Proteinisolierung aus den Entwicklungs embryonalen Mäuseherzklappen Region
23. September 2014
Die Analyse der Proteinexpression in jungen embryonalen Mausklappen wurde durch das begrenzte verfügbare Gewebe erschwert. Dieses Manuskript enthält ein Protokoll zur Präparation von Proteinen aus sich entwickelnden embryonalen Mausklappenregionen für die Western-Blot-Analyse.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Protein aus embryonalen Herzklappen zu isolieren und zu extrahieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Embryo von einer trächtigen Maus isoliert wird. Im zweiten Schritt wird das Herz vom Embryo präpariert, dann werden im letzten Schritt die Herzklappen entnommen.
Das Gewebe wird lysiert und die resultierende Proteinprobe für die anschließende Analyse vorbereitet. Letztendlich kann die westliche BLO-Analyse zur Beurteilung der Proteinexpressionsniveaus verwendet werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Präparierschritte aufgrund der kleinen, kompakten Form des sich entwickelnden Herzens schwer zu erlernen sind.
Verwenden Sie am gewünschten embryonalen Entwicklungstag 70%iges Ethanol, um den Bauch der schwangeren Frau zu sterilisieren. Heben Sie dann die Haut und die Muskeln des Unterbauchs nach oben und weg von den inneren Organen und präparieren Sie die untere Bauchhöhle, um den Zugang zum Gebärmutterhorn zu ermöglichen. Halten Sie dann den Gebärmutterhals mit einer Pinzette fest und schneiden Sie vorsichtig Futter bis zu den Spitzen ab.
Heben Sie dann das Gebärmutterhorn an, durchtrennen Sie das Bindegewebe, das das Horn an Ort und Stelle hält, und schließen Sie die Entfernung ab, indem Sie die Verbindung des Gebärmutterhorns mit der Brustscheide durchtrennen. Legen Sie das präparierte Uterushorn in eine Petrischale mit kaltem 0,1 molaren Tris-Puffer und spülen Sie es nach Bedarf aus. Schneide dann das Gebärmutterhorn ab.
Längs öffnen, um die embryonalen Säcke freizulegen. Um einen Embryo freizulegen, schneiden Sie einen embryonalen Sack an der Verbindungsstelle zwischen Plazenta und Embryo auf und schneiden Sie die Nabelgefäße auf, um den Embryo zu befreien. Legen Sie den präparierten Embryo in eine zweite Petrischale mit kaltem 0,1 molaren Trispuffer und legen Sie die erste Petrischale mit den restlichen und präparierten Embryonen bis zur nächsten embryonalen Dissektion wieder auf Eis.
Nach der Enthauptung legen Sie den Embryo auf den Rücken und schneiden Sie die Brustwand vertikal entlang der Seite des Brustkorbs in der Nähe eines Hinkens und horizontal über dem Zwerchfell. Um das Herz zu visualisieren, öffne die Brustwand. Dann halte die Pinzette hoch oben an den großen Gefäßen, hebe das Herz an und schneide die Gefäße darunter auf.
Schneiden Sie dann oberhalb der Pinzette, um das Herz zu befreien. Wenn die Lungengefäße ungeschnitten bleiben, die Lunge mit dem Herzen entfernt wird, bevor mit den hierin beschriebenen embryonalen Stadien fortgefahren wird, ist die Lungenarterie leicht undurchsichtig. Nachdem Sie die Arterie identifiziert haben, schneiden Sie sie ab und entfernen Sie sie oberhalb der Höhe der Klappe.
Schneiden Sie nun knapp unterhalb der Pulmonalklappe ab, vermeiden Sie das ECD-Ventrikelmyokard und entfernen Sie überschüssigen Tris-Puffer aus der interessierenden Region. Vor dem Einsetzen der Klappe in einen Einorschlauch, der wie die Pulmonalarterie zwei Mikroliter Lysepuffer enthält, erscheint die Aorta leicht undurchsichtig. Schneiden Sie nach der Identifizierung direkt unter der Aortenklappe.
Auch hier ist das trabekulierte ventrikuläre Myokard zu vermeiden. Entfernen Sie überschüssige Tri-Lösung und übertragen Sie dann das Ventil in den Einor-Schlauch, der Lyse-, Puffer- und Lungenarteriengewebe enthält. Nachdem das gesamte Gewebe entnommen wurde, legen Sie die Proben sofort bei minus 80 Grad Celsius bis zur Weiterentwicklung.
Tauen Sie für die Proteinextraktion das gesammelte Gewebe auf Eis auf und pelletieren Sie die Proben dann eine Minute lang bei 13.100 g bei vier Grad Celsius. Überprüfen Sie das Volumen der resultierenden Probe und verwenden Sie einen Lysepuffer, um das Gesamtvolumen auf 40 Mikroliter zu erhöhen. Fügen Sie dann fünf Millimeter große Edelstahlkügelchen hinzu, um die Proben in einem Lyr für zwei bis vier Minuten bei 50 Hertz aufzubrechen und zu homogenisieren, wie es der Hersteller angibt.
Nach der Homogenisierung werden die Röhrchen kurz geschleudert und in neue Röhrchen überführt, wobei die unlöslichen Rückstände für die weitere experimentelle Analyse zurückbleiben. Mit dieser Präparationstechnik kann phosphoryliertes smad 1 5 8 in einzelnen Aortenklappenregionen von E 13.5-Embryonen nachgewiesen werden. Zum Beispiel ist das Protein, das aus einer einzigen Ventilregion isoliert wurde, ausreichend, um eine schwache p smad-Bande zu detektieren, wobei die Signalintensität proportional zur Anzahl der gepoolten Ventilregionen zunimmt.
Wichtig ist, dass das p smad beta Aktin-Verhältnis aufgrund der geringen verfügbaren Proteingehalte über die verschiedenen Probengrößen hinweg deutlich konstant bleibt, so dass derselbe Blot nicht entfernt und auf Gesamt-SMAD untersucht werden kann. Ein separater Blot, der das Gesamt-Smad-One und das Beta-Aktin zeigt, zeigt jedoch das gleiche Expressionsmuster. Diese Klappenregionen sind unter Verwendung dieser Präparationstechnik in Kombination mit Proben aus dem rechten Ventrikel, dem ventrikulären Myokardmarker, fast vollständig frei von kontaminierendem Ventrikelmyokard, ein NP ist in Aortenklappenregionen nicht nachweisbar, während dieser Marker im Ventrikel leicht nachweisbar ist.
Darüber hinaus ist der ventrikuläre Myokardmarker Myosin-Leichtkette zwei V in der ventrikulären Probe ebenfalls leicht nachweisbar, in den Aortenklappenregionen jedoch kaum nachweisbar, was die Genauigkeit der Dissektion nach dieser Dissektion unterstreicht. Andere mes wie QPCR oder RN AIC können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche nachgeschalteten Gene während der verschiedenen Entwicklungsschritte beeinflusst werden.
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Überblick
Dieser Artikel präsentiert ein Protokoll zur Isolierung und Extraktion von Protein aus embryonalen Herzklappen bei Mäusen. Die Methode adressiert Herausforderungen bei der Analyse der Proteinexpression aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von Gewebe.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Entwicklungsbiologie
- Kardiovaskuläre Forschung
Hintergrund
- Die Analyse der Proteinexpression in embryonalen Geweben ist oft durch die Probengröße begrenzt.
- Das Verständnis der Proteinspiegel in Herzklappen ist entscheidend für Entwicklungsstudien.
- Western Blot Analyse ist eine gängige Technik zur Beurteilung der Proteinexpression.
- Die Dissektion kleiner Gewebe wie embryonaler Herzen kann technisch herausfordernd sein.
Zweck der Studie
- Ein detailliertes Protokoll für die Proteinextraktion aus embryonalen Maus-Herzklappen bereitzustellen.
- Die Western Blot Analyse zur Untersuchung von Proteinexpressionsniveaus zu erleichtern.
- Die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit bei der Proteinanalyse aus begrenzten Proben zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Isolierung von Embryonen aus trächtigen Mäusen.
- Dissektion des Herzens aus dem Embryo.
- Sammlung von Herzklappen für die Proteinextraktion.
- Lyse des Gewebes zur Vorbereitung der Proteinproben für die Analyse.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Extraktion von Protein aus embryonalen Herzklappen.
- Vorbereitung von Proben, die für Western Blot Analyse geeignet sind.
- Demonstration von Dissektionstechniken für effektives Lernen.
- Bewertung der Proteinexpressionsniveaus in sich entwickelnden Herzgeweben.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll ermöglicht eine effektive Untersuchung der Proteinexpression in embryonalen Herzklappen.
- Visuelle Hilfsmittel sind für das Beherrschen der Dissektionstechniken unerlässlich.
- Diese Methode kann die Forschung in der Herzentwicklung und verwandten Bereichen vorantreiben.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Protein isolation from limited embryonic tissue enables detection of signaling pathway activation in early developmental models. This approach supports target validation by providing semi-quantitative data on phosphorylated proteins from pooled microdissected valve regions. The method addresses a key bottleneck in preclinical research where sample scarcity hinders mechanistic de-risking of cardiovascular targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in cardiac valve development through detection of phosphorylated signaling proteins like pSmad1/5/8.
- Operational Value: Provides a reproducible workflow for protein extraction from four E13.5 mouse aortic valve regions, each yielding ~1 µg protein.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing semi-quantitative assessment of pathway activation in disease-relevant embryonic systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological samples for downstream western blot analysis, enabling reliable compound evaluation in phenotypic screening.
- Operational Value: Standardizes lysis and homogenization protocols using Tris-based buffer with protease inhibitors and SDS-sample buffer for denaturation.
- Scalability: Enables platform reuse across developmental timepoints by pooling tissue to overcome low protein yield limitations.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase protein expression data to preclinical validation through consistent pSmad/β-actin ratios across sample sizes.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target engagement by confirming ventricular myocardium exclusion via absence of MYL2V and ANP markers in valve regions.
- Predictive Confidence: Enables risk-adjusted advancement decisions by linking protein expression patterns to developmental stages using internal controls.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing mechanistic readouts from disease-relevant embryonic systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through detection of phosphorylated signaling proteins in valve tissue.
- Screening: Delivers assay-ready samples with standardized protein extraction, enabling reproducible western blot outputs for compound screening.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements via chemiluminescent signal intensity proportional to protein pool size, supporting comparative condition analysis.
- Translational Research: Maintains continuity from embryonic discovery to preclinical models by preserving pathway-specific expression patterns detectable in separate blots for total Smad and β-actin.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable capability for protein isolation across embryonic cardiovascular studies, reducing redundant protocol development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by enabling detection of low-abundance phosphorylated proteins from microdissected tissues.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined lysis volumes, bead-based homogenization, and consistent sample preparation for western blot.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in early cardiovascular target assessment.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by providing semi-quantitative pathway activation data from embryonic valve regions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection of embryonic cardiac structures to isolate valve regions without ventricular myocardium contamination.
- Dependent on instrumentation for homogenization (lyser with stainless steel beads) and centrifugation at 13,100 × g for sample clarification.
- Necessitates cross-team standardization of lysis buffer volumes (40 µL final volume) and protease inhibitor use to ensure sample consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to other embryonic tissues or developmental stages beyond E13.5 aortic valve regions.
- Includes practical limitations such as inability to quantify total protein via spectrophotometry due to low yield, requiring reliance on semi-quantitative western blot analysis.
