Name: Verfahren zur Haut Verwundung und Assays für Wound Antworten in C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Erfahren Sie Methoden zur Hautverwundung und Visualisierung epidermaler Wundheilungsreaktionen bei C. elegans. Diese Techniken nutzen Mikroinjektionsnadeln und Laserbestrahlung, um Calciumsignale und Aktinringbildung zu untersuchen.

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Nadelverwundungsmethoden für C. elegans wurden zuerst von Nathalie Pujol und Jonathan Ewbank entwickelt; wir danken Nathalie Pujol für ihre Kommentare zum Manuskript. Die Arbeit in unserem Labor zur epidermalen Wundreparatur von C. elegans wird durch ein Stipendium des NIH an A.D.C. unterstützt (R01 GM054657).

Die folgenden Protokolle beschreiben die detaillierte Prozedur für C. elegans Haut zu verletzen und zum Testen von Wundreaktionen. 1. Nadel Verwundung 3,4 <ol><li> Wachsen gesunde unstarved Würmer auf Standard NGM (Nematoden Wachstumsmedium) Platten mit E. coli OP50 Bakterien als Nahrung, in einem 20 ° C Inkubator gehalten. HINWEIS: Methoden für die NGM-Agar-Platten und Routine Anbau von C. elegans kann www.wormbook.org 6. </li><li> Wählen Sie 25 L4-Stadium Würmer zu einer frisch ausgesät Platte 1 Tag vor Verwundung und Kultur bei 20 ° CO / N. </li><li> Vor der Verwundung, ziehen Nadeln aus Kapillaren mit einer Nadel Magnet. Die in Verwundung verwendeten Nadeln identisch mit denen für die Mikroinjektion von C verwendet werden elegans. </li><li> Stellen Sie sicher, dass alle Würmer sind bei jungen Erwachsenen Bühne. Die Platte von Würmern auf Eis für ca. 30 min. Kühlung bewirkt, dass die Tiere träge zu sein, erleichtert Nadel Verwundung. <br /&gt; Hinweis: Innerhalb von 5 Minuten von der Entnahme aus dem Eis, werden die Würmer Zeiger sich normal bewegen. Es ist möglich, aber schwierig zu bewegenden Würmern aufgewickelt. Mit der Erfahrung, ist 5 Minuten genügend Zeit, um 25 Würmer gewickelt. Immobilisieren mit Medikamenten wie Levamisol (wie in Laser Verwundung verwendet, siehe unten), auch wenn Tiere wird länger dauern, sich zu erholen. </li><li> Entfernen Sie die Agar-Platte aus dem Eis zu einem Präpariermikroskop Stereomikroskop. Mit einem Pick-Wurm, verschieben 25 Würmer in der Mitte der Agar-Platte. </li><li> Stecken Sie die Nadel in einen 100 ul Pipettenspitze leichter halten Sie die Nadel. Punktion der vorderen oder hinteren Teil des Körpers der Schnecke mit der Nadel, die Vermeidung der Gonaden. Im allgemeinen versuchen, zwischen der hinteren Rachen und vorderen Gonade, oder zwischen dem hinteren Gonade und Rektum gewickelt. Wiederverwendung Nadeln mehrmals, bis sie brechen. HINWEIS: Achten Sie darauf, die Wunden sind kurze, sanfte Stiche, die die Nagelhaut und die Haut durchbohren, durchdringen ~ 5-10 um in das Tier. Die Nadel sollte das anim eingebenal ungefähr in einem rechten Winkel zu der Haut. Die Wunden sollten nicht dazu führen, offensichtlich Schäden an inneren Organen oder unmittelbaren Bruch des Körpers. Beachten Sie eine kleine Menge von Cytoplasma Nässen aus für ein paar Sekunden nach der Wunde; Wenn jedoch Zellinhalt austreten kann über einen längeren Zeitraum die Tiere nicht überleben. Für eine optimale Bildgebung, Wund die seitliche epidermalen Syncytium (hyp7) oder die seitliche Naht. HINWEIS: Dieses Verfahren umfasst die Verwendung einer Glasnadel. </li><li> Lassen Würmer bei RT bei 20 ° C zu erholen, dann Kultur. Beurteilen den Erfolg der Nadel Verwundung von einer Reihe von unten beschriebenen Assays. Mehr als 95% der Wildtyp-Tiere überleben 24 h nach der Nadel zu verletzen im jungen Erwachsenenstadium. Die Wirkung der Verwundung in Larven oder älteren Erwachsenen ist noch nicht umfassend untersucht. </li></ol> 2. Laser Verwundung 3 Verwenden Femtosekunden-Laserstrahlung (800 nm), um genauere Verwundung durchzuführen. <ol><li> Bereiten Agar pAnzeigen auf einem Objektträger mit geschmolzenem 2% Agar 7. Achten Sie darauf, die Pads ähnlich wie die Agar-Pads für die Live-Darstellung von C verwendet werden, elegans. </li><li> Übertragen Sie 10 jungen erwachsenen Würmer auf den Agarose-Pad mit Wurm holen, und fügen Sie ein 2 ul Tropfen 12 mM Levamisol Lösung. Decken Sie die Tiere und die Flüssigkeit mit einem Deckglas. Warten Sie 1-2 Minuten für die Würmer zu lähmen. </li><li> Legen Sie die Objektträger auf eine sich drehende Scheibe konfokalen Mikroskop. Bewegen Sie die Bühne, um die Würmer zu finden und sich auf den seitlichen vorderen oder hinteren Syncytial Epidermis mit einer 100X Objektiv (NA 1,4 bis 1,46). </li><li> Stellen Sie die Macht der Femtosekundenlaser bis 140 mW (gemessen vor dem Ziel). Verwenden der Femtosekundenlaser mit einer Wiederholungsrate von 80 MHz. HINWEIS: Zwei Pulse von 200 msec je (von 20 ms getrennt) sind ausreichend für Verwundung in unseren Händen. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf der apikalen Oberfläche der epidermalen Zell und Wund die Epidermis. Beachten Sie die örtlichen Störung des Zytoplasma (Blasenbildung), oder lokale Bleich of jeder Fluoreszenzmarker eingesetzt. HINWEIS: Befolgen Sie die entsprechenden Lasersicherheitsverfahren bei der Verwendung des Femtosekundenlaser. Linien- oder Punkt Scans mit Femtosekundenlasern, wie sie in zwei Photonenmikroskope sollte ausreichend Leistung für die Laser Verwundung bereitzustellen. HINWEIS: Während wir keine direkte Erfahrung mit anderen Lasern im Prinzip Verwundung sollte möglich sein, mit konventionellen UV-Laser (wie verwendet in C. elegans Zelle Ablationen). Optional können Sie eine Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) Modul auf Spinning-Disk-konfokale um die Epidermis (N. Pujol, persönliche Mitteilung) aufgewickelt. </li></ol> 3. Visualisierung von Epidermal Ca 2+ Responses to Verwundung <ol><li> Verwenden transgenen C. elegans-Stämme, die Ca 2+ Sensoren (wie beispielsweise solche der GCaMP Reihe) in der Epidermis exprimieren, unter der Kontrolle des Erwachsenen epidermalen spezifischen Promotor col-19 (1A; Transgene aufgeführt <strong&gt; Tabelle 1). Verwenden ein Transgen ein rotes Fluoreszenzprotein exprimieren, wie tdTomato als interne Kontrolle für die Transgen-Expressionsniveau. Anmerkung: Wir haben tdTomato als interne Kontrolle für die Expression des Transgens verwendet werden, wie epidermaler tdTomato Fluoreszenz relativ stabil ist und nicht mit GCaMP Abbildungs ​​stören. </li><li> Sowohl Nadel und Laser Verwundung Trigger Ca 2+ Erhebung in der Epidermis. Als Nadel Verwundung nicht ohne weiteres auf einer sich drehenden Scheibe konfokalen geführt werden, ist jedoch Laser Verwundung bevorzugt für die quantitative Analyse des Ca 2+ Antwort (Abbildung 1). </li><li> Erwerben Sie Zeitreihen-Aufnahmen in mehrdimensionalen Erfassungsmodus (Intervallzeit 2 s mit 114 ms Erregungslaserbelichtung) mit einer sich drehenden Scheibe konfokalen mit 100X Objektiv (NA 1,4 bis 1,46) und geeigneter Filtersätze (GFP Filter für GCaMP3 funktionieren). HINWEIS: Erwerben Sie Zeitraffer-Aufnahmen alle 30 Sekunden für ca. 2 Stunden, um die Ca 2+ bzw. prüfenonse zu verwunden über einen längeren Zeitverlauf. </li><li> Verwendung von Bildanalysesoftware messen die durchschnittliche GCaMP Fluoreszenz in Zehn-Äquivalent Regionen von Interesse (ROI), von denen fünf auf der epidermalen Zellcytosol und fünf im Hintergrund zentriert. </li><li> Erhalten Fluoreszenzbasis (F 0) durch Mitteln Fluoreszenz in 5 ROIs in der Epidermis dann Subtrahieren der Durchschnitt von 5 ROIs im Hintergrund vor Verletzung. Drücken die Fluoreszenzänderung &amp; Dgr; F als Verhältnis der Änderung gegenüber der Basislinie [(F t F 0) / F 0]. </li></ol> 4. Visualisierung von F-Actin Dynamics Nach Verwundung <ol><li> HINWEIS: Als Reaktion auf die Nadel Verwundung, beobachten eine Aktin-Ring an der Wundstelle, die nach und schließt sich um die Wunde. Diese Protokollabschnitt Assays Wundverschluss durch Messung der Aktin-Ringdurchmesser. </li><li> Gene transgenen Würmer, die eine F-Aktin-Marker Eil wie Drosophila Moesin Aktin-Bindedomäne fusioniertGFP, exprimiert unter der Kontrolle eines Epidermis-spezifischen Promotor, wie col-19 (2A) (Transgen juIs352). HINWEIS: Wir haben ähnliche Ergebnisse mit anderen Aktin-Bindedomäne Marker wie LifeAct oder F-tractin (unveröffentlichte Ergebnisse) erhalten. </li><li> Führen Nadel Verwundung auf P col-19-GFP-Moesin transgenen Würmer. Nach Nadel Verwundung, beobachten einen Ring von GFP-Moesin um die Wunde von ca. 5 min. Die Aktin-Ring kleiner im Durchmesser und schließlich schließt 2-3 Stunden nach der Verwundung in Wildtyp-Tiere (Abbildung 2A). </li><li> Bereiten Sie eine 2% Agar-Pad auf einem Glasträger und übertragen 10 Würmer auf das Pad in 2 ul 12 mM Levamisol Lösung. Bild der GFP-Moesin Ringe 1 Stunde nach der Verletzung mit herkömmlichen konfokalen Mikroskopie. HINWEIS: Die Verwendung der konfokalen Mikroskopie, um z-Stapel (13 x 0,5 um) von Aktin-Ringe 1 Stunde nach der Verletzung zu erwerben. </li><li> Messen Sie die Aktin-Ringdurchmesser nach der Verwundung. Zur Quantifizierung epidermalen GFP-Moesin, zuerst eine maximale Intensität Projektion der Z-Stapel und ziehen 4 Linien-Scans (bei 45 ° zueinander) über die GFP-Moesin Ring. Ringdurchmesser wird als die mittlere Spitze-Spitze-Abstand der vier Zeilenabtastungen (2B) definiert ist. Für Ringe, die bereits geschlossen haben, wird der Durchmesser als 0 &amp; mgr; m definiert. HINWEIS: F-Actin-Ringe sind bequem gemessen 1 h nach der Verwundung, da dies etwa auf halbem Weg durch den Wundverschluss Prozess im Wildtyp. F-Actin-Ringe können auch zu mehreren Zeitpunkten gemessen werden, um einen zeitlichen Verlauf des Wundverschlusses abzuleiten. Zeitraffer-Filme des Wundverschlusses kann mit Levamisol-immobilisiert Würmer und Spinning-Disk-konfokale Mikroskopie erworben werden. </li></ol> 5. Assay Induktion von Epidermal antimikrobielle Peptide HINWEIS: Verwundung löst auch angeborenen Immunantwort in der C elegans Haut. Transkription von Genen, antimikrobielle Peptide (AMP) kodiert, indin der Epidermis uced. Die NLP-29 (Neuropeptid-like protein) AMP ist stark durch Verwundung 4 induziert. Um zu untersuchen, wie sich die Epidermis steuert AMP Expression nach Verwundung, verwenden transgenen Reporter oder Echtzeit-PCR, einzelne AMP Transkriptniveaus erkennen. <ol><li> Transgene Reporter-Assay für die angeborene Immunantwort zu verwunden 4. </li><li> Führen Nadel Verwundung (wie in Protokoll 1) an erwachsenen Tieren die transgenen Reporter frIs7, die P nlp-29- GFP und P col-12-DsRed als interne Kontrolle enthält auszudrücken. Beachten unverwundete erwachsenen Tieren so dunkel rot oder orange in einer GFP-Langpassfilter. HINWEIS: Verwundung Wildtyp-Würmer P nlp-29 -GFP Expression zu induzieren, jedoch nicht auf P col-12 -dsRed, was zu Würmern, orange, gelb, grün oder unter GFP langen Pass Beleuchtung angezeigt. Der Verlust der Funktion von Genen in der p38 MAPK-Weg, wie Tempel-1 oder NSY-1 blockieren nlp-29 -GFPInduktion nach Verwundung 4. P nlp-29- GFP wird in großen Mengen in Larvenstadien exprimiert </li><li> Führen AMP Induktionsassays in reife junge Tiere. Stellen Sie sicher, dass unverletzten Kontrolltiere haben geringe Mengen an GFP. HINWEIS: P nlp-29- GFP-Expression wird auch durch osmotischen Stress 8 induziert, wobei jedoch auch andere Umwelteinflüsse sein. </li><li> 6 Stunden nach der Verwundung, punkten die Anzahl der Würmer, die P-29 nlp -GFP Induktion (Abbildung 3) 9 mit einem Fluoreszenz Binokular mit GFP Langpassfilter haben. HINWEIS: Bei 1 Stunde nach der Verwundung P nlp-29- GFP sichtbar induziert und erreichte einen Höchststand von 6 Stunden nach der Verwundung und dann bleibt bis zu 24 Stunden nach der Verletzung erhöht. Quantifizieren Ausdruck durch visuelle Scoring 4,9. Alternativ zu quantifizieren Expressionsniveaus mit Hilfe eines Fluoreszenz-aktivierten Wurm Sortierer 4. Für die Schneckensortierer, müssen mindestens 50 Tieren, die verletzt werden. </li><li> Echtzeit-PCR-Assay für quantitating Transkriptniveaus der einzelnen AMP-Gene. Assay Transkriptionsniveaus für mehrere Gene: NLP-29, NLP-30, CNC-1 und CNC-5. </li><li> Führen Nadel Verwundung auf Wildtyp oder mutierten Würmer (siehe Protokoll 1) </li><li> Sammeln Sie 50 verwundet Würmer und 50 unverwundete Würmer zu den gewünschten Zeiten (zB 3, 6, 24 Stunden) nach der Verwundung. </li><li> Extrahieren RNA unter Verwendung eines kommerziellen Kits nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Führen Sie die reverse Transkription zu insgesamt 20 ul cDNA erhalten unter Verwendung eines kommerziellen Reverse-Transkriptase-Kit. </li><li> Für die RT-PCR, verwendet 0,2 ul cDNA (1/40) von jeder Probe in Kombination mit einem grünen supermix mit Fluorescein und 0,2 uM Primer. Um RNA-Qualität zu vergleichen, verwenden ama-1 oder snb-1-RT-PCR als Referenz; Vergleichen Sie die relativen Expressionslevel AMP durch die Normalisierung der internen Kontrolle (ama-1 oder snb-1), oder vergleichen fache Induktion nach der Verwundung (AMP Induktion in verwundeten Würmern / unverwundete Würmer) von Normalizing die interne Kontrolle. HINWEIS: CNC-1 und CNC-5 sind caenacin Familie antimikrobielle Peptide, deren Transkription durch Verwundung 10 aktiviert. Typischerweise Nadel Verwundung induziert Ausdruck (~ 500fach für CNC-1) über einen Zeitverlauf von 4 h 10. Primer, die in veröffentlichten Arbeiten sind in Tabelle 2 aufgeführt. </li></ol> 6. Assay Überleben nach der Verwundung <ol><li> HINWEIS: Anschweissen aktiviert mindestens zwei unabhängige Signalwege in der Epidermis: die Ca 2+ abhängige Wundreparaturwegs und der angeborenen Immunantwort Wegs. Beide Wege sind für die vollständige Überlebens steriler Verwundung erforderlich. Um zu testen, ob eine Mutante oder RNAi-Behandlung wirkt Wundheilung, messen Überleben nach 24-48 Stunden nach der Verwundung. Optional können Sie mit herkömmlichen Lebensdauer-Tests, um die Wirkung der Verwundung auf Langlebigkeit 4,9 zu bestimmen. </li><li> Führen Nadel Verwundung auf junge Erwachsene (L4 + 24 h) Schnecken (50 Würmer, wiederholen several mal) folgende Protokoll 1 oben. Pflegen Sie eine entsprechende Anzahl von unverletzten Würmer als Kontrollen. </li><li> Überprüfen Überleben alle 24 h (Transfer verwundet Würmer auf eine neue Agarplatte alle 24 h). Beachten ~ 50% Überlebensrate 24 Stunden nach der Verletzung in Mutanten, die an der Wundheilung defekt sind, wie gtl-2 oder tir-1, bei Normierung auf unverletzten Kontrolltieren. Der Tod wird als ein Mangel der lokomotorischen Reaktion auf durch Schnecken Pick berühren definiert. </li></ol>

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</ol>

Den Autoren sind keine konkurrierenden Interessen bekannt.

Die Nadel und Laser Verwundung hier dargestellten Verfahren stellen komplementäre Ansätze, um die Fähigkeit des Epidermisepithel um Schäden zu reparieren. Laser Verwundung relativ lokalisierte und (je nach Laserkonfiguration) kann auf die Epidermis beschränkt werden, wobei nadel Verwundung stört die Epidermis, Kutikula und wahrscheinlich interne Basalmembranen. Needle Verwundung kann genauer ähneln Wunden, die durch Krankheitserreger oder mechanische Schäden in der natürlichen Umwelt zugefügt hat. In der Regel erfordert...

Wundheilung der Haut Mechanismen der biologischen Grundlagen Interesse und relevant für die menschliche Gesundheit. Wundheilung in Wirbeltieren und Säugetieren umfaßt eine komplexe Reihe von koordinierten Antworten von mehreren Geweben und Signalisierungs 1. Viele einfache genetische Modellorganismen sind auch fähig, Heilung von Hautwunden 2. Es ist daher von Interesse, genetisch manipulierbaren Modelle der Haut die Wundheilung zu untersuchen. Wir und andere haben damit begonnen, Caenorhabditis elegans Verwendung als neues Modell für die Haut Wundheilung 3,4. Ziel dieses Protokolls ist es, eine breitere Gruppe von Forschern, C. nutzen zu können elegans als Werkzeug zur molekularen und zellulären Mechanismen der epidermalen Wundheilung zu untersuchen. Die C. elegans Haut besteht aus der Epidermis (auch als Unterhaut bekannt) und die extrazelluläre Schuppenschicht 5. Die erwachsenen Epidermis ist aus einer kleinen Anzahl von mehrkernigen Syncytien, von denen der größte der Syncytium k gebildetnown als hyp7. Die Epidermis ist ein einfaches Epithel, das die Nagelhaut auf ihrer apikalen Oberfläche absondert. Die Haut kann aktiv gegen die Haut eindringenden Krankheitserreger zu verteidigen und zu reparieren kleine Wunden 4. Wundreparatur des C. elegans Haut ist robust, da fast alle Wildtyp-Tiere überleben können kleine Stichverletzungen durch Nadeln oder lokale Hautschäden durch Laserbestrahlung verursacht überleben. C. elegans Haut Verwundung löst eine Reihe von Reaktionen, einschließlich einer epidermalen angeborenen Immunantwort, Wundverschluss und die Narbenbildung 4. Die erwachsenen Epidermis ist postmitotischen und Wundheilung umfasst lokale Zellreaktionen im Gegensatz zu epidermalen Proliferation oder Zellmigration. Wir haben gezeigt, dass Haut Verwundung löst einen starken und nachhaltigen Anstieg der epidermalen Ca 2+, erfordern die Membran TRPM Kanal GTL-2 und der internen Ca 2+ Geschäfte 3. Für Bildung und Schließung von F-Actin Ringe an der wo ist der epidermale Ca 2+ Signal erforderlichund Ort. Verwundung induziert auch angeborene Immunantworten, die die Transkription AMPs wie NLP-29 zu aktivieren. Die Verwundung induzierten Transkription AMPs ist abhängig von einer TIR-1 / PMK-1 p38 MAP-Kinase-Kaskade wirkt sich autonom in der Epidermis 4. Defekte entweder in der Ca 2+ Signalweg oder in der angeborenen Immunantwort zu niedrigeren Überleben nach der Verwundung führen. Der relativ einfache Aufbau der C. elegans Epidermis, seine genetische Lenkbarkeit und Vorteile für die in-vivo-Bildgebung machen es ein ausgezeichnetes System, um mehrere Aspekte der Wundheilung zu untersuchen. Hier präsentieren wir Protokolle für die beiden häufigsten Methoden der Verwundung: needle Verwundung und Laser Verwundung. Needle Verwundung erfordert keine spezielle Ausrüstung (mit Ausnahme der Nadel puller) und mit der Erfahrung kann auf Hunderte von Würmern pro Tag durchgeführt werden. Needle Verwundung auf Tiere wachsen auf Agar-Platten durchgeführt. Im Gegensatz dazu wird die Laser Verwundung auf anes geführtthetized Tieren montiert auf Agar-Pads unter einem Deckglas, und ist für die Live-Darstellung der zellulären Reaktionen auf Schäden geeignet.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-8</td><td></td></tr><tr><td>Petriplatte aus Kunststoff</td><td>Tritech Research</td><td>T3308</td><td>60 mm</td></tr><tr><td>Levamisol</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td>12 mM</td></tr><tr><td>Kapillare aus Borosilikatglas</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Nadelabzieher</td><td>Sutter Instrument&nbsp;</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Schneckenpickel (Platindraht)</td><td>Tritech Research</td><td>PT-9010</td><td></td></tr><tr><td>M9 Lösung</td><td>Hausgemacht</td><td></td><td>3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O bis 1 Liter. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren</td></tr><tr><td>von Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>Verwenden Sie 500 ml für 50 Würmer</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green</td><td>Bio-Rad</td><td>1708882</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Gerät</td><td>Bio-Rad</td><td>C1000/CFX96</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-PCR-Röhrchen</td><td>Bio-Rad</td><td>MLL9601</td><td></td></tr><tr><td>Bildanalysesoftware</td><td>Molekulare Bauelemente</td><td>Metamorph</td><td></td></tr></tbody></table>

verfahren zur haut verwundung und assays für wound antworten in c. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Die C. elegans Epidermis und Cuticula bilden eine einfache, aber anspruchsvolle Hautschicht, die lokalisierte Schäden durch Verwundung was zu reparieren. Untersuchungen der Wunde Antworten und Reparatur in diesem Modell haben unser Verständnis des Zytoskeletts und genomische Reaktionen auf Gewebeschäden beleuchtet. Die beiden am häufigsten verwendeten Verfahren, um die C gewickelt elegans erwachsenen Haut sticht mit Mikroinjektionsnadeln und lokale Laserbestrahlung. Nadel lokal Verwundung stört die Kutikula, Epidermis und der extrazellulären Matrix assoziiert und können auch innere Gewebe beschädigen. Laserbestrahlung führt zu mehr lokalisiert Schaden. Verwundung löst eine Reihe von leicht getestet Antworten einschließlich erhöhter epidermaler Ca 2+ (Sekunden-min), die Bildung und die Sperrung eines aktinhaltigen Ring an der Wundstelle (1-2 h), erhöhte Transkription des antimikrobiellen Peptids Gene (2-24 h) und die Narbenbildung. Im Wesentlichen alle erwachsenen Tiere Wildtyp überleben Verwundung, woMutanten in der Wundheilung oder andere Reaktionen defekt zeigen verringerte Überleben. Detaillierte Protokolle für die Nadel und Laser Verwundung und Assays zur Quantifizierung und Visualisierung von Wundantworten und Reparaturprozesse (Ca Dynamik Aktindynamik, antimikrobielles Peptid Induktion und Überlebensrate) dargestellt.

Laser oder Nadel Verwundung wird eine schnelle und anhaltende Erhöhung der epidermalen Ca Ebenen auslösen wie bei Ca Sensoren wie GCaMPs (Abbildung 1) visualisiert. Das Ca Höhen tritt innerhalb von Sekunden und erhöht bleibt für zehn Minuten. Nadel Verwundung reproduzierbar resultiert in der Bildung von F-Actin-Ringe an Wundstellen (Figur 2); erscheinen diese innerhalb von Minuten, und nach und nach in der Nähe über 1-2 Stunden nach der Verwundung. Aktin-Ringe weniger oft nach genauer L...

Die Haut von erwachsenen C. elegans ist ein handhabbares Modell für Studien zu epithelialen Wundreaktionen, einschließlich Wundverschluss, Narbenbildung und angeborener Immunität.

Verfahren zur Haut Verwundung und Assays für Wound Antworten in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Methoden zu demonstrieren, die verwendet werden, um die Eleganz von Wunden zu sehen und die epidermalen Reaktionen auf Wunden zu visualisieren. Dies kann erreicht werden, indem die Epidermis mit kleinen Einstichen verletzt wird, die durch Stiche mit einer Mikroinjektionsnadel verursacht werden. Bei einer zweiten Verwundungsmethode kommt Laserbestrahlung zum Einsatz.Dies kann an Tieren durchgeführt werden, die für die Mikroskopie montiert sind, und ermöglicht eine sofortige Bildgebung der Verwundungsreaktion. Die Ergebnisse zeigen, dass die Verwundung einen raschen Anstieg des epidermalen Kalziums auslöst, gefolgt von der Ansammlung eines Aktinrings um die Wundstelle, der sich in wenigen Stunden schließt, so dass die Wunde heilen kann. Und die hier gezeigten Laser-Wunding-Methoden sind derzeit die am weitesten verbreiteten Methoden der Hautverletzung beim Fadenwurm C Elgan.Diese Methoden werden verwendet, um Schlüsselfragen im Bereich der Wundniere zu beantworten, z. B. wie Hautzellen Verletzungen erkennen und darauf reagieren. Legen Sie einen Teller mit jungen erwachsenen Würmern für etwa eine halbe Stunde auf Eis, um die Tiere zu verlangsamen. Diese durch Abkühlung induzierte Torpor ist wichtig für eine präzise Nadelverwundung.Da sich Würmer normalerweise zu schnell bewegen, um sie unter dem Stereomikroskop zu verletzen, betrachten Sie die Würmer und bewegen Sie sie mit einem Pickel alle in die Mitte der Platte. Fassen Sie dann eine gezogene Nadel, wie sie für die Mikroinjektion verwendet wird, mit einer 100-Mikroliter-Pipettenspitze. Bringen Sie die Nadelspitze als Nadelhalter an eines der Enden eines Wurms und vermeiden Sie dabei die Gonaden, entweder zwischen dem hinteren pH-Rachen und der inneren Gonade oder zwischen der hinteren Gonade und dem Rektum.Fügen Sie dann der Nagelhaut einen annähernd rechten Winkel hinzu. Mache einen kurzen, sanften Stich, der etwa fünf bis 10 Mikrometer in den Wurm eindringt. Diese Nadelwunden können auch innere Organe wie den Darm schädigen.Warten Sie einen Moment, um zu beobachten, wie zellulärer Inhalt aus der Wunde austritt. Ein paar Sekunden Leckage sind in Ordnung, aber mehr als das deutet darauf hin, dass die Wunde tödlich sein wird. Die Darstellung der Wundreaktionen ist am einfachsten, wenn die Wunde im lateralen epidermalen Synzytium oder in der lateralen Naht gemacht wird.Bei einer Nadelverletzung ist es wichtig, eher einen kleinen Einstich als einen großen Stich zu verursachen. Da die Leiter die Würmer schnell abtöten kann, ist Übung erforderlich, um reproduzierbar den minimalen Schaden zu verursachen, der erforderlich ist, um eine Wundreaktion auszulösen. Fahren Sie mit der Verwundung jedes Tieres mit derselben Nadel fort, bis es bricht oder schmutzig wird. Mit Erfahrung ist es durchaus machbar, alle 25 Tiere auf dem Teller in fünf Minuten zu verwunden, um genau auf die Nematoden zu gehen.Dieses Protokoll verwendet einen Femtosegment-Laser, der an einer Spinning-Disc befestigt ist, Fokalmikroskop-Linien- oder Punktscans unter Verwendung von Femto-Femtosekunden-Litern, wie sie in zwei Fotomikroskopen verwendet werden. Sollte auch ausreichen. Beginne damit, 10 junge Erwachsene auf einem Schneckenpad zu sammeln.Lähmen Sie sie in einem zwei Mikroliter Tropfen 12 Millimolar Lail Lösung. Decken Sie sie dann mit einem Deckglas ab und warten Sie einige Minuten, während sie lähmen. Es ist wichtig, dass das Tier vollständig gelähmt ist.12 Milli mehr wirken sich nicht nur auf die Reaktion aus. Es können aber auch andere Methoden der Ruhigstellung angewendet werden. Stellen Sie sicher, dass die Femtosekunden-Laserleistung auf 140 Milliwatt eingestellt ist, wie vor dem Objektiv gemessen, und die Laserwiederholrate bei 80 Megahertz liegt.Lokalisieren Sie nun die Würmer unter einem konfokalen Spinning-Disc-Mikroskop mit einem 100-fach-Objektiv mit hoher numerischer Apertur und fokussieren Sie auf die laterale, vordere oder hintere synzytiale Epidermis des Zielwurms, wobei Sie sich auf die apikale Oberfläche der Epidermiszelle konzentrieren. Richten Sie den Laser für zwei 200-Millisekunden-Pulse im Abstand von 20 Millisekunden an. Dies sollte ausreichen, um die Epidermis zu verwunden.Warten Sie einen Moment und beobachten Sie die lokale Störung des Zytoplasmas, die als Blasenbildung erscheint. Ist ein fluoreszierender Marker vorhanden, kann ein lokalisiertes Bleaching beobachtet werden. Dieses Protokoll nutzt C elegance, das Kalziumsensoren in der Epidermis exprimiert, wie z. B. G Camp drei, und auch ein rot fluoreszierendes Protein wie TD-Tomate als interne Kontrolle für das Expressionsniveau der Transgene exprimiert.Obwohl beide Verwundungsmethoden Kalziumerhöhungen auslösen, um dies durch konfokale Spinning-Disc-Mikroskopie abzubilden, muss die Laserverwundung nach der Verwundung Zeitrafferbilder mit einer Intervallzeit von zwei Sekunden und einer Anregung und einer Laserbelichtung von 114 Millisekunden verwenden. Die gleiche Vergrößerung, die für die Laserverwundung verwendet wird, ist für längere Zeiträume geeignet, z. B. können Bilder von zwei Stunden alle 30 Sekunden oder länger aufgenommen werden. Das Textprotokoll schlägt Analyseroutinen vor.Dieses Protokoll verwendet Würmer, die einen F-Aktin-Marker GFP mosin unter der Kontrolle eines epidermalen spezifischen Promotors exprimieren, wie z. B. Call 19 nach Nadelverwundungskultur. Die verwundeten Würmer bei 20 Grad Celsius inkubieren für eine Stunde und nehmen dann Zacks zur Bildbildung des Aktinrings, um unmittelbar nach der Nadelverletzung die Aktindynamik zu untersuchen, überführen die verwundeten Tiere auf ein Bohrkissen auf einer Rutsche und betäuben sie mit Laile. Anschließend bilden Sie die Tiere mit konventioneller konfokaler Mikroskopie ab.Erfassen Sie Zacks mit einem Intervall von 0,5 Mikrometern für ein bis zwei Stunden, um den Aktinring zu messen und den Ringdurchmesser zu quantifizieren. Erstellen Sie zunächst eine Projektion des Z-Stapels mit maximaler Intensität und zeichnen Sie vier Linienscans in einem Winkel von 45 Grad zueinander über die GFP-MOIs und den Ring. Berechnen Sie dann den Durchmesser des Rings als durchschnittlichen Spitzenabstand der vier Scans für Ringe, die geschlossen sind.Der Durchmesser ist definiert als Null O: Eine Laser- oder Nadelverletzung löst einen schnellen und anhaltenden Anstieg des epidermalen Kalziumspiegels aus, der durch das Kalziumsensor-G-Lager sichtbar gemacht wird. Eine Seitenansicht der Epidermis im Frontzahnkörper zeigt die mit einem X und N markierte Laserwunde, den Epidermiskern. Der Kalziumanstieg breitet sich schnell von der Wundstelle aus aus. Die Quantifizierung des Kalziumspiegels bei 2040 und 60 Mikrometern von einer Wundstelle hilft dabei, diese frühe Kinetik der Kalziumreaktion zu veranschaulichen.Die Kalziumerhöhung bleibt für Dutzende von Minuten bestehen und die Nadelverletzung zuverlässig. Führt zur Bildung von Aktinringen, die sich innerhalb von zwei Stunden an den Wundstellen allmählich schließen. Dies wurde mit Hilfe von P-Call 19 GFP-MOIs bei Tieren visualisiert.Diese Ringe werden seltener durch präzises Laserwickeln hergestellt. Der Durchmesser des Aktonrings wurde mit Hilfe eines vierzeiligen Scans quantifiziert. Die Quantifizierung der Linienscans zeigt, dass der Aktinring in verschiedenen Abständen von der Wunde unterschiedliche Intensitäten aufweist. Platz.Die Entwicklung dieser Wundheilungsmethoden hat es den Forschern ermöglicht, die Eleganz des Meeres als Modell für viele Aspekte der Wundheilung zu nutzen, einschließlich der angeborenen Immunreaktionen und des Wundverschlusses. Vergessen Sie nicht, dass Femtosegmentlaser eine Gefahr darstellen. Jeder, der mit dem Femto-Segmentlaser arbeitet, sollte eine Laserschutzschulung absolviert haben.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video stellt eine Methode der Laserverwundung vor, die verwendet wird, um sehr präzise Verletzungen in der Wurmepidermis zu verursachen. Das Beispielprotokoll stammt aus einer Studie über die Reaktion und Reparatur von Wunden.

Epidermale Laserverletzung: Induktion lokalisierter Schädigung zur Untersuchung von Reparaturprozessen bei C. elegans

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Mikroinjektion Wound Assay und<em&gt; In-vivo-</em&gt; Lokalisierung von Epidermal Wundreaktion Reporter in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos.

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