Expression rekombinanter Proteine ​​für Strukturbiologie in HEK 293F Suspensionszellen: eine neue und Barriere Ansatz

Das übergeordnete Ziel des folgenden Videos ist es, eine einfache und erschwingliche Technik zur Herstellung einer guten Ausbeute an Proteinen oder Proteinkomplexen unter Verwendung eines Säugetierexpressionssystems zu demonstrieren. Dies wird durch die Kultivierung von HEC 2 93 F-Zellen in Suspension in einem befeuchteten Schüttelbrutkasten mit einer Atmosphäre erreicht, die bei 5 % Kohlendioxid gehalten wird. In einem zweiten Schritt werden die Zellen transient mit einem oder mehreren Plasmiden mit hoher Kopienzahlexpression transfiziert.

Mit dem Transfektionsmittel Polyethylen EIN oder PEI wurden die Zellen vor der Ernte 48 Stunden lang wachsen gelassen. Als nächstes wird die Proteinreinigung mit Affinitätsharz durchgeführt, gefolgt von der Gelfiltration, um den interessierenden Proteinkomplex zu reinigen und strukturelle und funktionelle Studien durchzuführen. Letztendlich ermöglicht dieses erschwingliche und einfache Säugetierexpressionssystem die Expression und Reinigung von Proteinen und Proteinkomplexen, die in Bakterienzellen nur schwer zu exprimieren sind.

Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist seine Bequemlichkeit und Vielseitigkeit bei der Expression von Proteinkomplexen. Es ist fast so einfach wie die Herstellung von Proteinen in Bakterien, zumal man Proteinexpressionsvektoren mischen und anpassen kann. Die Methode kann zunächst in kleinem Maßstab verwendet werden, um die Expression von Proteinkompressen zu testen, aber sie ist leicht skalierbar, um eine gute Ausbeute an Proteinkompressen zu erzielen. Für strukturelle und funktionelle Studien liegt der Schlüssel zum Erfolg darin, die Zellen in einem gesunden Zustand zu halten, frei von Bakterien oder Hefeinfektionen.

Da Antibiotika in den Medien Ihre Proteinausbeute stark reduzieren. Nehmen Sie zunächst ein Kryofläschchen mit einem Milliliter HEC 2 9 3 F-Zellen mit einer Dichte von 20 Millionen Zellen pro Milliliter aus dem flüssigen Stickstoff und tauen Sie es schnell in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf. Brechen Sie alle Klumpen auf, indem Sie einige Male auf und ab pipettieren und pipettieren Sie den gesamten Inhalt in einen konischen 250-Milliliter-Zellkulturkolben mit 34 Millilitern Vorwärmmedium.

Stellen Sie die Kultur nach 48 Stunden in einen befeuchteten orbitalen Schüttelinkubator bei 37 Grad Celsius, 120 U/min und 5 % Kohlendioxid. Überprüfen Sie die Zellviabilität anhand von Trian Blue. Die normale Zellviabilität liegt in diesem Stadium bei etwa 70 %, wenn die Zellen eine Anzahl von etwa 1 Million Zellen pro Milliliter erreicht haben.

Massieren Sie sie bis zu einer Endzahl von 0,35 Millionen Zellen pro Milliliter in einen konischen 250-Milliliter-Zellkulturkolben mit 60 Millilitern vorwärmtem Medium und massieren Sie die Zellen alle 48 Stunden oder wenn sie etwa 2 Millionen Zellen pro Milliliter erreichen. Hier ist eine Probe von Trian-Blau-Färbezellen HEC 2 9 3 F mit 2,3 Millionen Zellen pro Milliliter aus einem Stamm, der für die Aussaat für die Transfektion bereit ist, Zellen sollten nur als Einzel- oder sich teilende Zellen vorliegen. Wenn Zellen überwuchert sind, bilden sie große Klumpen und haben eine sehr geringe Lebensfähigkeit, wie in diesem Bild gezeigt.

Wenn Zellen Cluster bilden, können diese durch kräftiges Vortexen für 25 Sekunden aufgebrochen werden. Zu Beginn der Kulturen im großen Maßstab werden die Zellen mit einer halben Million Zellen pro Milliliter in ein Endvolumen von 300 Millilitern in jeder Ein-Liter-Rollflasche ausgesät. Inkubieren Sie 24 Stunden lang in einem befeuchteten Orbitalschüttler bei 37 Grad Celsius, 135 U/min und 5 % Kohlendioxid, bis die Zellen eine Dichte von 1 Million Zellen pro Milliliter erreichen.

Pipettieren Sie anschließend insgesamt 300 Mikrogramm filtrierte, sterilisierte DNA in 30 Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS und wirbeln Sie drei Sekunden lang kräftig auf. Fügen Sie dann 1,2 Milliliter von 0,5 Milligramm pro Milliliter hinzu. Sterilisiertes PEI in die PB SDNA-Lösung filtrieren und weitere drei Sekunden lang kräftig vortexen.

Inkubieren Sie die Mischung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie die Mischung in die folgenden Zellen geben. Durch die Transfektion werden die Zellen in einem befeuchteten orbitalen Schüttelinkubator für weitere 48 Stunden bei 37 Grad Celsius, 135 U/min und 5 % Kohlendioxid nach 48 Stunden inkubiert. Ernten Sie intrazelluläre Proteine, indem Sie Zellen fünf Minuten lang bei 3000-fachem G zentrifugieren.

Ist das Zellpellet nicht für den sofortigen Gebrauch bestimmt, kann es bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Dieses Protokoll ist optimiert für die Aufreinigung von Proteinkomplexen aus dem Zellkern, bei denen eines der Proteine ein Flag-Tag hat. Um mit der Reinigungsreanimation zu beginnen, suspendieren Sie die Zellpalette in etwa 40 Milliliter vorgekühlte Lyse, puffern Sie pro Liter Kultur, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren und einen Glashomogenisator für drei Zyklen von 15 Sekunden bei 15 Sekunden aus beschallen.

Zentrifugieren Sie dann Ihre 108.000 mal G für 25 Minuten bei vier Grad Celsius und behalten Sie die Rückenlage. Als nächstes äquilibrieren Sie 1,2 Milliliter Anti-Flag-verpacktes Aros-Harz pro Liter Kultur, indem Sie dreimal mit Harzausgleichspuffer waschen, inkubieren Sie das Supinat, das den gesamten Zellextrakt mit dem Affinitätsharz darstellt, in einem oder mehreren 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das sich 30 bis 120 Minuten lang sanft dreht, bei vier Grad Celsius, nach der Inkubationszentrifuge bei 3000 mal G für eine Minute bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie das Supinat verworfen haben, geben Sie das Harz in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und waschen Sie es mit insgesamt 45 Millilitern vorgekühltem Puffer, eine Zentrifugen davor und verwerfen Sie dann das Supinat, wiederholen Sie das Waschen und Zentrifugieren mit einem Puffer mit hohem Salzgehalt, gefolgt von einem Puffer mit niedrigem Salzgehalt und einem TEV-Spaltpuffer.

Stellen Sie sicher, dass jede Wäsche ausreicht, um das Harz vollständig zu resuspendieren, aber nicht länger. Sammeln Sie als Nächstes eine 10-Mikroliter-Probe des Harzes und verdünnen Sie es zu einem Volumen aus zweifachem Proteinladepuffer für die Analyse, um die gebundene Proteinprobe darzustellen. Verwenden Sie keine Reduktionsmittel, da diese den Antikörper aus dem Harz freisetzen.

Dann resuspendieren Sie das Harz in 10 Milliliter vorgekühlten TEV-Spaltpuffer bei etwa 40 Mikrogramm TEV-Protease pro Liter Originalkultur und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen. Der Gehalt an TEV-Protease kann je nach Menge des exprimierten Proteins optimiert werden. Ersetzen Sie die Röhrenatmosphäre durch 100 % Stickstoffgas, um eine Proteinoxidation zu verhindern, bevor Sie am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius sanft rotieren.

Die Probe wird 10 Minuten lang bei 3000 mal G zentrifugiert, dann wird das Supinat in einen Ultrazentrifugalfilter mit einem geeigneten Molekulargewichtsgrenzwert überführt und auf 500 Mikroliter konzentriert. Entnehmen Sie eine 10-Mikroliter-Probe des konzentrierten Proteins und verdünnen Sie es zur Analyse in ein Volumen mit zweifachem Proteinladepuffer. Diese Probe stellt die TEV-Eluatprobe dar.

Entnehmen Sie dann eine 10-Mikroliter-Probe des Harzes und verdünnen Sie es zu einem Volumen von zweifachem Proteinladepuffer. Diese Probe stellt die Post-TEV-Harzprobe dar. Der nächste Schritt besteht darin, das Protein durch eine Größenausschlusssäule laufen zu lassen, und es sollte eine geeignete Gelfiltrationsmatrix entsprechend der Größe des interessierenden Komplexes verwendet werden.

In diesem Fall haben wir eine 10 x 300 Millimeter große S 200 Größenausschlusschromatographiesäule A verwendet, die der Größenausschlusschromatographiesäule mit Gelfiltrationspuffer gleichsetzt. Filtrieren Sie das Protein durch einen 0,22-Mikron-Filter und laden Sie die Probe in die Säule. Fahren Sie mit dem Sammeln der Fraktionen fort, wenn sie aus der Säule kommen.

Als letzten Schritt führen Sie eine SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektropherese oder SDS-Seite auf den gesammelten Proben sowie den Gelfiltrationsfraktionen, dem Histon DS SLA eins oder dem HD-Eins-Suppressor der defekten Stummschaltung drei oder SDS drei und syn drei, einer HDAC-Wechselwirkungsdomäne oder syn drei, einem HID einen stabilen Turny-Komplex durch. Die Affinitätsreinigung des Turny-Komplexes kann auf der SDS-Seite beobachtet werden. Hier ist der gereinigte Komplex zu sehen, der von Cot produziert wird, der zwei Liter Zellen durchtrennt.

Die gebundene Proteinspur zeigt den Komplex, der an das Affinitätsharz gebunden ist. Nach der TEV-Verdauung wird das auf der dritten Sünde A HID vorhandene Tag abgespalten und auf den Komplex angespielt. Bei dem hier gezeigten Harz handelt es sich um ein Chromatogramm des Proteinkomplexes, das mit einer 10 x 300 Millimeter großen S 200 großen Ausschlusschromatographiesäule gereinigt wurde.

Beachten Sie, dass sich der reine Komplex in der Nähe des Hohlraumvolumens entzieht, da er in Lösung ein Dimer bildet. Schließlich zeigt die SDS-Seitenanalyse das gereinigte Protein in den Gelfiltrationsfraktionen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie gezüchtete HEC-Zellen mit zwei und drei App-Zellen züchten, pflegen und cotran sowie wie Sie Ihr Protein affinisieren, reinigen und konzentrieren.

Komplex Gesunde Zellen sind für den Erfolg von Experimenten unerlässlich, also stellen Sie sicher, dass sie gezüchtet werden und regelmäßig unter ihren Bedingungen und in ihrer Passage bleiben. Lassen Sie sich nicht von Gewebekulturen abschrecken. Für Strukturbiologen ist es ein Leichtes, große Mengen an Proteinen und Proteinkomplexen aus Säugetierzellen zu exprimieren und zu reinigen.