Name: Ein Verfahren zur Mikroinjektion von Patiria Minata Zygotes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Erfahren Sie die Mikroinjektion von Patiria miniata Zygoten zur Entwicklungsbiologie. Diese Methode ermöglicht die Einführung von Reagenzien wie GFP-Reporter zur Analyse von Genregulationsnetzwerken in Seesternembryonen.

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Bewahren Sie alle Meerwasser oder künstlichem Meerwasser (SW), erwachsenen Tieren und Kulturen bei 15 ° C, so viel wie praktisch. Stellen Sie sicher, Eier und Zygoten sind in SW eingetaucht gehalten. Kommerziell hergestellte Meersalz mit destilliertem oder Umkehrosmose Wasser wiederhergestellt dient auch als Quelle der SW. Überprüfen Sie den Salzgehalt mit einem Hydrometer und stellen Salze oder Wasser, um ein optimales Niveau zu erreichen. Halten spezifische Gewicht Niveaus zwischen 1,020 bis 1,025. Bewahren Sie alle Glas-und Kunststoffprodukte getrennt von dem übrigen Laborgeräte, um eine Kontamination mit Chemikalien zu vermeiden. Embryo Grade Laborgeräte sauber durch Spülen mit VE-Wasser oder gelegentliche Einweichen in verdünnter Natriumhypochlorit gefolgt von Spülen mehrmals in Wasser. 1. Gewinnung und Reifung Gameten aus Patiria miniata Erwachsene <ol><li> Wählen Sie ein Tier Gonaden herauszuschneiden. Bestimmen Sex nach der Exzision durch die Suche nach der Gegenwart der Eierstöcke oder Hoden, weil P. miniata sind nicht an sichxually dimorphic. </li><li> Schneiden eine kleine Öffnung, die nicht größer als 1 cm, entlang der Seite von einem Seestern Arm mit einer Skalpellklinge (1A). Mit Hilfe von kleinen stumpfen Enden Zange das Zurückziehen der Schnittkanten der Gonaden Gewebe für den Zugriff auf und ziehen Gonaden Gewebe durch den Einschnitt. HINWEIS: Vermeiden Sie es, aus Darmgewebe, die eine lose grau oder braun Gewebe (Abbildung 1B) ist. Eierstöcke sind in der Regel orange, gelb oder hellbraun (1C), während die Hoden sind weiß oder beige und wenn gestört wird dazu führen, Meerwasser milchig oder trüb, im Aussehen (Abbildung 1D) zu werden. </li><li> Zurück zu den Frauen Aquarien. Isolieren Männchen um ein oder zwei Stunden in einen Behälter mit SW seit dem Stress aus Laich Handhabung kann zu induzieren. Tiere heilen entlang der Einschnittstelle und weiter zu Gameten für mehrere Monate zur Verfügung stellen. </li><li> Sammeln Hoden in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit so wenig wie möglich und SW Lagerung auf Eis bis zum Gebrauch. Bewahren Sie die Hoden nicht wired am Tag der Entnahme bei 4 ° C für bis zu einer Woche. </li><li> Sammeln Eierstöcke in einem kleinen Glas Kulturschale in einem mehrere Milliliter SW. Um die Eizellen aus dem Eierstock Gewebe freizugeben, necken neben das Gewebe mit zwei Pinzetten, bis keine großen Stücke bleiben. HINWEIS: Optimal ist die Mehrheit der Oozyten voll entwickelt. Solche Eizellen sind groß, rund und klar, gelb oder hellbraun mit einem deutlichen Keimbläschen in der Eizelle (2A), im Vergleich zu der Untergruppe der nicht entwickelten Eizellen, die kleiner, braun, körnig und opak (2B) sind. Wenn mehr als rund 25% der Eizellen sind von unentwickelten Vielfalt, wählen Sie eine andere weibliche Eizellen zu erhalten. </li><li> Gießen Sie die Eizellen und verbleibende Gewebe durch ein Sieb mit einer Filtertasse 200 um Porengröße und sammeln durch fließen. Dadurch werden alle Sorten von Eizellen enthalten, aber Eierstockgewebe zu entfernen. Verdrängen verbleibenden Oozyten aus dem Gewebe durch das Filter gefangen durch Sprühen wit SW aus einer Spritzflasche. Filtertassen werden mit einem 50 ml konischen Röhrchen (3A-A &#39;) hergestellt. </li><li> Gießen Sie die Strömung durch aus Schritt 1.6 durch ein 100 um Maschenfiltertasse. Verwerfen kleinen Eizellen bei der Durchströmung. Große voll entwickelten Eizellen, die bereit für die Reifung wird auf dem Filter zu bleiben. Spülen Sie die Oozyten in einen sauberen 200-ml-Becher. </li><li> Fügen Sie 95 ml SW auf den 200 ml-Becherglas von Eizellen. 5 ml von 200 uM 1-Methyladenin zu einer Endkonzentration von 10 uM. </li><li> Übertragen Sie die Eizellen zu einem großen flachen Kulturschale und Ort bei 15 ° C. Eine hohe Oberfläche zu Volumen Kulturschale ermöglicht den Sauerstoffaustausch. Die Eizellen reifen nicht oder nicht gut entwickeln, wenn sie in dieser Reifephase überfüllt sind. Aufgeteilt in mehrere Gerichte der SW plus 10 uM 1-methlyadenine bis Kultur ist weniger als 200 Eizellen / ml. </li><li> Lassen Sie die Oozyten für 45-90 min reifen, aber nicht mehr, da dies die Eizellen nicht in der Lage zu sein, machen fertilized. Um festzustellen, ob die Reifung abgeschlossen ist, bei der Eizellen schauen unter einem Binokular. Die Keimbläschen bewegt sich auf und verschmilzt mit der Zellmembran während der Reifung. Es bricht dann nach unten und ist nicht mehr in reifen Oozyten (Abbildung 2C) sichtbar daher. </li></ol> 2. Die Befruchtung der Eizellen Ältere <ol><li> Wählte eine kleine Gruppe von Hodengewebe, etwa erbsengroße und Hackfleisch in einem kleinen Glas Kulturschale mit etwa 1 ml SW. </li><li> Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette auf 2-3 Tropfen der resultierende milchige Meerwasser auf etwa 100 ml der reifen Eizellen übertragen und wirbeln die Kulturschale zu mischen. Vermeiden Sie die Übertragung Stücke von Hodengewebe. Vermeiden Sie es größere Mengen an Spermien, da dies zu Polyspermie und anschließende schlechten Entwicklung führen. </li><li> Nach einigen Minuten beobachten die Eizellen unter einem Binokular. Befruchtete Eier oder Zygoten, eine Befruchtung Umschlag, der eine klare Blase, die aus dem cel erhebt, istl Membran (2D). HINWEIS: Nicht mit der Kultur vor, wenn weniger als etwa 90% der Eier zu befruchten, da schlechte Befruchtungsraten sind ein Hinweis auf eine ungesunde Kultur, die auch nicht gut entwickeln kann. </li><li> Nach der vollständigen Befruchtung ist, ändern Sie die SW auf den Zygoten von Gießen durch einen 100 um Sieb-Filter und Spülen in eine Kulturschale mit frischem SW. Es ist wichtig, die überschüssige Spermien Sauerstoffmangel zu verhindern entfernen. Legen Sie die Kulturschale bei 15 ° C für 15-30 min. </li></ol> 3. De-Geliermittel und Rudern befruchteten Eier <ol><li> Vorbereitung Injektion Gerichte, indem Sie den Deckel von einem 60 x 15 mm Petrischale aus Polystyrol. <ol><li> Zeichnen Sie einen Permanent-Marker Stiftlinie auf der Rückseite der Schale, um den Bereich, den Bereich der Blick auf die Mikroinjektion Mikroskop passt. Dies stellt sicher, dass alle gerudert Embryonen im Mikroskop Feld. </li><li> Verwenden Sie ein Glas Pasteur-Pipette, um eine Linie durch den Kreis, S. punktenreferably zu einer Seite des Kreises (3B). Verwenden Sie diese Linie später Injektionsnadeln (Schritt 4.5) zu brechen. HINWEIS: Reagenzien häufig verwendet, um Seeigel-Embryonen, zB Protaminsulfat oder Poly-L Lysin, sind unnötig halten. De-Sülze P. miniata Zygoten haften sehr gut auf unbeschichteten Kunststoff. Beachten Sie, dass sie nicht gut zu Glasschalen bleiben. </li></ol></li><li> Fügen etwa 10 ml SW zu jeder Schale, so daß die Oberfläche bedeckt, aber das Wasser wird nicht zu spritzen in die Schale, da dies reihig Embryonen stören. </li><li> Entfernen Sie die P. miniata Zygote Gallerthülle mit Säure SW vor Rudern. Diese Gallerthülle ist umfangreicher als die für Modell Seeigel-Arten beobachtet. <ol><li> Bereiten Säure SW im Bereich von pH 4,0 bis 4,2. Der pH-Wert ist entscheidend für die effiziente Entfernung von Gallerthülle, gestattet jedoch eine normale Entwicklung. </li><li> Fügen Sie einzelne Tropfen von 1 N (1 M) HCl in SW zu einem 1 L Lager von SW. Lassen Sie jeder Tropfen vollständig mischenund zu überwachen, bevor Sie mehr pH-HCl. HINWEIS: Ein bis mehr ml HCl ergibt die entsprechenden pH-Wert, aber nicht das gesamte Volumen auf einmal hinzuzufügen. HINWEIS: Bereiten 1 N HCl in Abzug mit SW-und 12 N (12 M) HCl. </li><li> Entfernen SW auf Zygoten durch Gießen Sie sie auf einen 100 um Sieb-Filter. Spülen Sie in einen 200-ml-Becher in die kleinste Menge von SW möglich (ca. 10 ml). Das Becherglas wird bis zu 150 ml mit Säure SW (pH 4,0) und damit die Zygoten in die Säure SW 3 min stehen. </li></ol></li><li> Streifen Gallerthülle von den Zygoten von ihnen Gießen hin und her zwischen zwei 200 ml-Becher, jedes Mal vorbei an den Zygoten durch ein 200 um Sieb-Filter. Gießen Sie die Zygoten durch den Filter um 5-10x über ca. 2 min Zeitfenster. </li><li> Säure zu entfernen, indem die SW Zygoten auf einen 100 um Sieb-Filter. Spülen Sie die Zygoten in eine kleine Glasschale mit Kultur SW. De-Sülze Zygoten können Kunststoffschalen bleiben. Reihe Embryonen sofort; sie beginnen, mehr zu produzieren jElly Mantel, die schlechte Haftung der Zeit führt zu Kunststoffschalen. </li><li> Verwenden Sie einen Mund Pipette (3C-C &#39;) von der Kulturschale Glas abholen Zygoten und legen Sie sie in geraden Linien auf den Einspritz Gerichte. Schmelzen Sie die Mitte der dünnen Seite einer Pasteur-Pipette über einer Flamme, bis das Glas weich ist. Schnell ziehen Sie die Enden der Glas auseinander, um eine sehr dünne Strecke von Glas zu produzieren. Sobald das Glas abgekühlt ist, brechen Sie das kleine Ende des Pasteur-Pipette (für weitere Informationen auf die Vorbereitung ein Mund Pipette sehen Wessel et al., 2004 17 oder Süß et al., 2004 18). <ol><li> Machen Sie ein Ruder Pipette so dass der Durchmesser ist nur größer als der Durchmesser der Embryonen, so dass nur eine einzige Zygote wird betreten und verlassen die Pipette zu einer Zeit. Dies ermöglicht eine einzige Reihe zu bilden. Kleineren Durchmesser Pipetten können die Befruchtung Hülle abstreifen und stören die Zygoten als P. miniata Zygoten nicht über eine hyaline Membran einnd sind recht weich. </li><li> Wenn die Zygoten nicht auf die Kunststoffschale kleben, halten sie nicht für zusätzliche Zeit in Säure SW (bis zu mehreren Minuten). Alternativ kann ein kleiner Durchmesser Pipette kann bei der Beseitigung von Gallerthülle, damit die Zygoten, um effektiver halten zu helfen. </li><li> Die Zygoten sind leicht positiven Auftrieb und neigen dazu, zu schwimmen oder schweben knapp über dem Boden der Schale. In diesem Fall, positionieren Sie den Ruder Pipette, so dass die Zygoten werden sanft auf die Oberfläche der Schale wie sie aus der Pipette (3D) gedrückt. HINWEIS:. Es ist zulässig, viele Zeilen auf diesen Gerichten passen P. miniata embryonalen Membranen werden erst schwieriger, im Laufe der Zeit durchdringen und daher kann man Hunderte von Zygoten auf einem einzigen Gericht zu injizieren. </li></ol></li></ol> 4. Die Injektion von Zygotes <ol><li> Bereiten Injektionslösungen mit geeigneten Konzentrationen von Morpholino Antisense-Oligonukleotide (MASO), mRNA oder DNA in einer Endkonzentrationentration von 200 mM KCl. 400-800 uM MASO und 2,5 ng / ul DNA neigen dazu, morphanten Phänotypen bei gleichzeitiger Verringerung Toxizität. Die Endkonzentration in dem Ei 1/125 ten Ausgangskonzentration 14 sein. Injektionslösungen, die masos, Hitze auf 65 ° C für 5 min unmittelbar vor der Verwendung und bei Raumtemperatur lagern. <ol><li> Zur Vereinfachung der Sortier injizierten Embryonen, fügen Rhodamin Dextran Tracer zu der Injektionslösung in einer Konzentration von 0,1% zu erhalten. </li></ol></li><li> Bereiten Injektionsnadeln durch Ziehen Glaskapillarröhren (1,0 mm AD x 0,75 mm ID, 100 mm Länge) in einer Nadel ziehen Instrument folgenden Anweisungen des Herstellers. Geeignet für Injektionsnadeln in Seeigel auch gut für Seesterne, so verwenden ähnliche Parameter 19. </li><li> Legen Sie etwa 2 ul Injektionslösung in einer Injektionsnadel mit einem Microloader Pipettenspitze. </li><li> Legen Sie die stumpfe Ende der Nadel in den manipulator. Stellen Picospritzer zu 100 ms Puls und einen Luftdruck von 40 PSI. </li><li> Legen Sie ein Gericht aus Embryonen ruderte auf den Mikroskoptisch und haben alle Embryonen in Feld. Orientierung der Schale, so dass die Ritzlinie auf der Seite am nächsten zu der Nadel. Positionieren Sie die Nadel in einem ca. 60 ° Winkel, so ist die Spitze in der Nähe der Mitte der Linie und knapp über der Oberfläche des Wassers. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf der eingekerbten Linie und Senken der Nadel, bis die Spitze in den Fokus kommt. Senken Sie die Spitze ein wenig mehr und brechen sie, indem Sie sie sanft in die Rippen der Ritzlinie geöffnet. Heben Sie die Spitze von der Oberfläche der Schale und wird es an der Spitze der ersten Reihe der Zygoten und konzentrieren sich auf die Zygoten. </li><li> Senken Sie die Spitze, so dass es das Zentrum der Zygote kam und in um einen Winkel von 60 ° aufspießen. Die Nadel dringt leicht P. miniata Zygoten. Schritt auf das Fußpedal (oder andere Mittel aus der Injektionsnadel zu zwingen Material), einen Bolus von inje einführenction Lösung in den Embryo. </li><li> Ziel für einen Bolus, die 20-30% ist der Durchmesser des Embryos oder zwischen 25 und 80 pl. Wenn der Bolus größer oder kleiner ist als diese, Einstellen der Einspritzzeit auf der Picospritzer und injizieren das nächste Embryo. Weiter, um die Dauer einzustellen, um die gewünschte Bolus Größe zu erhalten. Beginnen bei 100 ms Dauer. Re-Break die Nadel, wenn mehr als etwa 200 ms benötigt wird, um die entsprechende Bolus einzuführen. Entsorgen Sie die Nadel und bereiten eine neue, wenn weniger als 15-20 ms benötigt wird, um diese Größe zu erhalten Bolus, wenn die Nadel ist zu groß und kann die normale Entwicklung stören. </li><li> Gehen Sie, um die restlichen Zygoten an der Einspritz Gericht zu injizieren. Embryonen kann leicht bis Spaltung beginnt und in einzelne Blastomeren nach der ersten Spaltung injiziert werden. Regelmäßig heben Sie die Nadel über der Oberfläche des Wassers zu Zygoten, die auf die Nadel stecken zu entfernen. Falls erforderlich, erneut brechen die Spitze der Nadel oder laden Sie eine neue Nadel, wenn eine Blockade auftritt. </li></ol><ol><li> Lassen Sie die Embryonen bei 15 ° C in SW zu entwickeln. Aufrechterhaltung einer hohen Oberfläche zu Volumen in den Kulturen um den Sauerstoffaustausch ermöglichen. Stellen Sie sicher, Embryonen sind nicht überfüllt; Kulturen halten bei oder unter 200 Embryonen / ml. Je nach dem gewünschten Stadium der Embryo, planen injizierten Embryonen bei etwa 20-24 Stunden nach der Befruchtung zu sammeln. HINWEIS: Dies ist oft eine ideale Zeit, zu sortieren und zu sammeln, und weil in der Regel entwickelnden Embryonen leicht morphologisch unterscheiden, sind aber noch nicht schwimmen. </li><li> Wenn Embryonen geschlüpft, vorsichtig salzen Schock für Schwimmen verhindern. Geben Sie 200 ul 5 M NaCl auf 10 ml SW in der Einspritz Gericht unter leichtem Schwenken der SW. Nach ein paar Minuten werden die Embryonen auf den Boden der Schale fallen. Sammeln diese und verschieben Sie sie in den normalen Salzgehalt SW. </li><li> Sammeln injizierten Embryonen unter einem geeigneten Fluoreszenzlichtquelle mit dem Tracer im INJEKTIERT kompatibelon-Lösung. Wenn kein Tracer verwendet wurde, sortieren Embryonen für normale Morphologie zu wählen. </li><li> Mit dem Mund ansaugen, ziehen fluoreszierende Embryonen mit einer minimalen Menge von SW und blasen sie in eine kleine Kulturschale mit SW gefüllt. Ideal Mund Pipetten haben eine ausreichend große Öffnung für Embryonen und herausgezogen werden, ohne diese zu beschädigen, aber nicht so groß, dass unerwünschte Fremd Embryonen und SW sind ebenfalls nach oben gezogen wird. </li><li> Sobald alle gewünschten Embryonen wurden in die neue Schale gesammelt, beobachten die Embryonen unter Fluoreszenzlicht und entfernen Sie alle un-injizierten Embryonen oder schlecht entwickelte Embryonen. </li><li> Kultur sortiert Embryonen, um die gewünschten Stufen in einem Inkubator und fahren Sie mit Bildgebung oder anderen gewünschten Protokolle. </li></ol>

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt von den Autoren.

Es gibt zwei wichtige Schritte, die schwierig für unerfahrene Anwender dieser Technik sind aber unerlässlich für die erfolgreiche Schaffung morphanten Embryonen. Die erste ist die Auswahl gesunder Eizellen, die reifen und richtig düngen wird. Der Prozentsatz der normalen Entwicklung in einer Kultur hängt von der Jahreszeit, der Gesundheit des Tieres, und die Anzahl der Male, die Oozyten wurden aus einem einzigen Individuum geerntet. Eizellen sind in der Regel von besserer Qualität von April bis Oktober. Es ist wichtig, ...

Das Sea Star, Patiria miniata, (allgemein als die Fledermaus Stern) ist als eine interessante und vielseitige Modellsystem Schwellen für eine Vielzahl von Mobil 1-3, Entwicklungs 4,5, Evolutions 6 bis 8 und 9 bis 11 ökologische Studien. Erwachsene P. miniata entlang der Pazifikküste von Sitka, Alaska nach Baja, Kalifornien 12 verteilt sind und leicht in Meerwasseraquarien gehalten. Eizellen sind erhältlich jährig und jedes Weibchen kann Zehntausende von Eiern zu vergießen. Eizellen sind leicht gereift und außen 13 befruchtet. Die daraus resultierenden Embryonen sind durchsichtig erlaubt eine einfache Beobachtung; entwickeln sie synchron und erfordern nur Meerwasser für die Entwicklung. Gesamte Genom Montage und mehrere Transkriptomen sind auch für P. verfügbar miniata ( <a href="http://www.echinobase.org/Echinobase/">Echinobase.org</a> ). Solche Vorteile machen sie ideal für eine Reihe von Forschungsund Lehrzwecke. In den letzten Jahren P. miniata hat sich zu einem Modellsystem für die Entwicklungs genregulatorischen Netzwerkanalysen 14-16. Ziel solcher Untersuchungen ist die gesamte Komplement regulatorischen Gene zu identifizieren und zu bestimmen, die das Netz ihre Wechselwirkungen. Ein großer Teil dieser Arbeit bringt störenden Genexpression durch Einführung von Antisense-Oligonukleotide oder in vitro synthetisierten mRNA. Zusätzlich sind cis-regulatorischen Analysen verwendet werden, um die Funktion von regulatorischen DNA 15 charakterisieren. Diese Analysen erfordern Einführung Störungs Reagenzien und / oder DNA-Reporterkonstrukte in Embryonen. Ferner sind die nachgeschalteten Effekte dieser Störungen zu charakterisieren, muß man viele Embryonen zu Veränderungen in der Genexpression potentieller Ziele zu untersuchen. Verfahren zur Mikroinjektion von vielen Hunderten von Zygoten sind von zentraler Bedeutung für diese Arbeit. Stachelhäuter, darunter P. miniata </em&gt;, erfordern viele Monate bis zur Geschlechtsreife zu erreichen. Aus diesem Grund ist es im allgemeinen nicht praktisch, zu entwickeln und aufrechtzuerhalten transgenen Linien dieser Tiere für Experimente. Daher kann die Zucht von transgenen Erwachsene nicht effizient geändert Embryonen erstellen. Stattdessen müssen Störung auftreten, de novo durch Mikroinjektion. Mikroinjektion bietet die Möglichkeit, Embryonen mit Reagenzien, die nicht zellgängig sind zu ändern. Das folgende Protokoll beschreibt ein Verfahren, um DNA, mRNA, Zell Tracer und Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden in Hunderten von befruchteten Eiern in einer 2-3 h durch Mikroinjektion sitzt einzuführen. Dies erzeugt genügend Material für eine Vielzahl von stromabwärts Experimente, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, qPCR beschränkt, in-situ-Hybridisierung, RNA-Seq und Western Blotting.

<table><tbody><tr><td>1-Methyladenin</td><td>Acros Organics (Fisher Scientific)</td><td>AC20131-1000</td><td></td></tr><tr><td>190 Mikron Nitex Nylon Filter</td><td>Kleinteile (ursprünglich Sefar)</td><td>CMN-0185-C/5PK-05</td><td></td></tr><tr><td>100 Mikron Nitex Nylon Filter</td><td>Kleinteile (ursprünglich Sefar)</td><td>CMN-0105-C/5PK-05</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen aus Polystyrol, 60 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Kapillarschlauch</td><td>FHC, Inc</td><td>30-30-0</td><td>Zum Ziehen von Mikroinjektionsnadeln</td></tr><tr><td>Modell P-97 Nadelabzieher</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Rhodamin Green</td><td>Life Technologies</td><td>D7163</td><td>Bei der Injektion eines GFP-Expressionsreporters ist es hilfreich, Texas Red Dextran als Injektionstracer zu ersetzen</td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>CD-116528</td><td>Auch in vielen Zoohandlungen erhältlich</td></tr><tr><td>Microloader Spitzen</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr></tbody></table>

ein verfahren zur mikroinjektion von patiria minata zygotes

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Stachelhäuter haben lange für die Untersuchung von Gen-Regulation und Evolution von Entwicklungsprozessen ein beliebtes Modellsystem für die Untersuchung der Fortpflanzung und Entwicklung, und in jüngerer Zeit. Das Sea Star, Patiria miniata, gewinnt Prävalenz als Modellsystem für diese Art von Studien, die bisher fast ausschließlich in den Seeigel, Strongylocentrotus purpuratus und Lytechinus variegatus durchgeführt wurden. Ein Vorteil dieser Modellsysteme ist die Leichtigkeit der Herstellung von modifizierten Embryonen, bei denen ein bestimmtes Gen ist nach oben oder unten reguliert, Markierung einer Gruppe von Zellen, oder Einführen eines Reportergens. Eine einzelne Mikroinjektionsverfahren ist in der Lage eine Vielzahl von solchen modifizierten Embryonen. Hier stellen wir ein Verfahren zur Gewinnung von Gameten aus P. miniata, Herstellung Zygoten, und die Einführung von störenden Reagenzien über die Mikroinjektion. Gesunde morphanten Embryonen werden anschließend für die quantitative und qualitative Studien von GE isoliertne Funktion. Die Verfügbarkeit von Genom und Transkriptom Daten für diesen Organismus die Arten von Untersuchungen, die durchgeführt werden und die Leichtigkeit der Ausführung von ihnen erhöht.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, Reagenzien in Embryonen vor. Wir zeigen die Wirksamkeit des Protokolls durch die Injektion eines DNA-Reporterkonstrukt, das die Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) antreibt. Injizierten Embryonen exprimieren GFP in klonalen Patches (4A-B), da die DNA enthält im frühen Spaltung. Viele Reagenzien, die wünschenswert, in Embryonen einzuführen sind, sind in hohen Mengen und zu suboptimalen Chargen von Embryonen toxisch. Toxizität manifestiert durch Verzögeru...

Methoden, die morphanten Embryonen sind unerlässlich, um Entwicklungsmechanismen und Gen-regulatorische Netzwerke zu studieren. Das Sea Star Patiria miniata ist ein aufstrebendes Modellsystem für diese Studien. Hier präsentieren wir ein Protokoll für den Erhalt von Gameten erzeugende Kulturen von Embryonen und schnelle Mikroinjektion von Zygoten von dieser Spezies.

Ein Verfahren zur Mikroinjektion von Patiria Minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Pitter-Miata-Embryonen mit störenden Reagenzien zu modifizieren, indem sie per Mikroinjektion eingeführt werden. Dies wird erreicht, indem zunächst Gameten von erwachsenen Tieren gesammelt und gereift werden. Der zweite Schritt des Eingriffs ist die Befruchtung der reifen Eizellen.Der dritte Schritt besteht darin, die Zygoten zu entdrehen und in Reihen auf eine Injektionsschale zu legen. Der letzte Schritt besteht darin, die Zygoten mit den gewünschten störenden Reagenzien zu injizieren. Letztendlich eingeführte Fremdreagenzien wie GFP Reporter können durch Fluoreszenzbildgebung der injizierten Embryonen betrachtet werden. Eine visuelle Demonstration dieser Technik ist sehr wichtig, da es schwierig ist, zu lernen, wie man Mikroinjektionen durchführt und insbesondere wie man die Nadel in einem dreidimensionalen Raum ausrichtet und wie man die richtige Bolusgröße in die Eizelle einführt.Diese Technik wird heute von einer Doktorandin aus meinem Labor, Elise tla, demonstriert. Beginnen Sie mit einer Sammlung von Tieren. Die Geschlechtsbestimmung erfolgt durch Exzision von Gameten.Wie P Miata sind Seesterne nicht sexuell dimorph. Um die Gonaden zu entfernen, schneiden Sie mit einer Klinge eine kleine Öffnung von nicht mehr als einem Zentimeter Größe an der Seite eines Arms. Eine Zange mit stumpfem Ende kann verwendet werden, um Kanten zurückzuziehen.Vermeiden Sie es, das lose, graue, braune Darmgewebe zu entfernen. Die Eierstöcke sind orange bis hell. Braun. Sammle sie in einer kleinen Glasschale mit ein paar Millilitern Wasser.Wenn Sie dieses Weichgewebe auseinander ziehen, werden die Zyten darin freigesetzt. Überprüfen Sie die Qualität der Zyten, um festzustellen, ob sie richtig reifen. Filtern Sie dann die Eizellen Um Eierstockgewebe und kleine unreife Eizellen zu entfernen, fügen Sie fünf Milliliter von 200 Mikromolaren hinzu, einen Methyllain zu 100 Millilitern Eizellen in Meerwasser und lassen Sie die Eizellen 45 bis 90 Minuten lang bei 15 Grad Celsius in der Lösung reifen.Die südafrikanische Qualität ist entscheidend für die Bestimmung, ob eine Kultur reift, befruchtet und sich richtig entwickelt. Verwenden Sie Eier nur dort, wo die meisten von ihnen groß, braun, klar und gelb oder hellbraun und gefärbt sind. Entsorgen Sie Chargen von Embryonen, von denen die meisten klein sind.Braune oder grünliche Hoden sind weiß oder beige und trüben das Wasser, wenn sie gestört werden. Sammeln Sie die Hoden in einem 1,5 Milliliter Röhrchen mit so wenig Meerwasser wie möglich und lagern Sie sie auf Eis. Beginnen Sie damit, ein erbsengroßes Bündel Hodengewebe in einem Milliliter Meerwasser zu zerkleinern.Geben Sie zwei bis drei Tropfen des entstandenen milchigen Meerwassers auf 100 Milliliter reife Eizellen in einer Kulturschale. Dieses Verhältnis soll Polyspermien verhindern. Übertragen Sie keines der Taschentuchstücke.Schwenken Sie die Mischung zu GAMTs. Nach einigen Minuten überprüfen Sie die GAMTs unter einem Präpariermikroskop auf befruchtete Eizellen. Habe eine Befruchtungshülle, die wie eine klare Blase um das Ei herum aussieht.Sobald die Befruchtung bestätigt ist, wechseln Sie das Wasser, indem Sie zuerst die Zygoten in einem 100-Mikron-Filterbecher sammeln und sie dann vom Filter in eine saubere Schüssel mit frischem Meerwasser waschen. Übertragen Sie nun die Zygoten für 15 bis 30 Minuten auf 15 Grad Celsius. Zur Vorbereitung säuern Sie das Meerwasser auf einen pH-Wert von etwa vier an, indem Sie eine normale Salzsäure tropfenweise hinzufügen.Überwachen Sie den pH-Wert und mischen Sie jeden Tropfen vollständig ein, bevor Sie ihn hinzufügen. Der nächste. Ebenfalls benötigt wird eine Mundpipette mit der Öffnung.Nur etwas größer als der Durchmesser einer Zygote mit einer Delle von 45 Grad. Fahren Sie nun mit dem Entmarmeladen der Zygoten fort, damit sie gut an der Plastikschale haften. Der Geleecode ist umfangreicher als der eines Seeigels, kann aber mit saurem Meerwasser entfernt werden.Zuerst filtern Sie die Zygoten mit einem 100-Mikron-Netz aus ihrem Wasser. Füllen Sie sie dann in ein 200-Milliliter-Becherglas mit minimalem Meerwasser um. Geben Sie dann 150 Milliliter des angesäuerten Meerwassers in den Becher und lassen Sie sie drei Minuten ruhen.In der vierten und fünften Minute entfernen Sie die Geleeschicht, indem Sie die Zygoten durch ein 200-Mikron-Netz mit dem angesäuerten Meerwasser gießen. Tun Sie dies fünf- bis zehnmal. Nachdem fünf Minuten vergangen sind.Sammeln Sie die Tat-Zygoten auf einem 100-Mikron-Netz. Spülen Sie sie dann in eine kleine Glasschale mit normalem Meerwasser. Sobald sie in der Schüssel sind, reiten Sie sofort die Zygoten, bevor sie mehr Gelee produzieren.Verwenden Sie die Aspiration aus einer Mundpipette, um die Zygoten zu behandeln. Schieben Sie sie aus der Glasschale auf eine vorbereitete Kunststoff-Injektionsplatte. Die Zygoten sind leicht schwimmfähig.Positionieren Sie die Pipetten so, dass die Zygoten beim Ausstoßen sanft auf die Oberfläche gedrückt werden. Ein abgewinkeltes Ende hilft dabei. Wenn die Zygoten nicht an der Plastikschale haften, geben Sie sie für ein paar Minuten zurück in saures Meerwasser und versuchen Sie es erneut.Gelöste Zygoten können nicht in so viele Zygoten injiziert werden, wie gewünscht. Ihre Durchdringbarkeit ändert sich im Laufe der Zeit nicht. Bereiten Sie alle Injektionslösungen, unabhängig von der Zusammensetzung, auf 200 Millimolar Kaliumchlorid vor.Morpho-Oligonukleotid sollte bei 400 bis 800 Mikromolar und DNA bei etwa 2,5 Nanogramm pro Mikroliter Heti-Injektionslösung mit Morphano-Oligonukleotiden bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten sein, unmittelbar vor ihrer Verwendung, fügen Sie der Injektionslösung zur späteren Visualisierung 0,1 %Rod domine DExT-Strangtracer hinzu. Eine Injektionsnadel kann über eine Mikroladerpipette aus einer Glaskapillare mit einem Außendurchmesser von einem Millimeter und einem Dreiviertelmillimeter Innendurchmesser gezogen werden, die mit ein bis zwei Mikrolitern Injektionslösung beladen ist. Befestigen Sie es dann am Manipulator.Steuern Sie den Auswurf mit einer Pico-Schorle, die auf 100-Millisekunden-Impulse bei 40 Pfund pro Quadratzoll eingestellt ist. Lösen Sie mit einem Fußpedal den Abwurfwinkel der Pipette in einem Winkel von etwa 60 Grad zur Schalenoberfläche aus. Brechen Sie die Spitze auf, indem Sie sie vorsichtig in den hervorstehenden Kunststoff an einer gekerbten Linie auf der Schale führen.Dann reihen Sie es zu einem Ei auf. Die Nadel sollte leicht in die Zygote eindringen. Stoßen Sie den Bolus basierend auf der ersten Injektion aus.Passen Sie die Auswurfdauer so an, dass der Bolus etwa 20 bis 30 % des durchschnittlichen Zygotendurchmessers beträgt. Passen Sie die Dauer weiter an, bis der gewünschte Bolus erreicht ist. Lassen Sie dann das Timing eingestellt.Wenn die Nadel verstopft ist, brechen Sie die Nadel erneut. Kehren Sie dann zu einem 100-Millisekunden-Impuls zurück und stellen Sie den Bolus neu ein. Wenn eine Injektionsdauer von mehr als 200 Millisekunden erforderlich ist, um den richtigen Bolus zu erhalten, brechen Sie die Nadel erneut.Und wenn eine Injektionsdauer 20 Millisekunden oder weniger betragen muss, tauschen Sie die Nadel aus. Wenn eine Zygote an der Nadel hängen bleibt, nimm die Nadel aus dem Wasser, um sie zu entfernen. Versuchen Sie, die Injektionen vor dem ersten Dekolleté abzuschließen.Andernfalls wird nur ein Teil des Embryos von den störenden Reagenzien beeinflusst. Sobald die Spaltung beginnt, können einzelne Blasphemiere injiziert werden, was ideal für einige Versuchslinien mit der beschriebenen Technik sein kann. Ein DNA-Reporterkonstrukt, das GFP exprimiert, wurde in embryonale Seesterne injiziert.Die injizierten Embryonen zeigten klonale Flecken der Konstruktexprimation, wie erwartet, waren die Reagenz für die Embryonen toxisch, wenn sie überinjiziert wurden. Hier blieb ein überinjizierter Embryo im Ein-Zell-Stadium stehen. In anderen Fällen führte das injizierte Material zu einer abnormalen Teilung, wie z. B. einer asymmetrischen frühen Teilung.Toxizität kann sich auch bei Fehlentwicklungen manifestieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein wirklich gutes Verständnis dafür haben, wie man Viter Mini äußere Zygoten kultiviert und mikroinjiziert. Du erstellst Morph- und Embryonen, um eine Vielzahl von nachgelagerten Experimenten durchzuführen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

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Ein Verfahren zur Mikroinjektion von Patiria Minata Zygotes

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