Name: Mess räumliche und zeitliche Ca 2 + Signale in Arabidopsis-Pflanzen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Lernen Sie eine Methode zur Messung räumlicher und zeitlicher Ca²⁺-Signale in Arabidopsis-Pflanzen. Diese Technik nutzt genetisch codierte Indikatoren zur Visualisierung von Calciumdynamiken unter abiotischem Stress.

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Wir danken B. Stevenson für die technische Unterstützung und Dr. Marc R. Knight für die Bereitstellung der transgenen Aequorin-Linie. Diese Arbeit wurde durch den National Institutes of Health Grant R01 GM059138 finanziert.

1. Aequorin Based Ca2 +-Imaging-System Mit der FAS <ol><li> Bereiten Pflanzgut für Lumineszenz-Bildgebung. Sterilisieren Samen von Arabidopsis-Pflanzen, Aequorin mit 10% Bleichlösung, die 0,01% Triton-100. Säen die Samen steril auf einer quadratischen Platte (10 x 10 cm im Quadrat Petrischale mit Gitter,) mit voller Kraft MS (Murashige und Skoog Basalsalzmischung), 1% Saccharose und 1,2% Agar. Ort Platten vertikal in einer Wachstumskammer nach einer Schichtung bei 4 ° C für 2 Tage (1A). </li><li> Übertragen Sie die Sämlinge auf einen Film. Ein Klebefilm (1B) auf der Oberseite der 7-10 Tage alten Sämlinge wachsen auf der Platte. Schieben Sie die Folie mit der Hand, um sicherzustellen, dass Keimlinge auf den Film (1C) einzuhalten. Schälen die Folie vorsichtig, so dass die Sämlinge bleiben an der Folie haften (1D und 1E) </li><li> Bebrüten die Sämlinge mit Cofaktor. Legen Sie die einedhered Sämlinge auf den Platz Platte (10 x 10 cm) mit 15 ml 2 pg / ml h-CTZ (Coelenterazins) in Wasser. Die Sämlinge bei Raumtemperatur inkubiert für 4 h bis über Nacht (1F). </li><li> Bereiten Sie sich für Lumineszenz-Bildgebung. Nehmen Sie den Film aus der h-CTZ Lösung und schneiden Sie es in der Mitte und bilden zwei Stücke. Legen Sie jedes Stück Film mit Jungpflanzen stehen in zwei verschiedenen Platten. Lassen Sie die Platten im Dunkeln für 5 min. </li><li> Erwerben Lumineszenz Bilder. Im Dunkeln, legen die beiden Platten nebeneinander auf der Bühne der Lumineszenz-Abbildungssystem (Figur 1G). Erwerben Bilder sofort nach Zugabe von 20 ml Lösung von Stimuli an die Platten gleichzeitig. </li><li> Analysieren Lumineszenz Bilder. Wählen Sie die gleichen Anzeigebereich für alle Lumineszenz Bilder. Beschneiden die Region of Interest (ROI) und erzeugen die Bilder als JPEG-Dateien (Abbildung 2a). Alternativ exportieren Sie die Bilder als SPE-Format-Dateien und importieren Sie sie in dieImageJ Bildanalyse-Software. Set-Messungen für die Berechnung der mittleren Grauwert der ROI. Wählen Sie die gleiche Größe der ROI-Bereich und messen die mittlere Grau und Darstellung von Daten als Balkendiagramme (Abbildung 2B). </li></ol> 2. Live Cell Imaging konfokale Ca 2 + <ol><li> Bereiten Setzlinge für die konfokale Bildgebung. Sterilisieren Samen von Arabidopsis-Pflanzen case12 ausdrücken mit 10% Bleichlösung, die 0,01% Triton. Aussaat der Samen auf einem sterilen Platte mit Vollkraft MS-Salze, 1% Saccharose und 1,2% Agar. Ort Platten vertikal in einer Wachstumskammer nach einer Schichtung bei 4 ° C für 2 Tage. </li><li> Setup Imaging Chambers <ol><li> Montieren Sie eine Imaging-Kammer mit einer Rutsche und Deckglas (Raum A). Legen Sie ein Stück Watte Wasser eingeweicht, auf der Mitte der Folie. Dann Transfer ein oder zwei 5 Tage alten Keimlingen von der Platte auf die Oberseite des Wasser eingeweicht Watte. Halten Sie kleine Stücke von Ton zu jeder Ecke eines Deckglases, eind Platz Deckglas auf der Oberseite der Setzlinge, um eine Lücke (Kammer) zwischen dem Deckglas und Objektträger (3A, links) zu erstellen. Das eine Ende des Polyethylenschlauch (0,58 mm Durchmesser) auf eine 1 ml-Spritze und das andere Ende des Rohrs unmittelbar angrenzend an die Kammer. Halten Sie den Schlauch mit Klebeband (3A, rechts). </li><li> Montieren Sie eine Imaging-Kammer mit einer Plexiglaskammer (Chamber B). <ol><li> Verteilen Sie eine dünne Schicht Silikonfett rund zwei Polyethylen-Rohre (0,58 mm Durchmesser), und drücken Sie die beschichteten Rohre in die Kanäle auf jeder Seite der Plexiglaskammer (3B links). Verteilen Sie eine dünne Schicht Silikonfett auf die Oberfläche der Kammer, dass das Rohr Nuten enthält und drücken Sie eine Deckglas in das Fett auf der einen Seite der Kammeröffnung (ausgeschnitten) zu versiegeln. </li><li> Übertragen einer 5 Tage alten Keimling von der Platte in die Kammer und setzen Sie ein Stück Watte mit Wasser getränkt auf der Oberseite of des Keimlings. Verbreiten Silikonfett auf die andere Oberfläche der Kammer, und drücken Sie eine andere Deckglas zu versiegeln. Verbinden des Endes eines der Rohre an eine 1 ml Spritze. Lassen Sie das Ende der anderen Röhre offen (3B rechts). </li></ol></li><li> Bereiten Sie eine Imaging-Kammer mit einem Kammerdeckglas (Kammer C). Sterilisieren Kammerdeckglas mit 70% Ethanol und lassen Sie es auf der Motorhaube bis trocken. 0,6 ml oder 0,2 ml Vollkraft MS-Medium mit 1% Saccharose und 0,5% Phytagel in jede Vertiefung einer 2-Kammer oder auch ein 8-Well-Kammer (3C rechts) auf. Sterilisieren Samen und säen die Samen direkt in einem Kammerdeckglas, das eine dünne Schicht klares Gel und lassen Sie sie vertikal für 5 Tage (Abbildung 3C) wachsen. </li></ol></li><li> Erwerben Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskop. Um Stress Reize, wie Salz, Kälte oder Peroxid gelten, langsam injizieren etwa 200 ul von 150 mM NaCl, Eis-cold Wasser oder 1 mM H 2 O 2-Lösung in die Kammer (Kammer A oder B) kurz vor der Aufnahme von Bildern oder sanft hinzufügen 500 ul oder 100 ul der Reiz Lösung für die Vertiefung einer 2-oder 8-Well-Kammer-bzw. . Erfassen von Bildern unmittelbar nach der Anwendung des Stimulus-Lösung unter Verwendung eines invertierten Nikon A1R konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit einem 20x Wasserimmersionsobjektiv (numerische Apertur 0.75). Sammeln einer Zeitserie von Bildern bei 4 sec Intervallen mit Anregungs-und Emissionswellenlängen von 488 nm und 500 bis 550 nm und bei einer Pixelauflösung von 512 x 512. </li><li> Bildanalyse Mit Nikon-Elemente wurden ROIs um jede Zelle (oder Fläche) von Interesse gezogen. Gesamtintensität innerhalb jedes ROI wurde im Laufe der Zeit über das Dialogfeld Zeitmessung (ImageJ stattdessen verwendet werden könnten) gemessen. Gesamtintensität Messungen wurden exportiert und in Datagraph verarbeitet. Ca 2 + Spike Amplitude wurde als Spitzenintensität minus Ruhe Intensität, Dauer, wie th definierte Zeit zwischen Initiierung und Abschluss einer Spitze, und Zeit als das Zeitintervall zwischen benachbarten Dorn Spitzen von zwei Spikes. t-test wurde verwendet, um die Mittel zu vergleichen. </li></ol>

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<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir haben ein FAS-System zur Aufzeichnung der räumlichen-zeitlichen Ca2 + Antwort von Arabidopsis Keimlingen nachgewiesen. Diese FAS Ca 2 +-Aufzeichnungssystem ist eine einfache, empfindliche und stabile Ansatz zur Messung Ca2 + Dynamik durch verschiedene Stimuli neben den abiotischen Stressreize, die hier vorgestellt werden ausgelöst, angepasst werden kann. Mit diesem System können wir einfach vergleichen gewebespezifische Reize oder räumlich-zeitliche Dynamik Ca 2 + in der g...

Die Pflanzenzelle reagiert auf die Umgebung über die Signalisierungszelle Aktionen koordiniert. Ein frühes Zellsignalisierungsereignis als Reaktion auf Umweltreize ist eine vorübergehende Ca 2 + zu erhöhen. Das Muster oder der Signatur einer transienten Zunahme der freien Ca 2 +-Konzentration wird durch seine Amplitude, Frequenz und Dauer ist. Unterschiedliche Raum-Zeit-Ca 2 +-Signaturen regulieren verschiedene Zellaktivitäten 1. Spezifische Reize, wie Hitze, Kälte, Salz, Trockenheit, Licht oder Pflanzenhormone, kann eine Feinabstimmung des räumlichen und zeitlichen Aktivität des Membran-lokalisierten Ca 2 +-Kanäle und / oder Transporteure, was in bestimmten Ca2 +-Signaturen. Obwohl Ca 2 +-Transporter sind gut gekennzeichnet, ist nur wenig über die molekularen Identitäten und Funktionen der Ca2 +-Kanäle in Pflanzen 1 bekannt. Genetische-Mutanten mit veränderten Ca 2 + Reaktion auf Reize betonen, kann eine wirksame ca. seinoach für die Identifizierung der Komponenten, die Ca 2 +-Signaturen zu komponieren. Kürzlich mehrere Aequorin basierend Ca 2 + Detektionssysteme entwickelt, die genetischen Screens erleichtern für Ca2 + Signalkomponenten in Reaktion auf Krankheitserreger angreifen und abiotischen Stress 2-4. Äquorin wurde zuerst verwendet, um in den frühen 1990er Jahren 5 Ca 2 +-Signale zu erkennen in Pflanzen. Seitdem hat Aequorin zu verschiedenen Zellkompartimenten wie dem Zytoplasma 5, Kern 6, 7, Chloroplasten, tonoplast 8, 9 Mitochondrien und Stroma 10 sowie an verschiedenen Zelltypen in der Stammzell spezifische Ca 2 überwachen gezielt worden + Signale 11. Äquorin basierend Ca 2 +-Messungen zeigen, die räumliche und zeitliche Ca2 + Antwort einer Population von Zellen auf Reize zu betonen. In den meisten Fällen sind jedoch die Ca 2 +-Antworten einzelner Zellen unsynchroniim antwort Gewebe 4 zed. Daher Aequorin Ca2 + Aufnahme nicht unbedingt die Ca 2 +-Signal in einzelnen Zellen zu melden. In den letzten Jahren genetisch kodierte Fluoreszenzprotein (FP) basierenden Ca 2 +-Indikatoren, wie gelb Cameleon (YCS) 12 und 13 CASEs12 verwendet worden, um Ca 2 + studieren Signalisierung mit hoher Auflösung subzellulärer. Ycs sind Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) basierenden Ca 2 +-Indikatoren, CFP und YFP-Varianten enthalten, durch die Ca 2 + gebunden bindende Protein Calmodulin und Calmodulin-Bindungspeptid M13. Calmodulin eine Konformationsänderung wie sie Ca 2 + bindet, wodurch bewirkt CFP und YFP näher zusammen, was zu einem erhöhten Energie-Transfer (FRET verstärkt). Die FRET-Level über die Zeit, in etwa dem Verhältnis der an GFP YFP Signalintensitäten berechnet, spiegelt die intrazelluläre Ca 2 + Dynamik. YC mehrere Versionen in Pflanzen verwendet worden. YC3.6 war tin das Cytosol 14,15, 16 Kern, Mitochondrien 17 und 18 Plasmamembran und YC4.6 und D4ER argeted wurden in die Notaufnahme 15,19 gezielte und D3cpv wurde den Peroxisomen 20 ausgerichtet. Transgene Pflanzen, die YCS ermöglichen die Live-Cell-Imaging von Ca2 + Dynamik in verschiedenen zellulären Kompartimenten verschiedener Zelltypen. Fällen (vermutlich Ca lcium se nsor) sind Einzel zirkular permutierten fluoreszierende Proteine ​​(cpFPs) beherbergen eine Calmodulin und Calmodulin-Bindungspeptid M13. Nach der Bindung an Ca 2 +, Koffer unterziehen Konformationsänderungen, die zu einer Erhöhung der Fluoreszenzintensität. Die Korrelation zwischen Fluoreszenzantwort der Fall und Ca 2 +-Konzentration ermöglicht die intrazelluläre Ca2 + Dynamik quantitativ gemessen werden. Die Case12 Variante hat 12-fach erhöht Fluoreszenz in den Ca 2 + -gesättigtem Formen. N. benthiminana Pflanzen vorübergehend ausdrEssing Case12 oder Arabidopsis-Pflanzen stabil exprimieren Fall 12 wurden verwendet, um Ca2 +-Signalisierung in der Verteidigung und abiotische Stress 4,21 studieren. Asynchrone räumliche und zeitliche Ca2 + Oszillationen in Zellen, die auf Pathogenbefall oder Austrocknung Stress haben mit Case12 basierend Ca 2 +-Bildgebung offenbart worden. Hier präsentieren wir detaillierte Anweisungen für Aequorin Lumineszenz-Bildgebung von Gewebe-und Reize spezifischen Ca2 + Dynamik in Arabidopsis-Keimlinge, und für die konfokale Bildgebung von zytosolischen und Kern Ca 2 + Dynamik in Arabidopsis Wurzelzellen, die Fall 12. Lumineszenz-Bildgebung von FAS äußern könnten, die den Stress-induzierten Ca2 + Dynamik in ganzen Pflanzen oder Gewebe hier nicht beschrieben zu analysieren oder mutagenisierten Arabidopsis Pflanzenpopulationen nach Mutanten mit veränderten Stress induziert Ca2 +-Signale zu screenen. Die Lebendzell Ca2 + Imaging-Setup könnte angepasst Ca analysieren2 + Dynamik innerhalb verschiedener subcelluar Kammern oder in verschiedenen Zelltypen mit anderen Ca 2 +-Indikatoren.

<table><tbody><tr><td>10 cm x 10 cm quadratische Petrischale</td><td>VWR</td><td>60872-310</td><td></td></tr><tr><td>Klebefolie</td><td>VWR</td><td>60941-062</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenschlauch</td><td>PerkinElmer</td><td>9908265</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Spritze</td><td>VWR</td><td>53548-000</td><td></td></tr><tr><td>Silikonfett</td><td>Beckman</td><td>335148</td><td></td></tr><tr><td>2-Well-Deckglas</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155379</td><td></td></tr><tr><td>8-Well-Kammer-Deckglas</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Lumineszenz-Bildgebungssystem</td><td>Princeton Instruments N</td><td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Inverses konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>N/A</td><td>Nikon A1R&nbsp;</td></tr><tr><td>Imaging-Software</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>N/A</td><td>Nikon Elements&nbsp;</td></tr><tr><td>DataGraph</td><td>Visual Data Tools Inc</td><td>N/A</td><td>DataGraph 3.1.1 ist die neueste Version</td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>NanoLight Technologies</td><td>#301B NF-BCTZ-FB</td><td></td></tr><tr><td>Allzweckbleiche</td><td>Jedes lokale Geschäft</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151500</td><td></td></tr><tr><td>MS Salz</td><td>Phytotechnology Labs</td><td>M524-50L</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>VWR</td><td>BDH8029-12KG</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A1296-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma</td><td>P8169-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

mess räumliche und zeitliche ca 2 + signale in arabidopsis-pflanzen

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Entwicklungs-und Umweltreize auslösen Ca 2 + Schwankungen in Pflanzenzellen. Reiz-spezifischen räumlichen-zeitlichen Ca 2 + Muster werden durch zelluläre Ca2 +-bindende Proteine, die Ca 2 +-Signalkaskaden initiieren abgetastet. Allerdings wissen wir noch wenig darüber, wie bestimmte Reiz Ca 2 +-Signale erzeugt. Die Spezifität eines Ca 2 +-Signal kann der ausgereiften Regulierung der Aktivitäten von Ca 2 +-Kanäle und / oder Transporteure als Antwort auf einen gegebenen Reiz zurückzuführen. Diese Zellkomponenten zu identifizieren und ihre Funktionen zu verstehen, ist es wichtig, Systeme, die eine empfindliche und stabile Aufnahme der Ca2 +-Signale sowohl auf dem Gewebe und zellulärer Ebene zu ermöglichen verwenden. Genetisch kodierte Ca 2 +-Indikatoren, die zu verschiedenen zellulären Kompartimenten richtet sind haben eine Plattform für Live Cell konfokale Bildgebung von zellulären Ca 2 +-Signale zur Verfügung gestellt. Hier beschreiben wir Unterrichts für die Verwendung von zwei Erfassungssystemen Ca 2 +: Aequorin basierend FAS (Klebefilm Sämlinge) Ca 2 +-Lumineszenz-Bildgebung und case12 basierend Lebendzell konfokalen Fluoreszenz Ca 2 +-Bildgebung. Lumineszenz-Bildgebung mit der FAS-System bietet eine einfache, robuste und sensitive Detektion der räumlichen und zeitlichen Ca 2 +-Signale in der Gewebeebene, während Live Cell Imaging mit konfokalen Case12 bietet simultane Detektion von zytosolischen und Kern Ca 2 +-Signale mit einer hohen Auflösung.

Mannit, NaCl und H 2 O 2 wurden als Stellvertreter für die Dehydratisierung, Salz und oxidativer Stress Stimuli verwendet wurden. Um zu überprüfen, ob die Schwermetallionen Cu 2 + Synergie mit jeder dieser drei Spannungsreize, verglichen wir die Ca2 + Antwort auf jeden Stimuli in Gegenwart oder Abwesenheit von Cu 2 +. Wie in 2 gezeigt, zeigte FAS Lumineszenzbildgebung dass Arabidoposis Sämlinge zu Dehydrierung, Salz und oxidativen Stress reagiert an...

Ca2 + Signalweg reguliert verschiedene biologische Prozesse in Pflanzen. Hier präsentieren wir Ansätze zur Überwachung abiotischen Stress induziert räumliche und zeitliche Ca 2 +-Signale in Arabidopsis Zellen und Geweben unter Verwendung der genetisch codierten Ca2 +-Indikatoren Aequorin oder Case12.

Mess räumliche und zeitliche Ca 2 + Signale in Arabidopsis-Pflanzen

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Methode zur Überwachung der Kalziumsignale sowohl auf zellulärer als auch auf gesamter Pflanzenebene zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem die Sämlinge zunächst auf der MS-Agarplatte oder direkt in der Bildgebungskammer gezüchtet werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Sämlinge auf eine Klebefolie zu übertragen oder in der Bildgebungskammer aufzubewahren.Als nächstes werden Stimuli auf die Sämlinge angewendet, um Kalziumsignale zu induzieren. Letztendlich wird die Lifestyle-Lumineszenz- oder Fluoreszenzbildgebung verwendet, um die Reaktion des gesamten Keimlings bzw. des zytosolischen Kernkalziums auf verschiedene Reize zu zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. dem Auftreten einzelner Pflanzen, besteht darin, dass der Belags-Sämlings-Assay einfach, empfindlich und robust ist.Daher kann diese Technik an das Hochdurchsatz-Screening nach Mutanten mit veränderten Kalziumsignalantworten angepasst werden. Darüber hinaus vermeidet die Verwendung eines GFP-basierten genetisch kodierten Kalziumindikators im Vergleich zur flachen Calciumbildgebung komplizierte mikroskopische Einstellungen und Berechnungen. Diese Methode gibt Aufschluss über die Kalzium-Signalgebung während der Stressreaktion in Arabidopsis, kann aber auch in anderen Zusammenhängen eingesetzt werden, z. B. während der Entwicklung oder Abwehr in anderen Pflanzenmodellen.Die Demonstration dieser Methode wird glänzend sein. Ein Student aus unserem Labor Um dieses Verfahren zu beginnen, sterilisieren Sie die Samen einer Kaninchen-Opsis-Pflanze, die einen Quain exprimiert, mit 10%iger Bleichlösung, die 0,01%Triton 100 enthält, säen Sie die Samen auf eine quadratische Platte, die MS 1%Saccharose und 1,2%Agar enthält. Legen Sie die Platten anschließend nach einer Schichtung von vier Grad Celsius für zwei Tage vertikal in eine Wachstumskammer.Übertragen Sie anschließend die Sämlinge auf eine Folie. Lege eine Klebefolie auf die sieben bis 10 Tage alten Sämlinge, die auf der Platte wachsen. Schieben Sie die Folie vorsichtig mit der Hand, um sicherzustellen, dass die Sämlinge auf der Folie haften.Schälen Sie dann die Folie vorsichtig, damit die Sämlinge an der Folie haften bleiben. Inkubieren Sie anschließend die Sämlinge mit dem Cofaktor, indem Sie die A-Klebersämlinge auf eine quadratische Platte legen, die 15 Milliliter zwei Mikrogramm pro Milliliter HCTZ in Wasser enthält. Inkubieren Sie die Sämlinge vier Stunden lang bis über Nacht bei Raumtemperatur.Zur Vorbereitung der Lumineszenzbildgebung nehmen Sie den Film aus der HCTZ-Lösung und schneiden Sie ihn in der Mitte in zwei Stücke. Legen Sie die beiden Folienstücke mit den Sämlingen nach oben in zwei verschiedene Platten. Lassen Sie die Platten dann fünf Minuten lang im Dunkeln, um Lumineszenzbilder im Dunkeln aufzunehmen.Stellen Sie zwei Platten nebeneinander auf den Tisch des Lumineszenz-Bildgebungssystems. Nehmen Sie Bilder sofort auf, nachdem Sie gleichzeitig 20 Milliliter Stimulilösung auf die Platten gegeben haben. Um die Lumineszenzbilder zu analysieren, wählen Sie für alle Lumineszenzbilder denselben Anzeigebereich, schneiden Sie den ROI zu und generieren Sie die Bilder als JPEG-Dateien.Alternativ können Sie die Bilder als Dateien im SPE-Format exportieren und in die Bildanalysesoftware image J importieren. Legen Sie die Maße für die Berechnung des mittleren Grauwerts des ROI fest und wählen Sie die gleiche Größe des ROI-Bereichs aus. Messen Sie dann den mittleren Grauwert und stellen Sie die Daten als Balkendiagramme dar.Zur Vorbereitung von Sämlingen für die konfokale Bildgebung. Sterilisieren Sie die Samen der Opsis-Pflanzen, die Fall 12 exprimieren, mit 10%iger Bleichlösung mit 0,01%Triton. Also die sterilen Samen auf einer Platte, die MS-Salze in voller Stärke, 1%Saccharose und 1,2%Agar enthält.Legen Sie die Platten dann nach der Schichtung bei vier Grad Celsius für zwei Tage senkrecht in eine Wachstumskammer. Bauen Sie in der Zwischenzeit eine Bildgebungskammer mit einem Objektträger und einem Deckglas zusammen. Lege ein Stück wassergetränkte Watte auf die Oberseite der Rutsche.Setze dann ein oder zwei fünf Tage alte Sämlinge von der Platte auf die Mitte der Folie um. Kleben Sie dann kleine Tonstücke an jede Ecke des Deckglases und legen Sie das Deckglas auf die Sämlinge, um einen Spalt zwischen Deckglas und Rutsche zu schaffen. Verbinden Sie danach ein Ende des Polyethylenröhrchens mit einer Ein-Milliliter-Spritze und platzieren Sie das andere Ende des Rohrs unmittelbar neben der Kammer.Halten Sie den Schlauch mit Klebeband fest, um eine Bildgebungskammer mit einer Plexiglaskammer zusammenzubauen. Verteilen Sie eine dünne Schicht Silikonfett um zwei Polyethylenrohre und drücken Sie die beschichteten Rohre in die Kanäle auf jeder Seite der Plexiglaskammer. Verteilen Sie dann eine dünne Schicht Silikonfett auf die Oberfläche der Kammer, die die Rohrrillen enthält, und legen Sie einen Deckschirm auf das Fett, um eine Seite der Kammeröffnung abzudichten.Setze als Nächstes einen fünf Tage alten Sämling von der Platte in die Kammer und lege ein Stück Watte, das mit Wasser getränkt ist, auf den Sämling. Verteilen Sie das Silikonfett auf der anderen Oberfläche der Kammer und drücken Sie zum Verschließen einen weiteren Deckglas darauf. Verbinden Sie anschließend das Ende eines der Röhrchen mit einer Ein-Milliliter-Spritze und lassen Sie das Ende des anderen Röhrchens offen.Um eine Bildgebungskammer mit einem Kammer-Deckglas vorzubereiten, sterilisieren Sie zuerst das Kammer-Deckglas mit 70 % Ethanol und lassen Sie es in der Haube, bis es bei 0,6 Millilitern oder 0,2 Millilitern voller MS-Stärke getrocknet ist. Medium, das 1 % Saccharose und 0,5 % Fighter-Gel enthält, in jede Vertiefung einer Zwei-Well-Kammer bzw. einer Acht-Well-Kammer. Dann sterilisiere die Samen und säe sie direkt auf ein Kammerglas, das eine dünne Schicht klares Gel enthält, und lass sie fünf Tage lang vertikal wachsen. Für die Bildaufnahme.Mit einem konfokalen Mikroskop werden Stressstimuli angewendet, indem kurz vor der Aufnahme von Bildern langsam 200 Mikroliter 150 Millimolar Natriumchlorid, eiskaltes Wasser oder eine Millimolare Wasserstoffperoxidlösung in die Kammer injiziert werden. Nehmen Sie die Bilder unmittelbar nach dem Auftragen der Reizlösung auf. Mit einem inversen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit einer 20-fachen Wasserimmersionslinse.Erfassen Sie eine Zeitreihe von Bildern im Abstand von vier Sekunden mit Anregungs- und Emissionswellenlängen von 4 88 Nanometern bzw. 500 bis 550 Nanometern und einer AIX-Auflösung von fünf 12 x fünf 12 oder Bildanalyse mit Nikon-Elementen. ROIs werden um jede interessierende Zelle herum gezeichnet. Die Gesamtintensität innerhalb jedes ROI wird im Laufe der Zeit mithilfe des Dialogfelds zur Zeitmessung gemessen.Dann werden die Gesamtintensitätsmessungen exportiert und in der gezeigten Datengrafik verarbeitet. Hier ist der Vergleich der räumlichen, zeitlichen Kalziumreaktion von 10-Tage-Sämlingen. Bei den verschiedenen Stressreizen handelt es sich hier um die Zeitreihe der Lumineszenz, Bilder von Sämlingen, die 400 Millimolar Mannitol und 400 Millimol Ol plus ein Millimolar Kupferchlorid, 75 Millimolar Natriumchlorid und 75 Millimolar Natriumchlorid plus ein Millimolar Kupferchlorid und ein Millimolar Wasserstoffperoxid oder ein Millimol Wasserstoffperoxid plus ein Millimolar Kupferchlorid ausgesetzt wurden.Das obere und untere Feld sind die Lumineszenzbilder, die während der ersten 40 Sekunden bzw. der zweiten 40 Sekunden aufgenommen wurden. Und hier ist das Balkendiagramm der durchschnittlichen Lumineszenzintensität von Sämlingen als Reaktion auf die angegebenen Stressreize, hier als zytosolische und nukleare Kalziumoszillation dargestellt. Als Reaktion auf Salzstress zeigen die konfokalen Bilder, dass Fall 12 im Zytoplasma und in den Zellkernen der Wurzelzellen und den Blattzellen der transgenen Pflanzen, die Fall 12 exprimieren, exprimiert wird.Es entsteht dieses Bild, Bild der roten Autofluoreszenz der Chloroplasten und der grünen Fluoreszenz von Fall 12. Diese beiden Diagramme zeigen die durch Salzstress induzierte Kalziumoszillation im Zytosol, einem Kern der Wurzelzellen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, gut gewachsene Sämlinge zu verwenden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Dynas sowohl auf zellulärer als auch auf gesamtpflanzlicher Ebene überwachen können.

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Forschung

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Biology

Biologie

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