztendlich wird die Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die transgene Expression in Hydra sichtbar zu machen.Diese Methode wurde für Forscher entwickelt, die transgene Hydrolinien zu niedrigen Kosten herstellen möchten, und ermöglicht so eine breitere Anwendung dieser nützlichen Technologie, sowohl für aktuelle Hydroforscher, als auch für diejenigen, die gerade erst mit der Verwendung dieses Modells beginnen möchten. Transgene Hydra werden verwendet, um die Gewebedynamik, die Proteinlokalisierung, die Genfunktion durch Knockdown und Überexpression sowie die Promotorfunktion zu untersuchen. Nach der Aufbereitung der Plasma-DNA gemäß dem Textprotokoll bereiten Sie eine Injektionsschale vor, indem Sie zuerst ein 75 x 50 großes Glasmikroskop platzieren.In eine 100 x 15 Millimeter große Petrischale schieben, schräg 2%Agros in 50 Millilitern Hydra-Medium auflösen. Abkühlen lassen. Dann in die Petrischale gießen Nachdem die Agros fest geworden ist, entfernen Sie den Glasschieber und schneiden Sie mit der Rasierklinge überschüssiges Agros ab, um eine Wand zu bilden.Gießen Sie dann sofort Hydra Medium in die Schüssel und verwenden Sie es entweder sofort oder lagern Sie es bei vier Grad Celsius, bis es benötigt wird. Zur Herstellung der Injektionslösung kombinieren Sie drei Mikroliter 2,5 Milligramm pro Milliliter Plasma-DNA-Lösung mit zwei Mikrolitern 10%iger Phenolrotlösung. Wirbeln Sie die Lösung kurz vor und schleudern Sie sie dann 10 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge, um unter einem Präpariermikroskop alle Partikel zu entfernen, die die Nadel verstopfen könnten.Schneide die Nadel mit einer Pinzette einige Millimeter von der Spitze entfernt, um eine kleine Öffnung zu schaffen. Richten Sie die Petrischale mit der Nadel so aus, dass sich die Nadel mit der Spitze nach unten in einer vertikalen Position befindet. Pipettieren Sie dann etwa 0,5 Mikroliter Injektionslösung in das hintere Ende der Nadel.Um Embryonen für die Injektion vorzubereiten, scannen Sie zunächst eine Hydra, eine EP-Stammkultur, auf Polypen, die Eier produzieren. Sammeln Sie diese Polypen und geben Sie sie in eine separate Kulturschale. Beobachten Sie diese Polypen alle paar Stunden während des Tages, um den Fortschritt der Eibildung zu überwachen.Wenn Eier das Ektoderm durchbrechen und auf einem Ring aus zurückgezogenen Hautzellen sitzen, sind sie bereit für die Injektion Platzieren Sie Polypen, die Eier zur Injektion bereit haben, in eine Schale mit mehreren Hydren, die Hoden für mindestens eine Stunde vor der Injektion haben, um eine Befruchtung zu ermöglichen, wenn Weibchen in einer EP-Kolonie mit voll ausgebildeten Eiern oder Embryonen im Zellstadium gefunden werden. Sammeln Sie diese auch für die Injektion vor der Injektion. Verwenden Sie ein Skalpell mit einer Klinge mit der Nummer 15, um den größten Teil des elterlichen Gewebes über und unter den Embryonen zu entfernen, die begonnen haben, sich zu spalten, so dass nur noch ein kleines Stück der Körpersäule des Elternteils befestigt ist.Bewahren Sie das präparierte Gewebe in Hydra-Medium auf, da es sich regeneriert und dafür sorgt, dass die Weibchen in der Hydra-Kolonie bleiben. Verwenden Sie eine Weidepipette, um die spaltenden Embryonen in eine Injektionsschale zu übertragen, und ordnen Sie sie parallel zur Wand des Agrostrogs an. Zur Vorbereitung des Mikroinjektors, der auf einem Magnetständer montiert ist, der auf einer Eisenplatte sitzt.Montieren Sie den Injektionshalter, der Teil des Mikroinjektors ist, der die Nadel an einem Joystick-Mikrom-Manipulator hält. Befestigen Sie den Joystick-Manipulator mit einem Magnetständer auf der Eisenplatte. Platzieren Sie dann das gesamte Setup auf der rechten Seite eines Präpariermikroskops und positionieren Sie den Injektionshalter so, dass er im Beobachtungsfeld sichtbar ist.Stellen Sie die Injektionsschale mit den Embryonen so unter das Präpariermikroskop, dass die senkrechte Wand des Agrostrogs nach links zeigt. Führen Sie die Nadel in den Injektionshalter ein und senken Sie die Nadelspitze in das Hydra-Medium in der Schale. Drehen Sie dann langsam den Knopf der Spritze im Uhrzeigersinn, bis Mineralöl die Oberseite der Nadel füllt und ein stetiger Strom von Injektionslösung beobachtet wird, der aus der Nadel in das Hydramedium austritt.Wenn der Strahl zu stark ist, verringern Sie den Druck, indem Sie den Knopf gegen den Uhrzeigersinn drehen. Zentrieren Sie einen Embryo im Sichtfeld und bewegen Sie die Nadel so, dass sie den Embryo berührt. Verwenden Sie dann den Mikrom-Manipulator, um den Embryo mit der Nadel zu durchstechen und lassen Sie die Injektionslösung ein bis zwei Sekunden lang in den Embryo fließen, bevor Sie die Nadel schnell entfernen.Wenn der Embryo mehr als eine Zelle hat, injizieren Sie jede Zelle einzeln. Fahren Sie fort, bis alle Embryonen injiziert wurden. Sobald alle Embryonen injiziert wurden, geben Sie sie in eine Schale mit ein paar Hydra, EP-Polypen mit Hoden, und inkubieren Sie sie bei 18 Grad Celsius, während sie sich weiter der Embryogenese unterziehen.Wenn die Embryonen das Kutikulastadium erreichen, bringen Sie jeden Embryo in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte, die mit Hydra-Medium gefüllt ist, und inkubieren Sie zwei Wochen lang im Dunkeln bei 18 Grad Celsius. Überprüfen Sie dann unter einem Präpariermikroskop jeden Embryo auf Ablösung von dem kleinen Stück elterlichen Gewebes und auf die Regeneration dieses Gewebes. Falls vorhanden, entfernen Sie es sofort, damit es nicht mit einem neuen Jungtier verwechselt wird.Nachdem Sie jeden Embryo untersucht haben, stellen Sie die Schale unter eine Aquarienlampe bei Raumtemperatur. Überprüfen Sie jeden Tag die Platten und sammeln Sie die Schlüpflinge ein. Neue Schlüpflinge werden weiß gefärbt, weil sie noch nicht gefressen haben.Beobachten Sie sie unter einem Fluoreszenzmikroskop auf Transgenexpression. Verwenden Sie art napoli, um transgene Jungtiere alle zwei bis drei Tage zu füttern. Wenn Jungtiere, die entweder im elektrodermalen oder im endodermalen Epithelgewebe transgen sind, Knospen produzieren, werden sie auf ihre Transgenexpression untersucht.Hier ist ein Jungtier mit chimärer Expression eines roten Ds, zwei Transgenen unter der Kontrolle eines Aktin-Promotors und eines Flecks ektodermaler Epithelzellen zu sehen. Kontinuierliches Knospen durch das Tier kann schließlich eine Linie mit einheitlicher Expression des Transgens entweder in der elektrodermalen oder in der endodermalen Epithellinie erzeugen. Wie hier zu sehen, produziert das ursprüngliche Jungtier nun zwei neue Knospen.Die mit einem Sternchen gekennzeichnete Knospe hat kein transgenes Gewebe und wurde als Gründungstier für eine Kontrolllinie verwendet, die mit Ausnahme des Vorhandenseins des Transgens genetisch identisch mit der transgenen Linie ist. Dieses Tier ist die erste Knospe mit transgenem Gewebe, das aus dem ursprünglichen Jungtier hergestellt wurde. Durch diese Experimente mit Transgenen, die keinen Einfluss auf die biologische Funktion haben, wurden einheitliche Epithelzelllinien aus etwa 30% der Hydra etabliert, die mit epithelialem transgenem Gewebe schlüpfen.Eine gleichmäßige elektrodermale Linie, wie hier zu sehen, wird 33 bis 50 % seltener etabliert als eine endodermale Linie. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie also ein gutes Verständnis dafür haben, wie man transgene Hydrolinien herstellt, was das Repertoire an funktionellen Studien, die Sie mit diesem Modell durchführen können, erweitert.

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