Erzeugung Enterobacter Sp. Ysu Auxotrophe Mit Transposon-Mutagenese

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, TROs eines Wildtyp-Bakterienstamms zu erzeugen, die in einem mit Glukose angereicherten Medium mit minimalen Salzen wachsen. Dies wird erreicht, indem eine Transpo-Zone in den Wildtyp-Wirtsstamm umgewandelt wird, um eine Canna-Mycin-resistente Bakterienpopulation mit zufälliger Transponierung auf Inserts zu erhalten. Als nächstes werden Transformanten durch Replica-Plating gescreent, das TROs identifiziert, die auf reichhaltigem Medium wachsen, aber nicht auf minimalen Salzen, mit Glukose angereichertem Medium.

Als nächstes wird die DNA der Mutante verdaut, ligiert und in e coli transformiert, um ein Plasmid zu erhalten, das das Transposon enthält, das an jedem Ende von Segmenten des unterbrochenen Gens flankiert wird. Es werden Ergebnisse erhalten, die die mutmaßliche Identität des unterbrochenen Gens auf der Grundlage von DNA-Sequenzierung und grundlegender Analyse des Local Alignment Search Tools zeigen. Das bei dieser Technik verwendete Transposon hat einen Replikationsursprung, ein Kanamycin-resistentes Gen und Mosaikenden.

Für transponiert die Proteinbindung. Es fehlt das transponierte Proteingen, und daher müssen wir dieses transponierte Gen mit dem Transposon-DNA-Fragment hinzufügen, und dann wird der Komplex zwischen der transpos-DNA und dem Protein in den Wirt elektroporiert. Die Hauptvorteile der Elektroporation bestehen darin, dass keine Transduktion oder Konjugation mehr erforderlich ist.

Das Fehlen eines Transponierungs-A-Gens führt in der Regel zu stabilen Inserts, und das Vorhandensein eines Replikationsursprungs und eines CIN-Resistenzgens ermöglichen eine einfache Identifizierung des mutierten Gens, das als rekombinantes Plasmid wiedergewonnen wird. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der mikrobiellen Physiologie zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung von Genen, die für die Biosynthese von Aminosäuren, Nukleinsäuren und Vitaminen erforderlich sind. Ich hatte die Idee zu dieser Methode zum ersten Mal, als ich nach Metallresistenz-Genen in Enterobacter-Spezies YSU suchte und beschloss, sie in ein mikrobielles Physiologie-Labor zu integrieren, das ich entwickelte, um kompetente Zellen mit einer Overnight-Kultur von Enterobacter-Spezies elektroporiert.

YSU bereiten eine Verdünnung von eins bis 20 in frischem LB-Medium vor und inkubieren bei 30 Grad Celsius und 120 U/min auf einen OD 600 zwischen 0,4 und 0,6. Wenn die Zellen die richtige Dichte erreicht haben, kühlen Sie sie fünf Minuten lang auf Eis und zentrifugieren Sie sie dann fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius und 7.000 g. Entsorgen Sie den Überstand und verwenden Sie die gleiche Menge eiskaltes Wasser für Resus.

Suspendieren Sie die Zellen und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius und 7.000 g. Nach Wiederholung des Waschvorgangs den Überstand entsorgen und die Zellen mit eiskaltem Wasser in einem Volumen aufhängen, das dem Volumen des Zellpellets entspricht. Fügen Sie als nächstes 0,5 Mikroliter der Transpo-Zone zu 40 Mikrolitern Zellen hinzu.

Geben Sie dann die Mischung aus der Zelltranspo-Zone in einen eiskalten Elektroporations-Vet und klopfen Sie die Mischung auf den Boden des Q Vet Schocks der Zellen bei 25 Mikrophs, 200 Ohm und 2,5 Kilovolt. Geben Sie sofort 960 Mikroliter filtersterilisiertes SOC-Medium hinzu, das durch Auf- und Abpipettieren gemischt wird, bevor Sie die Zellen in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrofurchenröhrchen überführen. Inkubieren Sie die Zellen bei 30 Grad Celsius und 120 U/min für 45 bis 60 Minuten.

Verteilen Sie dann 100 Mikroliter Zellen auf einer LB-Dosen-Agarplatte, bevor Sie die Platte über Nacht bei 30 Grad Celsius inkubieren, um Transformanten zu gittern. Kleben Sie ein Gitter auf den Deckel einer leeren 100 x 15 Millimeter großen Petrischale. Zeichnen Sie eine Linie auf den Boden einer LB-Dosen-Agarplatte und verankern Sie sie mit einem kleinen Stück Klebeband am Gitterdeckel, so dass das Gitter durch die Schnecke mit einem sterilen Zahnstocher sichtbar ist.

Wählen Sie einen einzelnen Transformator aus und platzieren Sie ihn in der Mitte eines Quadrats im Raster, platzieren Sie einen anderen Transformator in einem angrenzenden Quadrat und fahren Sie fort, bis die Platte voll ist. Dann über Nacht bei 30 Grad Celsius inkubieren. Dies ist die Masterplatte für jede Platte, die gerastert wurde.

Machen Sie einen Stapel aus drei frischen Schneckenplatten, die von eins bis drei nummeriert sind. Nummer eins für LB kann Dose, Nummer zwei für M neun kann. Und Nummer drei für LB: Kann die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius trocknen, bevor sie verwendet werden.

Nachdem Sie wie zuvor gezeigt eine Linie auf die Oberseite jeder Platte gezeichnet haben, wischen Sie das nachgebildete Beschichtungswerkzeug mit 70 % Ethanol ab und legen Sie ein steriles Veltinquadrat darauf, bevor Sie das Veltinquadrat festklemmen. Richten Sie als Nächstes die Linie auf der Masterplatte an einer Linie aus, die auf der Klemme gezeichnet wurde, und platzieren Sie die Platte auf dem Veltinquadrat. Üben Sie leichten Druck aus, um die Bakterien von der Platte auf das Veltinquadrat zu übertragen.

Richten Sie dann die auf Platte Nummer eins gezeichnete Linie mit der Linie auf der Klemme aus und legen Sie sie auf das Veltinquadrat. Üben Sie sanften Druck aus, um die Bakterien aus dem Veltinquadrat auf die Platte zu übertragen. Entfernen Sie Platte Nummer eins.

Lege das Samt-Teenie-Quadrat in ein Becherglas mit Wasser und lege ein sauberes, steriles Samtquadrat auf das Nachbildung-Beschichtungswerkzeug. Richten Sie wie zuvor die Linie auf Platte Nummer eins mit der Linie auf der Klemme aus und legen Sie sie auf das neue Samtquadrat. Üben Sie sanften Druck aus, um die Bakterien von der Platte Nummer eins auf das Samtquadrat zu übertragen.

Entferne die erste Platte, richte die auf der zweiten Platte gezeichnete Linie mit einer Linie auf der Klemme aus und lege sie auf das Samtquadrat. Üben Sie sanften Druck aus, um die Bakterien aus dem Samtquadrat auf Platte Nummer zwei zu übertragen, entfernen Sie Platte Nummer zwei, nachdem Sie den Vorgang für Platte Nummer drei wiederholt haben, und inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 30 Grad Celsius. Völker, die auf beiden LB-Dosenplatten wachsen, aber auf M neun Platten nicht wachsen, gelten als Funde.

Wählen Sie TROs von Platte Nummer eins und streichen Sie auf eine frische LB-Dosenplatte. Nachdem Du über Nacht gebrütet hast, wählst Du drei Kolonien aus der Streifenplatte aus und legst sie am nächsten Tag auf eine frische LB-Dosenplatte. Lokalisieren Sie Kolonien von der neu gestreiften Platte auf eine LB-Dosengitterplatte und verwenden Sie diese Platte, um die Nachbildung der Beschichtung wie gerade gezeigt zu wiederholen.

Führen Sie eine Genrettung durch. Verwende eine isolierte mutierte Kolonie, um ein drei Milliliter Pfund zu züchten. Kann über Nacht bei 30 Grad Celsius kultiviert werden.

Verwenden Sie dann ein kommerziell erhältliches genomisches DNA-Aufreinigungskit, um DNA aus einem Milliliter der Kultur mit 0,025 Einheiten BFUC und einer Restriktionsendonuklease auf 14 Mikroliter eines Mikrogramms pro Mikroliter genomischer DNA in einer 20-Mikroliter-Reaktion auf Eis zu reinigen. Dann inkubieren Sie die Reaktion 25 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, bevor Sie sie für 20 Minuten auf 80 Grad Celsius übertragen. Um das Enzym zu inaktivieren, analysieren Sie drei Mikroliter der teilweise verdauten DNA auf einem 0,8%igen AROS-Gel.

Als nächstes fügen Sie 800 Einheiten T-4-DNA-Ligase zu 15 Mikrolitern teilweise verdauter genomischer DNA in einer 500-Mikroliter-Reaktion hinzu und inkubieren Sie die Reaktion über Nacht am folgenden Tag bei vier Grad Celsius. Fältitieren Sie die ligierte DNA, indem Sie 50 Mikroliter drei molare Natriumacetate mit einem pH-Wert von 5,5 und einen Milliliter 95%iges Ethanol hinzufügen und 20 Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius inkubieren. Mikrofuge der DNA bei vier Grad Celsius und 13.500 g für 10 Minuten.

Gießen Sie die Supernat-Plätze ab, sieben 70%ige Ethanol, um das Pellet zu waschen. Trocknen Sie es in einem Zentrifugal-Vakuumkonzentrator und verwenden Sie 10 Mikroliter nukleasefreies Wasser. Um die DNA zu resuspendieren, verwenden Sie vier Mikroliter resuspendierte DNA, um durch Elektroporation e Coli-Stamm, ECD 100 DPIR oder ECD 100 DPIR zu transformieren, ein 16 Inokulat fünf Milliliter LB kann Medium mit einer einzigen Kolonie.

Bauen Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius und 120 U/min an. Am nächsten Tag, nachdem Sie die DNA aus der gesamten Kultur gereinigt haben, verwenden Sie Joe one, um 14 Mikroliter des Plasmids zu verdauen. Analysieren Sie 10 Mikroliter des unverdauten und verdauten Plasmids auf einem 0,8%igen Agarro-Gel.

Nach der Sequenzierung des Plasmids wird nach der Sequenz fünf prime GA, G-A-C-A-G three prime, die die letzten sieben Basenpaare der Transponierung sind, gesucht und es folgt die Sequenz für das unterbrochene Gen. Verwenden Sie die Explosion, um die mögliche Funktion des unterbrochenen Gens zu bestimmen. Eine erfolgreiche Elektroporation ergab in dieser Abbildung mehrere tausend Transformatoren mit jeweils mindestens einer Transponierung beim Einfügen.

Die schwarzen Quadrate zeigen zwei Völker, die auf der LB-Dosenplatte gewachsen sind, nicht aber auf der M neun minimalen mittleren Platte. Diese TROs enthielten wahrscheinlich Unterbrechungen in Genen, die an der Synthese einer Aminosäure, einer Nukleinsäure oder eines Vitamins beteiligt sind, die alle in lb, aber nicht in M neun, dem minimalen Medium, vorkommen. Die anderen 86 Völker hatten keine Unterbrechung in einem Gen, das für das Wachstum auf M neun erforderlich ist.

Minimales Medium, wie hier zu sehen, teilweise verdaute genomische DNA aus einem isolierten TRO reicht von über 10 Kilobasen bis unter 0,5 Kilobasen. Das gerettete Plasmid besteht aus dem zwei Kilobasen-Transposon und der flankierenden Wirts-DNA. Diese Abbildung zeigt ein Blast-Ergebnis für ein Plasmid, das aus einem Tro isoliert wurde.

Die unterbrochene Sequenz ähnelt einem Enterobacter-Cloy-Gen für ate-Mutase, das an der Biosynthese von L-Tyrosin, L-Phenylalanin und L-Tryptophan beteiligt ist. Diese Technik kann in 10 oder 11 Tagen abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei der Replik von Pla ist es wichtig, daran zu denken, die Platten nicht zu verschmieren, und Sie können dies verhindern, indem Sie trockene Platten verwenden und die Platten nicht bewegen, sobald sie auf dem Veltinquadrat platziert wurden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Klonierungs- oder Komplementationsexperimente durchgeführt werden, um die Funktion des identifizierten Gens zu verifizieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man TROs mithilfe der Transposon-Mutagenese generiert und wie man die mutierten Gene vorläufig identifiziert.