Name: Expression rekombinanter Proteine für Strukturbiologie in HEK 293F Suspensionszellen: eine neue und Barriere Ansatz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Lernen Sie die Expression rekombinanter Proteine in HEK 293F-Suspensionszellen für die Strukturbiologie. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die Produktion von Protein-Komplexen, die in bakteriellen Systemen schwer herstellbar sind.

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Wir möchten Dr. Xiaowen Yang (PROTEX Klonen Service) zur Herstellung der Expressionskonstrukte für diese Arbeit und der Universität von Leicester Kern Biotechnologie Services verwendet bedanken. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium unterstützt BBSRC, der Wellcome Trust und Senior Investigator Programme Zuschüsse WT085408 &amp; WT100237 und BBSRC gewähren RM31G0224.

HINWEIS: Das Protokoll ist geeignet für jede Skala des Ausdrucks, also Volumen und Mengen von Reagenzien werden proportional skaliert werden. Eine geeignete Säugetierexpressionsvektor muss für dieses Protokoll verwendet werden. Hier wurde eine modifizierte pcDNA 3.1 Expressionsvektor, der bequem ermöglicht den Einschluss oder Ausschluss von einer Affinitätsmarkierung in Abhängigkeit von der Wahl der Restriktionsenzyme in dem Klonierungsvektor (Abbildung 1). Das folgende Protokoll beschreibt eine große Skala Transfektion. 1. Large Scale Kultur / Transfektion in 1 L Rollerflaschen Entwickeln und zu pflegen HEK293F Suspension-adaptierten Zellen nach Standardprotokollen. Starterkulturen typischerweise zwischen 30 und 100 ml, werden in 250 ml konischen Zellkulturflaschen gezüchtet. <ol><li> Samenzellen bei 0,5 x 10 6 Zellen / ml in einem Endvolumen von 300 ml pro 1 Liter Rollflasche. HINWEIS: Roller-Flaschen aufnehmen mindestens 150 ml auf maximal300 ml Suspensionskultur. Für größere Transfektionen verwenden mehrere Flaschen. </li><li> Inkubation für 24 h in einem Schüttler-Inkubator bei 37 ° C, 120 rpm und 5% CO 2, bis die Zellen eine Dichte von 1,0 x 10 6 Zellen / ml erreicht (Zellen sollte etwa alle 24 h unterteilen). </li><li> Pipettieren insgesamt 300 ug sterilfiltriert DNA (siehe Zusatz Verfahren) in 30 ml PBS und kräftig vortexen für 3 Sekunden. HINWEIS: Verwenden Sie insgesamt 1 ug DNA pro Million transfizierten Zellen. Wenn zwei oder mehrere Plasmide sein cotransfiziert reduzieren die Menge von jedem, so daß das Verhältnis von DNA zu Zellen konstant bleibt. </li><li> 1,2 ml von 0,5 mg / ml filtersterilisiert PEI zum PBS / DNA-Lösung und kräftig vortexen für 3 Sekunden. </li><li> Inkubieren der Mischung bei RT für 20 min. </li><li> Wird die DNA / PEI mischen, um die Zellen - die zu einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen / ml (Schritt 1.3) sein sollte. </li><li> Nach Co-Transfektion, Inkubation der Zellenin einem Orbitalschüttler Inkubator für weitere 48 h bei 37 ° C, 120 rpm und 5% CO 2. </li><li> Ernteintrazelluläre Proteine ​​durch Zentrifugieren Zellen bei 3000 × g für 5 min und speichert das Pellet bei -80 ° C. HINWEIS: Alternativ können Sie ein Standard-(Nicht-CO 2) Schüttelinkubator, wenn die Atmosphäre über der Kultur wird mit 5% CO 2 ersetzt, und die Flasche Deckel verschlossen. Die Atmosphäre muss bei jedem Durchgang (in der Regel alle 2 Tage) ersetzt werden. </li></ol> 2. Proteinkomplex Reinigung aus Gesamtzellextrakt Dieses Protokoll wird für die Reinigung der Kernkomplexe mit FLAG-markierten Proteinen optimiert. <ol><li> Abzutauen Zellpellet in ~ 40 ml vorgekühltes Lysepuffer (100 mM Kaliumacetat, 50 mM Tris pH 7,5, 5% Glycerin, 0,3% Triton X-100, Protease-Inhibitoren) pro Liter Kultur. </li><li> Re-Aussetzung der Pellets durch Auf-und Abpipettieren mehrmals (Schaumbildung zu vermeiden, nicht Vortex). </li&gt; <li> Gründlich resuspendieren Zellen mit einem Glas-Homogenisator. Beschallen für 3 Zyklen (15 Sekunden ein, 15 Sekunden aus). Zentrifugieren bei 30000 × g für 25 min bei 4 ° C und der Überstand behalten. </li><li> Äquilibrieren 1,25 ml von Anti-Flag durch dreimaliges Waschen mit Harz Äquilibrierungspuffer (100 mM Kaliumacetat, 50 mM Tris pH 7,5) gepackt Agarose-Harz pro Liter Kultur. </li><li> Inkubieren des gesamten Zellextrakts aus Schritt 2.3 mit dem Affinitätsharz in einem oder mehreren 50 ml-Zentrifugenröhrchen und sanft drehen die Probe für 30-120 min bei 4 ° C ist. </li><li> Zentrifuge bei 3000 × g für 1 min bei 4 ° C, Überstand verwerfen. </li><li> Waschen des Harzes mit 45 ml vorgekühlten Puffer 1 (100 mM Kaliumacetat, 50 mM Tris pH 7,5, 5% Glycerin, 0,3% Triton X-100). Zentrifuge bei 3000 g für 1 min und Überstand verwerfen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.7 mittels Hochsalzpuffer (300 mM Kaliumacetat, 50 mM Tris pH 7,5, 5% Glycerin) mit Niedrigsalzpuffer (50 mM Kaliumacetat, 50 mM Tris pH 7, gefolgt.5, 5% Glycerin) und TEV Spaltungspuffer (50 mM Kaliumacetat, 50 mM Tris pH 7,5, 0,5 mM TCEP). HINWEIS: Stellen Sie sicher, jeder Wäsche ist kurz also ausreichen, um wieder vollständig zu suspendieren das Harz und nicht mehr. </li><li> Sammeln Sie 10 ul Probe von Harz und in 1 Volumen 2x Proteinladepuffer zur Analyse (gebundene Protein-Steuerung) zu verdünnen. Verwenden Sie keine Reduktionsmittel, um zu vermeiden Loslassen der Antikörper aus dem Harz. </li><li> Resuspendieren des Harzes in 8-10 ml vorgekühltes TEV-Spaltpuffer und in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Hinzufügen ~ 40 ug TEV-Protease (ab Lager bei 1 mg / ml) pro Liter ursprüngliche Kultur und gut mischen durch Pipettieren von oben und unten mehrmals. </li><li> Rohr ersetzen Atmosphäre mit 100% N 2 Gas Protein Oxidation zu verhindern. </li><li> Sanft drehen O / N bei 4 ° C. </li><li> Zentrifuge bei 3.000 g für 10 min. Den Überstand in ein Ultrafilterzentrifuge mit einem geeigneten Molekulargewichts-Cutoff und konzentrierenauf 500 ul. </li><li> Sammeln einer Probe von 10 ul der konzentrierten Protein und in 1 Volumen 2x Proteinbeladungspuffer für die Analyse zu verdünnen. (TEV Eluat Kontrolle). </li><li> Sammle eine 10 ul Probe des Harzes und in 1 Volumen 2 × Proteinbeladungspuffer für die Analyse zu verdünnen. Verwenden Sie keine Reduktionsmittel, um zu vermeiden die Freigabe großer Mengen Antikörper aus dem Harz. (Post-TEV-Harz-Steuerung). </li><li> Äquilibrieren die Größenausschluss-Chromatographie-Säule mit Gelfiltrations-Puffer (50 mM Kaliumacetat, 50 mM Tris pH 7,5, 0,5 mM TCEP). </li><li> Filtern des Proteins durch ein 0,22 um-Filter </li><li> Legen Sie die Probe in die Säule und sammelt die Fraktionen. </li><li> Führen Proben aus den Schritten 2.9, 2.15 und 2.16 und die Gelfiltration Fraktionen von Schritt 2.19 auf einem SDS-PAGE und Coomassie-Färbung für die Analyse. HINWEIS: Es wird empfohlen, eine SDS-PAGE der Proben von den Schritten 2.9, 2.15 und 2.16 vor Gelfiltration durchgeführt, um die Expression des Zielproteins zu bestätigen.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Wir haben eine einfache und kostengünstige Methode entwickelt (PEI kosten viel weniger als im Handel erhältlichen Transfektionsreagenzien lipophile) zur Expression und Reinigung von großen Mengen an rekombinanten Proteinen und Multi-Untereinheiten-Komplexen, die aus Säugetierzellen. Optimale Transfektion und Expressionseffizienz kann erreicht werden, wenn hochreine Plasmid-DNA (260/280 zwischen 1,8 und 2,0) in Kombination mit PEI wie in dem Protokoll beschrieben verwendet. Zellen müssen in serum-und antibiotikafreiem Medium kultiviert werden daher steriler Technik ist streng Passagierung und Transfektion von Zellen, um kostspielige und zeitraubende Infektionen zu vermeiden. Lebensfähigkeit der Zellen sollte 90% oder höher sein und Kulturen sollte nicht auf Dichten von mehr als 2,5 x 10 6 Zellen gezüchtet werden / ml unmittelbar vor einer Transfektion, da dies wird Proteinausbeute reduzieren. Für eine erfolgreiche Transfektion, sollte nur Kulturen enthalten einzelne oder teilenden Zellen. Cluster können durch Kraft gebrochen werdenOrganisationseinheiten Vortex 20 bis 30 sec (Abbildung 5). Das Verhältnis von jedem Plasmid in der Co-Transfektion verwendet werden, können durch den Benutzer gemäß der Stöchiometrie des Komplexes untersucht variiert werden. Expressionseffizienz für das Protein von Interesse optimiert werden, so dass ein geeignetes Expressionszeit hergestellt werden kann. Reinigung sollte durchgeführt halten die Proteinprobe Kälte zu jeder Zeit, um das Risiko von unerwünschten proteolytischen Abbau zu reduzieren. Die Auswahl des Tags und Reinigungspuffer ist kritisch, da sie strukturelle Elemente oder aktive Stellen von bestimmten Proteinen stören, was häufig zu einer reduzierten Löslichkeit und / oder Verlust der enzymatischen Aktivität. Klein Transfektionen sind besonders nützlich für das Testen verschiedener Konstrukte für die Reinigung von großen Proteinkomplexen. Heute ist eine große Vielfalt von alternativen Methoden sind für die Expression des rekombinanten eukaryontischen Proteinen (Tabelle 2) verfügbar. Zum Beispiel Baculovirus Expression in Insektenzellen wird häufig wegen seiner hohen Transduktionseffizienz und ihre mangelnde Zytotoxizität im Vergleich zu anderen viralen Spezies 6 verwendet. Jedoch ist das Verfahren zur Herstellung des Virus zeitaufwendig und seiner Instabilität nicht den Viren für längere Zeit gelagert werden. Auf der anderen Seite bieten Hefe-Expressionssystemen die Möglichkeit wachsenden Zellen zu sehr hohen Dichten in Fermenter-Kulturen, was zu hohen Proteinausbeuten 7. Aber noch nicht über die volle Vielzahl von post-translationalen Modifikationen für eukaryontische Proteine ​​erforderlich ist, um korrekt zu falten und die Interaktion mit den Proteinpartner. HDAC3 zum Beispiel exprimiert, aber nicht in E. falten coli. Wenn jedoch in 293F-Zellen exprimiert, waren wir in der Lage, ein aktives Enzym im Komplex mit seinem Co-Repressor (SMRT) und einem Molekül von Inositol-Tetraphosphat (IP4) 8, die in prokaryotischen Zellen gefunden wird, zu reinigen. Diese Methode hat sich uns auch die Möglichkeit zu reinigen und lösen das Kristall structure von HDAC1 Interaktion mit MTA1 im NuRD-Komplex, der in ähnlicher Weise durch IP4 9 aktiviert wird. Idealerweise würden wir immer gerne eukaryotischen Proteinen in ihrer natürlichen, physiologischen Umgebung auszudrücken. Säugetier-Expressionssysteme, die HEK 293-Zellen in Bioreaktoren EBNA1 10-12 beschrieben und ergeben sehr hohe Protein, diese können aber komplex in der Anwendung sein. Unser Verfahren ist eine einfache und leicht zugängliche Alternative zur Expression in Bakterien, Hefe und Bioreaktorsysteme. Expressionsverfahren ist schnell und erfordert nicht die Verwendung von teuren Geräten, insbesondere wenn der Rollflasche oder Kolbenatmosphäre mit 5% CO 2 und Standard Schüttelinkubatoren verwendet werden ersetzt. Wir haben diese Protokolle verwendet, um mehrere Plasmide co-transfizieren und zu reinigen Komplexe mit bis zu fünf Proteine ​​mit Ausbeuten von&gt; 1 mg / l Kultur. Interessant ist, hilft das System die Identifizierung von stabilen brav Komplexe. Zum Beispiel expression des binären Komplex von HDAC1 und Sin3A gab begrenzten Proteinausbeuten, noch Zusatz von SDS3 Folge 5-fach höhere Mengen und somit führt die Strukturbiologe bei der Wahl der geeigneten Konstrukte und stabile Komplexe für die Kristallisation.

Der rasche Fortschritt der molekularen Zellbiologie und der ständige Bedarf an verbesserten Drogen in der Medizin hat einen Bedarf an Strukturbiologen um bei zunehmend komplexer Proteinstrukturen aussehen erstellt. Diese können oft erfordern besondere post-translationale Modifikationen, molekulare Chaperone und Co-Faktoren, die ihre kunstvollen Falten und enzymatische Aktivität zu unterstützen. Während die überwiegende Mehrheit der in der Protein Data Bank wurden mit bakteriellen Expressionssystemen gewonnen worden gegenwärtigen Strukturen sind Prokaryoten nicht um eine große Anzahl dieser Modifikationen durchzuführen und es fehlt vielen wesentlichen eukaryotischen Co-Faktoren. Dies kann ein Problem für die Untersuchung von großen Multi-Untereinheiten-Komplexen, die bei kleinen Signalmolekülen sowie für nukleare, Zelloberflächen und sekretierte Proteine, die aufwendigen Faltung Maschinen erforderlich aktiviert werden. Eine Anzahl von E. coli-Stämme wurden entwickelt, um einige dieser Einschränkungen 1 überwinden. In den letzten Jahren wurde jedoch die Verwendung von mammalian Expressionssystemen ist gestiegen, weil sie zuverlässig eukaryotischen Proteinen, die sonst problematisch in anderen Systemen 2 auszudrücken produzieren. Heute ist es möglich, eine stabile und vorübergehende Expression Säugerzelllinien durch eine Vielzahl von Techniken, die aus viralen Transduktion chemisch vermittelte Transfektion Bereich zu erhalten, physikalischen Gentransfer wie Elektroporation und direkte Injektion 3. Während alle diese Verfahren haben ihre eigenen Vorteile und Nachteile, nur einige von ihnen sind für strukturelle Untersuchungen entweder zu teuer und / oder zeitaufwendig. Hier beschreiben wir eine sehr einfache, schnelle, kostengünstige, aber hochwirksames Verfahren zur Expression von Proteinkomplexen Strukturbiologie in Suspension gezüchtet Säugerzellen. Der Ansatz nutzt transiente Co-Transfektion einer humanen embryonalen Nierenzellen (HEK)-Zelllinie (zB Freestyle HEK 293F-Zellen). Diese Zellen wurden aus der HEK 293-CE abgeleitetll Linie dazu geeignet sind, in Suspensionskulturen wachsen und erreichte hohe Dichten mit Serum-freien Medien (wie FreeStyle 293 Expression Medium). Die Zellen werden dann vorübergehend mit einer verzweigten Version von Polyethylenimin (PEI), eine preiswerte Polymer Reagenz, das berichtet wurde, dass für eine Vielzahl von Säugetierzellen durch Bildung von 4 DNA / PEI-Komplexe, die die Wirtszelle geben durch Endozytose 5 funktionieren transfiziert. Dieses Verfahren eignet sich sowohl für kleine Skala (30 ml) und große (bis zu 300 ml) Versuchen und kann hohe gereinigtes Protein-Komplexe zu erzeugen. Es ist besonders nützlich für die Untersuchung von Proteinen, die komplexe Faltung Maschinen, Co-Faktoren oder bestimmte post-translationale Modifikationen, die nicht von Bakterien, Hefe und Insektenzellen durchgeführt werden kann, erforderlich. In diesem Protokoll zu präsentieren wir die Expression und Reinigung der drei zentralen Gerüstprotein aus der Sin3A Transkriptionsrepression komplex. Diese besteht aus HistoneDeacetylase 1 (HDAC1), Suppressor der Defekte Silencing 3 (SDS3) und Switch-unabhängige 3 (Sin3A). Das gereinigte Komplex ist für Hochdurchsatz-Kristallisationsversuche verwendet.

<table><tbody><tr><td>FreeStyle HEK 293F Zellen&nbsp;</td><td>LifeTechnologies</td><td>R790-07</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle 293 Expression Medium</td><td>LifeTechnologies</td><td>12338-018</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>SIGMA</td><td>A220</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Erlenmeyerkolben mit belüftetem Verschluss</td><td>Corning</td><td>431144</td><td></td></tr><tr><td>Rollerflaschen mit belüftetem Verschluss</td><td>Corning</td><td>01836-02</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimin, 25 kDa, verzweigt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>0,5 mg/ml in H2O herstellen, pH-Wert auf 7,0 mit verdünntem HCl einstellen und bei -20 - 4 μm lagern; C</td></tr><tr><td>Säugetier-Expressionsvektor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &Mikro; m Zentrifugalfiltereinheiten</td><td>Amicon</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Ultra-Zentrifugalfilter (10 kDa Cut-off)</td><td>Amicon</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Superdex&nbsp; 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5175-01</td><td></td></tr></tbody></table>

expression rekombinanter proteine ​​für strukturbiologie in hek 293f suspensionszellen: eine neue und barriere ansatz

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

Die Expression und Reinigung großer Mengen rekombinanter Proteinkomplexe ist eine wesentliche Voraussetzung für strukturbiologische Studien. Seit über zwei Jahrzehnten dominieren prokaryotische Expressionssysteme wie E. coli die wissenschaftliche Literatur gegenüber kostspieligen und weniger effizienten eukaryotischen Zelllinien. Trotz des klaren Vorteils in Bezug auf Ausbeute und Kosten der Expression rekombinanter Proteine in Bakterien kann das Fehlen spezifischer Co-Faktoren, Chaperone und posttranslationaler Modifikationen zu Funktionsverlusten und Fehlfaltungen führen und die Protein-Protein-Wechselwirkungen bestimmter eukaryotischer Multi-Subunit-Komplexe, Oberflächenrezeptoren und sezernierter Proteine stören. Die Verwendung von Säugetierzellexpressionssystemen kann diese Nachteile beheben, da sie eine eukaryotische Expressionsumgebung bieten. Geringe Proteinausbeuten und hohe Kosten solcher Methoden haben ihren Einsatz in der Strukturbiologie jedoch bis vor kurzem eingeschränkt. Hier beschreiben wir eine einfache und zugängliche Methode zur Expression und Reinigung von Milligramm-Proteinmengen durch transiente Transfektionen von suspensionsgezüchteten HEK (Human Embryonic Kidney) 293F-Zellen.

Hier zeigen wir eine 2-L (8 x 250 ml-Kulturen) transiente Co-Transfektion und Reinigung der HDAC1, SDS3, Sin3A ternären Komplex. HDAC1 und SDS3 mit Sin3A interagieren durch die HDAC-Interaktionsdomäne (HID) von Sin3A. Eine typische Reinigungsausbeuten von bis zu 1 mg Komplex pro Liter Kultur. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig1highres.jpg" width="500"> Abbildung 1 Schematische Darstellung des modifizierten pcDNA 3.1 Expressionsvektor. Das Plasmid wurde mit EcoRV und EcoRI verdaut, um die Affinität-Tags und TEV-Spaltstelle am Aminoterminus Sin3A umfassen. Ungetaggte Versionen von HDAC1 und SDS3 Klonierung wurde der Vektor mit KpnI und EcoRI verdaut. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig2highres.jpg" width="500"> Abbildung 2. SDS-PAGE zeigt den ersten Schritt der Reinigung. Der "gebundene Protein" Spur zeigt das an das Affinitätsharz gebundenen Komplexes. Nach TEV Verdauung, ist die vorliegende Tag auf Sin3A-HID abgespalten und der Komplex wird aus dem Harz eluiert, wie in der zweiten und dritten Spuren des Gels gezeigt. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig3highres.jpg" width="500"> Figur 3: Chromatogramm Protein-Komplexes unter Verwendung von gereinigtem Grßenausschlußchromatographie. Beachten Sie, dass der reine Komplex in dem Leervolumen eluiert, da sie ein Dimer bildet, in Lösung. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig4highres.jpg" width="500"> Abbildung 4. SDS-PAGE, die die Bruchteile des in 3 gezeigten Gelfiltration. Abbildung 5. Trypanblau-gefärbten HEK 293F-Zellen in 2.3x10 6 Zellen / ml bereit, transfiziert werden. Zellen sollten nur als Einzel oder teilenden Zellen vorhanden sein, während große Cluster kann durch kräftiges Vortexen für ca. 25 Sekunden unterbrochen werden. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Problem </td><td> Mögliche Ursachen </td><td> Aktion </td></tr><tr><td rowspan="4"> Geringe Proteinausbeute. </td><td> Geringe Anzahl von Zellen transfiziert. </td><td> Stellen Sie sicher, Zelldichte etwa 1,0 × 10 6 vor dem Hinzufügen der Transfektion Reaktionsgemisch auf die Kultur. </td></tr><tr><td> Zellen können zu oft subkultiviert wurden. </td><td> Verwenden Sie frische Lager Zellen nach etwa 90 PassAltersgruppen. </td></tr><tr><td> DNA verschlechtert oder eine hohe Menge an Verunreinigungen sein. </td><td> Stellen Sie sicher, die Plasmid-DNA verwendet hat eine 260/280 Verhältnis zwischen 1,8 und 2,0. Ausführen der DNA auf einem Agarose-Gel ist ratsam, seine Qualität zu beurteilen. </td></tr><tr><td> Protein (e) exprimiert sind nicht stabil oder löslich genug. </td><td> Testen Sie verschiedene Konstrukte im kleinen Maßstab vor, um up-Skalierung der Transfektionen. Stellen Sie sicher, Tags nicht mit der Struktur der Protein (e) von Interesse stören. </td></tr><tr><td> Zellen aussehen bewölkt und haben eine ungewöhnliche Farbe und / oder Geruch. </td><td> Zellen werden mit Bakterien oder Hefe infiziert. </td><td> Gute sterile Technik muss jederzeit verwendet werden. Räucherpatronen die Laminarströmungshauben und UV-Desinfektion des Zellkulturraum im Falle einer Infektion trägt das Problem enthalten. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Zellen haben eine geringe Überlebensfähigkeit. </td><td> Falscher pH-Wert in den Medien. </td><td> Stellen Sie sicher, Kulturen werden bei 5-8% CO 2 gewachsenzu allen Zeiten. </td></tr><tr><td> Zellen wurden bis zu einer Dichte von mehr als 3.0x10 6 Zellen / ml kultiviert. </td><td> Die Zellen sollten nicht bis auf Dichten von mehr als 2,5 x 10 6 Zellen / ml unmittelbar vor einer Transfektion und nicht über 3,0 x 10 6 Zellen / ml gezüchtet werden. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Affinitätsreinigung hat nicht funktioniert </td><td> Protein (e) wird nicht exprimiert. </td><td> Siehe oben. </td></tr><tr><td> Reinigungsbedingungen könnte falsch sein. </td><td> Passen Pufferbedingungen (zB hohe Salz, wenig Salz, pH-Wert.) </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Fehlersuche. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> System </td><td> Vorteile </td><td> Nachteile </td></tr><tr><td> E. coli </td><td><ul><li> SchnellExpressionssystem </li><li> Hohe Proteinausbeuten </li><li> Billig </li><li> Geeignet für die kostengünstige Herstellung von isotopenmarkierten Proteine </li></ul></td><td><ul><li> Fehlen wichtiger Chaperone, die für die Proteinfaltung erforderlich sein können </li><li> Mangel an viele Post-translationale Modifikationen </li><li> Kann Co-Faktoren, die wichtig für die Proteinfunktion und / oder komplexe Montage sind fehlt. </li></ul></td></tr><tr><td> P. pastoris </td><td><ul><li> Kann die Mehrheit der Post-translationale Modifikationen durchführen </li><li> Billig </li></ul></td><td><ul><li> Fehlen einige post-translationale Modifikationen </li><li> Kann Co-Faktoren, die wichtig für die Proteinfunktion und / oder komplexe Montage sind fehlt. </li></ul></td></tr><tr><td> Baculovirus Expression in Insektenzellen </td><td><ul><li> Können alle Post-translationale Modifikationen durchführen &lt;/ Li&gt; </li><li> Baculovirus weniger zytotoxische als andere Virusstämme </li></ul></td><td><ul><li> Herstellung des Virus für die Transduktion ist zeitaufwendig </li><li> Das Virus ist nicht stabil und kann für lange Zeiträume gelagert werden, </li><li> Insektenzellen können Co-Faktoren, die für die Proteinfunktion und / oder komplexe Montage sind fehlt. </li></ul></td></tr><tr><td> Bioreaktoren mit Säugetiersystemen </td><td><ul><li> Können alle Post-translationale Modifikationen durchführen </li><li> Können alle Co-Faktoren für die Proteinfunktion und komplexe Montage benötigt bieten </li><li> Können Kulturzellen mit sehr hohen Dichten </li><li> Können alle Säugerproteinen, die komplexe Faltung Maschinen bedürfen einer ausdrücklichen </li><li> Sehr hohe Proteinausbeuten </li></ul></td><td><ul><li> Erfordert Fachpersonal, den Bioreaktor zu verwenden. </li><li> Teure Ausrüstung erforderlich ist. </li><li> Optimierung der Expression Zustands kann zeitaufwendig sein. </li></ul></td></tr><tr><td> HEK 293F Suspensionszellen </td><td><ul><li> Können alle Post-translationale Modifikationen durchführen </li><li> Können alle Co-Faktoren für die Proteinfunktion und komplexe Montage benötigt bieten </li><li> Können alle Säugerproteinen, die komplexe Faltung Maschinen bedürfen einer ausdrücklichen </li><li> Schnelle und intuitive Transfektionsprotokolls </li><li> Relativ preiswert im Vergleich zu Bioreaktoren und / oder anderen im Handel erhältlichen Transfektionsreagenzien. </li></ul></td><td><ul><li> Obwohl erschwinglich, nicht so billig wie die Expression in Bakterien </li></ul></td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Vorteile und Nachteile der wichtigsten Expressionssysteme.

Die Expression rekombinanter Proteine durch Säugetiersysteme wird zu einer attraktiven Methode zur Herstellung von Proteinkomplexen für die Strukturbiologie. Hier stellen wir ein einfaches, aber hocheffizientes Expressionssystem vor, bei dem suspensionsgezüchtete Säugetierzellen zur Aufreinigung von Proteinkomplexen für Strukturstudien verwendet werden.

Expression rekombinanter Proteine ​​für Strukturbiologie in HEK 293F Suspensionszellen: eine neue und Barriere Ansatz

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Videos ist es, eine einfache und erschwingliche Technik zur Herstellung einer guten Ausbeute an Proteinen oder Proteinkomplexen unter Verwendung eines Säugetierexpressionssystems zu demonstrieren. Dies wird durch die Kultivierung von HEC 2 93 F-Zellen in Suspension in einem befeuchteten Schüttelbrutkasten mit einer Atmosphäre erreicht, die bei 5 % Kohlendioxid gehalten wird. In einem zweiten Schritt werden die Zellen transient mit einem oder mehreren Plasmiden mit hoher Kopienzahlexpression transfiziert.Mit dem Transfektionsmittel Polyethylen EIN oder PEI wurden die Zellen vor der Ernte 48 Stunden lang wachsen gelassen. Als nächstes wird die Proteinreinigung mit Affinitätsharz durchgeführt, gefolgt von der Gelfiltration, um den interessierenden Proteinkomplex zu reinigen und strukturelle und funktionelle Studien durchzuführen. Letztendlich ermöglicht dieses erschwingliche und einfache Säugetierexpressionssystem die Expression und Reinigung von Proteinen und Proteinkomplexen, die in Bakterienzellen nur schwer zu exprimieren sind.Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist seine Bequemlichkeit und Vielseitigkeit bei der Expression von Proteinkomplexen. Es ist fast so einfach wie die Herstellung von Proteinen in Bakterien, zumal man Proteinexpressionsvektoren mischen und anpassen kann. Die Methode kann zunächst in kleinem Maßstab verwendet werden, um die Expression von Proteinkompressen zu testen, aber sie ist leicht skalierbar, um eine gute Ausbeute an Proteinkompressen zu erzielen. Für strukturelle und funktionelle Studien liegt der Schlüssel zum Erfolg darin, die Zellen in einem gesunden Zustand zu halten, frei von Bakterien oder Hefeinfektionen.Da Antibiotika in den Medien Ihre Proteinausbeute stark reduzieren. Nehmen Sie zunächst ein Kryofläschchen mit einem Milliliter HEC 2 9 3 F-Zellen mit einer Dichte von 20 Millionen Zellen pro Milliliter aus dem flüssigen Stickstoff und tauen Sie es schnell in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf. Brechen Sie alle Klumpen auf, indem Sie einige Male auf und ab pipettieren und pipettieren Sie den gesamten Inhalt in einen konischen 250-Milliliter-Zellkulturkolben mit 34 Millilitern Vorwärmmedium.Stellen Sie die Kultur nach 48 Stunden in einen befeuchteten orbitalen Schüttelinkubator bei 37 Grad Celsius, 120 U/min und 5 % Kohlendioxid. Überprüfen Sie die Zellviabilität anhand von Trian Blue. Die normale Zellviabilität liegt in diesem Stadium bei etwa 70 %, wenn die Zellen eine Anzahl von etwa 1 Million Zellen pro Milliliter erreicht haben.Massieren Sie sie bis zu einer Endzahl von 0,35 Millionen Zellen pro Milliliter in einen konischen 250-Milliliter-Zellkulturkolben mit 60 Millilitern vorwärmtem Medium und massieren Sie die Zellen alle 48 Stunden oder wenn sie etwa 2 Millionen Zellen pro Milliliter erreichen. Hier ist eine Probe von Trian-Blau-Färbezellen HEC 2 9 3 F mit 2,3 Millionen Zellen pro Milliliter aus einem Stamm, der für die Aussaat für die Transfektion bereit ist, Zellen sollten nur als Einzel- oder sich teilende Zellen vorliegen. Wenn Zellen überwuchert sind, bilden sie große Klumpen und haben eine sehr geringe Lebensfähigkeit, wie in diesem Bild gezeigt.Wenn Zellen Cluster bilden, können diese durch kräftiges Vortexen für 25 Sekunden aufgebrochen werden. Zu Beginn der Kulturen im großen Maßstab werden die Zellen mit einer halben Million Zellen pro Milliliter in ein Endvolumen von 300 Millilitern in jeder Ein-Liter-Rollflasche ausgesät. Inkubieren Sie 24 Stunden lang in einem befeuchteten Orbitalschüttler bei 37 Grad Celsius, 135 U/min und 5 % Kohlendioxid, bis die Zellen eine Dichte von 1 Million Zellen pro Milliliter erreichen.Pipettieren Sie anschließend insgesamt 300 Mikrogramm filtrierte, sterilisierte DNA in 30 Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS und wirbeln Sie drei Sekunden lang kräftig auf. Fügen Sie dann 1,2 Milliliter von 0,5 Milligramm pro Milliliter hinzu. Sterilisiertes PEI in die PB SDNA-Lösung filtrieren und weitere drei Sekunden lang kräftig vortexen.Inkubieren Sie die Mischung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie die Mischung in die folgenden Zellen geben. Durch die Transfektion werden die Zellen in einem befeuchteten orbitalen Schüttelinkubator für weitere 48 Stunden bei 37 Grad Celsius, 135 U/min und 5 % Kohlendioxid nach 48 Stunden inkubiert. Ernten Sie intrazelluläre Proteine, indem Sie Zellen fünf Minuten lang bei 3000-fachem G zentrifugieren.Ist das Zellpellet nicht für den sofortigen Gebrauch bestimmt, kann es bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Dieses Protokoll ist optimiert für die Aufreinigung von Proteinkomplexen aus dem Zellkern, bei denen eines der Proteine ein Flag-Tag hat. Um mit der Reinigungsreanimation zu beginnen, suspendieren Sie die Zellpalette in etwa 40 Milliliter vorgekühlte Lyse, puffern Sie pro Liter Kultur, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren und einen Glashomogenisator für drei Zyklen von 15 Sekunden bei 15 Sekunden aus beschallen.Zentrifugieren Sie dann Ihre 108.000 mal G für 25 Minuten bei vier Grad Celsius und behalten Sie die Rückenlage. Als nächstes äquilibrieren Sie 1,2 Milliliter Anti-Flag-verpacktes Aros-Harz pro Liter Kultur, indem Sie dreimal mit Harzausgleichspuffer waschen, inkubieren Sie das Supinat, das den gesamten Zellextrakt mit dem Affinitätsharz darstellt, in einem oder mehreren 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das sich 30 bis 120 Minuten lang sanft dreht, bei vier Grad Celsius, nach der Inkubationszentrifuge bei 3000 mal G für eine Minute bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie das Supinat verworfen haben, geben Sie das Harz in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und waschen Sie es mit insgesamt 45 Millilitern vorgekühltem Puffer, eine Zentrifugen davor und verwerfen Sie dann das Supinat, wiederholen Sie das Waschen und Zentrifugieren mit einem Puffer mit hohem Salzgehalt, gefolgt von einem Puffer mit niedrigem Salzgehalt und einem TEV-Spaltpuffer.Stellen Sie sicher, dass jede Wäsche ausreicht, um das Harz vollständig zu resuspendieren, aber nicht länger. Sammeln Sie als Nächstes eine 10-Mikroliter-Probe des Harzes und verdünnen Sie es zu einem Volumen aus zweifachem Proteinladepuffer für die Analyse, um die gebundene Proteinprobe darzustellen. Verwenden Sie keine Reduktionsmittel, da diese den Antikörper aus dem Harz freisetzen.Dann resuspendieren Sie das Harz in 10 Milliliter vorgekühlten TEV-Spaltpuffer bei etwa 40 Mikrogramm TEV-Protease pro Liter Originalkultur und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen. Der Gehalt an TEV-Protease kann je nach Menge des exprimierten Proteins optimiert werden. Ersetzen Sie die Röhrenatmosphäre durch 100 % Stickstoffgas, um eine Proteinoxidation zu verhindern, bevor Sie am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius sanft rotieren.Die Probe wird 10 Minuten lang bei 3000 mal G zentrifugiert, dann wird das Supinat in einen Ultrazentrifugalfilter mit einem geeigneten Molekulargewichtsgrenzwert überführt und auf 500 Mikroliter konzentriert. Entnehmen Sie eine 10-Mikroliter-Probe des konzentrierten Proteins und verdünnen Sie es zur Analyse in ein Volumen mit zweifachem Proteinladepuffer. Diese Probe stellt die TEV-Eluatprobe dar.Entnehmen Sie dann eine 10-Mikroliter-Probe des Harzes und verdünnen Sie es zu einem Volumen von zweifachem Proteinladepuffer. Diese Probe stellt die Post-TEV-Harzprobe dar. Der nächste Schritt besteht darin, das Protein durch eine Größenausschlusssäule laufen zu lassen, und es sollte eine geeignete Gelfiltrationsmatrix entsprechend der Größe des interessierenden Komplexes verwendet werden.In diesem Fall haben wir eine 10 x 300 Millimeter große S 200 Größenausschlusschromatographiesäule A verwendet, die der Größenausschlusschromatographiesäule mit Gelfiltrationspuffer gleichsetzt. Filtrieren Sie das Protein durch einen 0,22-Mikron-Filter und laden Sie die Probe in die Säule. Fahren Sie mit dem Sammeln der Fraktionen fort, wenn sie aus der Säule kommen.Als letzten Schritt führen Sie eine SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektropherese oder SDS-Seite auf den gesammelten Proben sowie den Gelfiltrationsfraktionen, dem Histon DS SLA eins oder dem HD-Eins-Suppressor der defekten Stummschaltung drei oder SDS drei und syn drei, einer HDAC-Wechselwirkungsdomäne oder syn drei, einem HID einen stabilen Turny-Komplex durch. Die Affinitätsreinigung des Turny-Komplexes kann auf der SDS-Seite beobachtet werden. Hier ist der gereinigte Komplex zu sehen, der von Cot produziert wird, der zwei Liter Zellen durchtrennt.Die gebundene Proteinspur zeigt den Komplex, der an das Affinitätsharz gebunden ist. Nach der TEV-Verdauung wird das auf der dritten Sünde A HID vorhandene Tag abgespalten und auf den Komplex angespielt. Bei dem hier gezeigten Harz handelt es sich um ein Chromatogramm des Proteinkomplexes, das mit einer 10 x 300 Millimeter großen S 200 großen Ausschlusschromatographiesäule gereinigt wurde.Beachten Sie, dass sich der reine Komplex in der Nähe des Hohlraumvolumens entzieht, da er in Lösung ein Dimer bildet. Schließlich zeigt die SDS-Seitenanalyse das gereinigte Protein in den Gelfiltrationsfraktionen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie gezüchtete HEC-Zellen mit zwei und drei App-Zellen züchten, pflegen und cotran sowie wie Sie Ihr Protein affinisieren, reinigen und konzentrieren.Komplex Gesunde Zellen sind für den Erfolg von Experimenten unerlässlich, also stellen Sie sicher, dass sie gezüchtet werden und regelmäßig unter ihren Bedingungen und in ihrer Passage bleiben. Lassen Sie sich nicht von Gewebekulturen abschrecken. Für Strukturbiologen ist es ein Leichtes, große Mengen an Proteinen und Proteinkomplexen aus Säugetierzellen zu exprimieren und zu reinigen.

recombinant-protein-expression-for-structural-biology-hek-293f

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Protein Transduktion ermöglicht die direkte Abgabe von biologisch aktiven Proteinen in Zellen. Im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden wie DNA-Transfektion oder virale Transduktion dieser nicht-invasiven Paradigma ermöglicht hoch effiziente zelluläre Manipulation in eine titrierbare Weise umgehen zelluläre Toxizität und das Risiko der onkogenen Transformation durch permanente genetische Veränderung.

Engineering zellpermeablen Protein

Optimierte Transfektion Strategie für Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinantem Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T-Zellen

In der Post-Genom-Ära menschlicher, ist die Verfügbarkeit von rekombinanten Proteinen in nativer Konformation darauf an, strukturelle, funktionelle und therapeutische Forschung und Entwicklung. Hier beschreiben wir ein Test-und Proteomik-Expressionssystem in humanen embryonalen Nierenzellen 293T-Zellen, die verwendet werden, um eine Vielzahl von rekombinanten Proteinen hergestellt werden können.

Eine bequeme und allgemein Expression Plattform für die Produktion von sekretierten Proteinen aus menschlichen Zellen

Kindlins sind von grundlegender Bedeutung für die Zelladhäsion durch Integrine aber Studien von ihnen von der Schwierigkeit, sie rekombinante Expression in bakteriellen Wirten angetroffen behindert. Wir beschreiben hier Methoden für die effiziente Produktion in Baculovirus-infizierten Insektenzellen.

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Entwicklung biotinylatable Fusionsproteine ​​hat viele mögliche Anwendungen in verschiedenen Bereichen der Forschung. Rekombinante Protein-Engineering ist ein geradlinig Verfahren, die kostengünstig ist, das hohe Ausbeuten von kundenspezifischen Proteinen.

Expression, Isolierung und Reinigung von löslichen und unlöslichen biotinylierter Proteine ​​für Nervengeweberegeneration

Dies ist ein schnelles, kosteneffizientes Protokoll für die Herstellung von sekretierten, glykosylierten Säugetierproteinen und die anschließende einstufige Aufreinigung mit ausreichenden Ausbeuten an homogenem Protein für die Röntgenkristallographie und andere biophysikalische Studien.

Effiziente Mammalian Cell Expression und Single-step Reinigung der extrazellulären Glykoproteinen für die Kristallisation

Die Produktion von eukaryotischen Proteinen im Labormaßstab mit entsprechender posttranslationaler Modifikation stellt ein erhebliches Hindernis dar. Hier ist ein robustes Protokoll mit schneller Etablierung und Durchlaufzeit für die Proteinexpression unter Verwendung eines Säugetier-Expressionssystems. Dieses System unterstützt die selektive Aminosäuremarkierung, die selektive Markierung von Proteinen und die kleinmolekulare Modulatoren der Glykanzusammensetzung.

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Nichtlysierende Insektenzellexpressionssysteme sind für die Produktion, Zellmigration / Lokalisierung und rekombinante Protein funktionelle Analyse nicht ausgelastet. Hier beschreiben wir Verfahren, Expressionsvektoren und nachfolgende transiente Proteinexpression in kommerziell erhältlichen Lepidoptera-Zelllinien zu erzeugen. Die Co-Lokalisierung von Bemisia tabaci aquaporins mit subzellulären fluoreszierenden Markerproteinen wird ebenfalls vorgestellt.

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Expression rekombinanter Proteine ​​für Strukturbiologie in HEK 293F Suspensionszellen: eine neue und Barriere Ansatz

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