Name: Hochdurchsatz-Titration von Luciferase-exprimierenden rekombinanten Viren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Erfahren Sie eine Hochdurchsatz-Methode zur Quantifizierung von Luciferase-markierten Viren mit automatisierter Flüssigkeitsverarbeitung. Diese Technik ermöglicht die schnelle gleichzeitige Verarbeitung zahlreicher Proben bei gleichzeitiger Bewertung der Zellviabilität.

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Vanessa Garcia wird durch ein Queen Elizabeth II Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology finanziert und Cory Batenchuk durch ein Stipendium des Natural Sciences and Engineering Research Council.

1. Probenvorbereitung <ol><li> Proben, die erhalten Luciferase-exprimierenden Virus (hierin VSVΔ51-Fluc als Beispiel) für die Titration und Übertragung in 96-Well-Platten. Alternativ führen Infektionen in 96-Well-Gewebekulturplatten und Nutzung Ständen direkt. </li><li> Verlassen zwei Säulen unbehandelt für die Aufnahme von Standardkurven. Für Experimente direkt in 96-Well-Platten,-Titer am Ende des Experiments (40 h nach Infektion) oder bei -80 ° C und Titer zu einem späteren Zeitpunkt erfolgen. </li></ol> 2. Herstellung von permissiven Zellen für Virustitration <ol><li> 24 Stunden vor der Titrierung Eine Suspension von Vero-Zellen bei einer Konzentration von 2,5 x 10 5 Zellen / ml in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das 10% fötales Rinderserum (FBS), 30 mM HEPES und 1% Penicillin / Streptomycin. HINWEIS: Dieses Protokoll Vero-Zellen verwendet, kann jede geeignete permissive Zelllinie für die VSV-Infektion be verwendet. </li><li> Saatgut 2,5 x 10 4 Zellen (100 ul) in 96-Well-weißer Feststoff-Flachbodenplatten unter Verwendung eines Mikrospender. <ol><li> Bereiten Sie 12 ml Zellsuspension pro Platte plus 5 ml zur Grundierung. </li><li> Saubere Mikrospender Kassette durch Spülen der Rohrleitung mit 50 ml sterilem Wasser. </li><li> Füllen Sie die Mikrospender Linien mit Zellsuspension und lassen 5 ml Zellsuspension durch fließen. </li><li> Wählen Sie ein Programm, das 100 ul in jede Vertiefung einer weißen Mauern 96-Well-Platte verzichtet werden. Verzichtet werden, und wiederholen Sie nach Bedarf für zusätzliche Platten. Saatgut auch ein paar Vertiefungen in einer 96-Well-Flachboden klar Platte, wenn undurchsichtige Boden weißen Mauern Platten werden zur Überprüfung der Zellgesundheit und Dichte verwendet. </li><li> Wenn Sie fertig sind, spülen Zellen wieder in Originalbehälter. Reinigen der Kassette laufen 50 ml 70% Ethanol, gefolgt von 50 ml warmem sterilem Wasser durch die Rohrleitung. </li><li> Stellen Sie sicher, Kassette und Schläuche sind appropriately zwischen den Anwendungen zu reinigen. </li></ol></li><li> Zellen für 24 h bei 37 ° C inkubieren in einer befeuchteten 5% CO 2-Inkubator. </li></ol> 3. Herstellung von Viral Standardkurve <ol><li> Vorbereitung einer Standardkurve von VSVΔ51-Fluc in Serum-freiem DMEM, so dass die Endkonzentration des Plaque-bildenden Einheiten (pfu) pro ml nach Transfer auf Vero-Zellen ist wie folgt: 10 8 pfu / ml, 10 7 pfu / ml, 10 6 pfu / ml, 10 5 pfu / ml, 10 4 pfu / ml, 10 3 pfu / ml, 10 2 PBE / ml, und 10 1 pfu / ml. Bereiten Sie 50 ul jeder Konzentration pro Platte von Vero-Zellen sowie eine zusätzliche 10%. HINWEIS: Titer des Luciferase-Virus Lager müssen in einem klassischen Weg 10, um eine Standardkurve, die zur absoluten Quantifizierung ermöglicht erzeugen bewertet werden. Ansonsten relative Quantifizierung kann ohne genaue Titer Informationen willkürlich Einstellung virale Titer erreicht werden kannauf Verdünnungsschritte. Beispielsweise die erste Verdünnung der Standardkurve kann bis zu 10 8 Viruseinheiten und der folgenden Verdünnung 1:10 bis 10 7 und so weiter eingestellt werden. In diesem Zusammenhang sollte man Werte als-fache Veränderung gegenüber einer vorbestimmten Probe als eine absolute Quantifizierung ist nicht genau auszudrücken. </li></ol> 4. Übertragung der Probe auf Überstände permissiven Zellen <ol><li> Überprüfen Vero-Zellen in der klaren Boden 96-Well-Platte unter einem Lichtmikroskop überzogen, um zu bestätigen, dass Monoschichten sind mindestens 95% konfluent. </li><li> Transfer 25 ul Probe Stand auf Vero-Zellen in der weißen Wandplatten ausgesät. Überstände in die 2 Spalten für Standardkurven bezeichnet nicht übertragen. HINWEIS: Dies kann gleichzeitig für alle Vertiefungen auf einer einzigen Platte mit einem 96-Kanal-Liquid Handler erfolgen. </li><li> Verwendung einer 8 oder 12-Kanal-Multi-Kanal-Pipette, fügen Sie 25 ul jeder Verdünnung der Standardkurve in Schritt 3 auf die Vero-Zellen hergestellt inDie 2 bezeichneten Spalten. </li><li> Zentrifuge Platten für 5 min bei 430 · g bei RT. </li><li> Inkubation für 5 h bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2-Inkubator. </li></ol> 5. Bewertung der Lebensfähigkeit der Zellen <ol><li> HINWEIS: Wenn ausgehend von Überständen von Infektionsversuche in klaren 96-Loch-Platten durchgeführt erhalten, können Proben Lebensfähigkeit vor der Quantifizierung mit einer Lebensfähigkeit der Zellen beurteilt werden Indikatorfarbstoff wie Resazurin. </li><li> Hinzufügen Resazurin in einer Menge gleich 10% des Volumens in jedem Well der 96-Well-Platte der Proben Virus und Zellen enthält. Schließen Zell nur steuert sowie Medien-Kontrolle nur, um Werte für 100% und 0% Lebensfähigkeit bzw. zu bestimmen. </li><li> Nach 2-4 Stunden (Inkubationszeit je nach Zelltyp und von der Konzentration der im Handel erhältlich oder rekonstituierte Pulver des Farbstoffes kann variieren), lesen und notieren Sie die Signal mit einem Fluoreszenz-Plattenlesegerät (530-560 Anregung, 590 Emission). Bericht Zelle viability für eine Probe nach der Formel Relative Stoffwechselaktivität = ((Test Probensignal - negativen Steuersignal) / (Cell nur das Steuersignal - negativen Steuersignal)) x 100% </li></ol> 6. Vorbereitung des Luciferinsubstrat <ol><li> 30 min vor dem Ende der 5-stündigen Inkubation bereiten Luciferin, eine 2 mg / ml Lösung in steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) erhalten. Bereiten Sie 2,5 ml pro Platte plus ein extra 2 ml. Schutz-Lösung von Licht. Hinweis: Das Luciferin kann auch früher am Tag hergestellt und bei 4 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. </li></ol> 7. Lesen Biolumineszenz <ol><li> Nach 5 h Inkubation werden 25 ul Luciferin zu jeder Vertiefung der Vero-Zellen in den weißen Festplatten. Hinzufügen Luciferin manuell oder mit einem automatischen Spender im Luminometer integriert. HINWEIS: Die Verwendung von einem Gerät mit nur Einzel-und Endpunkt liest kann die Zugabe eines Luciferase-kompatibel Lyse buf erforderlichfer vor der Zugabe des Luciferin-Substrat, um die Konsistenz zu verbessern. </li><li> Lesen Sie die Platten mit den folgenden Parametern: <ol><li> 5 Sekunden schütteln. </li><li> Warten Sie 30 Sekunden. </li><li> Lesen Lumineszenz bei einer entsprechenden Fest Empfindlichkeit / Belichtungswert. Wenn die Option auf dem Gerät verfügbar ist, verwenden Multi-Point liest (zB 3 x 3-Matrix), um die Genauigkeit zu verbessern. </li></ol></li><li> Notieren und die Intensität quantifiziert Biolumineszenz. </li><li> Wenn ein automatisierter Spender wurde verwendet, um hinzuzufügen Luciferin spülen Luciferin und Minister die Linien mit warmem sterilem Wasser. </li></ol> 8. Datenanalyse <ol><li> Für genaue Ergebnisse, löst das nicht-lineare Regression, um eine Hill-Gleichung aus den Standardkurven zu erzeugen. Wenden Sie diese Gleichung, um die Proben titriert viralen Expressionseinheiten zu berechnen. Einige Viren oder Situationen kann eine Standardkurve mit einer linearen Beziehung herzustellen; in diesem Fall löst für eine lineare Gleichung. </li></ol>

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<li>Diallo, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+pharmacoviral+approach+identifies+novel+oncolytic+virus+sensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A high-throughput pharmacoviral approach identifies novel oncolytic virus sensitizers.</a> Mol Ther. 18, 1123-1129 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die hier beschriebene Luciferase basierenden Ansatz bietet eine Reihe von Vorteilen gegenüber anderen bestehenden Methoden einschließlich der Leichtigkeit, Schnelligkeit, Minimalausstattung notwendig und relativ niedrigen Kosten. Ein wichtiger Beitrag dazu ist die Vermeidung eines Verdünnungsschritt. Dennoch sind Verdünnungsbasierte Derivate dieses Protokoll sicherlich möglich und wurden vor kurzem zur Luciferase-exprimierenden Ebola-Titer in einem Hochdurchsatz-Antivirus-Bildschirm von 11 zu bewerten. Während naturgemäß zeitaufwändig und teurer, können solche Anpassungen größeren Dynamikbereich für die virale Quantifizierung bieten, wenn nötig. Zusätzlich dazu, dass sich besonders gut zur Auswertung Virustiter im Rahmen der Hochdurchsatz geeignet ist, erzeugt unser Ein-Schritt-Luciferase-basierte virale Quantifizierungsverfahren genaue Schätzungen von infektiösen Virionen bei der Replikation von Viren. Weiterhin Auslesungen der Lumineszenz mit Zytotoxizität von demselben Experiment ergeben einvollständiges Bild der Wirkung der Versuchsbedingungen auf Zielzellen, die besonders nützlich im Zusammenhang mit der onkolytischen Viren und Drogen-Bildschirme ist. Das hier dargestellte Beispiel wird eine Replikation von negativen Einzelstrang RNA-Virus; Jedoch kann dieses Protokoll auf eine Anzahl von replizierenden und nicht-replizierende Viren mit einigen geringfügigen Anpassungen Protokoll angepasst werden. Dazu gehören DNA-Viren, wie Vaccinia, HSV und AAV (siehe Abbildung 5). Proben mit intrazelluläre Viren, wie Vaccinia-Virus infiziert sind beispielsweise, eine Virentrennschritt vor der Quantifizierung (zB mindestens einem Gefrier-Auftau-Zyklus). Bei der Anwendung dieser Technik auf andere Viren, ist es notwendig, die Reaktionszeit von der Übertragung des viralen Überstand oder Lysat, um das Lesen der Platten durch das Luminometer zu optimieren. Dieser Parameter wird in erster Linie auf der Replikationszyklus des Virus in der permissiven Zelllinie und der Stärke der p hängenromoter Fahr Luciferase-Expression. Dies geschieht am besten mit Hilfe der Standardkurve voll in die Optimierung Schritt getan. Um dies zu tun, muß man die entsprechende permissive Zellinie mit verschiedenen Wiederholungen des hergestellten Standardkurve zu infizieren und zu lesen jede Wiederholung bei einer verschiedenen Zeitpunkten nach der Übertragung. Idealerweise wird eine Inkubationszeit Punkt gewählt, die zu einer linearen Beziehung zwischen log (RLE) und LOG (Titer) führt überspannt den erwarteten Proben Titerbereich. Für VSVΔ51-Fluc ist dies typischerweise von 10 4 pfu / ml bis 10 7 pfu / ml für 5 Stunden Inkubationszeit. Wenn niedrigeren oder höheren Titer von Proben erwartet, kann man einfach mit höheren oder niedrigeren die Inkubationszeit. Alternativ können Proben verdünnt werden, um in dem Bereich viel, wie es typischerweise für ELISA getan fallen. Wie oben erwähnt, ist dieses Verfahren gut geeignet, um hohen Durchsatz Drogen-Bildschirme mit Wirkstoffbibliotheken meisten Schritte können automatisiert durchzuführen. Zellen plattiert efficiently unter Verwendung eines automatisierten Mikroplatten-Dispenser kann die Medikamentenbibliothek unter Verwendung eines 96-Kanal-Handler Flüssigkeit zugegeben werden kann, kann unter Verwendung eines Mikroplatten-Virus Spender zugesetzt, und die Platten gelesen unter Verwendung eines automatisierten Luminometer. Theoretisch kann dies auch für 384er oder kleinere Formate angepasst werden; jedoch die Einschränkung zu diesem Zweck ist die Anzahl der Zellen, die plattiert werden können, da weniger Zellen führt zu einem engeren Bereich in der Linearität der LOG (RLU) bis (Titer) Beziehung Protokoll. Schließlich können Beurteilung der Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung von Resazurin oder andere Stoffwechsel Farbstoffe leicht in den Workflow integriert werden, so dass für die Diskriminierung von zytotoxischen Verbindungen in der antiviralen Bildschirmen oder zur Identifizierung von Verbindungen, die an synergistische Tötung in Kombination mit Viren 12 führen. Dennoch Beschränkungen dieses Verfahrens umfassen das Erfordernis eines Luciferase-Transgen exprimierenden Virus, was nicht immer möglich ist, und die Verfügbarkeit eines ausreichend permissive Zelllinie. , Wahrscheinlich möglich, anzupassen, ist es jedochVerfahren zur Verwendung mit anderen Reportergene (zB GFP) bereitgestellt Reporter Quantifizierungsverfahren eine geeignete Linearität und das Signal-Rausch-Verhältnis. Insgesamt können die beschriebenen Verfahren mit hohem Durchsatz angepasst werden, um viele verschiedene Viren entsprechen und unterschiedliche Anwendungen zugeschnitten.

Klassische virale Plaque-Assays sind nach wie vor eine tragende Säule in der Virusforschung, auch wenn sie notorisch zeitaufwändig sein können und einen erheblichen Engpass bei der Erzielung von Ergebnissen aus Experimenten darstellen. Es haben sich schnellere Methoden zur indirekten Virusquantifizierung entwickelt, darunter die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), ELISA und Durchflusszytometrie1-4. Jüngste Innovationen wie der Virocyt-Viruszähler können Viren mithilfe einer fortschrittlichen Flow-Sorting-Technologie und durch eine Kombination aus Protein- und DNA/RNA-Farbstoffen direkt zählen5. Während all diese Methoden zweifellos das Tempo der Virusforschung beschleunigt haben, hat jede Methode ihre Vor- und Nachteile. Zum Beispiel kann die qPCR die Quantifizierung der spezifischen viralen Genomsequenz ermöglichen, aber nicht effektiv zwischen infektiösen und defekten Virionenunterscheiden 6. ELISAs können sehr spezifisch sein, erfordern jedoch einen geeigneten Antikörper gegen das gewünschte virale Zielprotein und können sehr teuer sein. Obwohl die Durchflusszytometrie-Technologie viele Vorteile bietet und sich deutlich verbessert hat, bleibt der Durchsatz und der Zugang zu hochspezialisierten Geräten dennoch eine Hürde. Wichtig ist, dass alle diese Techniken nicht ideal für das Hochdurchsatz-Screening geeignet sind, für das die Leichtigkeit und der Zeitaufwand des Virusquantifizierungsschritts von entscheidender Bedeutung sind.
Hier beschreiben wir eine hochdurchsatzfähige und leicht automatisierbare Technik zum Titern von Viren, die ein Firefly-Luciferase (Fluc)-Transgen exprimieren. Dieses Verfahren erzeugt approximative Virustiter in einer Testprobe auf der Grundlage von Lumineszenzsignalen durch die parallele Verwendung einer Standardkurve bekannter Virusmengen. Proben, die unbekannte Mengen an Luciferase-exprimierenden Viren enthalten, werden parallel zur Standard-Virusverdünnungskurve auf eine permissive "Plaquing"-Zelllinie übertragen und die virusassoziierte Lumineszenz nach einer Inkubationszeit von einigen Stunden abgelesen. Dies ermöglicht eine schnelle, quantitative und oft noch am selben Tag vorliegende Ergebnisgenerierung, im Gegensatz zu klassischen Plaque-Assay-Protokollen, die in der Regel eine mehrtägige Inkubation erfordern, um die sichtbaren Plaques7-9 manuell zu zählen. 
Das Protokoll beschreibt die Schritte unserer Titrationsmethode am Beispiel des onkolytischen vesikulären Stomatitis-Virus, das für ein Fluc-Transgen (VSV∆51-Fluc) kodiert, und gibt einen Überblick über 1. Probenvorbereitung 2. Das Plattieren einer permissiven Zelllinie für die Virustitration unter Verwendung eines automatisierten Dispensers 3. Die Vorbereitung der viralen Standardkurve 4. Der Transfer der Probenüberstände auf die permissive Zelllinie mit Hilfe eines manuellen 96-Well-Pipettierers 5. Die Beurteilung der Zytotoxizität von Proben unter Verwendung eines Reagenzes für die Zellviabilität 6. Die Vorbereitung des Luciferin-Substrats 7. Ablesung der Biolumineszenz und 8. Datenanalyse.

<table><tbody><tr><td>Dulbeccos' modifiziertes Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>NorthBio Inc.</td><td>NBSF-701</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td>Bereiten Sie eine 1 mM Lösung vor, pH 7,3</td></tr><tr><td>alamarBlue &nbsp;</td><td>AbD Serotec</td><td>BUF012B</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin Kaliumsalz</td><td>Biotium</td><td>10101-2</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Mikrotiterplatten aus weißem Polystyrol mit flachem Boden TC-behandelte Mikrotiterplatten</td><td>Corning</td><td>3917</td><td>384-Well-Platten können auch für einen höheren Durchsatz verwendet werden</td></tr><tr><td>Synergy Mx</td><td>BioTek</td><td>SMTBL</td><td>Monochromator Mikroplatten-Reader</td></tr><tr><td>Liquidator96</td><td>Mettler Toledo</td><td>LIQ-96-200</td><td>Manuelles Pipettiersystem mit 96 Spitzen</td></tr><tr><td>Liquidator96 LTS Spitzen sterilisiert mit Filtern</td><td>Mettler Toledo</td><td>LQR-200F</td><td>Alle sterilen gefilterten Spitzen, die mit Pipettierern Ihrer Wahl kompatibel sind, sind geeignet</td></tr><tr><td>Microflo</td><td>BioTek</td><td>111-206-21</td><td>Wird verwendet, um Zellen in einer 96-Well-Platte zu plattieren</td></tr><tr><td>Fluoroskan Ascent FL</td><td>Thermo Scientific</td><td>5210450</td><td>Mikrotiterplatten-Fluorometer</td></tr></tbody></table>

hochdurchsatz-titration von luciferase-exprimierenden rekombinanten viren

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard-Plaque-Assays zur Bestimmung infektiöser Virustiter können zeitaufwändig sein, sind für ein großes Probenvolumen nicht geeignet und können nicht mit Viren durchgeführt werden, die keine Plaques bilden. Als Alternative zu Plaque-Assays haben wir eine Hochdurchsatz-Titrationsmethode entwickelt, die die gleichzeitige Titration eines großen Volumens von Proben an einem einzigen Tag ermöglicht. Dieser Ansatz umfasst die Infektion der Proben mit einem Firefly-Luciferase-markierten Virus, die Übertragung der infizierten Proben auf eine geeignete permissive Zelllinie, die anschließende Zugabe von Luciferin, das Ablesen von Platten, um Lumineszenzmesswerte zu erhalten, und schließlich die Umwandlung von Lumineszenz- in Virustiter. Die Beurteilung der Zytotoxizität mittels eines metabolischen Viabilitätsfarbstoffs kann einfach parallel in den Arbeitsablauf eingebunden werden und im Rahmen eines Wirkstoffscreenings wertvolle Informationen liefern. Diese Technik bietet eine zuverlässige Hochdurchsatzmethode zur Bestimmung viraler Titer als Alternative zu einem Standard-Plaque-Assay.

Ein Überblick über die Arbeitsweisen durch die Hochdurchsatz-Verfahren ist in Abbildung 1 dargestellt. Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse eines typischen Standardkurve ofVSVΔ51-Fluc. Vier-Parameter-nichtlinearen Regressionsanalyse erzeugt eine Hill-Kurve, aus dem unbekannten Eingangs pfu (Schätzung der Virustiter) interpoliert werden kann. Diese geschätzten Titer werden als viralen Expressionseinheiten (VEU). 3A zeigt VEUS und Titer durch Ausführen eines Standard-Plaque-Assay mit den gleichen Proben 10 erhalten. Proben stammten von einem Experiment, in dem verschiedene Chemikalien wurden verwendet, um die Replikation zu erhöhen und von VSVΔ51-Fluc verbreitet in Zellen 786-0. VEUS aus der Standardkurve interpoliert, um einen Faktor, der von der Verdünnung der Probenüberstände beruht zu multiplizieren, die auf Vero-Zellen überführt (in diesem Fall ist der Verdünnungsfaktor 5). Die lineare Korrelation zwischen dem Titer und VEU ist in 3B gezeigt, </strong&gt; Mit einem R 2 von 0,8083 und einer Pearson-r-Score von 0.899 (p &lt;0,0001). In Figur 4 ist typisch Zytotoxizität von Daten von einem metabolischen Assay erhaltenen 786-0 für Zellen mit Chemikalien vor der Infektion mit VSVΔ51-Fluc behandelt gezeigt. Schließlich zeigt 5 typische Standardkurven mit verschiedenen Viren erhalten (Herpes Simplex Virus (HSV), Vaccinia-Virus und Adeno-assoziierte Virus (AAV), die alle exprimierenden Firefly Luziferase) und beschreibt Inkubationszeiten und Gefrier-Auftau-Zyklen, wie gewünscht. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Workflow-Hochdurchsatz-Virus Titerung und Zytotoxizität-Test unter Verwendung VSV Δ 51-Fluc. (A) Samen, 2,5 x 10 4 Vero-Zellen pro Vertiefung (100 ul) und Inkubation bei 37 ° C. (B) 24h später Transfer 25 ul Standardkurve auf Vero-Zellen (2 Spalten pro Platte). (C) Transfer von 25 ul Proben, die auf die verbleibenden Vero-Zellen titriert werden. Zentrifuge Platten und bei 37 ° C. (D) in einer Höhe von 10% des Volumens in die gut, fügen Resazurin Reagenz zu der Platte mit den Originalproben. Platten bei 37 ° C. (E) inkubieren Nach 3 h, lesen und beschreiben und zu bewerten Fluoreszenz Zytotoxizität. (F) Nach 5 h, fügen Sie 25 ul von 2 mg / ml Lösung von Luciferin in jede Vertiefung der Vero-Zellen. Lesen Lumineszenz und berechnen viralen Expressionseinheiten. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Erwartete Standardkurve von VSV Δ 51-Fluc. Mich Luciferaseexpressiongesicherter 5 Stunden nach der Überstand Übertragung an fünf verschiedenen Punkten innerhalb eines gut mit einem Luminometer und Biolumineszenz wurde im mittleren relativen Lichteinheiten (RLU) angegeben. Bedeuten RLU wurde gegen bekannte Eingangs aufgetragen pfu / ml, die nicht-lineare Regression gelöst und erzeugen eine Hill-Gleichung. Der Durchschnitt von zwei Wiederholungs Kurven und Standardfehlerbalken dargestellt (r 2 = 0,9993). <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3 Vergleich von Standard-Plaque-Assay-Titer mit denjenigen von Hochdurchsatz-Verfahren erhalten. (A) Virustiter in pfu / ml durch Standard-Plaque-Assay auf Vero-Zellen erhalten wurden, berechnet die viralen Titer (VEU / ml) aus den gleichen Proben titriert mit der Hochdurchsatz-Luciferase-Assay verglichen. (B) lineare Beziehung zwischen VEU / ml und Titer über Standard-p erhaltenLaque-Assay. Lineare Regressionskurve und der Bestimmungskoeffizient (R 2) dargestellt sind. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig4highres.jpg" width="500" /> Abbildung 4. Beispiel Lebensfähigkeit. Beispiels Lebensfähigkeit vor der Überstand Übertragung auf Vero-Zellen wurde durch die Bewertung zelluläre metabolische Aktivität mit einem handelsüblichen Resazurin-Lösung bestimmt. Raw Fluoreszenzwerte wurden normalisiert, um die von unbehandelten, nicht infizierten Brunnen. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig5highres.jpg" width="500" /> Abbildung 5. Erwartete Standardkurven mit HSV, Vaccinia und AAV-Viren. Luciferase-Expression wurde an fünf verschiedenen Punkten innerhalb eines gut mit einem Luminometer gemessen und Biolumineszenz wurde im mittleren rela ausgedrückttive Lichteinheiten (RLU). (A) HSV-Standardkurve wurde auf Vero-Zellen gegeben plattierten 24 Stunden vorher mit einer Dichte von 2,5 x 10 4 Zellen pro Vertiefung (100 ul) und die Luciferase-Messung erfolgte 17 h nach der Übertragung überstehende (R 2 = 0,9489, n = 1). Eine Hill-Gleichung wurde durch die Lösung der nicht-linearen Regression erzeugt. (B) Vaccinia-Standardkurve wurde auf Vero-Zellen gegeben plattierten 24 Stunden vorher eine Dichte von 2,5 x 10 4 Zellen pro Vertiefung (100 ul) und 2,5 h bei 37 ° inkubiert, C, wonach Luciferase Messungen vorgenommen wurden (R 2 = 0,9892). Eine lineare Gleichung wurde durch die Lösung für die lineare Regression erzeugt. (C) AAV-Standardkurve wurde auf menschlichen Lungenkarzinomzellen (A549) zugegeben plattierten 24 Stunden vorher mit einer Dichte von 2,5 x 10 4 Zellen pro Vertiefung (100 ul) und die Luciferase-Mess wurde 24 Stunden nach der Infektion. Eine Hill-Gleichung wurde durch die Lösung der nicht-linearen Regression erzeugt. Die durchschnittlichevon fünf Wiederholungs Kurven und Standardfehlerbalken dargestellt (R 2 = 0,9926).

Dieser Artikel stellt eine auf Hochdurchsatz-Luziferase-Expression basierende Methode zur Titration verschiedener RNA- und DNA-Viren mit automatisierten und manuellen Liquid Handlern vor.

Hochdurchsatz-Titration von Luciferase-exprimierenden rekombinanten Viren

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Das allgemeine Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Virus-Titer eines mit Luciferase markierten Virus mithilfe einer Hochdurchsatz-Quantifizierungsmethode zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem der Überstand der zu titrierenden Proben sowie eine virale Standardkurve auf eine permissive Zelllinie übertragen werden, um die Expression der Luciferase zu ermöglichen. In einem zweiten Schritt kann Resazurin zu den ursprünglichen Proben hinzugefügt werden, um die Zellviabilität zu bewerten.Anschließend wird nach einer geeigneten Inkubationszeit Luciferin zu den Zellen hinzugegeben, um die Biolumineszenz zu quantifizieren. Die Ergebnisse zeigen die Menge an Virus in der Probe basierend auf der Luciferase-Expression.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Plaque-Titerung besteht darin, dass eine große Anzahl von Proben schnell und gleichzeitig verarbeitet werden kann. Diese Methode kann außerdem auf nicht-plaquierende, Luciferase-exprimierende Viren erweitert werden, da sie nicht von der Plaque-Bildung abhängt. Ein Nachweis der Zellzytotoxizität kann problemlos in den Arbeitsablauf integriert werden und könnte im Kontext eines Wirkstoff-Screenings nützlich sein. Die Durchführung der Prozedur wird Vanessa, Ramya und Colin übernehmen, drei Doktorandinnen und Doktoranden aus meinem Labor. Zunächst Infektionen mit VSV-Delta 51, das Firefly-Luciferase exprimiert, in 96-Well-Zellkulturplatten durchführen. Die Überstände dieser Platten werden nach einer geeigneten Inkubationszeit titriert. Bereiten Sie 24 Stunden vor der Titrierung eine Suspension von Vero-Zellen mit einer Konzentration von 2,5 × 10⁵ Zellen pro Milliliter in DMEM, das 10 % FBS, 30 mmol HEPES und 1 % Penicillin-Streptomycin enthält, vor. Säen Sie 2,5 × 10⁴ Zellen in 96-Well-weiße, flache Vollplatten unter Verwendung eines Mikroplatten-Dosiersystems aus. Um die Zellsuspension vorzubereiten, reinigen Sie eine Kassette des Mikroplatten-Dosiersystems, indem Sie die Schläuche mit 50 mL steriler Wasser durchspülen.Füllen Sie anschließend die Leitungen des Mikroplatten-Dosiersystems mit der Zellsuspension und lassen Sie fünf Milliliter der Zellsuspension durchlaufen. Wählen Sie ein Programm aus, das 100 Mikroliter in jede Vertiefung einer weißwandigen 96-Loch-Platte abgibt. Geben Sie die Suspension ab und wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf für zusätzliche Platten. Beimpfen Sie außerdem einige Vertiefungen in einer klaren 96-Loch-Platte mit weißem Boden, um die Zellgesundheit und -dichte zu überprüfen.Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, spülen Sie die Zellen zurück in den ursprünglichen Behälter. Reinigen Sie die Kassette, indem Sie 50 Milliliter 70%igen Ethanol, gefolgt von 50 Millilitern warmem sterilem Wasser, durch die Schläuche leiten. Anschließend inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid.Stellen Sie eine Standardkurve von VSV-Delta-51 in DMEM ohne Serum so her, dass die endgültige Konzentration an Plaque-bildenden Einheiten pro Milliliter nach der Übertragung auf Vero-Zellen wie folgt ist. Bereiten Sie 50 Mikroliter jeder Konzentration pro Platte mit Vero-Zellen vor, zuzüglich weiterer 10 %. Die Standardkurve kann in eine 96er-Tieflochplatte überführt werden. Überprüfen Sie anschließend die in der klaren 96-Loch-Platte ausgesäten Vero-Zellen unter einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass die Monolagen mindestens zu 95 % konfluent sind. Übertragen Sie 25 Mikroliter der Probenüberstände auf die in den weißwandigen Platten ausgesäten Vero-Zellen, indem Sie einen 12-Kanal-Mehrkanalpipettierer verwenden, sowie jeweils 25 Mikroliter jeder Verdünnung der Standardkurve auf die Vero-Zellen in den beiden dafür vorgesehenen Spalten. Zentrifugieren Sie die Platten fünf Minuten lang bei 430 ×g bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie danach die Platten fünf Stunden lang bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO₂-Inkubator.Fügen Sie an dieser Stelle Resazurin in einer Menge hinzu, die 10 % des Volumens jedes Wells der 96-Well-Platte mit Proben aus Virus und Zellen entspricht. Nach zwei bis vier Stunden messen und notieren Sie das Signal mit einem Fluoreszenz-Plattenreader unter Verwendung von 530 bis 560 zur Anregung und 590 zur Emission. Geben Sie die Zellviabilität der Probe gemäß der folgenden Formel an.30 Minuten vor dem Ende der fünf Stunden dauernden Inkubation Luciferin vorbereiten, um eine Lösung mit zwei Milligramm pro Milliliter in steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung zu erhalten. Die Lösung vor Licht schützen. Nach der fünf Stunden dauernden Inkubationszeit 25 Mikroliter Luciferin mit einem automatisierten Dosierer, der in das Luminometer integriert ist, jeder Vertiefung mit Vero-Zellen in den weißen Vollplatten hinzufügen. Die Platten mit den folgenden Parametern auslesen.Schütteln Sie fünf Sekunden lang und warten Sie anschließend 30 Sekunden. Messen Sie die Lumineszenz bei einem geeigneten festen Empfindlichkeits- beziehungsweise Belichtungswert, erfassen und speichern Sie dann die quantifizierte biolumineszente Intensität. Falls ein automatischer Dosierer zum Hinzufügen von Luciferin verwendet wurde, spülen Sie das Luciferin aus und befüllen Sie die Leitungen mit steriler Wasser. Für genaue Ergebnisse lösen Sie die nichtlineare Regression, um eine Hill-Gleichung aus den Standardkurven abzuleiten.Wenden Sie diese Gleichung auf die titrierten Proben an, um die viralen Expressions-Einheiten zu berechnen. Die Ergebnisse einer typischen Standardkurve von VSV-Delta 51 sind hier dargestellt. Eine nichtlineare Regressionsanalyse mit vier Parametern ergab eine Hill-Plot, aus der unbekannte Eingabe-Plaque-bildende Einheiten interpoliert werden können. Virus-Titer, die mittels Standard-Plaque-Assay an Vero-Zellen ermittelt wurden, wurden mit berechneten Virus-Titern derselben Proben verglichen, die mit dem Hochdurchsatz-Luciferase-Assay getitriert wurden. Die Proben stammten aus einem Experiment, bei dem verschiedene Chemikalien verwendet wurden, um die Replikation und Ausbreitung von VSV-Delta-51 in 786-0-Zellen zu verstärken. Die lineare Korrelation zwischen Titer und viralen Expressions-Einheiten mit einem Bestimmtheitsmaß (R-Quadrat) von 0,8083 und einem Pearson-R-Wert von 0,899 ist hier abgebildet. Typische Zytotoxizitätsdaten von 786-0-Zellen, die vor der Infektion mit VSV-Delta-51 mit Chemikalien behandelt wurden, sind hier anhand eines Stoffwechsel-Assays dargestellt. Typische Standardkurven, die mit Herpes-simplex-Virus, Vaccinia-Virus und adeno-assoziiertem Virus – alle exprimieren Feuerfliegen-Luciferase – erhalten wurden, sind hier aufgeführt. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie zur Durchführung von Hochdurchsatz-Screenings von Substanzbibliotheken in Kombination mit Ihrem Virus von Interesse verwendet werden, um Titer- und Zytotoxizitätsdaten zu gewinnen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Standardkurve korrekt zu verdünnen, da dies entscheidend für die Interpolation der viralen ExpressionsEinheiten ist.Beachten Sie, dass die Arbeit mit lebenden Viren äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit in einem biologischen Sicherheitswerkbank und das Tragen der geeigneten persönlichen Schutzausrüstung stets zu ergreifen sind, während dieses Verfahren durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie virale Titer mithilfe einer Hochdurchsatz-Quantifizierungsmethode geschätzt werden können, die auf der Expression eines Luciferase-Transgens und der Messung der Biolumineszenz zur Interpolation unbekannter viraler ExpressionsEinheiten aus einer Standardkurve basiert. Gleichzeitig kann die Zytotoxizität der Probe durch einen geeigneten Vitalitätsassay bestimmt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Um Lentiviren, sind DNA-Vektoren in humanen 293-Zellen transfiziert. Nach der Ernte und die Konzentration der Überstand wird Virustiter mittels Fluoreszenz-Ausdruck mit einem Durchflußzytometer bestimmt.

Lentivirus Produktion

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates a luciferase-based pseudovirus titration assay to determine the optimal target cell density for maximum infection. By comparing luminescence across cell densities, the method ensures high assay sensitivity and reproducibility for downstream applications.

Determining Optimal Target Cell Density Using a Luciferase-Based Pseudovirus Infection Assay

Das Video zeigt den Luciferase-Assay, der zur Quantifizierung von Luciferase-markierten Proteinen verwendet wird. Der Assay verwendet ein künstlich hergestelltes Luciferase-Enzym, das aus einem großen Fragment besteht, das an das kleine Fragment bindet, das mit einem Protein von Interesse konjugiert ist. Die gebundenen Untereinheiten bilden ein aktives Enzym, das in Gegenwart des Substrats ein Lumineszenzsignal freisetzt. Dieses Signal wird dann mit einem Luminometer quantifiziert.

Der Luciferase-Assay: Ein Hochdurchsatz-Assay zur Messung von Lumineszenzsignalen mit Hilfe von Bioreportern auf Basis von Nanoluziferase-Systemen

Dieses Video demonstriert eine in vitro Technik zum Nachweis einer Hepatitis-B-Virus (HBV)-Infektion über ein rekombinantes HBV-Reportersystem. Bei der Infektion von Wirtszellen exprimiert das rekombinante virale Genom das Luciferase-Reporterenzym, das bei der Oxidation seines Substrats Biolumineszenz erzeugt und so zum Nachweis einer Virusinfektion beiträgt.

Ein in vitro rekombinantes Virusreportersystem zum Nachweis von Virusinfektionen

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Verfolgung von Virusinfektionen in Mausmodellen mit einem rekombinanten Luciferase- und Fluoreszenzprotein-exprimierenden bi-Reporter-Influenza-A-Virus. Diese Methode ermöglicht sowohl in vivo- als auch ex vivo-Studien, die es den Forschern ermöglichen, Einblicke in die virale Dynamik und die Auswirkungen von Interventionen zu gewinnen.

Ein Luziferase-fluoreszierendes Reporter-Influenzavirus zur Verfolgung von Virusinfektionen

Dieses Video zeigt einen Assay zur Untersuchung der Translationsregulation in Pockenvirus-infizierten Zellen. Nicht infizierte und virusinfizierte Zellen wurden mit mRNAs co-transfiziert, die für Glühwürmchen-Luziferase (Fluc) und Renilla-Luziferase (Rluc) ko-transfizieren, wobei die Fluc-mRNA eine 5'-Poly(A)-Leader-Sequenz enthielt. Nach dem Hinzufügen von biolumineszierenden Substraten zu lysierten Zellen messen Sie das Signal von beiden Luciferasen, um den translationalen Vorteil der Fluc...

Ein Luciferase-Reporter-Assay zur Untersuchung der Translationsregulation in Pockenvirus-infizierten Zellen

Wir präsentieren Ihnen eine schnelle und kostengünstige Screening-Methode zur Identifizierung von Transkriptionsregulatoren mit Hochdurchsatz-Roboter-Transfektionen und ein hausgemachtes Dual-Luciferase-Assay glühen. Dieses Protokoll erzeugt schnell direkten Seite-an-Seite funktionellen Daten für Tausende von Genen und ist leicht modifizierbar, um jedes Gen von Interesse zielen.

Hochdurchsatz-Screening mit einem Funktionshomemade Dual-Luciferase Assay-Schein

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur pseudotyped Partikel in eine Einstellung "BSL-2" unter Einbeziehung der Spike-Protein des hoch pathogenen Viren Nahen Osten respiratorisches Syndrom und Schweres Akutes Respiratorisches Syndrom Coronaviren zu generieren. Diese pseudotyped Partikel enthalten eine Luciferase Reporter-gen ermöglicht die Quantifizierung der Virus Eintritt in Zielzellen Host.

Produktion von Pseudotyped Partikel hoch pathogene Coronaviren in eine Einstellung "Biosafety Level 2" zu studieren

Wir legen ein Protokoll vor, um die mRNA-Übersetzungsverordnung in poxvirus-infizierten Zellen zu untersuchen, die in vitro Transcribed RNA-based luciferase reporter Assay verwendet werden. Der Test kann für das Studium der Übersetzungsregulierung durch cis-Elemente einer mRNA verwendet werden, einschließlich 5 '-unübersetzter Region (UTR) und 3 '-UTR. Mit dieser Methode können auch verschiedene Übersetzungsinitiationsmodi untersucht werden.

In Vitro Transcribed RNA-basierter Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infizierten Zellen

Influenza-A-Viren (IAVs) sind ansteckende Atemwegserreger, die jährliche Epidemien und gelegentliche Pandemien verursachen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Verfolgung viraler Infektionen in vivo mit einer neuartigen rekombinanten Luziferase und fluoreszenz-exzierenden Bi-Reporter IAV (BIRFLU). Dieser Ansatz bietet Forschern ein ausgezeichnetes Werkzeug, um IAV in vivo zu studieren.

Ein luziferasefluoreszierendes Reporter-Influenzavirus zur Live-Bildgebung und Quantifizierung von Virusinfektionen

Um neue Regulatoren von Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, entwickelten wir einen Ansatz für die Bildschirmanordnung von lentiviralen oder retroviralen RNAi-Bibliotheken unter Verwendung eines auf Dual-Luciferase basierenden Transkriptions-Reporter-Assays. Dieser Ansatz bietet eine schnelle und relativ kostengünstige Möglichkeit, Hunderte von Kandidaten in einem einzigen Experiment zu überprüfen.

Identifizierung von Transkriptionsfaktor-Regulierern mit Medium-Throughput-Screening von Arrayed Libraries und einem Dual-Luciferase-basierten Reporter

Erfahren Sie eine Hochdurchsatz-Methode zur Quantifizierung von Luciferase-markierten Viren mit automatisierter Flüssigkeitsverarbeitung. Diese Technik ermöglicht die schnelle gleichzeitige Verarbeitung zahlreicher Proben bei gleichzeitiger Bewertung der Zellviabilität.

Hochdurchsatz-Titration von Luciferase-exprimierenden rekombinanten Viren

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