Lumineszenz-Resonanzenergietransfer zu Konformationsänderungen in Membranproteinen in Säugerzellen exprimiert Studieren

Wir beschreiben hier eine verbesserte Lumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (LRET) Verfahren, wo wir eine Protease-Schnittstelle zwischen dem Spender und Akzeptor-Fluorophor Stellen einzuführen. Diese Modifikation erlaubt es uns, spezifische LRET Signale aus Membranproteinen von Interesse, so dass für die Untersuchung von Membranproteinen ohne Proteinreinigung erhalten.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die bestätigenden Veränderungen in Membranproteinen in ihrem physiologischen Zustand zu messen. Dies wird durch die ortsspezifische Markierung von Membranproteinen erreicht, um ihre LRE-Lebensdauer und damit den Abstand zwischen den beiden Stellen zu messen. In einem zweiten Schritt wird ein Ligand hinzugefügt, der eine bestätigende Änderung induziert, die gemessen werden kann.

Als nächstes wird die entsprechende Protease hinzugefügt, um eine der Etagenvieren zu spalten und das Hintergrundsignal zu erhalten. Letztendlich kann die Änderung der Fluoreszenzlebensdauer durch den Energietransfer der resultierenden Bewohner gemessen werden, um die bestätigenden Änderungen zu messen, die in der Proteinstruktur auftreten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der X-Extra-Kristallographie besteht darin, dass wir mit dieser Methode die dynamischen Veränderungen von Proteinen in ihrem physiologischen Zustand messen können.

Obwohl diese Methode Einblicke in inotrope Liderezeptoren oder asay sensorische Ionenkanäle geben kann, kann sie auch auf andere Arten von Proteinen wie NICO-Rezeptoren angewendet werden. Wir werden die Technik des Luminesses und des Stress- und Energietransfers zeigen, insbesondere im Zusammenhang mit der Untersuchung von bestätigenden Veränderungen von Membranproteinen in Säugetierzellen. Meine Schüler, Dino und Swara Swami, werden das Verfahren vor Beginn des Experiments demonstrieren.

Es ist wichtig, Markierungsstellen zu wählen, die in der Lage sind, die möglichen Konformationsänderungen innerhalb des Proteins widerzuspiegeln. Wenn möglich, verwenden Sie eine Kristallstruktur des Proteins oder eines homologen Proteins, um diese Bestimmung zu treffen. Wählen Sie die Reste so, dass die Seitenketten der ausgewählten Reste oberflächenexponiert und für die Fluor-Vierer zugänglich sind, damit das Protein markiert werden kann.

Fügen Sie eine Protease-Spaltstelle hinzu, die spezifisch eines der Cystine vom Protein abspalten kann, wenn die Proteinsequenz dies zulässt. Führen Sie eine Stelle ein, indem Sie das Protein konservativ mutieren, um ein Thrombin oder Faktor 10 zu haben, eine Sequenz in der Nähe des eingeführten Cystins und zugänglich für die Proteasespaltung. Wählen Sie eine Stelle so, dass sich eines der eingeführten Cystine bei der Spaltung vom Rest des Proteins dissoziiert.

In bestimmten Fällen kann dies zwei Spaltstellen erfordern, die ein mutiertes Cystin flankieren. Wählen Sie die Etagenvierer basierend auf dem erwarteten Entfernungsbereich aus, der gemessen wird, sodass der Bereich zwischen 0,5 und dem Einsfachen des R-Nullpunkts des Etagenviererpaars liegt. Dies ermöglicht eine einfachere Subtraktion des Hintergrunds, der typischerweise eine viel längere Lebensdauer für einen Bereich von etwa 35 Ångström aufweist, und ein geeignetes Bodenviererpaar wäre tur chelat als Donor und Alexa 5 94 als Akzeptor mit einem R-Nullpunkt von 53 Ångström

Sobald das gewünschte Protein ausgewählt wurde, lösen Sie die HEK-Zellen ab, indem Sie einfach den Puffer gegen den Boden der Schale pipettieren. Schleudern Sie dann die Zellen herunter und resuspendieren Sie das Pellet in drei Millilitern extrazellulärem Puffer. Inkubieren Sie als Nächstes die Zellen im Spender und nehmen Sie ihren Boden auf.

Vieren in äquimolaren Mengen bis zu einer Endkonzentration von 100 bis 300 Nanomolar auf einem Rotator für eine Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen nach der Markierung drei- bis viermal mit extrazellulärem Puffer, um ungebundenes Fluor zu entfernen, und resuspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern frischem extrazellulärem Puffer. Um die Elastizität der Zellen zu messen, überführt man die Zellsuspension in einen Quarz mit einem Mindestvolumen von einem Milliliter und stellt die Anregungswellenlänge des Photolumineszenzspektrometers auf den Absorptionsbereich des Donor-Fluoro-Vier ein.

Stellen Sie die Emissionswellenlänge entsprechend ein. Stellen Sie dann die Länge der Emissionserkennung auf mindestens das Dreifache der erwarteten LRE-Lebensdauer ein, um sicherzustellen, dass eine Komponente mit langer Lebensdauer nicht übersehen wird, und führen Sie mindestens drei Scans mit 99 Sweeps durch, um konsistente Ergebnisse zu gewährleisten. Speichern Sie die Ergebnisse als Textdatei und messen Sie dann die Bestätigungsänderungen eines Proteins als Reaktion auf die Zugabe eines Liganden.

Fügen Sie den Liganden hinzu und führen Sie unter dieser neuen Bedingung mindestens drei Scans mit jeweils 99 Sweeps an derselben Probe durch. Fügen Sie dann bis zu fünf Einheiten der entsprechenden Protease hinzu. Kontinuierliches Scannen, bis die Spaltung abgeschlossen ist und keine weitere Veränderung während der Lebensdauer für drei aufeinanderfolgende Scans zu sehen ist, etwa zwei bis drei Stunden, um die LRE-Daten zu analysieren.

Beginnen Sie mit der Einstellung der Durchschnittswerte als Liniendiagramm mit der Fluoreszenzintensität auf der Y-Achse und der Lebensdauer in Mikrosekunden auf der X-Achse, um eine Kurve zu erstellen, die die Lebensdauer der sensibilisierten Emission des Akzeptors darstellt. Ändern Sie die Y-Achse des Diagramms in einen logarithmischen Maßstab. Öffnen Sie dann im Menü Plotten das Dialogfeld zur Layersteuerung und übertragen Sie die Daten mit dem Hintergrundmittelwert in die Liste der Layerinhalte.

Verwenden Sie als Nächstes im Menü "Mathematik" die einfache mathematische Funktion, um die Hintergrunddaten nach Bedarf zu multiplizieren oder zu dividieren, bis sich das hintere Ende des Hintergrunds mit dem hinteren Ende der Rohdaten überschneidet und das Hintergrundsignal vor und nach der Proteinspaltung vorhanden bleibt. Verwenden Sie dann erneut die einfache mathematische Funktion, um das ausgerichtete Hintergrundsignal vom anfänglichen LRE-Rohsignal zu subtrahieren und die Daten an einen exponentiellen Zerfall anzupassen. Legen Sie die Startbegrenzung für die Anpassung so fest, dass sie nach dem Ende des Laserpulses beginnt.

Wählen Sie dann im Dialogfeld Anpassungsfunktion auswählen die Option Exponentialer Zerfall aus, um die Lebensdauer an die Gleichung für einen einzelnen exponentiellen Abfall anzupassen. Dabei steht Y für die Fluoreszenzintensität, Y Null für die Hintergrundintensität aufgrund des Rauschens des Systems. A Eins ist die Signalintensität, T ist die Fluoreszenzlebensdauer, X ist die Zeit und X Null ist der Zeitversatz.

Korrigieren Sie schließlich X null auf null. Starten Sie die Anpassungsfunktion, und passen Sie die Daten mit den aus den Daten erhaltenen Lebensdauern an. Verwenden Sie die Forstgleichung, um den Abstand zwischen den Etagenvieren zu berechnen.

Eine erfolgreiche LRE-Messung mit einem Lahane-Spender sollte eine Lebensdauer des Spenders nur im Millisekundenbereich haben. Bei der Messung von Bestätigungsänderungen sollte das spezifische LRE-Signal eine Änderung der Lebensdauer außerhalb des Messfehlers anzeigen, die dann durch die Ausbreitung der mit der Anpassung der Lebensdauern verbundenen Fehler berechnet werden kann. Die Lebensdauer der sensibilisierten LRE-Emission für das Protein, das sowohl mit dem Donor als auch mit dem Akzeptor markiert ist, ist mit einer Lebensdauer im Millisekundenbereich deutlich kürzer.

Nach der Hintergrundsubtraktion führt die Proteasespaltung zu einer Verlängerung der Lebensdauer, die im Laufe der Zeit stabil werden sollte, was darauf hindeutet, dass die Proteasespaltung abgeschlossen ist. Wenn das LRE-Signal nur von einer Gruppe von Standorten stammt, sollte die resultierende Emissionslebensdauer nach Subtraktion des Hintergrunds eine exponentielle Lebensdauer von einer einzigen exponentiellen Lebensdauer ergeben. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier bis fünf Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Parameter, Wellenlängen und die Steroidgeschwindigkeit nach seiner Entwicklung zu überwachen. Diese Technik hat den Weg für die Untersuchung von Konformationsänderungen in Membranproteinen in ihrem neurophysiologischen Zustand geebnet.