Von einem 2DE-Gel-Spot die Proteinfunktion: Lektion gelernt von HS1 in chronischer lymphatischer Leukämie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, einen kombinierten proteomischen Ansatz zu verwenden, um potenzielle prognostische Marker und/oder therapeutische Ziele bei menschlichen Krankheiten zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem primäre leukämische Zellen aus dem peripheren Blut des Patienten isoliert werden, die eine gute oder schlechte Prognose tragen, und sowohl CD 19 als auch CD 5-Oberflächenmarker exprimieren, um sie in einem zweiten Schritt für die proteomische Analyse zu verwenden. Leukämische Zelllysate werden durch zweidimensionale Elektrophorese oder zwei de aufgelöst, und der Vergleich von Proteomkarten ermöglicht die Identifizierung von Flecken, die bei Patienten mit guter und schlechter Prognose unterschiedlich exprimiert werden, die anschließend durch Massenspektrometrie oder ms identifiziert werden können.

Anschließend können verschiedene Assays verwendet werden, um die Rolle der identifizierten Proteine im natürlichen Krankheitsverlauf zu validieren und zu analysieren. Die Ergebnisse zeigen, dass ein unterschiedlicher Phosphorylierungsstatus von HS, der durch zwei De-Gele nachgewiesen wurde, mit dem klinischen Outcome der Patienten korreliert. Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie der chronischen lymphatischen Leukämie, da sie dazu beitragen kann, Proteine zu identifizieren, die am Fortschreiten der Krankheit beteiligt sind und als prognostischer Marker und/oder therapeutische Ziele genutzt werden können, die dieses Verfahren demonstrieren, wird zusammen mit mir sein.

Pamela lief zu einem Techniker im Labor und einem Postdoc aus einem externen Labor. Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, entnehmen Sie peripheres Blut in Vacutainer-Blutentnahmeröhrchen mit Natriumheparin. Füllen Sie das Blut in ein 15-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie einen humanen B-Zell-Anreicherungscocktail mit 50 Mikrolitern pro Milliliter Vollblut hinzu. Dann gut mischen und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Verdünnen Sie die Probe nach der Inkubation mit einem gleichen Volumen PBS plus 2 % FBS-Mischung, und legen Sie vorsichtig Blut über den Fliegenruf, wobei Sie darauf achten, dass die Schnittstelle nicht beschädigt wird. Die Probe wird bei 400 μG bei Raumtemperatur 20 Minuten lang ohne Unterbrechung zentrifugiert. Wenn Sie fertig sind, saugen Sie die Grenzfläche vorsichtig ab, um die Zellen zu gewinnen, und legen Sie sie in ein neues Röhrchen.

Waschen Sie die Zellen nach der Zentrifugation und Entfernung des Überstands einmal mit PBS. Wiederbelebung. Suspendieren Sie das Pellet im restlichen Überstand, indem Sie das Röhrchen nach der Verdünnung manuell hin und her schnippen. Zählen Sie mit vollständigem RPMI-Medium die Zellen mit der Trian-Blau-Ausschlussmethode.

Als nächstes fügen Sie die folgenden Antikörper zu 100 Mikrolitern der gereinigten Zellsuspension in einem Faxrohr hinzu. Inkubieren Sie die Probe 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Nachdem Sie die Probe mit vier Millilitern PBS gewaschen haben, überprüfen Sie die Reinheit durch Durchflusszytometrie.

Kontrollieren Sie den prozentualen Anteil der chronischen lymphatischen Leukämie oder CLL-Zellen, die Coex CD 19 und CD fünf auf ihrer Oberfläche exprimiert. Stellen Sie sicher, dass die Präparate praktisch frei von NK-t-Lymphozyten und -Monozyten sind, indem Sie den Prozentsatz von CD 3, CD 14 und CD 1656 in der Parzelle überprüfen, der zu diesem Zeitpunkt nahe Null liegen sollte. Solubilizieren Sie CLL-Zellpellets mit einem Endvolumen von 380 Mikrolitern zweidimensionalem Elektrophoresepuffer.

Tragen Sie ein Milligramm der Proteinproben auf 18 IPG-Streifen auf, um eine ISO-Elektrofokussierung durchzuführen. Nach dem Lauf werden die Streifen in zwei Millilitern Äquilibrierungspuffer, ergänzt mit 2 % frischem DTT, 15 Minuten lang bei Raumtemperatur äquilibriert. Nach dem Verwerfen der Lösung zwei Milliliter Äquilibrierungspuffer hinzufügen, ergänzt mit 2,5%I Oto-Acetamid.

Dann inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einer Wippplattform. Trocknen Sie anschließend die Streifen auf Papier, ohne das Gel zu berühren, um die überschüssige Lösung zu entfernen. Legen Sie nach dem Trocknen jeden Streifen auf ein SDS-Seitengel mit neun bis 16 % Steigung.

Geben Sie ein kleines Volumen SDS-Elektrophoresepuffer auf das Gel, um das Laden des Streifens zu erleichtern. Versiegeln Sie anschließend das Gel, indem Sie etwa fünf Milliliter 0,8%ige Agarlösung hinzufügen, um ein Aufschwimmen des Streifens zu verhindern. Sobald die Elektrophoreseeinheit zusammengebaut ist, füllen Sie sie mit SDS-Elektrophoresepuffer.

Führen Sie dann den Lauf vier Stunden lang bei 60 Milliampere pro Gel bei vier Grad Celsius oder unter Verwendung eines Kühlsystems durch. Nachdem Sie das Gel aus der elektrophoretischen Einheit genommen haben, legen Sie es in die entsprechende Färbebox. Bereiten Sie etwa 200 Milliliter jeder Lösung vor.

Geben Sie jede Lösung vorsichtig in die Färbebox, die das Gel enthält. Führen Sie alle Inkubationen auf einer schaukelnden Plattform durch. Entfernen Sie nach der Färbung die Stopplösung und lassen Sie das Gel bis zur Akquisition in einer Lösung von 1%iger Essigsäure.

Für den Migrationsassay werden die zuvor gereinigten Zellen durch die Reanimation suspendiert. Bei vollständigem RPMI bereiten Sie die untere Transwell-Kammer vor, indem Sie 600 Mikroliter vollständiges RPMI mit oder ohne die spezifischen Stimuli hinzufügen. Um die induzierte bzw. die spontane Migration zu messen, legen Sie die obere Kammer darauf und lassen Sie das System 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius im Inkubator äquilibrieren.

Wenn Sie fertig sind, säen Sie 10 bis zu den sechs Zellen pro 200 Mikroliter in der oberen Kammer aus und inkubieren Sie die Platte vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius im Inkubator. Entfernen Sie nach der Inkubation die obere Kammer und sammeln Sie das Medium in der unteren Kammer. Waschen Sie dann die untere Kammer einmal mit einem Milliliter PBS.

Nachdem Sie das PBS in einem Röhrchen gesammelt haben, zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei 300-fachem G, nachdem der Überstand entfernt wurde. Resuspendieren Sie die Probe in 500 Mikrolitern PBS durch Durchflusszytometrie. Zählen Sie die Anzahl der migrierten Zellen nach einer Minute der Erfassung.

Überprüfen Sie die Anzahl der Zellen in einem zweidimensionalen Punktdiagramm unter Berücksichtigung der seitlichen Streuungen der Zellen und der Anzahl der in einer Minute visualisierten Ereignisse, d. h. der Zahl, die für die Berechnung verwendet werden soll. Isolierte primäre leukämische Zellproben von CLL-Patienten wurden basierend auf den klinischen Merkmalen jedes Patienten in zwei Hauptuntergruppen eingeteilt und anhand von zwei DE- und MS-Massen innerhalb einer bestimmten Massentoleranz analysiert. Sie wurden Peptidsequenzen in der Datenbank zugeordnet und dann zu einem Protein zusammengesetzt, das als identifiziert gilt, wenn es einen bestimmten Wahrscheinlichkeitswert erreicht.

Durch diese Analyse wurden Proteine identifiziert, die hauptsächlich an der Aktivität des Zytoskeletts und an Stoffwechselprozessen beteiligt sind. Hämatopoetische Linie, zellspezifisches Protein oder hs. Jemand, dessen differentielle Phosphorylierung stark mit dem klinischen Krankheitsverlauf assoziiert war, wurde differentiell exprimiert.

Insbesondere Patienten mit einem einzelnen Fleck haben ein schlechtes klinisches Ergebnis, während Patienten mit zwei Flecken eine gute Prognose haben. Es wurde festgestellt, dass CLL-Zellen, die HS one as one spot tragen, im Vergleich zu hypophosphoryliertem HS eine beeinträchtigte Zytoskelettaktivität in Bezug auf Migration, Adhäsion und Aktinpolymerisation aufweisen. Ein, zwei Stichproben. Dies erklärt ein anderes klinisches Verhalten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Proteomik einsetzen können, um biologische Kandidaten zu identifizieren, die am Fortschreiten der Krankheit beteiligt sind und als prognostischer Marker und/oder therapeutische Ziele verwendet werden können.