Hochdurchsatz-Titration von Luciferase-exprimierenden rekombinanten Viren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die viralen Titer eines Luciferase-markierten Virus mit Hilfe einer Hochdurchsatz-Quantifizierungsmethode zu schätzen. Dies wird erreicht, indem der Überstand der zu titerierenden Proben sowie eine virale Standardkurve auf eine permissive Zelllinie übertragen wird, um die Luciferase-Expression zu ermöglichen. In einem zweiten Schritt kann den Originalproben RESA zurin zugesetzt werden, das zur Beurteilung der Zellviabilität verwendet wird.

Als nächstes wird nach einer geeigneten Inkubationszeit Luziferian zu den Zellen hinzugefügt, um durch Lumineszenz zu quantifizieren. Die Ergebnisse zeigen die Menge des Virus in der Probe basierend auf der Luciferase-Expression. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Plaque-Tittern besteht darin, dass eine große Anzahl von Proben schnell und gleichzeitig verarbeitet werden kann.

Diese Methode kann auch auf nicht klackende Luciferase-exprimierende Viren ausgeweitet werden. Da es nicht von der Plaquebildung abhängig ist, kann eine Auslesung der Zellzytotoxizität leicht in den Arbeitsablauf integriert werden und kann im Rahmen eines Wirkstoffscreenings nützlich sein. Vanessa Ramia und Colin, drei Doktoranden aus meinem Labor, werden das Verfahren demonstrieren: Zuerst führen sie Infektionen mit VSP Delta 51 durch, die Firefly Luciferase in 96 exprimieren.

Nun, Gewebekulturplatten, die von diesen Platten überstehen, werden nach einer angemessenen Inkubationszeit 24 Stunden vor dem Titern titeriert. Bereiten Sie eine Suspension von Vero-Zellen in einer Konzentration von 2,5 mal 10 to den fünften Zellen pro Milliliter in DMEM vor, die 10 % FBS 30 millimolare Häufchen und 1 % Penicillin Streptomycin C, 2,5 x 10 bis die vierten Zellen in 96 enthält. Nun, weiße, feste Platten mit flachem Boden, die einen Mikroplatten-Dispenser zur Vorbereitung der Zellsuspension verwenden, reinigen Sie eine Mikroplatten-Dispenser-Kassette, indem Sie den Schlauch mit 50 Millilitern sterilem Wasser spülen.

Füllen Sie dann die Mikrotiterplatten-Dispenserlinien mit Zellsuspension, so dass fünf Milliliter der Zellsuspension durchfließen können. Wählen Sie ein Programm aus, das 100 Mikroliter in jede Vertiefung einer weißwandigen 96-Well-Plattenausgabe dosiert, und wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf für weitere Platten. Säen Sie auch einige Vertiefungen in einer klaren weißen Bodenplatte mit 96 Vertiefungen aus, um die Zellgesundheit und -dichte zu überprüfen.

Wenn Sie fertig sind, spülen Sie die Zellen zurück in den ursprünglichen Behälter. Reinigen Sie die Kassette, indem Sie 50 Milliliter 70 % Ethanol und anschließend 50 Milliliter warmes steriles Wasser durch den Schlauch laufen lassen. Anschließend inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5%igen Kohlendioxid-Inkubator.

Bereiten Sie eine Standardkurve von VSV Delta 51 in serumfreiem DMEM so vor, dass die endgültige Konzentration der Plattformeinheiten pro Milliliter nach dem Transfer auf Vero-Zellen wie folgt ist. Bereiten Sie 50 Mikroliter jeder Konzentration pro Platte Vero-Zellen plus zusätzliche 10 % vor. Die Standardkurve kann auf eine 96-Deep-Well-Platte übertragen werden. Überprüfen Sie als Nächstes die Vero-Zellen, die in der durchsichtigen unteren 96-Well-Platte plattiert sind, unter einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass die Monoschichten zu mindestens 95 % konfluent trans übertragen werden.

25 Mikroliter Probenüberstand auf die Vero-Zellen, die in den weißwandigen Platten sitzen, unter Verwendung einer 12-Kanal-Mehrkanalpipette mit 25 Mikrolitern jeder Verdünnung der Standardkurve zu den Vero-Zellen in den beiden dafür vorgesehenen Säulen. Zentrifugieren Sie die Platten fünf Minuten lang bei 430 g bei Raumtemperatur. Dann inkubieren Sie die Platten fünf Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5%igen Kohlendioxid-Inkubator.

Zu diesem Zeitpunkt fügen Sie Zurin in einer Menge hinzu, die 10 % des Volumens in jeder Vertiefung der 96-Well-Platte mit Proben, die Viren und Zellen enthalten, entspricht. Nach zwei bis vier Stunden wird das Signal mit einem Fluoreszenzplatten-Lesegerät mit 530 bis 560 für die Anregung und 590 für den Emissionsbericht abgelesen und aufgezeichnet. Zellviabilität für die Probe gemäß der folgenden Formel.

30 Minuten vor Ende der fünfstündigen Inkubation bereiten Sie den Luzifer so vor, dass er eine Lösung von zwei Milligramm pro Milliliter in steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung erhält. Schützen Sie die Lösung nach der fünfstündigen Inkubationszeit mit 25 Mikrolitern Luzifer in jeder Vertiefung der Vero-Zellen in den weißen festen Platten mit einem automatisierten Spender, der in das Luminometer integriert ist, vor Licht. Lesen Sie die Platten mit den folgenden Parametern ab.

Schütteln Sie fünf Sekunden lang und warten Sie 30 Sekunden. Lesen Sie die Lumineszenz mit einem geeigneten Slash-Belichtungswert mit fester Empfindlichkeit ab, zeichnen Sie dann die quantifizierte Biolumineszenzintensität auf und speichern Sie sie. Wenn ein automatischer Dispenser verwendet wurde, um Luziferium hinzuzufügen, setzen Sie den Luziferian auf und grundieren Sie die Linien mit sterilem Wasser oder genauen Ergebnissen, lösen Sie die nichtlineare Regression, um eine Hügelgleichung aus den Standardkurven zu generieren.

Wenden Sie diese Gleichung auf die titerierten Proben an, um die viralen Expressionseinheiten zu berechnen. Hier sind die Ergebnisse einer typischen Standardkurve des VSV Delta 51 dargestellt, bzw. die Parameternichtlineare Regressionsanalyse hat einen Hagelplot erzeugt, aus dem unbekannte Eingabeeinheiten interpoliert werden können. Virale Titer, die mit einem Standard-Plaque-Assay an Vero-Zellen erhalten wurden, wurden mit berechneten Virustitern aus denselben Proben verglichen.

mit dem Hochdurchsatz titterierten Luciferase-Assay-Proben stammten aus einem Experiment, bei dem verschiedene Chemikalien verwendet wurden, um die Replikation und Ausbreitung von VSV-Delta-Zellen 51 und 7, 8, 6, 0 zu verbessern. Die lineare Korrelation zwischen Titern und viralen Expressionseinheiten mit einem R-Quadrat von 0,8083 und einem Pearsons-R-Score von 0,899 ist hier dargestellt. Typische Zellzytotoxizitätsdaten, die aus einem metabolischen Assay gewonnen wurden, werden hier für 7, 8, 6, 0 Zellen gezeigt, die vor der Infektion mit Chemikalien behandelt wurden.

Bei VSV Delta 51 sind hier typische Standardkurven dargestellt, die mit Herpes-simplex-Virus, Vaccinia-Virus und Adeno-assoziiertem Virus erhalten wurden und alle Glühwürmchen-Luziferase exprimieren. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie verwendet werden, um Hochdurchsatz-Screenings von Wirkstoffbibliotheken in Kombination mit dem von Ihnen gewünschten Virus durchzuführen, um Titer und Zytotoxizitätsdaten zu generieren. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Standardkurve richtig zu verdünnen, da dies für die Interpolation der viralen Expressionseinheiten entscheidend ist.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit lebenden Viren äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten in einer biologischen Sicherheitswerkbank und das Tragen der entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung getroffen werden sollten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man virale Titer mit einer Hochdurchsatz-Quantifizierungsmethode schätzt, die auf der Expression eines Luciferase-Transgens basiert, um die Biolumineszenz in der Interpolation unbekannter viraler Expressionseinheiten zu messen. Aus einer Standardkurvenprobe kann die Zytotoxizität gleichzeitig durch einen geeigneten Viabilitätsassay bestimmt werden.